CN1345378A - 用于检测膜来源的caspase活性和其调节剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供检测膜来源的细胞凋亡活性的方法。在一个实施方案中,本发明提供鉴定膜来源的caspase活性的方法。在另一个实施方案中,提供药物发现方法用于筛选抑制或增强膜来源caspase活性的化合物。在这些不同的实施方案中,重膜组分被用于本文所述的筛选方法中。

Description

用于检测膜来源的caspase活性和其调节剂的方法

发明领域

一般地，本发明涉及检测膜来源的caspase活性和其调节剂的方法，更具体地，涉及一种新的用于鉴定膜来源caspase活性的抑制剂和增强剂的无细胞筛选分析方法。

发明背景

组织稳态是通过细胞凋亡过程，即细胞程序性死亡的正常生理过程，来维持的。与细胞周期调节的异常一样，防止或延缓正常细胞更新的细胞凋亡途径的改变在疾病的发病机理中常是重要的。就象细胞分裂通过细胞周期调节蛋白之间的复杂相互作用而受到控制一样，在正常情况下细胞凋亡也是通过起着阻止或诱导细胞死亡作用的基因产物的相互作用而受到调节的。

由于在多种生理过程，例如胚胎发育、免疫细胞调节和正常的细胞更新中，细胞凋亡起着维持组织稳态的作用，所以受调控的细胞凋亡的功能障碍或丧失能够导致各种病理疾病状态。例如，丧失细胞凋亡会导致与许多自身免疫病相关的自身反应性淋巴细胞聚积。细胞凋亡的不恰当丧失或抑制也会导致病毒感染细胞和过度增殖细胞如赘生性细胞或肿瘤细胞的积累。同样，细胞凋亡的不当激活也会引起各种病理疾病状态，包括例如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、神经变性病和缺血性损伤。

尽管细胞凋亡由多种信号和细胞基因产物的复杂相互作用介导，但这些相互作用的结果最终将进入在人类和无脊椎动物之间进化上保守的细胞死亡途径。该途径本身是类似于凝血级联事件的一系列蛋白水解级联事件。

目前已鉴定了几个调节细胞凋亡过程的基因家族和产物。一个家族是天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(“caspase”)。线虫(C.elegans)中鉴定的caspase Ced-3是线虫C.elegans发育过程中细胞程序性死亡所必需的。已经对Ced-3的同系物及其它caspase进行了特性分析。人类caspase家族包括例如Ced-3、人ICE(白介素-1-β转化酶)(caspase-1)、ICH-1(caspase-2)、CPP32(caspase-3)、ICE_relII(caspase-4)、ICE_relIII(caspase-5)、Mch2(caspase-6)、ICE-LAP3(caspase-7)、Mch5(caspase-8)、ICE-LAP6(caspase-9)、Mch4(caspase-10)、caspase-11、caspase-12、caspase-13、caspase-14等。

半胱氨酸蛋白酶的caspase家族是细胞凋亡过程的必需因子(Yuan等，细胞(Cell)75：641-652，1993；Alnemri等，细胞87：171，1996；Cohen，生物化学(Biochem.)326：1-16，1997；Miller，Semin.Immunol.9：35-49，1997；Salvesen和Dixit，细胞91：443-446，1997)。caspase是作为无活性酶原合成的，其通过蛋白水解加工产生联结形成活性酶的大(约18 kDa)和小(约12 kDa)亚基来激活(Thornberry等，自然(Nature)396：768-774，1992；Nicholson等，自然376：37-43，1995；Stennicke和Salvesen，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272：25719-25723，1997)。各种细胞凋亡刺激物可引起特异caspase的激活，然后该激活的caspase通过蛋白水解加工其它的caspase起始一系列蛋白酶级联反应(Srinivasula等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：14486-14491，1996；Yu等，癌症研究(Cancer Res.)58：402-408，1998)。一旦激活，这些下游(行刑者)caspase通过切割对于细胞的存活必需的特异分子靶标或通过激活促细胞凋亡因子杀死细胞(Liu等，细胞89：175-184，1997；Enari等，自然391：43-50，1998；Salvesen和Dixit，细胞91：443-446，1997)。尽管caspase一般表现为是胞质蛋白质(Miller等，生物化学杂志268：18062-18069，1993；Nicholson等，自然376：37-43，1995；Li等，生物化学杂志272：30299-30305，1997)，但免疫化学研究提示在某些情况下caspase也可能与细胞核或质膜相关(Singer等，J.Exp.Med.182：1447-1459，1995；Krajewski等，血液(Blood)89：3817-3825，1997；Posmantur等，J.  Neurochem.68：2328-2337，1997)。近来公布的资料也指出某些caspase与线粒体和内质网相关(Mancini等，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)140：1485-1495，1998；Chandler等，生物化学杂志273：10815-10818，1998)。

Bcl-2家族构成另一组关键的细胞凋亡途径调节物。这些蛋白质能够在广泛多种细胞系统中起到调节细胞凋亡的作用(Oltvai和Korsmeyer，细胞79：189-192，1994；Reed，自然387：773-776，1997)。Bcl-2家族的蛋白质含有一至四个保守域，称为BH1-BH4，而且大多数家族成员含有一个羧基端跨膜锚定序列，从而允许它们与细胞膜(包括线粒体外膜、核被膜和内质网)相联系(Reed，自然387：773-776，1997；Krajewski等，癌症研究53：4701-4714，1993；Yang等，细胞生物学杂志128：1173-1184，1995；Lithgow等，细胞生长分化(Cell Growth Differ)3：411-417，1994)。已经显示在几种细胞系统中Bcl-2的超量表达抑制细胞凋亡刺激后细胞质caspase的激活(Armstrong等，生物化学杂志271：16850-16855，1996；Chinnaiyan等，生物化学杂志271：4573-4576，1996；Boulakia等，癌基因(Oncogene)12：29-36，1996；Srinivasan等，神经科学杂志(J.Neurosci.)16：5654-60，1996)。而且，以前的工作已证明Bcl-2抑制细胞凋亡的起始，但是一旦细胞凋亡被启动，则Bcl-2不会妨碍该过程(McCarthy等，细胞生物学杂志136：215-217，1997)。然后，仍然不清楚该膜结合Bcl-2是如何控制可溶性细胞质caspase的。而且，也不存在适合的方法可以用于以无细胞的方式研究膜结合Bcl-2以及它对caspase活性的影响。

由于缺乏这样的方法，阻碍了对通过增强或抑制膜来源的caspase活性来调节细胞凋亡途径的化合物的鉴定。由于完整细胞或其细胞质提取物缺乏特异性、有效性和/或实用性(Utilization)，所以对可获得的方法造成了限制。例如，可以对大多数抗癌药物杀死细胞的能力进行筛选，然后由此鉴定诱导细胞坏死或细胞凋亡的化合物。此外，有许多其它分析技术也在集中研究定位于该级联反应更内部的caspase酶的抑制或增强。因此，在本领域中需要一些方法用于鉴定抑制或促进细胞死亡的化合物以及调节细胞凋亡级联反应起始的化合物。本发明将满足这种需求，同时还提供其它相关优点。

前述特性以及将在下文作更为详细描述的其它特性使得本文所描述的方法对于药物开发应用尤其具有吸引力。

发明概述

一般地，本发明提供鉴定膜来源的caspase活性的方法，以及鉴定该活性的调节物的方法。一方面，本发明提供鉴定膜来源的caspase活性的方法，包括在足以允许caspase活性形成的条件和时间下孵育含有重膜或核膜的膜组分，之后检测caspase活性。

另一方面，本发明提供用于鉴定膜来源caspase活性的抑制剂的方法，包括在至少一种候选抑制剂存在和不存在时将膜组分与caspase底物接触；然后比较caspase底物转化的水平，并由此鉴定出膜来源caspase的活性的抑制剂。

再一方面，本发明提供用于鉴定膜来源caspase活性的增强剂的方法，包括在至少一种候选增强剂存在和不存在时将膜组分与caspase底物接触；然后比较caspase底物转化的水平，并由此鉴定膜来源caspase的活性的增强剂。

本发明的再一方面是用于鉴定膜组分中caspase加工过程展开(evolution of caspase processing)的抑制剂或增强剂的方法，包括将膜组分与至少一种候选抑制剂或候选增强剂接触；然后鉴定大caspase亚基和小caspase亚基的存在，并由此确定caspase加工的水平，其中加工水平的降低指示存在caspase加工的抑制剂，而其中加工水平的增加指示存在caspasse加工的增强剂。

在其它实施方案中，本发明提供鉴定调节膜组分来源caspase活性的化合物的方法，包括在足以允许caspase活性形成的条件和时间下，在至少一种候选化合物存在和不存在时，将膜组分、细胞凋亡抑制剂和caspase底物一起孵育；然后比较caspase底物转化的水平，籍此鉴定调节膜来源caspase活性的化合物。

在其它实施方案中，提供通过这些方法鉴定的膜来源caspase活性的抑制剂和增强剂。

在这些不同的实施方案中，caspase活性是通过测量底物的转化或caspase的加工来检测的。在其它实施方案中，底物转化通过时程或终点分析测量。在进一步的实施方案中，该膜组分含有重膜或核膜。在再进一步的实施方案中，该膜组分来源于表达抗细胞凋亡多肽的细胞。在再进一步的实施方案中，该膜组分来源于非凋亡细胞。

参考以下的详述和附图，本发明的这些和其它方面将是明了的。此外，以下列出在某些程序或组合物(例如质粒等)方面给出了更为详细描述的各种参考文献，由此将它们以参考文献的方式完整地并入本文。

