WO2019126960A1

WO2019126960A1 - 一种具有蛋白酶活性的多肽及其应用

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Publication number: WO2019126960A1
Application number: PCT/CN2017/118376
Authority: WO
Inventors: 李文奇; 施一公
Original assignee: 清华大学
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2019-07-04

Abstract

一种具有蛋白酶活性的多肽以及含有该多肽的编码核苷酸序列的构建体、载体、宿主细胞；还提供一种含有多肽的试剂盒以及该具有蛋白酶活性的多肽在切割融合蛋白标签中的应用。该多肽具有高度的酶切序列专一性，可以作为一种专门用于特异性切除重组表达蛋白的标签的工具酶。

Description

一种具有蛋白酶活性的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有蛋白酶活性的多肽及其在蛋白切割，尤其是融合蛋白标签切除中的用途。

背景技术

蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。同时将目的蛋白和融合标签进行融合表达是提高蛋白可溶性、增加蛋白表达量，并且有利于分离纯化的有效方法之一。融合蛋白在纯化后，通过蛋白酶的酶切而使目的蛋白和融合标签相分离而释放目的蛋白，因此随着蛋白标签的不断发展，切除蛋白标签的酶供不应求。

烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEV蛋白酶)，酶切位点Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln/Gly(Invitrogen–LifeTechnologies)，是来源于烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)的Nla蛋白酶经改进后的50kDa的蛋白酶，经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好。此蛋白酶常被用来切除纯化后融合蛋白的亲和标签。TEV蛋白酶具有很强的位点特异性，能够识别EXXYXQ(G/S)的七氨基酸序列(其中X是任意氨基酸)，最普通的是ENLYFQG(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)，其切割位点在谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间。蛋白酶在G/S(或P1)位点切割多种氨基酸序列，为切割后C端融合部分提供一个想要的N端氨基酸。在pH 7.0，30℃时可达到最佳活性，但在pH 5.5-8.5和4-30℃的广泛范围内TEV蛋白酶皆有活性，使得反应条件的选择可根据目的蛋白的情况而修改。切割后也很容易利用其N端的HQ标签进行TEV蛋白酶清除。也可以从固定在树脂上的融合蛋白切除掉目的蛋白。

PreScission(Amersham-Biosciences)是一种由人鼻病毒14型的3C蛋白酶和GST组成的融合蛋白。这种蛋白酶特异识别短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro中的Gln和Gly残基而进行切割，底物的识别和切割不仅依赖于融合蛋白的一级结构还依赖于融合蛋白的二级和三级结构。它可以特异性的将pGEX-6P系列等载体表达出的带有酶底物识别多肽序列融合蛋白的GST标签进行分离。

TAGZyme：His-tag removal by Exoproteolytic Digestion系统的主要组成部分，是一种外切蛋白酶——二肽氨基肽酶Ⅰ(dipeptidyl aminopeptidase I，DAPase)，如果表达的外源蛋白不含有外切酶识别的停顿位点，那么还需要联合使用谷氨酸循环转移酶(glutamine cyclotransferaseQcyclase)和焦谷氨酸氨基肽酶(pyroglutamyl amino peptidasepGAPase)(Intein Site dithiothreitol cleavage)。这些酶都经过重组可以通过Ni-NTA填料除去。应用TAGZyme系统的反应是十分灵敏的，不会存在有内切的现象，并且切割效率高，一些灵敏的蛋白可以在4℃进行反应，最大程度地防止了蛋白的降解。这个系列有两个载体，当外源蛋白不含有DAPase停顿位点时，可以使用TAGZyme pQE-1，它可以在外源蛋白前面人工加入停顿位点谷氨酸残基，之后利用Qcyclase将它转成焦谷氨酸成为一个外切酶的停顿位点。对于那些外源蛋白中已经含有外切酶停顿位点的可以选用TAGZyme pQE-2。

