JP2018068136A - パーキンソン病モデル非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
Description
かかる知見に基づき、さらに検討した結果、当該パーキンソン病モデル動物に被験物質を投与した場合に、運動機能、レビー小体様の構造の凝集体及び黒質緻密部のドーパミン細胞から選ばれる1以上を指標とすれば、パーキンソン病治療薬のスクリーニングが可能になることを見出し、本発明を完成した。
(1)加齢に伴い野生型動物に比して運動機能が低下する
(2)ドーパミン細胞にレビー小体様の構造の凝集体を有する
(3)黒質緻密部において野生型動物に比してドーパミン細胞が減少している
〔2〕Creリコンビナーゼ標的配列loxPに前後を挟まれたatg7遺伝子をホモ接合型で有し、さらにチロシン水酸化酵素(TH)プロモーターにより発現制御されたcre遺伝子を有するものである〔1〕記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
〔3〕非ヒト動物が齧歯動物である〔1〕又は〔2〕記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
〔4〕非ヒト動物がマウスである〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
〔5〕Creリコンビナーゼ標的配列loxPに前後を挟まれたatg7遺伝子をホモ接合型で有する非ヒト動物をTHプロモーターにより発現制御されるcre遺伝子を有する非ヒト動物と交配させることを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物の作製方法。
〔6〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、運動機能、レビー小体様の構造の凝集体及び黒質緻密部のドーパミン細胞から選ばれる1以上を測定することを特徴とするパーキンソン病治療薬のスクリーニング方法。
「ドーパミン神経においてatg7遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物」とは、ドーパミン細胞において染色体上のatg7遺伝子が例えば破壊又は除去されてノックアウトされ、E1様活性化酵素として機能するタンパク質を産生することができないか或いは遺伝子産物が得られてもそのタンパク質がE1様活性化酵素として機能しない非ヒト動物をいう。具体的には、ドーパミン細胞のみでatg7遺伝子のプロモーター領域又はコード領域の塩基配列の欠失、挿入又は置換等によってその機能が破壊された非ヒト動物等が挙げられる。すなわち、「ドーパミン神経においてatg7遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物」とは、atg7遺伝子を遺伝子工学的な手法を用い改変(操作)して作出された、ドーパミン細胞特異的なatg7遺伝子発現不全非ヒト動物、すなわちドーパミン神経特異的オートファジー機能不全非ヒト動物を意味する。なお、当該非ヒト動物のドーパミン神経以外の組織でのatg7遺伝子の発現は、野生型非ヒト動物における発現と同等である。
リコンビナーゼと標的配列の組み合わせとしては、CreリコンビナーゼとloxP配列(Cre−loxPシステム)又はFLPリコンビナーゼとFRT配列(FLP−FRTシステム)等が挙げられる。このうち、Cre−loxPシステムは、バクテリオファージP1の有する部位特異的組換えシステムを利用したもので、loxP配列と称されるバクテリオファージP1のゲノム由来の34塩基からなるDNA配列に対し、DNA組換え酵素であるCreリコンビナーゼが働き、loxP配列同士の間で部位特異的組換えを生じる。FLP−FRTシステムは、出芽酵母由来のFRT配列にFLPリコンビナーゼが働き、FRT配列同士の間で部位特異的組換えを生じる。Creリコンビナーゼ又はFLPリコンビナーゼを発現するためのプロモーターを選択することにより、標的遺伝子の改変を組織又は時期特異的にコントロールできるため、これらシステムはコンディショナルノックアウト法に好適に利用される。
