WO2019163166A1

WO2019163166A1 - 遺伝子改変非ヒト動物及び脊髄小脳変性症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法

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Publication number: WO2019163166A1
Application number: PCT/JP2018/031919
Authority: WO
Inventors: 秀史川上; 豊之森野; 由喜子松田
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2019-08-29
Anticipated expiration: 2020-08-26
Also published as: JPWO2019163166A1

Abstract

遺伝子改変非ヒト動物は、相同染色体の一方又は両方のＴ型カルシウムチャネルＣａｖ３．１をコードする遺伝子において、該Ｃａｖ３．１におけるリピートＩＶのＳ４領域内のＮ末端からＣ末端に向かってＡｒｇ－Ｉｌｅ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ａｒｇで示されるアミノ酸配列のＮ末端から７個目のアミノ酸であるアルギニンをコードするトリプレットがアルギニン以外のアミノ酸をコードするトリプレットに置換されている。

Description

遺伝子改変非ヒト動物及び脊髄小脳変性症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法

　本発明は、遺伝子改変非ヒト動物及び脊髄小脳変性症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法に関する。

　脊髄小脳変性症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＳＣＤ）は、運動失調症状をきたす神経変性疾患である。ＳＣＤは、根本的治療法が確立されていない難病である。ＳＣＤには、遺伝的な多様性があることが知られている。これまでに常染色体優性遺伝性である種々の病型で原因遺伝子が同定されている。

　例えば、ＳＣＤの病型の１つである脊髄小脳失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　ａｔａｘｉａ、ＳＣＡ）１型の原因遺伝子として、ＡＴＸＮ１遺伝子が同定されている。ＳＣＡ１型は、ＡＴＸＮ１遺伝子において異常伸長したＣＡＧ繰り返し配列によって発症する。非特許文献１には、３０回の繰り返し配列及び８２回の繰り返し配列を有するＡＴＸＮ１遺伝子を人為的に導入したトランスジェニックマウスが開示されている。当該トランスジェニックマウスは、運動失調症状及びプルキンエ細胞の変性を示した。

　特許文献１には、マウス胚性幹細胞ウイルスプロモーターに連結された目的遺伝子を含むベクターを生殖系列に導入したトランスジェニックマウスが開示されている。当該トランスジェニックマウスでは、目的遺伝子が小脳プルキンエ細胞、脳幹及び嗅球に特異的に過剰発現する。特許文献１には、目的遺伝子としてＳＣＡ１４型の原因遺伝子であるＰＫＣＧ遺伝子をプルキンエ細胞に過剰発現させたことが記載されている。

　上記のようにＳＣＤの原因遺伝子の解明が進められているものの、優性遺伝性が推測される症例のうち約３０％においては、原因遺伝子が不明で、依然として未解明な部分も多い。ＳＣＤに関してさらに詳細な病態の解明が求められている。

　近年、非特許文献２に開示されたように、日本人の常染色体優性遺伝性ＳＣＡの大家系についての遺伝学的な解析によって、新たな原因遺伝子としてＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子が同定された。ＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子は、低電位活動型電位依存性カルシウムチャネル（Ｔ－ｔｙｐｅ　ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ）の1つであるＣａｖ３．１をコードする。Ｃａｖ３．１は、図１に示すように、６個の膜貫通部位（Ｓ１～Ｓ６）を４回繰り返す構造（リピートＩ～ＩＶ）を有している。リピートＩ～ＩＶそれぞれのＳ４に電位センサとしての役割がある。非特許文献２によれば、ＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子の変異によって、リピートＩＶのＳ４に存在するアルギニン残基がヒスチジンに置換されている（Ｒ１７１６Ｈ）。非特許文献２で同定されたＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子の変異は、非特許文献３で報告されたように、別のＳＣＡの家系でも見出されている。