常见的酶与酶切位点还包括：凝血酶(Thrombin)：Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser(Amersham-Biosciences,Novagen,SIGMA,Roche)；凝血因子Xa(Factor Xa)：Ile-Glu/Asp-Gly-Arg/(Amersham-Biosciences,New England Biolabs,Roche)；肠激酶(Enterokinase)：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys/(New England Biolabs,Novagen,Roche)；HRV 3C Protease Novagen,Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro；SUMO Protease,recognize the tertiary structure of the ubiquitin-like(UBL)protein,SUMO。

然而，在使用中，以上所述的酶会出现价格昂贵、酶切实验操作难度较大、酶切特异性不高、酶切后残留部分酶、目的蛋白的收率常常较低的缺陷。

半胱天冬酶(Caspase)是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是活性位点都含有半胱氨酸，并特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。

半胱天冬酶是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子。该酶有多种亚型结构，其中最常见的是Caspase-2，Caspase-3型。人们对半胱天冬酶在凋亡中起重要作用的认识来自于一些实验观察：①天然和合成的半胱天冬酶抑制剂可以显著降低甚至阻断多种刺激引起的细胞凋亡；②一些半胱天冬酶基因敲除动物模型表现出明显的无凋亡现象；③半胱天冬酶催化裂解众多的细胞内功能蛋白分子，这些裂解的分子可以导致细胞凋亡。

半胱天冬酶除了在凋亡过程中起重要作用外，在炎症过程中也起重要作用。半胱天冬酶以酶原的形式被合成，并且在体内低水平组成性表达。外部或内部的刺激引起半胱天冬酶以瀑布式的活化方式活化。活化的半胱天冬酶催化裂解众多的效应分子，诱发细胞凋亡。

半胱天冬酶的含义表现在两个方面：①它们为半胱苷酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团；②它们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。Caspase一词是从Cysteine aspartic acid specific protease的字头缩写衍生而来，就反映了这个特征，而这种高度的特异性，在蛋白酶中是很少见的。由于这种特异性，使半胱天冬酶能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数(通常只有1个)位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。

由此，本发明提供了一种特异性识别特定序列的用于切割蛋白标签且具有蛋白酶活性的多肽。

发明内容

本发明提供了一种特异性识别特定序列的具有蛋白酶活性的多肽，用于重组蛋白标签的切割。该多肽具有高度酶切序列专一性，可以作为一种专门用于特异性切割重组表达蛋白标签的工具酶。

本发明的第一方面，涉及一种分离的核酸，所述的核酸选自下列组中的一种：

a)所述核酸编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

b)所述核酸序列如SEQ ID NO：2所示；

c)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：2所示的核酸序列杂交；

d)所述核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的核酸序列具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度；

a)、b)、c)或d)的全长互补链。

本发明的第二方面，涉及一种分离的多肽，其具有蛋白酶的活性，具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％同一性的氨基酸序列，例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％序列一致性的多肽。

优选的，所述多肽的氨基酸序列选自下列组中的一种：

a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

b)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列杂交，且具有蛋白酶的活性；

c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，所述氨基酸序列具有蛋白酶的活性；

d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸，且具有蛋白酶的活性；

e)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1的变体，其中所述变体与相应的氨基酸序列的差异不多于25个氨基酸，其中包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列或至少一个N-/C-末端延伸，且具有蛋白酶的活性。

优选的，所述多肽为果蝇来源的半胱天冬酶。

优选的，所述的氨基酸的差异为保守的氨基酸取代。

所述保守的氨基酸取代包括但不限于：丙氨酸与丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸或谷氨酸之间的替换；和/或，天冬氨酸与甘氨酸、天冬酰胺或谷氨酸之间的替换；和/或，丝氨酸与甘氨酸、天冬酰胺或苏氨酸之间的替换；和/或，亮氨酸与异亮氨酸或缬氨酸之间的替换；和/或，缬氨酸与亮氨酸、异亮氨酸之间的替换；和/或，酪氨酸与苯丙氨酸之间的替换；和/或，赖氨酸与精氨酸之间的替换。上述所述的取代基本不会改变本发明所述的氨基酸序列的活性。