附图简述

图1是免疫印迹的扫描图象，代表了采用抗PARP、细胞色素氧化酶(亚基IV)、D4GDI和Bcl-2的抗体对来自697-neo和697-Bcl-2细胞的亚细胞组分SDS-PAGE进行的分析。Nuc＝核组分，HM＝重膜组分，LM＝轻膜组分，S100＝胞质组分。箭头指示特异的免疫活性带。

图2A-D是亚细胞组分中caspase底物裂解活性的柱形图。

图3A和3B为膜相关procaspase-3自发激活图。图3A以DEVD-amc转化的函数形式说明了来自697-neo和697-Bcl-2细胞的重膜中caspase活性的自发激活。图3B以DEVD-amc转化的函数形式说明了可溶性caspase活性自细胞膜的产生。

图4是免疫印迹的扫描图象，代表了用抗caspase-3多克隆抗体对来自697-neo和697-Bcl-2细胞的重膜和胞质组分SDS-PAGE进行的分析。楔形符号指示蛋白质大小标记物(Rainhow Markers，Novex)的迁移；箭头指示procaspase-3。HM＝重膜组分；S100＝胞质组分。

图5图示外源caspas-1对膜相关DEVD-amc切割活性的激活。

图6A和6B图解了在细胞色素c存在和不存在时697-neo和697-Bcl-2细胞中的DEVD-amc切割活性。图6A说明重膜组分中存在的caspase活性。图6B说明细胞质组分中存在的caspase活性。

图7A、7B和7C图解了透化去污剂对膜相关caspase活性的影响。图7A阐明了NP-40对neo膜中自发和诱导的caspase活性的影响。图7B说明了NP-40对Bcl-2和neo膜中自发caspase活化的影响。图7C描述了由于粒酶B对富含线粒体的组分的处理引起的procaspase-3的NP-40依赖性和不依赖性激活。

发明详述

正如以上提及的，本发明一般指向鉴定和调节膜来源caspase活性的方法。本公开发明的一个应用是鉴定细胞凋亡的抑制剂或增强剂。简单地说，这种新的无细胞分析系统的使用提供了一种鉴定在关键起始点(即细胞膜)上促进或抑制细胞程序性死亡的化合物的手段。本发明的另一方面在于该公开的分析系统能够研究来源于超量表达细胞凋亡途径蛋白质(例如bcl-2家族蛋白质)的细胞的膜的作用。

正如本文所描述的，优选的分析系统利用重膜或核膜在无细胞系统中检测膜来源的caspase活性，和/或鉴定直接或间接地调节caspase活性的化合物。因此，通过使用这些膜系统，能够有效地分析细胞质细胞凋亡途径上游的控制点，并且可以鉴定其调节物。

部分地借助于高处理量方法学，本发明的分析方法将在药物开发中尤其有用。因此，通过利用本发明的无细胞分析系统，可以快速鉴定影响来自该膜组分的caspase活性形成的化合物。

在阐明本发明之前，阐明下文中将用到的某些术语的定义可能对于理解本发明是有帮助的。

本文所用“caspase”是指特异在Asp残基之后切割蛋白质的半胱氨酸蛋白酶。caspase最初表达成酶原，其中大亚基位于小亚基的N端。一般，caspase通过在内部Asp残基处切割而被激活。在许多真核生物中已鉴定到这些蛋白质，包括C.elegans、果蝇(Drosophila)、小鼠和人。目前，至少有14种已知的caspase基因，命名为caspase-1至caspase-14。表1列举了10种人caspase和它们的别名。

caspase	别名
		caspase-1	ICE
caspase-2	ICH-1
		caspase-3	CPP32，Yama，apopain
caspase-4	ICErelII；TX，ICH-2
		caspase-5	ICErelIII；TY
caspase-6	Mch2
		caspase-7	Mch3，ICE-LAP3，CMH-1
caspase-8	FLICE；MACH；Mch5
		caspase-9	ICE-LAP6；Mch6
caspase-10	Mch4，FLICE-2

在本发明上下文中，应当理解，caspase包括野生型蛋白质序列，以及天然蛋白质序列的其它变体(包括等位变体)。简单地说，这些变体可以从天然多态性产生，或可以通过重组方法合成，并且与野生型蛋白质相差一个或多个氨基酸替代、插入或缺失等。典型地，当进行改造时，氨基酸替代将是保守性的，即在极性、非极性、芳香族、带电荷等氨基酸组内进行的氨基酸替代。在与天然序列同源的区域中，变体应优选具有至少90％的氨基酸序列一致性，而且在某些实施方案中具有高于92％、95％或97％的一致性。该氨基酸序列一致性可以通过标准方法确定，这些方法包括利用在www.ncbi.nlm.nih.gov能获得的国家生物技术信息中心BLAST搜索方法。优选的一致性方法描述于美国专利5,691,179和Altschul等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25：3389-3402，1997中，所有这些均以参考文献形式并入本文。如果采用Gapped BLAST 2.0，则使用默认设置。

正如本领域技术人员将理解的，由于密码子的简并性、核苷酸的多态性或氨基酸的差异，编码caspase或变体的核苷酸序列可以与已知的天然序列不同。在其它实施方案中，变体应优选与天然核苷酸序列在正常严紧条件下杂交，所述正常严紧条件是低于天然双螺旋的Tm值大约25-30℃(例如，5×SSPE、0.5％SDS、5×Denhardt氏溶液、50％甲酰胺、42℃，或等同条件；一般参见Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborPress，1987；Ausubel等，当代分子生物学操作指南(Current Protocolsin Molecular Biology)，Greene Publishing，1987)。

“分离的核酸分子”是指至少一度以基本纯的形式从其来源细胞(包括其通常所位于的染色体)中分离出来的多核苷酸分子，该分子可以是独立的片段形式，或是作为一个更大核酸结构的成分。核酸分子可以由许多种核苷酸构成，这包括DNA、RNA、核苷酸类似物或这些的某种组合。

本文所用“膜组分”是指真核细胞的含有细胞膜的亚细胞组分。具体地，术语“重膜”在本文中用于指基本不含有核膜和轻膜的亚细胞组分，其中的主要成分之一是线粒体。

“细胞凋亡刺激物”或“促细胞凋亡剂(pro-apoptotic agent)”在本文中用于指增加细胞的特异细胞凋亡活性的药剂。这些刺激的说明性例子有生长因子剥夺、Fas配体、抗Fas抗体、星形孢菌素、紫外辐射、γ辐射、肿瘤坏死因子和本领域熟知的其它物质。因此，细胞凋亡刺激物是一种直接或间接增强caspase分子的分子活性的药剂。此外，细胞凋亡刺激物还可以是能够增强或诱导细胞的凋亡活性的多肽。这些多肽包括那些直接调节细胞凋亡途径的多肽例如Bax、Bad、Bcl-xS、Bak、Bik和活性caspase，以及那些间接调节该途径的多肽。

本文所用“细胞凋亡抑制剂”或“抗细胞凋亡剂”是指当与对照药剂相比时，降低细胞的细胞凋亡活性的药剂。该抗细胞凋亡剂的说明性例子包括小分子、fmk、p35、crmA、Bcl-2、Bcl-X_L、Mcl-1、腺病毒的E1B-19K、以及促细胞凋亡剂的拮抗剂(例如反义分子、核酶、抗体等)。因此，细胞凋亡抑制剂是一种直接或间接地降低caspase分子的分子活性的药剂。

本文所用“细胞凋亡途径蛋白质”是指参与细胞死亡途径的蛋白质。说明性的例子包括Bcl-2、Bcl-X_S、Bcl-X_L、Bik、Bak、Bax、Bad、caspase分子、Apaf-1和细胞色素c等。

“caspase活性的形成(evolution of caspase activity)”在本文用于指在一段时间内caspase蛋白酶活性水平的可检测的增加。该形成可以通过底物转化(例如荧光底物)可检测的增加和/或caspase加工可检测的增加来显示。

本文所用“膜来源的caspase活性”是指从重膜或核膜释放的或与之相关的caspase活性。A.膜制品

在本发明中，膜制品可以来源于多种细胞类型或来源。典型地，为了便于操作，所用细胞将是真核细胞系或其它可培养的细胞类型。然而，细胞也可以来源于组织和其它非培养来源。本领域的普通技术人员将容易理解，本发明的分析方法并不依赖于用于制备膜组分的确切细胞来源或类型。

在最近30年里，亚细胞分级分离一直是细胞生物学中的一项基本研究工具。因此，本领域的普通技术人员对于用于该分级分离的各种技术是熟悉的。典型地，亚细胞分级分离包括两个基本步骤，1)匀浆和2)分离。理想形式的匀浆允许颗粒细胞器例如细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体保持完整。有多种匀浆技术是已知的，例如Dounce匀浆器(玻璃/玻璃)、Potter-Elvehjem匀浆器(玻璃/聚四氟乙烯)、反复抽吸、通过小规格的针头等。技术的例子详细描述于Harms等，美国国家科学院院刊77：6139-6143，1980；Darter等，J.Exp.Med.157：1208-1228，1993；和Balch等，细胞39：405-416，1984。