特開２０１１－２５４７０１号公報

Ｅｒｉｃ　Ｎ．Ｂｕｒｒｉｇｈｔ、外８名、「ＳＣＡ１　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ：ａ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ａｎ　ｅｘｐａｎｄｅｄ　ＣＡＧ　ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ」、１９９５年、Ｃｅｌｌ、８２（６）、ｐ．９３７－９４８Ｈｉｒｏｙｕｋｉ　Ｍｏｒｉｎｏ、外１０名、「Ａ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ＣＡＣＮＡ１Ｇ　ａｌｔｅｒｓ　ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｎｅｌ，ｃａｕｓｉｎｇ　ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　ａｔａｘｉａ」、２０１５年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒａｉｎ、８：８９Ｍａｒｉｅ　Ｃｏｕｔｅｌｉｅｒ、外１４名、「Ａ　Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＣＡＣＮＡ１Ｇ　Ａｌｔｅｒｓ　Ｃａｖ３．１　Ｔ－Ｔｙｐｅ　Ｃａｌｃｉｕｍ－Ｃｈａｎｎｅｌ　Ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃａｕｓｅｓ　Ａｕｔｏｓｏｍａｌ－Ｄｏｍｉｎａｎｔ　Ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　Ａｔａｘｉａ」、２０１５年、Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ、９７、ｐ．７２６－７３７

　非特許文献１及び特許文献１に開示されたトランスジェニックマウスでは、人為的に導入した遺伝子が内在性の原因遺伝子とは別のゲノム上の位置に挿入され、過剰に発現する。このため、遺伝子が挿入されたゲノム上の位置及び過剰な発現量がマウスに影響を及ぼすおそれがある。さらに、トランスジェニックマウスでは、導入した遺伝子のコピー数もマウスに影響することがある。このため、遺伝子を導入しても、ヒトの病態がマウスで十分に再現されない懸念がある。

　また、ＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子に上述の変異を有するモデル動物はこれまでに作製されていない。ＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子の変異に起因するＳＣＡの病態の解明及び治療法の確立のためにも、ＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子に同様の変異を有するモデル動物が求められている。

　本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、ヒトの病態をより忠実に再現できる遺伝子改変非ヒト動物及び該遺伝子改変非ヒト動物を用いた脊髄小脳変性症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

　本発明の第１の観点に係る遺伝子改変非ヒト動物は、
　相同染色体の一方又は両方のＴ型カルシウムチャネルＣａｖ３．１をコードする遺伝子において、該Ｃａｖ３．１におけるリピートＩＶのＳ４領域内のＮ末端からＣ末端に向かってＡｒｇ－Ｉｌｅ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ａｒｇで示されるアミノ酸配列のＮ末端から７個目のアミノ酸であるアルギニンをコードするトリプレットがアルギニン以外のアミノ酸をコードするトリプレットに置換されている。

　この場合、前記アルギニン以外のアミノ酸は、
　ヒスチジンである、
　こととしてもよい。

　また、プルキンエ細胞の密度が、
　野生型と比較して有意に小さい、
　こととしてもよい。

　また、プルキンエ細胞の樹状突起スパインの密度が、
　野生型と比較して有意に小さい、
　こととしてもよい。

　また、上記本発明の第１の観点に係る遺伝子改変非ヒト動物は、
　マウスである、
　こととしてもよい。

　また、上記本発明の第１の観点に係る遺伝子改変非ヒト動物は、
　脊髄小脳変性症モデル動物である、
　こととしてもよい。

　本発明の第２の観点に係る脊髄小脳変性症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法は、
　上記本発明の第１の観点に係る遺伝子改変非ヒト動物を用いる。

　本発明によれば、ヒトの病態をより忠実に再現できる。

Ｃａｖ３．１の構造を模式的に示す図である。ノックインマウスのゲノムにおいて置換される塩基の位置を示す図である。野生型及びノックインマウスにおけるＣａｖ３．１をコードする遺伝子の塩基配列の一部を示す図である。実施例２に係るロタロッドテストの結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ６か月齢及び１４か月齢のマウスが回転台から落ちるまでの時間を示す図である。実施例３に係るビームウォーキングテストの結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ６か月齢及び１０か月齢のマウスがゴール地点に辿り着くまでの時間を示す図である。実施例４に係るフットプリントテストの結果を示す図である。（Ａ）はマウスの足跡を示す図である。（Ｂ）はマウスの歩幅を示す図である。実施例５に係るオープンフィールドテストの結果を示す図である。（Ａ）は実施例６に係る小脳切片の画像を示す図である。（Ｂ）はプルキンエ細胞の密度を示す図である。（Ａ）は実施例７に係る樹状突起スパインの画像を示す図である。（Ｂ）は樹状突起スパインの密度を示す図である。