优选的，所述多肽识别序列为Asp-Glu-Val-Asp-Ala。其中，切割位置为Asp与Ala之间。

本发明的第三方面，涉及一种核酸构建体，包括第一方面所述的核苷酸序列。

优选的，所述核酸构建体还包括调控序列；在宿主细胞中，所述的调控序列可连接第一方面所述的核苷酸序列；所述的调控序列为一个或多个。

所述的调控序列指导核苷酸编码序列在宿主细胞中表达，所述的一个或多个调控序列为相容状态。所述的调控序列为启动子和/或终止子和/或mRNA稳定子和/或前导序列和/或聚腺苷酸化序列和/或信号肽编码区和/或前肽编码序列和/或任何通过调节宿主细胞生长来调节多肽表达的调节序列。优选的，所述启动子包括突变型、截断型及杂合启动子中的一种或两种以上。优选的，所述的终止子可操作的连接到编码该多肽的多核苷酸序列的3'-末端。优选的，所述的mRNA稳定子，增强基因表达的稳定性，可操作的连接在启动子下游并且在基因编码序列上游。优选的，所述的前导序列为非翻译mRNA区，可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸序列的5'-末端。优选的，所述的聚腺苷酸化序列可操作地连接至该多核苷酸序列的3’-末端，转录时宿主细胞可以识别并将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。优选的，所述的信号肽编码区可以是外源的也可以是天然的，是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽。优选的，所述的前肽编码序列编码位于多肽的N-末端处的前肽，当信号肽序列也存在的情况下，前肽序列更接近N-末端。本发明所述的第四方面，涉及一种表达载体，所述载体含有第一方面所述的核苷酸序列。

优选的，所述载体还包括控制序列。进一步优选的，在宿主细胞内，所述控制序列可操作地与第一方面所述的核苷酸序列连接。最优选的，所述的控制序列包括启动、标记基因以及带有转录、翻译终止信号序列中的一种或两种以上。

优选的，所述的表达载体是线状的或闭合的环状质粒。该表达载体导入宿主细胞后，整合到基因组中，随着整合了它的染色体一起复制。优选的，所述的表达载体为可以被一同导入宿主细胞中的一个或多个单一载体和/或一个或多个质粒或转座子。优选的，所述的表达载体包括一个或多个选择性标记基因。优选的，所述质粒选自pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060、pAMβ1、ARS1、ARS4、ARS1、 CEN3、ARS4或CEN6中的一种或两种以上。

本发明所述的第五方面，涉及一种宿主细胞，包括第一方面所述的核苷酸序列和/或第三方面所述的核酸构建体和/或第四方面所述的表达载体。

在所述的宿主细胞中，核苷酸序列与一个或多个控制序列/调控序列连接，该一个或多个控制序列/调控序列指导本发明所述多肽的产生。

优选的，所述宿主细胞可以为细菌或真菌。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

本发明还涉及一种产生第一方面所述的多肽的方法，该方法包含：

(a)提供一种细胞，培养该细胞，所述的细胞以其野生型形式可以产生本发明所述的多肽；并且

(b)回收该多肽。

所述的多肽对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的，所述多肽涵盖肽、寡肽及多肽。

优选的，所述细胞为本发明第五方面所述的宿主细胞。

优选的，所述的培养可以为摇瓶培养或发酵罐培养。优选的，所述的培养的方法可以为连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵。所述培养所需培养基中含有碳源、氮源及无机盐，还可以包括维生素、氨基酸等细胞所需的营养成分。当所述多肽为胞内产物时，回收细胞需先进行破碎细胞，随后从细胞裂解液中回收。当所述多肽为分泌到细胞外的产物时，可先过滤掉发酵液中的细胞后，再回收多肽。所述回收的方法可以使用本领域已知的方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀中的一种或两种以上。