传统上，亚细胞组分的分离采用密度梯度来完成。尽管蔗糖梯度是最为广泛使用的，但还可以获得许多其它的替代方法(例如Ficoll、Percoll、三碘苯甲酰氨基葡萄糖和Nycodenz)(见酶学方法(Methods inEnzymology)，第31卷，A部分(Flescher和Packer编)，1974)。此外，还开发了许多用于分离各种成分的其它方法，包括密度改变、自由流动电泳和免疫分离(见膜运输的无细胞分析(Cell free Analysis ofMembrane Traffic)，第35-127页，(Morre等编)(1988))。而且，可以获得各种详细描述多种分级分离技术的参考文献，例如参见酶学方法，第31卷，A部分(Flescher和Packer编)，1974；细胞颗粒和大分子的区分：生物分子、细胞器、膜和细胞的分离和纯化(Partition of CellParticles and Macromolecular：Separation and Purification ofBiomolecules，Cell Organelles，Membrances，and Cells)(Albertsson编)，1986；Martin等，Eur.J.Clin.Inv.13：49-56，1983。

一个细胞分级分离方法的例子包括将细胞悬浮在其中含有各种蛋白酶抑制剂(例如PMSF、亮抑酶肽、抑胃酶肽、抑酶肽、EDTA等)的低渗缓冲液中。将样品于冰上孵育，然后采用Dounce匀浆器匀浆。匀浆后，匀浆物于500×g离心，分离细胞核。之后可以洗涤并重悬该细胞核沉淀。而上清液然后于14,000×g离心30分钟，沉淀重膜。之后该14,000×g离心后的上清液可以在100,000g离心30分钟，产生上清液(细胞质组分)和沉淀(轻膜组分)。然后可以在适当的缓冲液中洗涤并重悬这些沉淀组分用于分析。B.筛选来自膜组分的caspase活性形成的抑制剂和增强剂

1.膜来源caspase活性的抑制剂和增强剂

可以从多种来源分离或获得候选抑制剂和增强剂，这些来源例如细菌、真菌、植物、寄生物、化学制品库、肽或肽衍生物等。也可以根据X射线晶体学测定的蛋白质结构，合理地设计抑制剂和增强剂(见，Mittl等，生物化学杂志272：6539-6547，1997)。在某些实施方案中，该抑制剂靶向特定的caspase(例如膜相关caspase)。在其它实施方案中，该候选抑制剂或增强剂间接地影响膜来源caspase活性的释放和/或形成。

该抑制剂并不拘泥于特定机制，它可以通过阻止caspase的加工、抑制caspase的酶活性、其它机制、或通过阻止caspase从膜的释放来起作用。因此，该抑制剂可以直接地或间接地发挥作用。在一个实施方案中，抑制剂干扰caspase蛋白质的加工。在其它实施方案中，该抑制剂是小分子。在又一实施方案中，抑制剂与Bcl-2相互作用。在其它方面，该抑制剂阻止细胞凋亡。抑制剂应具有最小的副作用并且优选无毒性。优选能够透过细胞的抑制剂。

此外，在某些情况中可能期望caspase活性或表达的增强剂。有时，增加细胞凋亡将具有治疗效果。例如，肿瘤或介导自身免疫病的细胞是进行破坏的适合细胞。增强剂可以增加caspase加工的速度或效率、增加转录或翻译、增加caspase从膜的释放/形成、或通过其它机制起作用。正如本领域技术人员所明了的，以上给出的许多原则同样适用于增强剂的设计。

2.筛选分析形式

用于抑制剂和增强剂的筛选分析将根据抑制剂或增强剂的类型和所影响的活性的性质而改变。一般地，在本发明中，分析方法被设计成评价caspase蛋白的加工，或作为从膜组分形成/来源的caspase活性结果的caspase酶活性。在所有这些分析中，与恰当的对照相比，统计学上显著的增加或降低意味着增强或抑制。而且，应当理解，膜来源的caspase活性可以通过直接或间接的方式来检测。例如，一种直接方式是检测膜caspase底物的转化，而一种间接方式是检测由膜来源caspase激活的caspase的加工或直接活性。

在一个实施方案中，该分析利用来自真核细胞的膜制品。在这点上，根据分析的目的可以采用任何细胞类型。在某些实施方案中，该膜组分含有重膜和/或核膜。一方面，在存在或不存在候选抑制剂或增强剂的情况下接触或接触并孵育该膜组分，然后测量底物的转化或caspasse的加工。可以通过本领域技术人员已知的各种方法来评价底物的转化或caspasse的加工(caspase裂解为大、小亚基)，这些方法包括例如荧光光谱学、质谱分析、HPLC、比色法(例如UV和可见光谱学)、荧光自显影、放射显影、凝胶电泳、免疫印迹/免疫亲和、层析、N端肽测序等。而且，本领域普通技术人员将知道，根据待研究的动力学，孵育可以在各种温度下进行。在一个实施方案中，该孵育温度是从20℃至40℃。在其它实施方案中，该孵育温度是从25℃至37℃。

一种体外分析可以通过检测候选化合物对caspase(例如procaspase或caspase的其它蛋白质底物)加工成两个亚基的影响来进行。简单地说，就是利用含有膜来源caspase-3的酶识别位点的底物(例如肽、蛋白质、或肽模拟物(peptide mimetic))(如DEVD)，例如当该底物是蛋白质或肽时，体外翻译或从细胞表达系统纯化该底物。在存在或不存在候选抑制剂或增强剂的情况下，将此初级产物与膜组分接触或接触并孵育，然后对所述两个亚基的出现进行评价。为了利于检测，典型地，在翻译过程中，或在表达之前通过基因融合标记该蛋白质或肽。如果进行放射性标记，则可以在凝胶电泳后通过放射自显影容易地检测到这两个亚基。本领域的技术人员将知道，也可以采用其它的标记和检测方法。

另一种体外分析被设计来测量caspase底物类似物(例如乙酰-DEVD-氨基甲基香豆素(amc)、核纤层蛋白、多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)等，多种这些物质可以从商业途径获得)的切割。底物的转化(即底物的水解)可以采用时程(time course)(即进度曲线)分析(例如通过稳态速率比较进行的活性形成和底物水解速率分析)或终点分析(例如最终荧光减去初始荧光)的比较来确定。简单地说，在该方法中将该膜组分与候选抑制剂或增强剂以及caspase底物一起孵育。通过多种标准方法中的任一种检测裂解的底物。一般地，对该底物进行标记，并通过适当的检测手段进行示踪。

在本发明中所用的典型底物包括其转化直接或间接地测量了细胞凋亡途径，具体是一种或多种caspase分子酶活性的那些药剂。在这点上，各种底物例如标记的caspase分子、核纤层蛋白、PARR和caspase底物类似物是本领域已知的。这些底物还可以从商业途径例如OncogeneResearch Products，Cambridge，MA等公司获得。用荧光标记物标记的底物类似物的例子包括ZEVD-amc(苄氧羰基-Glu-Val-Asp-氨基甲基香豆素)、YVAD-amc(乙酰基-Tyr-Val-Ala-Asp-氨基甲基香豆素)、和DEVD-amc(乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-氨基甲基香豆素)。

而且，可以采用任何已知的酶分析来确定候选化合物对膜来源caspase活性的抑制或增强能力。本领域普通技术人员将明了，可以将该候选抑制剂或增强剂在分级分离之前与细胞一起孵育，或在分级分离之后但在检测之前与膜组分一起孵育。而且，该候选抑制剂或增强剂可以与膜组分并同时与caspase底物接触，或接触并一起孵育。

可以采用本文中简要描述的这些分析鉴定特异影响膜来源caspase活性的增强剂或抑制剂。有多种可以用来研究候选化合物作用的方法。这些方法是通常用于分析酶反应的那些方法，包括例如SDS-PAGE、分光术、HPLC分析、放射自显影、化学发光、生色反应和免疫化学(例如印迹、沉淀等)。

而且，在其它分析实施方案中，可以在用于将诱导型或组成型表达的促或抗细胞凋亡蛋白质递送至膜制品的来源细胞中的结构内使用真核启动子。例如，可以转染细胞，使它们超量表达抗细胞凋亡多肽Bcl-2，籍此提供其膜制品含有更高水平Bcl-2的细胞，以便仅检测能够克服Bcl-2抑制的细胞凋亡增强剂。在这同一点上，可以用细胞凋亡刺激物处理这些细胞，以便该细胞在亚分级分离之前为细胞凋亡“做好准备”。在该方法中，用细胞凋亡途径增强剂处理该膜组分，导致比增强剂对非做好准备的细胞的相应作用明显高得多的激活速率。

在其它实施方案中，在分级分离之前通过细胞凋亡刺激物的递送而为细胞死亡“做好准备”的细胞，可以通过处理不超量表达抗细胞凋亡多肽的细胞来建立，但在细胞凋亡之前对其进行分级分离。可以将这些细胞进行亚分级分离，然后利用由此获得的膜进行候选抑制剂和增强剂的分析。

以上描述的用于鉴定细胞凋亡抑制剂和增强剂的方法提供了另一种用于测量细胞凋亡活性的形式，其中对细胞进行处理，以便细胞为细胞程序性死亡“做好准备”。以此方式，该细胞合成和/或激活细胞程序性死亡所需要的所有必要成分。所需要的仅是使细胞越过其控制点(holdingpoint)进入细胞凋亡的刺激。因此，在有细胞凋亡刺激时，增强剂将使得该细胞进入细胞程序性死亡，而抑制剂将延缓或抑制该过程。