　本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。

　（実施の形態１）
　本実施の形態に係る遺伝子改変非ヒト動物は、相同染色体の一方又は両方のＴ型カルシウムチャネルＣａｖ３．１をコードする遺伝子が改変されている。上記非ヒト動物は、ヒトを除く脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはげっ歯類である。具体的には、非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ及びサル等が挙げられる。汎用性及び利便性を考慮すると、好適には非ヒト動物はマウスである。以下では、本実施の形態に係る非ヒト動物として、マウスを用いた場合について説明する。

　Ｃａｖ３．１をコードするＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子は、ヒトでは１７番染色体にある。Ｃａｖ３．１は、中枢神経系、特には小脳及び視床で発現する。ヒトＣａｖ３．１は、例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースにおいてＩＤ：ＮＰ＿９３８１９６．１として登録されている。当該ＩＤで登録されたアミノ酸配列のＮ末端から１６８６番目のアミノ酸から１７０７番目のアミノ酸までがリピートＩＶのＳ４領域である。Ｃａｖ３．１におけるリピートＩＶのＳ４領域内には、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡｒｇ－Ｉｌｅ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ａｒｇ（配列番号１）で示される４個のアルギニン残基を含むアミノ酸配列が存在する。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ヒト、ゴリラ、サル、ウサギ、マウス、ニワトリ及びカエル等の動物において広く保存されている。

　Ｃａｖ３．１において、カルシウムチャネルを開くためには、リピートＩ～ＩＶそれぞれのＳ４が同時に活性化される必要がある。アルギニンは側鎖に正電荷を有するアミノ酸であるため、配列番号１に示されるアミノ酸配列における４個のアルギニンは電圧感知及びＳ４の活性化に重要である。

　４２型に分類されるＳＣＡ（ＳＣＡ４２型）は、進行性失調症及び小脳萎縮を呈する。ＳＣＡ４２型の患者では、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から７個目のアミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換されている。アルギニンがヒスチジンに置換されることで、Ｃａｖ３．１の電気生理学的な特性が変化する。この結果、ＳＣＡ４２型を発症すると考えられる。

　ＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子のマウスにおけるオーソログはＣａｃｎａ１ｇ遺伝子である。Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子は、１１番染色体にある。マウスにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子のエクソン２９にコードされている。

　したがって、本実施の形態に係る遺伝子改変マウスは、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子において、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から７個目のアミノ酸であるアルギニンをコードするトリプレットがアルギニン以外のアミノ酸をコードするトリプレットに置換されている。アルギニン以外のアミノ酸としては、ＳＣＡ４２型に係る変異と同様にヒスチジンが好ましい。なお、アルギニン以外のアミノ酸は、Ｃａｖ３．１が細胞膜に発現し、野生型の活性と同等ではなくとも一定の活性を有するのであれば特に限定されない。例えば、アルギニン以外のアミノ酸は、側鎖に正電荷を有するリシン、又は側鎖に電荷を有していないアミノ酸等であってもよい。

　野生型マウスの場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号２に示される。一方、上記遺伝子改変マウスでは、相同染色体の一方又は両方において、配列番号２に示される塩基配列が、例えば配列番号３に示される塩基配列に置換される。配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から７個目のアミノ酸であるアルギニンは、配列番号２の５’末端から数えて７個目のトリプレット「ＣＧＣ」でコードされているが、配列番号３に示された塩基配列では、当該トリプレットがヒスチジンをコードする「ＣＡＣ」に置換されている。遺伝子改変マウスでは、配列番号２の５’末端から数えて７個目のトリプレット「ＣＧＣ」がヒスチジンをコードする「ＣＡＴ」に置換されていてもよい。なお、配列番号２及び配列番号３に示されるＣａｃｎａ１ｇ遺伝子における塩基配列は、コーディング鎖の塩基配列である。

　次に、上記遺伝子改変マウスの作製方法について説明する。Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子を上記のように改変するには、一細胞期受精卵のゲノムを改変し、得られた個体から目的の変異が導入された個体を選抜しなければならい。上記遺伝子改変マウスは、好ましくは、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子に相同組換えにより変異遺伝子を導入し、変異タンパク質を発現させるノックインマウスである。