对于多肽活性的检测方法，包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。

对于多肽的纯化方法，包括但不限于，色谱法(离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(制备型等电点聚焦)、差别溶解度(硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取。

本发明的第六方面，涉及一种试剂盒，包括第二方面所述的多肽和用于酶切的缓冲液/缓冲液母液。

优选的，所述试剂盒包括所述的核酸构建体、表达载体或宿主细胞、蛋白表达诱导剂和用于酶切的缓冲液/缓冲液母液。所述试剂盒还包括氯化钴溶液。

优选的，所述试剂盒包括修饰物，所述修饰物为脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、带标记的脱氧核苷酸、带标记的双脱氧核苷酸、脱氧核苷酸类似物或双脱氧核苷酸类似物。

优选的，所述蛋白表达诱导剂选自异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、阿拉伯糖、色氨酸、磷酸盐中的一种。对于蛋白表达的诱导也可以通过升高温度的方式来实现。

优选的，所述的缓冲液为在25℃条件下pH值在7-8之间的含有Tris-醋酸、醋酸钾、醋酸镁的水溶液。

在本发明的一个具体实施例中，所述的试剂盒组成为酶切缓冲液为25mMTris(pH 8.0)，150mMNaCl，100uL 0.5mg/mL的本发明所述的多肽。

本发明还提供了一种试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

a)将需要被纯化的含有目的蛋白的溶液，进行柱层析，提取获得纯化的含有目的蛋白的溶液；

b)将第一步获得的纯化的含有目的蛋白溶液浓缩至10-15mg/mL，总体积大约1.5mL；

c)依次加入所述试剂盒中的试剂Tris、NaCl、具有蛋白酶活性的多肽，反应。

优选的，所述的反应条件为室温下1h或18℃过夜反应。

本发明的第七方面，涉及上述的多肽、上述的核酸构建体、表达载体、宿主细胞、上述的试剂盒在蛋白切割中的用途。

优选的，所述的蛋白为融合蛋白。进一步优选的，所述的融合蛋白为具有标签的融合蛋白。

优选的，所述的蛋白含有序列Asp-Glu-Val-Asp-Ala。

本发明还涉及所述的多肽、上述的核酸构建体、表达载体、宿主细胞、或上述的试剂盒在蛋白纯化中的用途。所述的蛋白含有序列Asp-Glu-Val-Asp-Ala。

所述蛋白纯化优选为切割融合蛋白标签以达到分离蛋白的目的。

本发明的第八个方面，还提供了一种切割融合蛋白标签或蛋白纯化的方法，包括如下步骤：

a)将含有标签蛋白序列、第二方面所述的多肽的识别位点序列和目的蛋白序列的粗蛋白经第一层析柱，随后洗脱，得到进一步纯化的目的蛋白；

b)将步骤a)获得的进一步纯化的目的蛋白与第二方面所述的多肽制成混合液，酶切；

c)将步骤b)获得的反应液通过第二层析柱。

优选的，所述标签蛋白为His标签。

优选的，所述第一层析柱内的介质选自高交联的琼脂糖、葡聚糖和纤维素、亲和层析填料、离子交换填料中的一种。所述第二层析柱内的介质选自亲和层析填料、离子交换填料和分子筛类填料中的一种。

本发明提供的具有蛋白酶活性的多肽，在蛋白的切割时，该多肽具有高度酶切序列专一性，可以作为一种专门用于特异性切割重组表达蛋白标签的工具酶。

本发明所述的“具有蛋白酶活性”指具有蛋白酶活性的多肽，即肽酶、肽水解酶、朊酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是外切蛋白酶或内切蛋白酶(内肽酶)。基于蛋白酶的特异性，内肽酶对蛋白的任一末端被封闭的肽底物具有活性。

本发明所述的“蛋白酶”为水解肽键的酶。它包括属于EC3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一种)。