阻止细胞进入细胞程序性死亡的控制点可以是细胞存活多肽(survival polypeptide)的过量表达或用已知细胞凋亡抑制剂对细胞的处理。细胞存活多肽的特征在于，当在被诱导而将经历细胞凋亡的细胞中表达或激活时，它们表现出能够阻止细胞凋亡。例如，当不存在有功能的细胞存活多肽时，用细胞凋亡增强剂(例如促细胞凋亡剂)处理细胞将引起或加速细胞凋亡。然而，当存在细胞存活多肽时，用促细胞凋亡剂/增强剂进行处理能够起始细胞程序性死亡途径，但由于该途径中的一或多个事件受到抑制，细胞仍可存活。根据细胞存活多肽发挥作用的点，可以在导致最终细胞死亡的级联事件的执行中或早或相对晚地抑制该细胞程序性死亡途径。细胞存活多肽和它们的编码核苷酸是本领域所熟知的，包括例如Bcl-2家族的相关蛋白质Bcl-2、Bcl-X_L、Mcl-1、E1B-19K，以及caspase活性的抑制剂如p35、crmA和caspase的显性失活形式。这些形式包括例如在半胱氨酸活性位点带有失活突变的caspase。

细胞存活多肽的过量表达可以采用例如本领域技术人员已知的重组方法来实现。实施该重组表达方法的常规程序描述于例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，纽约(1992)，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，纽约(1995)。采用这些方法能够以足以阻止细胞凋亡诱导的水平稳定或瞬时表达细胞存活多肽。编码细胞存活多肽的核酸分子可以由例如来自相同物种或细胞类型的同源核苷酸编码，或者是，该核酸分子可以由来自不同物种或细胞类型的异源核酸编码。该编码核酸的来源并不重要，只要所编码的细胞存活多肽表现出细胞凋亡抑制活性即可。

足以阻止细胞凋亡诱导的细胞存活多肽表达水平是本领域技术人员已知的，而且还可以由本领域技术人员通过常规方法测定。用于重组多肽表达的表达载体和系统是已知的，而且可以从商业途径获得。对于本领域的技术人员而言，选择可以在特定宿主细胞中提供充足表达水平的载体或系统是一项常规技术。或者，可以通过表达该细胞存活多肽，然后在用促细胞凋亡剂处理后测量该细胞是否存活，常规地确定足以阻止细胞凋亡诱导的表达水平。

除了过量表达细胞存活多肽的重组方法之外，还可以采用天然过量表达细胞存活多肽的细胞。天然过量表达细胞存活多肽的细胞的具体例子是Bcl-2最先在其中获得鉴定的B细胞淋巴瘤。该白血病具有14号染色体向18号染色体的易位，结果导致Bcl-2的高水平表达并由此导致细胞的存活。该白血病表型是细胞存活增强所导致的。天然过量表达细胞存活多肽的其它细胞系同样可以用于本发明的这些方法中。

由于细胞存活多肽的过量表达所造成的细胞凋亡阻断，以及促细胞凋亡试剂对这些细胞的处理，对这些细胞产生了对抗的影响。以此方式，基本上该细胞为细胞程序性死亡做好准备。促细胞凋亡剂可以是对细胞的各种不同损伤，包括分子的、环境的和物理的刺激。正如之前定义的，这些刺激是本领域技术人员已知的，可以用激活细胞凋亡途径中的分子来表征。促细胞凋亡剂的例子包括诱导剂如生长因子剥夺、Fas配体、抗Fas抗体、星形孢菌素、肿瘤坏死因子、紫外和γ辐射等。因此，用促细胞凋亡剂处理过量表达细胞存活多肽的细胞将使细胞为凋亡做好准备，因为正、负信号提供了平衡作用。该准备的一个优点在于，一旦接收到克服该细胞存活多肽/抗细胞凋亡剂引起的阻断的信号，用于细胞凋亡的所有细胞死亡成分即可就绪。这就使得可以快速诱导细胞凋亡，从而能够用于筛选在Bcl-2或Bcl-X_L存在时具有细胞凋亡诱导活性的化合物。这些细胞对于分别筛选Bcl-2或Bcl-X_L的抑制剂是尤其有用的。

3.高处理量

本文描述的方法还适于高处理量操作形式(例如可以对大量样品进行快速有效筛选的多孔形式分析)。例如，由于可以从商业途径获得适合于操作的96孔板和测量装置，96孔格式提供了实用的优点。这些程序可以进一步自动化，以进一步增加该方法的速度和效率。这些性质以及该方法的特异性使得可以对膜来源caspase活性的候选抑制剂或增强剂进行无细胞高处理量筛选。例如，可以给大量的膜样品施用测试化合物库，然后分析它们增强或抑制细胞凋亡的能力。所鉴定的化合物对于治疗和诊断目的是有价值的，因为它们能够允许对细胞凋亡介导的疾病进行治疗和检测。这些化合物在有关细胞凋亡机制的研究中也是有价值的，因为它们能够帮助推导出进一步的分子事件并为其它化合物的发现和开发提供进一步的特异性。C.caspase和细胞凋亡途径基因

正如以上提及的，本发明提供与caspase和其它细胞凋亡途径基因及基因产物有关的分析方法，以及应用这些基因和基因产物的方法。具体地，本发明提供检测膜来源caspase活性的调节的分析方法。考虑到本文所提供的公开，以及本领域技术人员的知识，可以从各种细胞类型分离编码细胞凋亡途径蛋白质的基因。

1.细胞凋亡蛋白质编码基因的分离

可以从基因组DNA或优选从cDNA分离细胞凋亡蛋白质编码基因。从基因组DNA或cDNA分离细胞凋亡途径基因典型地可以通过首先产生适当的DNA文库来进行，该适当DNA文库可以通过用于构建文库的本领域已知技术制备(见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Spring HarborPress，1989)或从商业途径(例如Clontech，Palo Alto，CA)购买。简单地说，可以在噬菌体载体(例如λZAPII)、质粒或其它适于筛选的载体中构建cDNA文库，而基因组DNA文库可以在染色体载体例如YAC(酵母人工染色体)、噬菌体载体例如λEMBL3、λgt10等、粘粒或质粒上构建。

在一个实施方案中，可以利用已知的细胞凋亡蛋白质基因序列(caspase、Bcl-2、Bcl-X_S、Bcl-X_L、Bik、Bad、Bax等)，设计适用于筛选基因组或cDNA文库的寡核苷酸杂交探针。优选地，该寡核苷酸探针长20-30个碱基。为了利于杂交检测，可以方便地用报道分子例如放射性核素(例如³²p)、酶学标记物、蛋白质标记物、荧光标记物或生物素等，(一般在5’末端)对该寡核苷酸进行标记。然后取决于所用载体，一般将这些文库铺板形成噬菌体或菌落。随后，将这些菌落或噬菌体转移至硝酸纤维素或尼龙膜上，探测该膜以鉴定含有细胞凋亡途径基因的候选克隆。可以通过多种方法中的任意一种，包括例如DNA序列分析或用第二种非重叠探针进行杂交，验证这些候选分子是否含有该目的DNA。

一旦文库被鉴定为含有细胞凋亡蛋白质基因，则可以通过扩增分离该基因。简单地说，以caspase基因作为说明，当采用cDNA文库的DNA作为模板时，基于已知的caspase基因序列(见GenBank索取号X65019(caspase-1)、U13021(caspase-2)、U13737(caspase-3)、U25804(caspase-4)、U28015(caspase-5)、U20536(caspase-6)、U37448(caspase-7)、U60520(caspase-8)、U56390(caspase-9)、U60519(caspase-10)、和本领域可以获得的序列)，设计扩增引物。优选扩增从具有高caspase活性的细胞制备的cDNA文库。为了分离全长cDNA，用于扩增的引物优选来源于5’和3’非翻译区中的序列。这些引物优选具有大约50％的GC含量，并含有限制性位点以便于进行克隆，而且不仅没有自我互补序列，在它们的3’末端也不含有互补序列(以防止引物二聚体的形成)。使这些引物与cDNA或基因组DNA退火，然后进行足够的扩增循环以产生易于通过电泳和染色观察的产量。纯化该扩增片段并将其插入载体例如λgt10或pBS(M13+)中，并增殖。通过DNA序列分析，或间接地通过所编码多肽的氨基酸序列测定，验证该片段的性质。

还可以采用其它方法来获得编码细胞凋亡途径蛋白质的核酸分子。例如，可以用与caspase反应的一种抗体或多种抗体进行筛选从表达文库中获得编码caspase的核酸分子(见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1987；Ausubel等，当代分子生物学实验指南，Greene Publishing Associates andWiley-Interscience，NY，1995)。

可以从天然变体(例如多态性、剪接变体、突变体)改造、合成或构建细胞凋亡途径蛋白质基因的变体。已经开发了许多用于制备突变体的方法(一般参见，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；和以上的讨论)。简单地说，用于制备几个核苷酸替代的优选方法利用了横跨待突变的单个或多个碱基并含有该突变的单个或多个碱基的寡核苷酸。该寡核苷酸与互补单链核酸杂交，并从该寡核苷酸引发第二链的合成。制备双链核酸，用于转化宿主细胞，典型的是例如大肠杆菌，但也可以是其它原核生物、酵母或其它真核生物。采用标准的筛选和载体生长操作步骤鉴定突变序列并获得高的产量。

同样地，可以通过以上讨论的各种已知方法中的任意一种构建基因的缺失和/或插入。例如，可以用限制性酶消化该基因，然后重新连接以便造成序列缺失，或使序列与额外的序列重新连接在一起从而产生插入或大的替换。可以采用本领域已知的其它方法制备变体序列，例如那些描述于Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)中的方法。变体序列的验证典型地是通过限制性酶作图、序列分析或探针杂交来进行的。D.表达和产生蛋白质的载体、宿主细胞和方法

可以在多种宿主生物中表达细胞凋亡途径蛋白质。在某些实施方案中，该蛋白质在细菌例如大肠杆菌，或哺乳动物细胞(例如CHO和COS-7)中制备，对于这些宿主细胞已经开发并且可以获得许多表达载体。其它适合的宿主生物包括其它细菌种类，和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))等真核生物，以及昆虫细胞(例如Sf9)。