まず、マウスatg7遺伝子の機能を欠損させるための相同組換え用ターゲティングベクターを作製する。ターゲティングベクターは、データベース等より得た塩基配列情報をもとに、欠失させるatg7遺伝子の領域を決め、その上流及び下流にリコンビナーゼ標的配列を同じ向きで挿入し、さらにその上流及び下流に欠失させる領域の両端のゲノム領域(1〜8kb程度)を相同組換えに必要な相同領域として配置して設計すればよい。欠失させるatg7遺伝子の領域は、特に制限されず、atg7遺伝子の全部でも一部でもよいが、一部を用いる場合、機能ドメインを含むエキソン等、その領域が失われると機能する遺伝子産物が得られなくなる領域が好ましい。例えば、活性部位のシステイン残基が存在するエキソン14を含む領域が挙げられる。このとき、リコンビナーゼを発現しない細胞では、正常な遺伝子産物が得られるようにする点に留意する。相同領域については、相同組換え効率、相同組換えを起こした細胞の同定方法等を考慮して設計するのが好ましい。
Cre−loxPシステムを利用する場合、ターゲティングベクターは、例えば、同じ向きのloxP配列で前後を挟まれたatg7遺伝子の全部又は一部を含み、その上流及び下流に相同領域を含む。Creリコンビナーゼ発現下では、染色体上のloxP配列で挟まれたatg7遺伝子は切り出され、正常な遺伝子産物が得られなくなる。
例えば、J1株のマウスES細胞とC57BL/6J系の宿主胚を用いて得られたキメラマウスをC57BL/6J系と交配する場合は、娩出される産仔は、キメラマウスの生殖細胞が相同組換えES細胞に由来していれば該ES細胞が由来するマウスと同じ野生色(アグーチ)を呈し、宿主胚に由来していれば該宿主胚が由来するマウスと同じ黒色を呈する。
ドーパミン細胞特異的にリコンビナーゼを発現するマウスは、例えば、ドーパミン細胞特異的に作用するプロモーターの下流にリコンビナーゼをコードする遺伝子を発現可能に連結したトランスジーンを用いて、公知のトランスジェニックマウスを作製する方法により作製することができる。
Cre−loxPシステムを用いる場合、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、Creリコンビナーゼをコードするcre遺伝子を用いればよい。cre遺伝子としては、loxP配列を認識してloxP配列に挟まれたDNA配列を切り出すことができるタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されないが、好ましくはバクテリオファージP1由来のcre遺伝子が用いられる(GenBank accession No.X03453)。
本発明のドーパミン神経においてatg7遺伝子の機能が欠損したマウスは、(1)で得られたリコンビナーゼ標的配列で前後を挟まれたatg7遺伝子をホモ接合型で有するマウスと、(2)で得られたドーパミン細胞特異的にリコンビナーゼを発現するマウスを交配することで得ることができる。例えば、(1)のAtg7 F/Fマウスと(2)のTH−Cre(+/−)マウスを交配する場合、得られるF1動物はAtg7 F/+:TH−Cre(+/−)、あるいはAtg7 F/+:TH−Cre(−/−)である。このF1動物同士を交配すれば、F2動物の一部がAtg7 F/F:TH−Cre(+/−)となる。
Atg7 F/F:TH−cre(+/−)マウスは、THプロモーターの働きにより、ドーパミン細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現し、当該Creリコンビナーゼにより染色体上のatg7遺伝子が切り出されるため、ドーパミン神経においてatg7遺伝子の機能が欠損したマウスとなる。当該マウスは、ドーパミン神経特異的にオートファジーを欠損する。以下、Atg7 F/F:TH−cre(+/−)マウスをAtg7 F/F:TH−creマウスとも称す。
(1)加齢に伴い野生型動物に比して運動機能が低下する
(2)ドーパミン細胞にレビー小体様の構造の凝集体を有する
(3)黒質緻密部において野生型動物に比してドーパミン細胞が減少している
(1)〜(3)の性質はパーキンソン病に特徴的な運動障害と2つの病理像を再現するものであることから、本発明の非ヒト動物は、パーキンソン病モデル非ヒト動物として有用である。
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与した場合に、野生型非ヒト動物と比較した時の運動機能低下が改善される、凝集体形成が抑制される及び/又は野生型非ヒト動物と比較した時のドーパミン細胞減少が抑制されれば、その被験物質はパーキンソン病治療薬である。「野生型非ヒト動物」は、上述の通りである。
あるいは、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与した場合に、被験物質を投与していない本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較して、運動機能低下が改善される、凝集体形成が抑制される及び/又はドーパミン細胞減少が抑制されれば、その被験物質はパーキンソン病治療薬である。比較の明確さの点で、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物をコントロールとするのが好ましい。
