JP7286139B2 - 円形脱毛症モデル動物 - Google Patents
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Description
そこで、本発明者らは、CCHCR1タンパク質に注目し、かかる遺伝子のノックアウトマウスを作製したところ、全く意外にもCCHCR1遺伝子改変マウスとは異なり、CCHCR1遺伝子ノックアウトマウスは、胎生期及び第一期の毛成長が正常である一方、ストレス負荷により初めて円形脱毛症を発症して円形脱毛症に特徴的な症状を呈し、発症段階を含めたヒトの円形脱毛症の病態をよりよく再現できることを見出し、本発明を完成した。
〔2〕〔1〕に記載の円形脱毛症モデル非ヒト動物に被験物質を投与することを特徴とする、円形脱毛症発症予防又は治療薬のスクリーニング方法。
リコンビナーゼと標的配列の組み合わせとしては、CreリコンビナーゼとloxP配列(Cre-loxPシステム)又はFLPリコンビナーゼとFRT配列(FLP-FRTシステム)等が挙げられる。このうち、Cre-loxPシステムは、バクテリオファージP1の有する部位特異的組換えシステムを利用したもので、loxP配列と称されるバクテリオファージP1のゲノム由来の34塩基からなるDNA配列に対し、DNA組換え酵素であるCreリコンビナーゼが働き、loxP配列同士の間で部位特異的組換えを生じる。FLP-FRTシステムは、出芽酵母由来のFRT配列にFLPリコンビナーゼが働き、FRT配列同士の間で部位特異的組換えを生じる。
Cre-loxPシステムを利用する場合、ターゲティングベクターは、例えば、同じ向きのloxP配列で前後を挟まれたCCHCR1遺伝子の全部又は一部を含み、その上流及び下流に相同領域を含む。
該モデル非ヒト動物に被験物質を投与した場合に、投与後の脱毛巣面積が投与前の脱毛巣面積に比して小さくなれば、好ましくは投与後の脱毛巣面積が投与前の脱毛巣面積に比して50%以下になれば、より好ましくは投与後に脱毛がみられなくなれば、その被験物質は、円形脱毛症の治療薬であると判定できる。かかる治療薬は、円形脱毛症に罹患していない対象や罹患する可能性が高い対象などに対する円形脱毛症の発症予防薬としても用いられる。また、かかる研究は、円形脱毛症に罹患していない対象や罹患する可能性が高い対象などに対する円形脱毛症の予防開発法としても用いられる。
(1)ターゲティングベクターの構築
マウスC57BL/6N由来RENKA ES細胞(Mishina M. et al. Neurosci Res. 2007, 58(2): 105-12)のゲノムDNAを鋳型として、マウスCCHCR1遺伝子(配列番号1)のエクソン2及び3を含む2.8kbのDNA断片を、配列番号2及び3のプライマーセットを用いてPCRにて増幅した。同様に、エクソン4を含む0.9kbのDNA断片を、配列番号4及び5のプライマーセットを用いて、エクソン5-10を含む5.0kbのDNA断片を、配列番号6及び7のプライマーセットを用いてPCRにて増幅した。なお、各プライマーには、クローニングのための制限酵素認識サイトを含む。
XhoI_5_af_5: 5'-ctcgagcacaccacccacattcctgtaag-3'(配列番号2)
HindIII_5_ar_2: 5'-aagcttacctaagggctagtgagatcagg-3'(配列番号3)
EcoRI_F_af_1: 5'-gaattcctgagcccagaaagtggatgac-3'(配列番号4)
EcoRI_F_ar_2: 5'-gaattcgctatgggcgccattcatgag-3'(配列番号5)
XhoI_AscI_3_af_1: 5'-tcgagggcgcgccgcctgcatgggacacacttaatg-3'(配列番号6)
PmeI_3_ar_5: 5'-gtttaaacctgagcctgatccagctccatc-3'(配列番号7)
(各下線部は、制限酵素認識サイトを示す。)
ポジティブ選択用マーカーとしてPGKプロモーターでドライブされるネオマイシン耐性遺伝子の両端にFRT配列を有する遺伝子カセット(PGK_neoカセット)と、ネガティブ選択用マーカーとしてMC1プロモーターでドライブされるDT-A遺伝子を有する遺伝子カセット(MC1_DTAカセット)と、2つのloxP配列とを含むベクターのloxP配列間に、上記で増幅した0.9kbのDNA断片をクローニングした。次いで、上記で増幅した2.8kbのDNA断片と5.0kbのDNA断片も同ベクターにクローニングした。最終的に、MC1_DTAカセット、2.8kbの5’相同領域、第一のloxP配列、0.9kbのfloxゲノム領域、PGK_neoカセット、第二のloxP配列、及び5.0kbの3’相同領域をこの順で含むターゲティングベクターを得た。
(1)で構築したターゲティングベクターを1本鎖化し、RENKA ES細胞にエレクトロポレーション法にて導入した。ジェネティシン(Invirogen製)を用いて細胞を選抜し、ジェネティシンに耐性を有するクローンを単離した。単離クローンのDNAと配列番号8及び9のプライマーセットを用いたPCRにて、相同組換えを生じたクローンをスクリーニングした。
sc_5AF2: 5’-caactgaggcccgttacagag-3’(配列番号8)
neo_108r: 5’-cctcagaagaactcgtcaagaag-3’(配列番号9)
PCR陽性ESクローンを培養した。該クローンよりDNAを抽出し、配列番号8及び9のプライマーセット(5’領域増幅用)、配列番号10及び11のプライマーセット(3’領域増幅用)、並びに配列番号12及び13のプライマーセット(第一のloxP領域増幅用)を用いたPCRにてさらに解析した。
sc_3AR4: 5’-cgaggctcttccaggcaacag-3’(配列番号10)
neo_100: 5’-atcaggacatagcgttggctac-3’(配列番号11)
lox_5_fw_6: 5’-tagcctctgctatgtactg-3’(配列番号12)
lox_5_ar_1: 5’-aagtccctactaagcacacgtgg-3(配列番号13)