将编码该蛋白质的DNA序列引入适于该宿主的表达载体中。在某些实施方案中，可以将该蛋白质插入载体中，以便产生融合蛋白质。正如以上所讨论的，对于有多种密码子的每种氨基酸，该序列可以含有另外的可替代密码子。可以选择对于宿主物种而言“最佳”的可替代密码子。典型地将限制性位点掺入引物序列中，而且对限制性位点的选择取决于该载体的克隆位点。如果必需的话，可以将翻译起始和终止密码子加入该引物序列中。

该载体最少必须含有启动子序列。本文所用“启动子”是指含有指导所连基因转录的元件并含有RNA聚合酶结合位点的核酸序列。更典型的是，在真核细胞中，启动子序列含有控制基因表达速度和时间选择的其它转录因子的结合位点。这些位点包括TATA盒、CAAT盒、POU盒、AP1结合位点等。启动子区域还可以含有增强子元件。当启动子与基因相连以致能够使基因获得转录时，即是被“可操作地连接”。

可以包括其它调节序列。这些序列包括转录终止信号序列，分泌信号序列、复制起点、选择标记等。可以将这些调节序列操作性地彼此连接在一起以允许转录或翻译。

本文所用表达载体包括设计用于在宿主细胞(例如细菌)中表达所述蛋白质的启动子。适合的启动子可以从多种途径获得，而且是本领域熟知的。优选诱导型或组成型启动子。用于细菌中表达的该启动子包括来自T7噬菌体和其它噬菌体例如T3、T5和SP6以及trp、lpp和lac操纵子的启动子。还可以使用杂合启动子(见美国专利4,551,433)，例如lacVV、tac和trc。用于真核细胞中表达的启动子包括杆状病毒/昆虫细胞表达系统的P10或多角体基因启动子(见例如美国专利5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784)、MMTV LTR、CMV IE启动子、RSVLTR、SV40、金属硫蛋白启动子(见例如美国专利4,870,009)等。

控制该细胞凋亡途径蛋白质转录的启动子本身可以受到阻抑物的控制。在一些系统中，可以通过改变细胞的生理状况，例如通过加入竞争与该阻抑物结合的分子，或通过改变生长培养基的温度，使该启动子去阻抑。优选的阻抑蛋白包括但不限于响应IPTG诱导的大肠杆菌lacI阻抑物、温度敏感性λc1857阻抑物等。

在其它优选实施方案中，该载体还包括转录终止序列。“转录终止区”含有提供信号使识别所选启动子的聚合酶终止转录的序列和/或聚腺苷酸化信号序列。

优选地，该载体能够在该宿主细胞中复制。因此，当该宿主细胞是细菌时，该载体优选含有细菌的复制起点。优选的细菌复制起点包括p15A、pSC101和col E1复制起点，特别是来源于pUC质粒的ori。在酵母中，可以采用ARS或CEN序列以保证复制。在哺乳动物细胞中常用的系统是SV40 ori。

该质粒还优选包括至少一个在宿主中有功能的选择标记。选择标记基因包括赋予宿主表型以允许转化细胞能得以鉴定并选择性生长的任何基因。对于细菌宿主适合的选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因(Amp^r)、四环素抗性基因(Tc_r)和卡那霉素抗性基因(Kan_r)。目前优选卡那霉素抗性基因。对于真核生物适合的标记物通过要求在宿主中有互补缺陷(例如tk-宿主中的胸苷激酶(tk))。然而，也可以获得药物标记(例如G418抗性和潮霉素抗性)。

本领域技术人员明了，对于细菌细胞中的表达存在大量的适合载体，而且这些载体可以容易地获得。载体例如pET系列(Novagen，Madison，WI)、tac和trc系列(Pharmacia，Uppsala，瑞典)、pTTQ18(AmershamInternational plc，英国)、pACYC 177、pGEX系列等均适合于该蛋白质的表达。杆状病毒载体例如pBlueBac(见例如美国专利5,278,050、5,244,805、5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784；可从Invitrogen，San Diego获得)可以用于昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)sf9细胞(见美国专利4,745,051)中的表达。用于细胞凋亡途径蛋白质表达的细菌宿主的选择部分地取决于该载体。可从商业途径获得的载体是与适合宿主配对的。

对于真核细胞中的表达可以获得大量的适合载体。这些载体包括pCMVLacI、pXT1(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；pCDNA系列、pREP系列、pEBVHis(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在某些实施方案中，目的基因被克隆在基因导向载体中，例如pMClneo、pOG系列载体(Stratagene Cloning Systems)。

细胞凋亡途径蛋白质可以通过标准方法来分离，例如亲和层析、大小排阻层析、金属离子层析、离子交换层析、HPLC和其它已知的蛋白质分离方法(一般参见Ausubel等，同上；Sambrook等，同上)。当用考马斯亮兰染色时，分离的蛋白质在SDS-PAGE上给出单一的条带。

细胞凋亡途径蛋白质可以表达成六-his(His)₆融合蛋白，并通过含有金属的层析，例如镍偶连珠，来分离。简单地说，将编码His₆的序列与编码期望蛋白质的DNA序列连接在一起。尽管该His₆序列可以位于该分子中的任何位置上，但优选将其连接在紧接终止密码子之后的3’末端。该融合物可以通过多种方法中的任意一种构建。E.抑制剂或增强剂的用途

在本发明中，抑制剂或增强剂可以用于控制细胞的死亡过程或细胞因子(例如由caspase-1激活的IL-1)的激活。因此，这些抑制剂和增强剂可以应用于以细胞凋亡水平过度或不足为特征的疾病中。蛋白酶的抑制剂具有治疗主要神经变性疾病：中风、帕金森疾病、阿尔茨海默氏病和ALS的潜能。同样，caspase蛋白酶抑制剂可以用于抑制心肌梗死后心脏中的细胞凋亡、急性缺血后肾脏中的细胞凋亡、和肝脏疾病中的细胞凋亡。caspase活性的增强剂可以用于期望实现细胞凋亡或细胞因子激活的情况中。例如，可以通过递送caspase增强剂诱导或增强癌细胞或异常增殖细胞中的细胞凋亡。

该抑制剂和增强剂还可以偶联与细胞特异的细胞表面受体结合的导向部分。抑制剂或增强剂的施用一般将遵循已确立的操作程序。通过本发明的方法鉴定的化合物可以单独或作为药物组合物施用。简单地说，本发明的药物组合物可以含有本文所描述的一种或多种抑制剂或增强剂，以及一种或多种可药用或生理上可接收的载体、稀释剂或赋形剂。这些组合物可以含有缓冲液例如中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐溶液等，糖例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖，甘露糖醇，蛋白质，多肽或氨基酸例如甘氨酸，抗氧化物，鏊合剂例如EDTA或谷胱甘肽，佐剂(例如氢氧化铝)和防腐剂。此外，本发明的药物组合物还可以含有一种或多种其它的活性成分。

可以将通过本发明方法鉴定的组合物配制用于指示的施用方式，这些施用方式包括例如口服、鼻腔、静脉、颅内、腹膜内、皮下或肌肉内施用。在本发明的其它实施方案中，本文所述的组合物可以作为持续释放植入物的部分来施用。在其它实施方案中，可以利用能提供冻干物稳定性的适合赋形剂，将本发明组合物制成冻干物，之后重新水化。

正如以上提及的，本发明还提供药物组合物。这些组合物可以含有任何上述抑制剂、增强剂、DNA分子、载体或宿主细胞，以及可药用或生理上可接收的载体、赋形剂或稀释剂。一般地，这些载体在施用的剂量和浓度下对于接受体应是无毒性的。通常，这些组合物的制剂需要该治疗剂与如下物质组合，这些物质是缓冲液、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、低分子量(少于大约10个残基的)多肽、蛋白质、氨基酸、糖(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、鏊合剂例如EDTA、谷胱苷肽、和其它稳定剂和赋形剂。适合稀释剂的例子是中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水。

此外，还可以配制本发明药物组合物用于各种不同途径施用，包括例如关节内、颅内、皮内、肝内、肌内、眼内、腹膜内、鞘内、静脉内、皮下施用或甚至直接施用于肿瘤中。此外，可以将本发明药物组合物连同提供该药物组合物使用有关说明的包装材料一起放置在容器中。一般地，这些说明包括对该试剂浓度的确实表述，以及在某些实施方案中还包括对于重新组成该药物组合物可能必须的赋形剂成分或稀释剂(例如水、盐水或PBS)的相对量的确实表述。药物组合物对于诊断或治疗目的是有用的。

本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)疾病的方式来施用。施用的量和频率将取决于患者的情况、及患者疾病的类型和严重性等因素。可以在临床试验中对剂量最为精确地确定。可以通过适当的技术，包括临床恶化迹象、图象等，监视患者的治疗效果。

提供以下实施例用于说明，而不是进行限制。

实施例

实施例1

细胞系和细胞培养

在这些研究中采用稳定转染了含有Bcl-2 cDNA(697-Bcl-2细胞)或对照新霉素抗性基因(697-neo细胞)(Miyashita和Reed，1993)(获自Dr.John Reed，Burnham Institute)的逆转录病毒表达结构的697人类类淋巴母细胞。这些细胞在补加有10％胎牛血清((FBS)Hyclone，Logan，UT)、0.2mg/ml G-418(Gibco，Gaithersburg，MD)和0.1mg/ml青霉素/链霉素(Irvine Scientific，Santa Aha，Ca)的RPMI 1640培养基(Irvine Scientific)中维持对数中期生长。将鼠多巴胺能MN9D细胞(获自芝加哥大学A.Heller博士)培养在补加了10％FBS、2mM谷氨酰胺和0.1mg/ml青霉素/链霉素的DMEM培养基(Irvine Scientific)中。在含有15mM HEPES的Hank氏缓冲盐溶液(Irvine Scientific)中，制备妊娠E15的小鼠大脑皮层细胞。用0.1％胰蛋白酶简单离解该组织，然后用补加了10％FBS和0.4mg/ml DNase I(Sigma，St.Louis，MO)的MEM培养基进行彻底洗涤，温和地将其磨碎之后使其快速冷冻。