ドーパミン細胞特異的に作用するTHプロモーターの下流にリコンビナーゼをコードするマウスとして、Savitt et al., The Journal of Neuroscience, Vol.25, No. 29, 2005, 6721-6728に記載のTH−Creマウスを用いた。当該マウスは、リニアライズされたTH−Creベクターを胚形成初期のB6/SJLF2胚にマイクロインジェクションすることにより作製した。THプロモーターとして既にクローニング済みであったpTH9000プラスミド(Min et al., Brain Res Mol Brain Res, Vol. 27, 1994, 281-289)からプロモーター部分を切り出し、pSP73bベクターの上流にクローニングし、その下流にCreをコードするカセットを連結し、さらに下流にはポリAシグナルを配置した。インジェクションによって生まれた5ラインのマウスの尾尻からDNAを抽出し、Cre配列上に設定したプライマーによってPCRを行い、予想されるPCR断片(300bp)を検出したラインのマウスをTH−Creマウスとして採用した。マウスは病原体の外部から侵入を防ぐ陽圧の飼育室にて一定温度、12時間サイクルの明暗が設定された環境にて系統維持した。
リコンビナーゼ標的配列で前後を挟まれたatg7遺伝子をホモ接合型で有するマウスとして、Komatsu et al., The Journal of Cell Biology, Vol. 169, No. 3, 2005, 425-434に記載のAtg7 F/Fマウスを用いた。当該マウスの作製では、リニアライスされたターゲットベクターをエレクトロポレーション法によってTT2 ES細胞に導入し、相同組み換えを誘導した。PCRにて組み換えを確認後、8細胞期胚にマイクロインジェクションを行うことによりキメラマウスを作製した。ターゲットベクターとしてブルースクリプトベクターを用いた。Atg7遺伝子のエキソン14をバクテリオファージ由来のloxP配列で挟んだDNA断片を作製し、同ベクターにクローニングし、同エキソンの上流と下流の相同配列をloxP配列の上流と下流にクローニングし配置した。さらに5’側loxP配列の直前にはneo−poly Aカセットをクローニングし、相同組み換えが起こったES細胞をG418にてセレクションした。インジェクションによって生まれたキメラマウスはC57BL/6Jマウスと掛け合わせ、最終的にサザンブロティングにより予想された相同組み換え(7.5kbバンド)を確認したものについてAtg7 F/Fマウスとして交配に用いた。マウスは病原体の外部から侵入を防ぐ陽圧の飼育室にて一定温度、12時間サイクルの明暗が設定された環境にて飼育した。Atg7 F/Fマウスを実施例1にて作製したTH−Creマウスと交配した結果としてAtg 7 F/+とAtg 7 F/+:TH−Creを得た。さらにAtg 7 F/+とAtg 7 F/+:TH−Creを掛け合わせることにより、Atg 7 F/FあるいはAtg 7 F/F: TH−Creを作製した。Atg 7 F/F: TH−Creマウスは上述のごとくドーパミン細胞特異的にAtg7遺伝子機能が欠損したマウスとして維持管理した。Atg7 F/Fはそれに対する対照として同様に維持管理した。一定の週齢が経過後実験を行った。
ドーパミン神経においてatg7遺伝子の機能が欠損したマウスについて、ロタロッド試験により、運動機能の評価を行った。
Atg7 F/F:TH−Creマウス又は比較対照としてのAtg7 F/Fマウスを直径3cmのマウス用回転ローラー上で静置させ、45rpm/300secの一定加速度で回転させた際の落下に要するまでの時間(落下潜時)を測定した。結果を図1に示す(縦軸:落下潜時、横軸:週齢、P**<0.01)。Atg7 F/F:TH−Creマウスは、Atg7 F/Fマウスに比して、加齢に伴い落下潜時が短縮傾向にあり、運動機能の低下が見られた。運動機能の低下は、100週齢以降、特に120週齢で顕著に認められた。
ドーパミン神経においてatg7遺伝子の機能が欠損したマウスについて、ビーム課題により、運動機能の評価を行った。
Atg7 F/F:TH−Creマウス又は比較対照としてのAtg7 F/Fマウスを、幅12mmのバランスビーム上で80cmの距離歩行させ、歩行状態を観察した。結果を図2に示す。Atg7 F/F:TH−Creマウスは、後脚を頻回にすべらせて歩行するのが観察された。