これらのクローンで相同組換えが正しく生じたことは、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしたゲノムサザンハイブリダイゼーションによっても確認した。
アグリゲーション法により、(2)で得られた相同組換えES細胞クローンとICRマウス由来8細胞期胚を融合させてキメラマウスを作製した。RENKA ES細胞寄与率の高いキメラマウスをC57BL/6Nマウスと交配し、germline transmissionを生じたCCHCR1遺伝子ヘテロfloxマウスを得た。目的アレルの存在は、配列番号8及び9のプライマーセット、並びに配列番号12及び13のプライマーセットを用いたPCRにて確認した。
次いで、CCHCR1遺伝子ヘテロfloxマウスを、B6;CBA-Tg(CAG-Cre)47Imegマウス(Araki K. et al. Nucleic Acids Res. 2002, 30(19): e103)と交配し、エクソン4及びPGK_neoカセットを欠失させた。エクソン4を欠失したCCHCR1遺伝子ヘテロノックアウトマウスは、配列番号14及び15のプライマーセットを用いたPCRにて同定した。
5A-F2: 5’-ctcacctagaattcagacatcc-3’(配列番号14)
3A-R1: 5’-agttgcaactggctatagctgc-3’(配列番号15)
かくして得られたCCHCR1遺伝子ヘテロノックアウトマウス同士を交配し、CCHCR1遺伝子ホモノックアウトマウスを得た。該マウスの遺伝子型は、配列番号14及び15のプライマーセットを用いたPCRにて判定した。CCHCR1遺伝子ホモノックアウトマウスは、胎生致死ではなく、また胎生期及び第一期毛成長は正常であった。
なお、CCHCR1遺伝子ホモノックアウトマウスの作出は、株式会社トランジェニックにて実施した。
(1)WAS試験
本試験には、6-8週齢の実施例1で作出したCCHCR1遺伝子ホモノックアウトマウス(n=3)と、対照として6-8週齢の野生型マウス(n=3)を用い、各マウスについてWAS試験を行った。WAS試験は、プラスチックコンテナにプラットフォーム(高さ11cm、直径7cm)を設置し、コンテナ内をプラットフォームの高さの1cm下まで滅菌水で満たし、該プラットフォームの中央にマウスを2時間置くことで行った。この操作を週に5回、2週間実施した。
試験実施8週間後、マウスの外観を肉眼観察し、さらに毛の形態学的特徴をダーモスコピーを用いて観察した。また、患部の毛をゆっくり引っ張る牽引試験(hair pull test)を行った。さらに、試験実施18週間後、マウスを再度肉眼観察及びダーモスコピーを用いて観察した。
WAS試験実施8週間後のノックアウトマウスの毛包のパラフィン包埋切片を調製し、ImmPRESS REAGENT(ベクターラボラトリー製)を用い、製品添付のマニュアルに従って、CD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球について免疫組織染色を行った。抗体としては、rabbit anti-CD4(ab183685、abcam)と、biotin anti-mouse CD8a(100703、BioLegend)を用いた。
WAS試験実施8週間後のノックアウトマウスの毛幹を走査電子顕微鏡で観察した。
WAS試験実施8週間後、野生型マウスに比べ、全てのノックアウトマウスでは、背部に局所的な脱毛が認められた(図1(A))。ダーモスコピー観察では、脱毛部に、折れた毛髪及び感嘆符毛という円形脱毛症に特徴的な表現型がみられた(図1(B))。牽引試験の結果、異栄養性成長期毛の増加がみられた。
免疫組織染色では、ノックアウトマウスの毛包の球周囲領域には炎症性リンパ球浸潤はほとんど認められなかったが、毛球にはCD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球浸潤が認められた(図3)。また、形質細胞の浸潤、毛包数の増加、成長期毛包の小型化がみられた。
走査電子顕微鏡観察では、全てのノックアウトマウスで、感嘆符毛(図4(A))と毛幹の異常(図5(B))が明らかとなった。
WAS試験実施18週間後、局在脱毛は、自然に回復した(図5(A))。脱毛後、1~3ヶ月で毛が再生し、その後同じ又は異なる領域に脱毛が生じた。
マウスの円形脱毛症の予後は、様々であり繰り返された。円形脱毛症を長期間維持したマウスでは、脱毛巣内の毛の再生は、円形脱毛症に特徴的な形で生じており、ダーモスコピー観察によると、新たに成長した毛は白く先細りしており、毛包の多くが退行期又は休止期にあった(図5(B))。
Claims (3)
- coiled-coil α-helical rod protein 1(CCHCR1)遺伝子が破壊又は除去されてCCHCR1タンパク質を産生しないか、CCHCR1遺伝子が破壊又は除去されてCCHCR1遺伝子産物がCCHCR1タンパク質として正常に機能しない円形脱毛症モデル非ヒト動物であって、円形脱毛症発症誘因因子の負荷により円形脱毛症を発症する円形脱毛症モデル非ヒト動物。
- 円形脱毛症発症誘因因子がストレスである、請求項1に記載の円形脱毛症モデル非ヒト動物。
- 請求項1又は2に記載の円形脱毛症モデル非ヒト動物に被験物質を投与することを特徴とする、円形脱毛症発症予防又は治療薬のスクリーニング方法。
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Alopecia areata susceptibility variant identified by MHC risk haplotype sequencing reproduces symptomatic patched hair loss in mice,bioRxiv preprint, 2018年,p.1-47,doi: https://doi.org/10.1101/308197 |
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