　ノックインは、公知の方法で行うことができる。好適には、ノックインには、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔ　ａｎｄ　Ｃｒｉｓｐｅｒ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）システム（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」ともいう）が用いられる。

　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９では、ＰＡＭ配列に隣接する標的の塩基配列に相補的な塩基配列を有するガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとを使用する。Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子の標的とする塩基配列に結合したガイドＲＮＡを認識したＣａｓ９ヌクレアーゼがＰＡＭ配列より５’末端側において二本鎖ＤＮＡを切断する。ガイドＲＮＡの代わりに、ＤＮＡ修復の鋳型として１本鎖オリゴＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ）を用いてもよい。ｓｓＯＤＮは、変異を導入した標的塩基と、標的塩基の５’末端側及び３’末端側にそれぞれ隣接する４０～８０塩基の相同配列（アーム配列）と、を有する。

　Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子において、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から７個目のアミノ酸であるアルギニンをコードするトリプレットを、ヒスチジンをコードするトリプレット「ＣＡＣ」に置換する場合、配列番号４に示される塩基配列のｓｓＯＤＮが好ましい。

　二本鎖ＤＮＡの切断は、多くの遺伝情報の損失又はガン化の原因になるため、細胞内で極めて迅速に修復される。修復の主な経路の１つである、切断された末端同士を繋ぎ合わせる非相同末端結合修復の際、ｓｓＯＤＮを鋳型としてＣａｃｎａ１ｇ遺伝子における上記アルギニンをコードするトリプレットがヒスチジンをコードするトリプレットに高確率で置換される。

　なお、二本鎖ＤＮＡの切断には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに限らず、ＴＡＬＥＮ及びｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）等のプログラマブルエンドヌクレアーゼを用いてもよい。

　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとガイドＲＮＡとを発現するベクターを、マウスの受精卵に導入する。導入方法は、特に限定されず、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法などの公知の方法が挙げられる。ｓｓＯＤＮを用いる場合は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをｓｓＯＤＮとともに受精卵に導入すればよい。

　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター等を導入した受精卵を、野生型の偽妊娠マウスの胎内に戻すことで得られるキメラマウスと、野生型マウスとの交配によりヘテロ接合体の雄及び雌が得られる。次に、ヘテロ接合体の雄及び雌を交配することで、Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子に変異が導入されたホモ接合体のマウスを得ることができる。ヘテロ接合体のマウスでは、相同染色体の一方のＣａｃｎａ１ｇ遺伝子に変異が導入されている。ホモ接合体のマウスでは、相同染色体の両方のＣａｃｎａ１ｇ遺伝子に変異が導入されている。

　Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子に変異が導入されたか否かを確認するには、マウスからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）及びＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法等の公知の方法を用いればよい。

　次に、本実施の形態に係る遺伝子改変マウスの病理学的特徴を以下に説明する。当該遺伝子改変マウスは、神経変性、特にプルキンエ細胞の変性の兆候が見られる。例えば、当該遺伝子改変マウスでは、プルキンエ細胞の密度が、野生型と比較して有意に小さい。プルキンエ細胞の密度は、公知の方法に従って、野生型及び遺伝子改変マウスから採取した小脳切片をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色し、顕微鏡下の視野内に存在するプルキンエ細胞を計数することで評価できる。

　また、当該遺伝子改変マウスは、プルキンエ細胞の樹状突起スパインの密度が、野生型と比較して有意に小さい。樹状突起スパインの密度は、野生型及び遺伝子改変マウスから採取した小脳から小脳スライスを作製し、公知の方法に従ってプルキンエ細胞を染色し、顕微鏡下の視野内に存在する樹状突起スパインを計数することで評価できる。

　ここで「有意に小さい」とは、統計学上の有意な差をもって小さいことを意味する。例えば、プルキンエ細胞の密度の場合、野生型及び遺伝子改変マウスそれぞれの複数個体の小脳切片についてプルキンエ細胞の個数を計数し、小脳切片におけるプルキンエ細胞の密度の平均値を算出し、野生型及び遺伝子改変マウスの平均個数の差を、ｔ検定等の統計学的手法で検定すればよい。上記遺伝子改変マウスは、数ヶ月齢以上、好ましくは６か月齢以上、７か月齢以上、８か月齢以上、好ましくは９か月齢以上、１０か月齢以上、１１か月齢以上又は１２か月齢以上で上述の病理学的特徴が現れる。