实施例2

亚细胞分级分离

将含有≈10⁹个细胞的冷冻细胞团融化，然后重悬在补加有1mM PMSF、1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑胃酶肽A、5μg/ml抑酶肽、0.1mM EDTA、0.1mM EGTA和5mM DTT(Sigma)的冷低渗缓冲液(10mM Na-HEPES、5mMMgCl₂、42mM KCl，pH 7.4)中，密度为≈1.5×10⁸个细胞/ml。该样品在冰上孵育30分钟，在此期间用Dounce匀浆器以30-40次冲击裂解细胞。4℃500×g 10分钟离心该样品两次，分离细胞核。然后在补加了1.6M蔗糖的相同缓冲液中洗涤该细胞核沉淀两次，产生细胞核组分。然后将以上离心步骤的上清液于14,000×g、4℃离心30分钟，以沉淀重膜。用1.5ml含有蛋白酶抑制剂和DTT的冷低渗缓冲液洗涤该重膜3次。将洗涤过的膜重悬在低渗缓冲液中，使总蛋白质浓度为大约2mg/ml，从而产生重膜组分，将该组分快速冷冻或不经冷冻立即用于酶学测试。将该14,000×g离心的上清液在100,000×g、4℃离心30分钟，产生上清液(细胞质组分)和沉淀(轻膜组分)。蛋白质浓度的测量采用了BioRad的蛋白质分析试剂盒II，其中牛血清白蛋白作为校对标准品。在一些实验中，按上述裂解细胞沉淀，但没有冷冻步骤。为了测试细胞色素c对caspase活性的影响，在整个分离程序中用10μg/ml牛细胞色素c(Sigma Chemical，St.Louis，Mo)处理一些样品。在一些实验中，通过Mancini和其同事的大鼠肝线粒体方法(Mancini等，1998)从697-neo和697-Bcl-2细胞制备线粒体组分。

实施例3

免疫印迹

通过SDS-PAGE在12％或16％凝胶(Novex，La Jolla，CA)上分离亚细胞组分(每个泳道50μg蛋白质)，然后将其转移至Immobilon PVDF膜(Millipore，Bedford，MA)上。在PBS/0.1％Tween 20(PBST)+0.4％酪蛋白(I-block，Tropix，Bedford，MA)中对膜进行封闭。在用PBST/酪蛋白稀释的1μg/ml一抗中孵育印迹1小时。在PBST中洗涤3次之后，在用PBST/酪蛋白1∶15,000稀释的结合碱性磷酸酶的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(Tropix)中，孵育印迹1小时。然后用PBST洗涤印迹两次，在测试缓冲液(10mM二乙醇胺，pH10.0，1mM MgCl₂)中再洗涤两次，然后在测试缓冲液中与250μM化学发光底物CSPD(Tropix)一起孵育，并对Biomax胶片(Kodak，Rochester，NY)过夜曝光。

在一些情况中，二抗孵育后，用10mM Tris，pH9.5、1mM MgCl₂洗涤印迹。然后在溶解于Tris缓冲液的1.25μg/ml DDAO磷酸盐(Amersham，Arlington Heights，IL)中孵育该印迹30分钟。采用STORM荧光成像仪(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)扫描这些印迹。所用抗体为抗Bcl-2(Transduction Labs，Lexington，KY)、caspase-3(Srinivasan等，1998)、细胞色素c(Pharmingen，San Diego，CA)、细胞色素氧化酶、亚基IV(Molecular Probes，Portland，OR)、D4-GDP解离抑制剂(D4-GDI)(由G.Bokoch博士(Scripps Research Institute，La Jolla，CA)赠送)和多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(Enzyme Systems，Livermore，CA)的抗体。

实施例4

活性分析

通过在重复的Cytoplate孔中将50μl含有酶的组分和200μl ICE缓冲液(20mM HEPES、1mM EDTA、0.1％CHAPS、10％蔗糖、5mM DTT，pH7.5)中的25μM DEVD-amc(Asp-Glu-Val-Asp-氨基甲基香豆素)底物混合，测量caspase活性。采用CytoFluor 4000板读数器(Perseptive Biosystems，Framingham，MA)，通过30℃1-2个小时内荧光的增加(ex＝360nm，em＝460nm)检测产物的形成。对于动力学研究，在1-100μM的范围内改变底物浓度。对于抑制研究，在加入50μl 50μM的底物溶液之前，用150μl抑制剂室温预先处理该酶30分钟。抑制剂的IC₅₀值采用以下公式确定：

△FL/△t＝(△FL/△t)₀/(1+[I]/IC₅₀)△FL/△t是抑制剂浓度为[I]时观察到的初始荧光改变速度，(△FL/△t)₀是未受抑制的酶的初始荧光改变速度。

实施例5

激活分析

在有或没有1％NP-40的含有5mM DTT的低渗缓冲液或0.25M蔗糖、10mM MOPS、2mM EDTA(pH7.4)  (Mancini等，1998)中，将重膜样品稀释至1mg/ml。通过加入60-160ng/ml重组鼠caspase-1(细菌裂解物中)、2μg/ml纯化的人粒酶B(Enzyme Systems Products，Livermore，CA)或缓冲液，然后于30℃或37℃孵育该样品60分钟，诱导caspase的激活。在激活期之后，通过14,000×g、4℃离心10分钟从该样品中除去该重膜沉淀。用该外源酶的活性修正所获上清液中的DEVD-amc切割活性。为了检查膜来源caspase活性自发激活的时程，在96孔Cytofluor板中将含有50-100μg总蛋白的50μl重膜浆液与含有25μM DEVD-amc底物以及6mM DTT的200μl低渗缓冲液混合，然后在一段时间内测量荧光。在所选择的时间点上，从一些孔中取出等分试样，14,000×g离心10分钟以去除该重膜，然后将上清液加回该96孔板中以测量可溶性DEVD-amc裂解活性。在一些实验中，在测量caspase活性之前，用1μg/ml牛细胞色素c(Sigma)和50μM dATP(New England Biolabs，Beverly，MA)(终浓度)处理亚细胞组分。

实施例6

重组caspase的制备

将克隆的人caspase-3 cDNA(Fernandes-Alnemri等，1994)(由Thomas Jefferson大学的E.Alnemri提供)连接在pET21b(Novagen，Madison，WI)的Bam HI/Xho I位点中构建质粒，并将含有该质粒的BL21(DE3)细胞于37℃培养在1升含有0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。当培养物密度达到A₆₀₀=1时，加入IPTG(Sigma)至1mM的浓度，然后25℃孵育该培养物3个小时。通过4℃ 2,000×g离心15分钟收获细胞。在含有0.1mg/ml溶菌酶的100ml结合缓冲液(20mM TrisCl，500mM NaCl，5mM咪唑，0.1％tritonX-100)中采用一个冻融周期裂解这些细胞。通过4℃ 20,000×g离心30分钟从样品中去除细胞碎片。仅在离心前用MgCl₂和DNase I处理这些裂解的细胞，以降低粘度。上清液通过一个0.45μm针头滤器过滤，并以1ml/min的流速加载到一个1ml带Ni+²的HiTrap鏊合柱(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)上。用10ml结合缓冲液，之后用含有60mM咪唑的10ml结合缓冲液以1ml/min的流速洗涤该柱。采用30ml咪唑线性梯度(60-500 mM)从该柱上洗脱该caspase-3蛋白质。

采用含有pET3ap30mICEFLAG质粒(由H.R.Horvitz和Ding Xue(MIT)博士馈赠)的BL21(DE3)pLysS细胞表达重组鼠caspase-1，其中该质粒含有插入pET3a表达载体(Novagen)的NdeI/BamH I位点中的p30caspase-1 cDNA。在含有0.1mg/ml氨苄青霉素和0.025mg/ml氯霉素的诱导培养基(20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、6g/l NaCl、3g/l Na₂HPO₄、1g/l KH₂PO₄、1mM MgCl₂、0.1mM CaCl₂，pH7.4)中37℃培养3升培养物。当培养物密度达到A₆₀₀＝1.0时，加入IPTG至1mM，并于25℃振摇该培养物3个小时。4℃ 2000×g离心15分钟收集细胞，然后重悬在含有25mMTrisCl(pH8.0)、25mM KCl、0.1％triton X-100和0.1mg/ml溶菌酶(InovaTech，Abbottsford，B.C.，加拿大)的100ml冷缓冲液中。采用一个冻融周期裂解细胞，并通过用0.02mg/ml DNaseI、0.5mM MgCl₂(Sigma)处理样品60分钟，然后4℃ 20,000×g离心30分钟去除细胞碎片，以澄清裂解物。

实施例7

caspase的体外翻译

采用兔网织红细胞裂解物中的偶联转录/翻译系统和TNT试剂盒(Promega)，根据厂家推荐，在存在³⁵S-甲硫氨酸时通过体外翻译获得³⁵S-标记的caspase(野生型)。