本发明所述的“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的肽键，催化酰胺键或蛋白的水解的蛋白水解活性(EC3.4.21.)。用于测定蛋白酶活性的若干测定在本领域是可获得的。

本发明所述的“序列一致性”、“同一性”用来表示两个核苷酸序列之间或两个氨基酸序列之间的相关性。

本发明所述的“变体”指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(即若干个)氨基酸残基取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占据同一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

在描述本发明的变体中，采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

本发明所述的“目的蛋白”为需要被分离、纯化的蛋白。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：DrICE酶镍柱亲和纯化电泳图，其中，M：Marker，A：诱导前全菌，B：诱导后全菌，C：裂解后上清，D：裂解后沉淀，E：穿透峰，F：20mM咪唑洗脱峰，G：50mM咪唑洗脱峰，H：100mM咪唑洗脱峰，I：250mM咪唑洗脱峰；

图2：pET-15b载体图谱示意图；

图3：pET-15b载体改造区示意图；

图4：改造后pET-15b载体图谱示意图；

图5：聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，15％)纯化蛋白(PYL10)的分析结果，其中，M为Marker，纯化的蛋白为PYL10。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、目的基因克隆：

1、引物设计：以DrICE酶基因序列为模板设计N端带有NdeI酶切位点，C端带有XhoI 酶切位点的上下游引物。

上游引物(SEQ ID NO：3)：GGAATTCCATATGGCTAGAGCCCTGGGCTCCGTGGG

下游引物(SEQ ID NO：4)：CCGCTCGAGAACCCGTCCGGCTGGTGC

2、PCR反应体系：总体积为50μL，其中，其中Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)1μL，10×PCR buffer 5μL，上、下游引物(20μM)各1μL，dNTP(2.5mM)5μL，模板DNA(100ng/μL)0.5μL，补足ddH ₂O至50μL。

3、PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃90s共30个循环；72℃10min；4℃储存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)用凝胶成像系统检测PCR扩增情况。

二、PCR产物和质粒pET21b的双酶切反应：

1、酶切体系为50μL体系，其中限制性内切酶(NdeⅠ与XhoⅠ)各2μL，10×cutsmart buffer 5μL，PCR产物30μL或质粒2μg，补足ddH ₂O至50μL。37℃，过夜酶切。

2、进行胶回收实验，得到双酶切后的PCR片段和载体片段。

三、连接及转化：

1、连接体系为20μL，其中T4 DNA ligase 1μL，10×T4 DNA ligase buffer 2μL，酶切PCR片段10μL，酶切质粒3μL，补足ddH ₂O至20μL，25℃孵育30min。

2、转化：取5μL连接产物加至50μL DH5α感受态细胞中，冰浴20min后，移至42℃水浴热激60s，迅速置于冰浴中2min，加入500μL LB液体培养基中(不含抗生素)，37℃振摇45min；取150μL菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃细菌培养箱倒置过夜。

3、随机挑取5个菌落，进行菌落PCR鉴定；挑取其中的阳性克隆测序。测序成功的重组质粒进行下一步实验。

四、蛋白表达

1、蛋白诱导表达：将测序正确的重组表达载体转化表达感受态细胞E.coil BL21(DE3)，通过IPTG诱导来检测目的蛋白的表达量。

1.1从转化板上挑取单克隆，接入10-20mL LB(加入氨苄)作为扩繁菌种，37℃，220rpm培养过夜。

1.2将无抗性LB培养基37℃提前预热2h左右，然后将扩繁菌种以1:100-1:200的比例接种至1L LB(加入氨苄)培养基中进行扩大培养，37℃，220rpm。

1.3在OD600达到1.2-1.4左右时，降温至22℃，30min之后，加入400μL IPTG(终浓度为0.2mM)诱导表达14-16h左右。

2、蛋白提取

2.1将诱导培养后的培养液4000rpm/min，离心10min；

2.2取出离心瓶，倒掉上清培养基，加入约20mL Lysis Buffer(25mM Tris 8.0，150mM NaCl)，涡旋振荡，重新悬浮菌体后倒入50mL离心管，使终体积约为35mL；