　また、本実施の形態に係る遺伝子改変マウスは、下記実施例２～４に示すように運動失調症状を呈する。より詳細には、運動失調症状は、例えば、野生型と比較して有意な運動機能の低下、平衡感覚の低下、運動協調の低下及び歩行障害が見られる。また、上記遺伝子改変マウスは、野生型と比較して自発的活動性が向上する。

　上記遺伝子改変マウスの用途は特に限定されない。上記病理学的特徴及び運動失調症状から、上記遺伝子改変マウスは、神経変性疾患、特にはＳＣＤ、ＳＣＡ及びＳＣＡ４２型のモデルマウスとして好適である。例えば、上記遺伝子改変マウスは、ＳＣＤ及びＳＣＡ、特にＳＣＡ４２型の発症メカニズムの解明及び病態の理解に有用である。また、Ｃａｖ３．１はＴ型カルシウムチャネルであるため、プルキンエ細胞の変性におけるＣａ２＋シグナルパスウェイの役割の解明に有用である。

　上記遺伝子改変マウスは、自発的活動性が向上するため、過活動のモデルマウスとしても用いることができる。過活動は自閉症等の症状の１つであるため、当該遺伝子改変マウスは、自閉症等のメカニズムの解明及び病態の理解にも有用である。

　上記遺伝子改変マウスの用途として、好ましくはＳＣＤ、ＳＣＡ及びＳＣＡ４２型（ＳＣＤ等）の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法が挙げられる。上記遺伝子改変マウスを用いる当該スクリーニング方法は、例えば、遺伝子改変マウスに被験物質を投与する投与ステップと、該遺伝子改変マウスのＳＣＤ等に関する指標を評価する評価ステップと、を含む。投与ステップでは、１０か月齢以上の遺伝子改変マウスを用いるのがＳＣＤ等の病理をより忠実に再現する点で好ましい。

　上記遺伝子改変マウスへの被験物質の投与では、化合物、抗体、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸等の被験物質を、上記遺伝子改変マウスに投与する。投与の方法は、特に限定されないが、被験物質に適切な方法を選択するのが好ましい。投与の方法としては、例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈注射及び皮下注射等が挙げられる。被験物質の投与は、単回でもよいし、複数回であってもよい。被験物質の濃度は、被験物質の種類によって適宜決定すればよい。また、被験物質の濃度を数段階希釈した複数の濃度の被験物質を投与してもよい。

　評価ステップにおける指標としては、プルキンエ細胞の形態、プルキンエ細胞の密度及び樹状突起スパインの密度等の病理評価、並びに運動失調指標及び行動指標等が挙げられる。評価ステップでは、被験物質を投与された上記遺伝子改変マウスと、被験物質を投与されなかった上記遺伝子改変マウスとの間で、ＳＣＤ等に関する指標を比較してもよい。指標によってＳＣＤ等を改善した被験物質をＳＣＤ等の治療薬又は予防薬の候補として選抜すればよい。

　以上詳細に説明したように、上記遺伝子改変マウスは、下記実施例に示すように、その病理学的特徴からヒトのＳＣＤ及びＳＣＡ、特にはＳＣＡ４２型の病態をより忠実に再現できる。

　なお、上記遺伝子改変マウスの一部、例えば、臓器、組織及び細胞もＳＣＤ等の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法に使用することができる。

　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

　（実施例１：ノックインマウスの作製）
　Ｃａｃｎａ１ｇ遺伝子に変異を有するノックインマウスを以下のように作製した。図２は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＣａｃｎａ１ｇ遺伝子のエクソン２９の塩基配列の一部を示す。ノックインマウスでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、図２において矢印で示される塩基Ｇ（コーディング鎖）及びＣ（非コーディング鎖）をそれぞれＡ及びＴに置換した（Ｅｎｓｅｍｂｌｅ：ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０７７８９、ｃＤＮＡ：５１４７Ｇ＞Ａ、タンパク質：Ｒ１７１６Ｈ）。図３には、置換する塩基を含む領域の野生型マウスのアレル及びノックインマウスのアレルを示す。野生型マウスではアルギニンをコードする「ＣＧＣ」の「Ｇ」が、ノックインマウスではヒスチジンをコードする「ＣＡＣ」の「Ａ」に置換される。