120週齢のAtg7 F/F:TH−Creマウスのドーパミン細胞を電子顕微鏡で観察した。具体的には、マウスを5% グルタールアルデヒド/0.1(mol/L) phosphate bufferで環流固定後、脳を取り出し中脳黒質部分を切り出し数ミリ角に細切した。切片はエポン樹脂に埋め込み固定後、70nmの超薄切片を作製した。観察は日立HT7700電子顕微鏡にて行った。結果を図3に示す。ドーパミン細胞の細胞質に球形の凝集体が観察された(図3a)(スケールバー:5μm)。図3b(スケールバー:2μm)は凝集体を拡大したものであり、凝集体内部には繊維状の構造も確認された。
70週齢のAtg7 F/F:TH−Creマウス2個体又は比較対照としてのAtg7 F/Fマウスを4% パラフォルムアルデヒドで環流固定し48時間後20% スクロースに置換した。脳はドライアイスにて急速凍結後、クライオスタットにて30μm厚の浮遊切片を作製した。中脳黒質部分を選択し、一次抗体としてp62(guinea pig)とシヌクレイン(rabbit)に対する抗体を4℃にて24時間反応後、抗guinea pig蛍光二次抗体(Alexa 594),抗rabbit蛍光二次抗体(Alexa 488)を室温にて1時間反応させた。さらにDAPIにより核染色を行い0.1% Tween20/PBSで洗浄後、蛍光マウント剤にて封入した。観察はZeissの共焦点レーザー顕微鏡(LSM710)にて行った。結果を図4に示す。Atg7 F/F:TH−Creマウスでは、p62とシヌクレインが共局在することが確認された一方、Atg7 F/Fマウスでは染色がみられなかった。したがって、Atg7 F/F:TH−Creマウスでは、p62とシヌクレインを含む凝集体の存在が示唆された。
120週齢のAtg7 F/F:TH−Creマウス又は比較対照としてのAtg7 F/Fマウスを4% パラフォルムアルデヒドで環流固定後、48時間後に20% スクロースに置換した。中脳黒質部分を細切しパラフィン包埋後4μm厚のパラフィン切片を作製した。一次抗体(チロシン水酸化酵素(TH)rabbit抗体)を4℃で一晩反応後、DAB染色にて検出し細胞数を測定した。具体的には、黒質を内側部(SNm)、外側部(SNI)、緻密部(SNc)に分割し、単位面積当たりの細胞数を集計し、その平均値をstudent’s−t検定にて比較した。結果を図5に示す(P**<0.01)。Atg7 F/F:TH−Creマウスでは、パーキンソン病におけるのと同様に、黒質緻密部のドーパミン細胞数が、Atg7 F/Fマウスに比して有意に減少していた。
Claims (6)
- ドーパミン神経においてatg7遺伝子の機能が欠損したパーキンソン病モデル非ヒト動物であって、下記の(1)〜(3)の全ての性質を有することを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物。
(1)加齢に伴い野生型に比して運動機能が低下する
(2)ドーパミン細胞にレビー小体様の構造の凝集体を有する
(3)黒質緻密部において野生型に比してドーパミン細胞が減少している - Creリコンビナーゼ標的配列loxPに前後を挟まれたatg7遺伝子をホモ接合型で有し、さらにチロシン水酸化酵素(TH)プロモーターにより発現制御されたcre遺伝子を有するものである請求項1記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
- 非ヒト動物が齧歯動物である請求項1又は2記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
- 非ヒト動物がマウスである請求項1〜3のいずれか1項記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
- Creリコンビナーゼ標的配列loxPに前後を挟まれたatg7遺伝子をホモ接合型で有する非ヒト動物をTHプロモーターにより発現制御されるcre遺伝子を有する非ヒト動物と交配させることを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物の作製方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、運動機能、レビー小体様の構造の凝集体及び黒質緻密部のドーパミン細胞から選ばれる1以上を測定することを特徴とするパーキンソン病治療薬のスクリーニング方法。
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