2.3将装有重悬菌液的50mL离心管至于冰上，用超声破碎仪破碎菌体，超声条件：超声3s，静置10s，净超声时间为5min；

2.4将超声后的菌液14000rpm离心60min；

2.5将离心后的上清倒入一个干净的50mL的离心管中，准备进行后续纯化。

3、蛋白纯化和保存

3.1镍亲和纯化：将上清与平衡好的亲和层析镍柱充分结合；分别用lysis buffer(25mM Tris 8.0,150mM NaCl)和wash buffer1(25mMTris 8.0,150mM NaCl,20mM咪唑)，wash buffer2(25mM Tris 8.0,150mM NaCl,50mM咪唑)和wash buffer3(25mM Tris 8.0,150mM NaCl,100mM咪唑)去除非特异性结合的杂蛋白；最后用elution buffer(25mM Tris 8.0,150mM NaCl,250mM咪唑)将目的蛋白从亲和层析住上洗脱下来；

3.2将目的蛋白浓缩至0.5mg/mL，分装100μL每管，-80℃冰箱保存。

五、结果

本发明所述的蛋白酶表达及纯化结果见图1所示。其中，M：marker，A：诱导前全菌，B：诱导后全菌，C：裂解后上清，D：裂解后沉淀，E：穿透峰，F：20mM咪唑洗脱峰， G：50mM咪唑洗脱峰，H：100mM咪唑洗脱峰，I：250mM咪唑洗脱峰。

实施例2

一、实验步骤：

1、载体的改造

以pET15b原核表达载体为模板(图2)进行改造，通过PCR的方式将N端linker和DrICE酶切位点共21bp核苷酸序列(SEQ ID NO：5CATAGTGATGAAGTTGATGCA)插入到Thrombin酶切位点和NdeI位点之间(图3)，得到改造后的载体。

2、目的基因克隆

2.1引物设计

以PYL10(SEQ ID NO：6)为模板设计N端带有NdeI酶切位点，C端带有XhoI酶切位点的上下游引物如下：

上游引物(SEQ ID NO：7)：GGAATTCCATATGAATGGCGACGAAACG

下游引物(SEQ ID NO：8)：CCGCTCGAGCTATTCGGCTTGCAGACG

2.2PCR反应体系

总体积为50μL，其中，其中Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)1μL，10×PCR buffer 5μL，上、下游引物(20μM)各1μL，dNTP(2.5mM)5μL，模板DNA(100ng/μL)0.5μL，补足ddH2O至50μL。

2.3PCR扩增条件

94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃90s共30个循环；72℃10min；4℃储存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)用凝胶成像系统检测PCR扩增情况。

3、PCR产物和质粒的双酶切反应

3.1酶切体系

将本实施例方案1得到的改造后的载体和本实施例方案2得到的N端带有NdeI酶切位点，C端带有XhoI酶切位点的PYL10PCR产物分别进行酶切。

50μL体系，其中，限制性内切酶(NdeⅠ与XhoⅠ)各2μL，10×cutsmart buffer 5μL， PCR产物30μL或质粒2μg，补足ddH2O至50μL。37℃，过夜酶切。

3.2进行胶回收实验，得到双酶切后的基因片段和载体片段。

4、连接及转化

4.1连接体系为20μL，其中，T4 DNA ligase 1μL，10×T4 DNA ligase buffer 2μL，酶切基因片段10μL，酶切质粒3μL，补足ddH ₂O至20μL，25℃孵育30min。

4.2转化：取5μL连接产物加至50μL DH5α感受态细胞中，冰浴20min后，移至42℃水浴热激60s，迅速置于冰浴中2min，加入500μL LB液体培养基中(不含抗生素)，37℃振摇45min；取150μL菌液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃细菌培养箱倒置过夜。