　ｓｓＯＤＮとして、置換後の塩基と、当該塩基の５’末端側に隣接する６０塩基及び当該塩基の３’末端側に隣接する５９塩基のアーム配列を有する計１２０塩基のオリゴＤＮＡを用いた。置換する塩基から３’末端側には図２に示すようにＰＡＭ配列が存在する。当該ＰＡＭ配列にＣａｓ９ヌクレアーゼが結合する。

　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター及びｓｓＯＤＮを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵に注入し、相同組換えにより変異を導入した。常法に従って、受精卵を偽妊娠ＩＣＲマウスに移植し、ノックインマウスを得た。

　得られたヘテロ接合体（＋／Ｒ１７１６Ｈマウス）及びホモ接合体（Ｒ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウス）のゲノムにおけるＣａｃｎａ１ｇ遺伝子の塩基配列は、ＰＣＲ及びＲＦＬＰで確認した。ＰＣＲに用いたフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号５及び６に示す。

　（実施例２：ロタロッドテスト）
　ノックインマウスの運動機能を評価するために、加速ロタロッドテストを行った。２日間のトレーニング後、１日４回の試行を４日間連続で行った。１回目の試行をすべてのマウスで行った後、２回目の試行を行い、同じマウスにおける試行間隔を２０分以上とした。５分間で５ｒｐｍから４０ｒｐｍまで一定に回転台を加速させ、マウスが回転台から落ちるまでの時間を測定した。評価の対象は、６か月齢と１４か月齢の野生型マウス（＋／＋マウス）とＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスとした。＋／＋マウスとＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスとで、４日目の平均値を比較した。

　６か月齢及び１４か月齢での回転台から落ちるまでの時間の平均値を、それぞれ図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す。６か月齢では、＋／＋マウスとＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスとの間に有意な差は見られなかった。一方、１４か月齢では、Ｒ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスにおいて回転台から落ちるまでの時間が有意に短くなった。この結果より、変異によって運動機能が低下することが示された。

　（実施例３：ビームウォーキングテスト）
　平衡感覚及び運動協調を評価するために、ビームウォーキングテストを行った。直径１ｃｍ、長さ９０ｃｍの木製の梁を地面から５０ｃｍの高さに設置した。スタート地点を照明装置で明るくし、ゴール地点に黒いホームケージを置いた。マウスがスタート地点からゴール地点に向かって梁の上を移動し、ゴール地点に辿り着くまでの時間を測定した。一日目に２回のトレーニングを行い、２日目に２回試行を行い、最も短い時間を記録値とした。評価の対象は、６か月齢と１０か月齢の＋／＋マウス、＋／Ｒ１７１６Ｈマウス及びＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスとした。

　６か月齢及び１０か月齢でのゴール地点に辿り着くまでの時間の平均値を、それぞれ図５（Ａ）及び図５（Ｂ）に示す。６か月齢では、＋／＋マウス、＋／Ｒ１７１６Ｈマウス及びＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスの間に有意な差は見られなかった。一方、１０か月齢では、＋／＋マウスと比較して、Ｒ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスにおいてゴール地点に辿り着くまでの時間が長くなる傾向が見られた。この結果より、変異によって平衡感覚及び運動協調が低下することが示された。

　（実施例４：フットプリントテスト）
　歩き方を観察するために、フットプリントテストを行った。マウスの前足に赤の墨、後ろ足に黒の墨を塗布し、半紙を敷いた長さ１１０ｃｍの筒の中をマウスに歩かせ、図６（Ａ）に示すように、足跡から歩幅を測定した。観察の対象は、１２か月齢の＋／＋マウス及びＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスとした。

　マウスの歩幅の平均値を、図６（Ｂ）に示す。＋／＋マウスと比較して、Ｒ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスにおいて歩幅が短くなる傾向が見られた。この結果より、変異によって歩行障害が生じていることが示唆された。

　（実施例５：オープンフィールドテスト）
　行動解析装置ＳＣＡＮＥＴ（メルクエスト社製）を用いてオープンフィールドテストを行った。探索行動を比較するため、トレーニングをせずに、行動解析装置にマウスを置いたと同時に測定を開始し、１０分毎３０分間の総移動距離を測定した。総移動距離は、ｘ軸及びｙ軸がそれぞれ６ｍｍ幅のセンサを横切った回数として評価した。評価の対象は、６か月齢の＋／＋マウス、＋／Ｒ１７１６Ｈマウス及びＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスとした。