实施例8

亚细胞组分的特性分析

从稳定转染了表达Bcl-2cDNA或新霉素抗性基因的逆转录结构的697细胞(分别是697-Bcl-2和697-neo细胞)(Miyashita和Reed，1993)，制备亚细胞组分。从这些细胞分离细胞核、重膜、轻膜和胞质组分，然后采用具有已知独特亚细胞分布的蛋白质的特异抗体，按实施例3所述方法通过Western印迹分析对这些膜组分进行特性分析。所用抗体是抗线粒体内膜所特异的细胞色素氧化酶(Tzagoloff，1982)、细胞核所特异的多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(Berger，1985)、细胞质所特异的D4-GDP解离抑制剂(D4-GDI)(Na等，1996)和Bcl-2的抗体。除了细胞色素氧化酶的免疫印迹通过化学荧光观察外，其余的免疫印迹通过化学发光在胶片上观察。

正如图1所显示的，几乎仅在重膜组分中发现线粒体标记物，仅在细胞核组分中发现细胞核标记物，而仅在细胞质组分中发现细胞质标记物。因此，所用的该分级分离方法产生了具有期望的标记物蛋白质亚细胞分布的组分。重要的是，不能检测到细胞核组分和膜组分中有细胞质污染，而且细胞核组分中仅检测到最小的线粒体污染(图1所显示的细胞核组分中的弥散D4-GDI反应条带是非特异的)。用抗人Bcl-2的抗体对来自697-neo细胞的组分进行Western分析(图1)，结果说明在细胞核和重膜组分中有强反应性，在轻膜组分中有较弱的反应性，而在细胞质中没有可检测的信号，这与前人的结果(Krajewski等，1993；Yang等，1995；Lithgow等，1994)是相符的。对来自697-Bcl-2细胞的组分进行的相似分析表现出显著的过表达。

实施例9

切割活性的亚细胞分布

预实验提示caspase活性与来源于未经刺激细胞的膜有关。为了确定这些caspase的亚细胞分布，将来自697-neo细胞的亚细胞组分与DEVD-amc底物一起孵育，然后测量随后2个小时内荧光的增加，对这些亚细胞组分中的caspase活性进行定量。除了caspase-2外，对于目前所分析过的所有caspase而言，DEVD-amc都是一个有用的底物(Talanian等，1997；以及未显示的资料)。尽管大多数DEVD-amc切割活性(约75％)存在于细胞质组分中，但在细胞核、重膜和轻膜组分中也发现了相当量的切割活性(图2A和2C)。对用neo对照或Bcl-2表达载体转染的697细胞的亚细胞组分中DEVD-amc切割活性进行分级分离，并分析每种亚细胞组分的caspase活性。柱状图中裂解活性的观察值是对于恒定细胞数目(图2A-2B)或mg蛋白质(图2C-2D)的标准化值。A和B中每个柱所标出的值指示了每种组分中存在的总切割活性的百分数。图2A-2D中的误差线指示两个独立679细胞制品的观察值范围。

每种组分中的主要DEVD-amc裂解活性实际上就是caspase的活性，因为特异的caspase抑制剂可以有效地阻断该活性(实施例13表1第1栏，以及未显示的资料)。

实施例10

Bcl-2对膜来源caspase活性的抑制

我们接着测试了多种亚细胞组分中Bcl-2对caspase活性的影响。当从697-Bcl-2细胞制备亚细胞组分，并将其与DEVD-amc底物一起孵育时，观察到与697-neo细胞相比细胞核和重膜组分中的caspase活性有实质性的降低(图2B)。当在每个细胞或每mg蛋白质的基础上测量该caspase活性时，该Bcl-2影响是明显的，并且导致这些组分中caspase活性的80-90％降低(图2B和2D)。Bcl-2表达对这些组分中caspase活性的影响是特异的，因为，在所观察到的细胞质或轻膜组分的caspase活性中，即使有抑制，这种抑制也是极为微弱的(图2A-2D)。这些观察提示，在697-neo培养物中该膜相关caspase活性并不单纯来源于在697-Bcl-2培养物中受到抑制的数目的少数比例凋亡细胞。如果这是事实的话，那么也应期望在来源于697-neo和697-Bcl-2细胞的细胞质组分之间观察到capase活性的较大差异。事实上，对照实验说明，当通过星形孢菌素处理诱导697-neo细胞进入细胞凋亡时，在细胞质中发现caspase活性有大的增加(资料未显示)。

Bcl-2抑制膜相关caspase活性的能力并不限制于697类淋巴母细胞，因为在Jurkat T细胞和FL5.12细胞中也观察到类似的影响(资料未显示)。由于本发明的数据和其它公开的研究均说明Bcl-2蛋白质主要存在于核被膜和重膜组分中(图1；Krajewski等，1993；Yang等，1995)，所以本发明的结果与如下可能性相符，即Bcl-2可能局部地起着调节该膜来源caspase活性的作用。在致力于开始分析这些机制时，我们进一步分析了该Bcl-2可抑制的膜来源caspase活性，并将我们的工作集中在重膜组分上。

实施例11

膜来源caspase活性的自发激活和膜释放

膜相关caspase活性可能是由于活性膜结合酶，或者是自发激活以及可溶性活性酶的释放造成的。因此，设计了一组实验以区别这两种可能性。首先，向从697-neo细胞新鲜制备的重膜(neo膜)中，室温下立即加入低渗缓冲液和DEVD-amc底物，然后测量90分钟内amc荧光的出现(图3A)。通过向含有20μM DEVD-amc(终浓度)的低渗缓冲液中加入20μg新鲜制备的膜，测量该DEVD-amc切割活性。室温下通过荧光的改变(ex＝360nm，em＝460nm)测量amc产物的形成。数据显示，在孵育的头15分钟内几乎没有可检测的荧光改变，但该延滞期后，amc产生的速度显著地增加(图3A)。这些结果说明，该新鲜制备的膜不含有活性caspase，但在孵育期间发生自发激活。为了评价该新激活的caspase是可溶性的还是膜结合的，在不同长度的时间期限(0-90分钟)内孵育膜，之后于10℃14,000×g离心样品10分钟，并采用DEVD-amc底物测定所获上清液的caspase活性。这些数据显示，最初上清液中几乎没有caspase活性，但之后出现可溶性caspase活性(图3B)。这些数据的定量分析说明，对于每份上清液，荧光呈线性增加，这提示一旦从膜中释放后就不再发生激活。而且，这些曲线的斜率(图3B)接近重膜浆液的进度曲线中相应时间点上的瞬时斜率(图3A)。因此，在该上清液组分中能够占有所有的caspase-3活性，这暗示所有的活性酶均已从膜中释放出来。与neo膜相反，来源于697-Bcl-2细胞的膜(Bcl-2膜)不能产生明显的DEVD-amc切割活性(图3A)。

实施例12

存在于重膜中的procaspase-3

Bcl-2膜中DEVD-amc切割活性的缺乏可能是由于没有可被激活的procaspase或是procaspase的激活受到抑制而引起的。由于所测量到的DEVD-amc切割活性实际上是由于caspase-3产生的(见下文)，所以为了区别这两者，首先用caspase-3的特异抗体(实施例3)对膜和胞质组分进行Western印迹分析。结果(图4)显示在neo膜和Bcl-2膜中存在强度相似的caspase-3活性条带，而且该条带具有近似于该procaspase酶原的期望大小。有趣的是，该膜来源条带的电泳迁移率比细胞质procaspase-3的电泳迁移率稍慢。

由于能够通过在大小亚基之间天冬氨酸残基位的蛋白水解切割激活procaspase(Srinivasula等，美国国家科学院院刊93：14486-14491，1996；Stennicke和Salvesen，生物化学杂志272：25719-25723，1997；Salvesen和Dixit，细胞91：443-446，1997)，所以为了进一步阐明neo膜和Bcl-2膜中procaspase-3的存在，我们尝试通过用外源caspase-1处理来激活这些组分。正如我们在上面显示的，当在我们的标准条件下测量时，来源于Bcl-2细胞的膜几乎没有表现出caspase活性。然而，用caspase-1处理Bcl-2膜引起酶活性的强诱导(图5)。在该实验中，来自697-Bcl-2细胞和697-neo细胞的重膜组分(含有50μg总蛋白)被重新悬浮起来，并用鼠caspase-1室温处理1小时。离心后，测量所获上清液中的DEVD-amc切割活性。通过从观察到的荧光中减去仅含有caspase-1的对照样品的荧光，用外源caspase-1活性修正caspase-1处理样品的DEVD-amc切割活性。图5中的误差线代表了3个独立实验的观察值的标准差。neo膜也被外源caspase-1激活。但重要的是，激活后，从Bcl-2和neo膜产生的caspase活性总是相似的，处于两倍的范围内(图5)。连同该procaspase-3的免疫印迹数据，该数据支持如下结论，即在neo膜和Bcl-2膜中存在类似水平的procaspase-3。

用caspase-1处理膜不仅激活内源性的caspase活性，而且将其从膜中释放出来，因为当通过离心除去该膜后该活性仍保留在上清液中(图5)。由于该caspase-1激活可以被200nM acYVAD-醛完全阻断(数据未显示)，在该浓度时acYVAD-醛抑制caspase-1而非膜caspase，所以该诱导和释放是由于caspase-1的蛋白水解活性造成的。这些结果说明，neo表达细胞和Bcl表达细胞含有相似量的能够被caspase-1激活的膜相关无活性procaspase。然而，没有外源caspase的处理，仅有来源于neo表达细胞的膜表现出自发的caspase激活。