随机挑取5个菌落，进行菌落PCR鉴定；挑取其中的阳性克隆送测序。测序成功的重组质粒进行下一步实验。

5、目的蛋白的表达和纯化

5.1表达

转化表达菌株BL21(DE3)。将阳性克隆接种至100mL氨苄抗性LB培养基中，37℃，220r/min过夜培养；以1∶100的比例转接至1L培养基37℃培养3～4h，加入0.2mM IPTG，22℃过夜诱导。

5.2纯化

5.2.1粗蛋白提取：4000r/min离心10min收集菌体后超声破碎，14000r/min离心1h，除去细胞碎片取上清即为粗蛋白。

5.2.2亲和层析：将粗蛋白与Ni-NTA充分结合，用20mM咪唑、25mMTris(pH 8.0)、150mMNaCl缓冲液去除非特异性结合的杂蛋白，再用250mM咪唑、25mMTris(pH 8.0)、150mMNaCl洗脱目的蛋白。

5.2.3离子交换层析：将洗脱液上样至SourceQ离子交换色谱柱，使用盐浓度梯度洗脱的方式，去除杂蛋白，进一步提纯目的蛋白。

5.2.4His标签切除：将上步洗脱液浓缩至10-15mg/mL，总体积大约1.5mL，酶切缓冲液为 25mMTris(pH 8.0)、150mMNaCl，加入100uL 0.5mg/mL的Drice酶，在室温反应1小时，或在18℃过夜酶切。

5.2.5分子筛纯化：通过Superdex200色谱柱将切掉的HIS标签、Drice酶和目的蛋白进行分离和纯化。

二、结果

SDS-PAGE结果如图4所示，结合紫外吸收峰位置，得到最终纯化的去除N端组氨酸标签的目的蛋白。表明本发明所述的蛋白酶用于特异性切除重组表达蛋白的标签，获得的蛋白纯度高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸选自下列组中的一种：

a)所述核酸编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

b)所述核酸序列如SEQ ID NO：2所示；

c)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：2所示的核酸序列杂交；

d)所述核酸序列与SEQ ID NO：2所示的核酸序列具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度；

或者，a)、b)、c)或d)的全长互补链。
一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自下列组中的一种：

a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

b)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列杂交，所述氨基酸序列具有蛋白酶的活性；

c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，且具有蛋白酶的活性；

d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸，且具有蛋白酶的活性；

e)SEQ ID NO：1的变体，其中所述变体与相应的氨基酸序列的差异不多于25个氨基酸，其中包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列或至少一个N-/C-末端延伸，且具有蛋白酶的活性。
根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽识别序列为Asp-Glu-Val-Asp-Ala。
一种核酸构建体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，其包含SEQ ID NO：5所示的序列、或者序列如SEQ ID NO：9所示、或者质粒图谱如附图4所示。
一种核酸构建体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸。
一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的多肽和用于酶切的缓冲液/缓冲液母液。
根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的核酸构建体、表达载体或宿主细胞、还包括蛋白表达诱导剂和用于酶切的缓冲液/缓冲液母液。
一种权利要求2或3所述的多肽、或者权利要求5所述的核酸构建体、表达载体或宿主细胞、或者权利要求6-7任一所述的试剂盒在融合蛋白切割或蛋白纯化中的用途。
根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的融合蛋白为具有标签的融合蛋白。
根据权利要求8-9任一所述的用途，其特征在于，所述的具有标签的融合蛋白含有序列Asp-Glu-Val-Asp-Ala。
一种切割融合蛋白标签或蛋白纯化的方法，包括如下步骤：

a)将含有标签蛋白序列、权利要求2或3所述的多肽的识别位点序列和目的蛋白序列的粗蛋白经第一层析柱，随后洗脱，得到进一步纯化的目的蛋白；

b)将步骤a)获得的进一步纯化的目的蛋白与权利要求2或3所述的多肽制成混合液，酶切；

c)将步骤b)获得的反应液通过第二层析柱。