　総移動距離の平均値を図７に示す。＋／＋マウスと比較して、Ｒ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスにおいて移動距離が有意に長くなった。この結果より、変異によって過活動傾向があることが示唆された。

　（実施例６：プルキンエ細胞の密度）
　１０か月齢の＋／＋マウス及びＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスにおいてプルキンエ細胞の密度を測定し比較した。マウスをソムノペンチル（１．５ｍｇ／ｇ体重）の腹腔内注射により麻酔した。４％ＰＦＡを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いた心臓内灌流によって、全身を灌流固定した。１０％、２０％及び３０％スクロースにより、固定した脳を徐々に脱水させ、ＯＣＴ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ中で凍結させた。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ　ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて１０μｍの脳切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた。脳切片に対してＨ＆Ｅ染色を行い、顕微鏡下で小脳プルキンエ細胞の個数を計数した。プルキンエ細胞の個数を細胞体の中心を結んだ線の長さで除してプルキンエ細胞の密度を測定した。小脳切片の撮像には光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）を用いた。

　図８（Ａ）は、＋／＋マウス及びＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスについて、顕微鏡下で撮像した小脳切片を示す。図８（Ｂ）に示すように、＋／＋マウスと比較して、Ｒ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスにおけるプルキンエ細胞の密度は有意に小さかった。

　（実施例７：プルキンエ細胞樹状突起スパインの密度）
　６～７か月齢の＋／＋マウス及びＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスにおいてプルキンエ細胞樹状突起スパインの密度を測定し比較した。マウスにＣＯ_２ガスを吸入させて麻酔した後、マウスより脳を採取し、ビブラトームにより２５０μｍの小脳スライスを作製した。パッチピペットにより、プルキンエ細胞の細胞体にｎｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎを注入し、小脳スライスを４％ＰＦＡで固定後、ａｎｔｉ－ｂｉｏｔｉｎａ　Ａｌｅｘａ４８８により染色し、顕微鏡下で観察した。樹状突起スパインの撮像にはＺｅｉｓｓ社製のコンフォーカル顕微鏡（ＬＳＭ８００　Ａｉｒｙｓｃａｎ）を用いた。対物レンズには６３ｘｏｉｌを用いた。樹状突起スパインの個数はＩｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社製）を用いて計数した。

　図９（Ａ）は、＋／＋マウス及びＲ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスについて、撮像した樹状突起スパインを示す。図９（Ｂ）に示すように、＋／＋マウスと比較して、Ｒ１７１６Ｈ／Ｒ１７１６Ｈマウスにおける樹状突起スパインの密度は有意に小さかった。

　上記実施例に係るノックインマウスは、ヒトにおけるＳＣＤの運動失調症状を呈し、小脳のプルキンエ細胞の変性の兆候を示した。

　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

　本出願は、２０１８年２月２６日に出願された、日本国特許出願２０１８－３１７０６号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１８－３１７０６号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

　本発明は、ヒトの病態を再現するモデル動物、特にはＳＣＤのモデル動物に好適である。

Claims

　相同染色体の一方又は両方のＴ型カルシウムチャネルＣａｖ３．１をコードする遺伝子において、該Ｃａｖ３．１におけるリピートＩＶのＳ４領域内のＮ末端からＣ末端に向かってＡｒｇ－Ｉｌｅ－Ｍｅｔ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ａｒｇで示されるアミノ酸配列のＮ末端から７個目のアミノ酸であるアルギニンをコードするトリプレットがアルギニン以外のアミノ酸をコードするトリプレットに置換されている、
　遺伝子改変非ヒト動物。
　前記アルギニン以外のアミノ酸は、
　ヒスチジンである、
　請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
　プルキンエ細胞の密度が、
　野生型と比較して有意に小さい、
　請求項１又は２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
　プルキンエ細胞の樹状突起スパインの密度が、
　野生型と比較して有意に小さい、
　請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
　マウスである、
　請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
　脊髄小脳変性症モデル動物である、
　請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
　請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を用いる、
　脊髄小脳変性症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。