实施例13

对诱导的和自发的caspase活性的特性分析

通过测量几种肽醛抑制剂对DEVD-amc切割的抑制，进一步定性该膜来源的caspase活性(表1)。来源于激活Bcl-2膜的DEVD-amc活性抑制IC₅₀值与来源于neo膜的活性抑制IC₅₀值十分相似，这提示caspase-1在两种膜制品中激活了相同的procaspase。而且，这些IC₅₀值与来源于neo膜的自发激活DEVD-amc活性的IC₅₀值相似，这提示该自发的和caspase-1诱导的活性来源于相同caspase。在所有情况下，该抑制数据与简单竞争抑制曲线很好地吻合，这提示所有的DEVD-amc活性都是从单一caspase而非酶混合物产生的。膜相关caspase的IC₅₀观察值与纯化的经完全加工过的重组人caspase-3的IC₅₀观察值极为相似。动力学测量也说明，膜来源caspase(10μM)解DEVD-amc的K_m值与用经完全加工过的caspase-3所观察到的相似(Nicholson等，自然376：37-43，1995)。亲和纯化的激活重膜caspase的N端微量序列分析证实，该酶的确是人caspase-3。

                 表1：来自各种细胞类型的重膜(HM)来源caspase

                   和重组人caspase-3：通过肽醛进行的抑制

                                     IC₅₀(nM)

      697-neo    697-neo HM  697 Bcl-2HM 皮层细胞HM  MN9D HM       r-抑制剂    HM(自发    (caspase-   (caspase-1  (caspase-1  (caspase-1处  caspase-3

      活性)      1处理的)    处理的)     处理的)     理的)         (His)₆DEVD-醛   2.3        2.8         1.3         1.0         0.72          1.0DFLD-醛   3.4        4.5         3.6         2.3         2.5           1.5YVAD-醛   ＞10,000   ＞10,000    ＞10,000    ＞10,000    ＞10,000      ＞10,000

为了确定膜相关caspase活性的存在是否是哺乳动物细胞的一般性质，测定来自另外两种细胞来源的重膜中DEVD-amc切割活性：小鼠E15初生大脑皮层细胞和小鼠多巴胺能MN9D细胞系(Choi等，神经生物学(Neurobiology)89：8943-8947，1992)。采用用于697细胞的相同程序制备重膜组分，并用caspase-1激活。这些组分含有与697细胞中观察到的每mg蛋白质切割活性相似的膜相关caspase活性(资料未显示)，而且caspase抑制剂阻断该活性的效力与使用697细胞来源的组分或重组caspase-3所观察到的类似(表1)。因此，膜来源的caspase活性并非特异存在于697细胞中，而似乎是一种更为普遍的现象。

实施例14

外源细胞色素c和膜相关procaspase-3

几个最近的报道显示，细胞色素c自线粒体的释放能够引起细胞质caspase-3的激活(Liu等，细胞86：147-157，1996；Li等，细胞91：479-489，1997)。其它报道显示，细胞色素c在细胞凋亡损伤后自线粒体中被释放出来，而Bcl-2能够抑制该释放(Kluck等，科学(Science)275：1132-1136，1997；Yang等，科学275：1129-1132，1997)。因此，在来自Bcl-2表达细胞和neo表达细胞的重膜之间所观察到的caspase活性差异可能仅反应了在重膜组分的制备期间或在这些组分随后的孵育期间Bcl-2对细胞色素c释放的抑制。为了研究此可能性，在存在外源细胞色素c的情况下进行细胞的分级分离，然后测量这是否影响了caspase的激活。如果Bcl-2膜由于Bcl-2对细胞色素c的隔离影响而具有低的caspase活性，那么在膜分级分离期间加入外源细胞色素c应使这些膜来源的caspase活性增加至在neo细胞来源的膜中所观察到的水平。因此，在从neo和Bcl-2表达细胞分级分离重膜的过程中，在Dounce匀浆后，将样品分成两份。一份用标准缓冲液加工，而另一份中加入10μg/ml牛细胞色素c，并用含有10μg/ml牛细胞色素c的该缓冲液悬浮和洗涤重膜。选择该细胞色素c浓度是因为它是初始细胞沉淀物中存在的细胞色素c的估计总量(Li等，生物化学杂志272：30299-30305，1997)。最后，将这些膜重新悬浮在加有50μM dATP的1μg/ml细胞色素c中，孵育并之后检测DEVD-amc切割活性。于30℃将经细胞色素c处理过的重膜以及细胞质组分等分试样与含有50μM dATP/1μg/ml细胞色素c的低渗缓冲液一起孵育40分钟，而未经细胞色素c处理的该膜和细胞质样品仅与缓冲液一起孵育。将每个样品离心，并测量上清液中DEVD-amc切割活性。图6中的数据代表了3次相同的实验(图6A)。将来自我们通常的未用细胞色素c制备的膜制品、且没有用细胞色素c和dATP进行孵育而产生的活性与该活性进行比较。

数据显示，在膜分级分离和孵育期间包含细胞色素c并不影响膜来源的caspase活性；在来自Bcl-2表达细胞的膜中该活性仍比neo膜中的该活性低，而且细胞色素c对neo膜来源的该caspase活性也没有影响(图6A)。尽管该细胞色素c处理没有激活该膜来源的caspase，但用外源caspase-1进行的随后处理仍能够激活该酶(数据未显示)。细胞色素c没有影响该膜caspase的激活，并非是由于制备的细胞色素c没有活性造成的，因为在分级分离和分析过程中来自neo和Bcl-2细胞的该细胞质组分的DEVD-amc切割活性受到所加入的细胞色素c的强烈激活(图6B)。因此，Bcl-2的表达抑制了膜相关procaspase-3的激活，但该作用不被外源细胞色素c的加入消除。而且，Bcl-2超量表达并不影响细胞色素c激活细胞质组分中caspase-3的能力。

实施例15

膜来源caspase的释放并非由细胞器的简单渗漏引起

近来的一个报道描述了在线粒体膜间间隙中存在procaspase-3(Mancini等，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)140：1485-1495，1998)。因此，可能该物质能够说明在含有线粒体的重膜组分中测量到的可激活caspase活性。而且，可能在697-neo细胞的膜组分中测量到的自发活性是由于从线粒体渗漏的活性caspase造成的，而从697-Bcl-2细胞分离的线粒体仅有较小的渗漏(Yang等，科学275：1129-1132，1997)。然而，几个实验均说明，所测量到的活性并非由线粒体渗漏造成的，而且该活性与Mancini等(同上)所描述的不同。

首先，检测在neo膜中加入1％ND-40是否影响自发活性水平或caspase-1或粒酶B诱导的活性水平。如果procaspase和/或活性caspase被隔离在细胞器中，那么可以合理地推测当存在NP-40时将测量到活性的增加。用1％NP-40处理已足以将存在于重膜制品中的几乎所有细胞色素c释放出来(数据未显示)。而且，Mancini和其同事显示，用1％NP-40处理他们的线粒体制品使得粒酶B可以裂解procaspase-3，而在没有去污剂时没有观察到裂解(Mancini等，细胞生物学杂志140：1485-1495，1998)。然而，本发明结果显示，1％NP-40对自发活性或用caspase-1或粒酶B处理所诱导的活性均几乎没有影响(图6A)。在该实验中，用180μl低渗溶液稀释160μl neo膜，然后用40μl 10％NP-40去污剂或dH₂O处理(终体积＝380μl)。通过加入20μl粒酶B或caspase-1裂解物或缓冲液，然后在30℃孵育60分钟，激活该稀释膜。激活后，通过离心去除重膜，并通过在各50μl的每个上清液中加入200μl在ICE缓冲液中的25μM DEVD-amc底物，测量每个样品的DEVD-amc切割活性(图7A)。

接着，为了分析来自697-Bcl-2细胞的膜制品是否可能是由于caspase隔离的增强而具有低的自发活性，我们将DEVD-amc加入Bcl-2和neo膜制品中，在单纯的缓冲液中或在加有1％NP-40的缓冲液中进行孵育，然后测量荧光的出现。在该实验中，通过将含有或不含1％NP-40去污剂的200μl在pH 7.5低渗缓冲液(含有4mM DTT)中的25μM DEVD-amc加入50μl新鲜制备的neo或Bcl-2膜中，测量NP-40对重膜催化的DEVD-amc水解进度曲线的影响。该结果显示，1％NP-40对荧光增加的数量或速度仅有微弱影响。无论是否存在1％NP-40，来源于697-Bcl-2细胞的制品都具有低的活性，这说明该低水平的活性并非是由于活性caspase的隔离引起的。

最后，我们采用Mancini等(1998)所描述的方法从697-neo和697-Bcl-2细胞制备了线粒体组分，以便更为直接地评价我们的结果和他们公开的数据之间的关系。在该实验中，通过加入粒酶B或缓冲液激活含有或不含1％NP-40的稀释膜60分钟，离心并分析DEVD-amc切割活性，该活性描述在图7A中。正如图7C所显示的，通过这些方法从697-neo和697-Bcl-2制备的组分在没有NP-40时具有能够被粒酶激活的caspase活性。然而，在1％NP-40存在时，粒酶B导致caspase活性的增强。因此，在这些情况下，粒酶B可以以独立于NP-40的方式和NP-40依赖性方式产生caspase活性。

从前文所述，应该理解，尽管本文为了说明的目的描述了本发明的具体实施方案，仍然可以进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明仅受所附权利要求的限制。

Claims (68)

1.用于鉴定膜来源的caspase活性的方法，包括在足以允许caspase活性形成的条件和时间下孵育含有重膜或核膜的膜组分，以及随后检测caspase的活性。

2.权利要求1的方法，其中caspase活性通过测量caspase底物的转化来检测。

3.权利要求2的方法，其中底物的转化通过时程分析测量。

4.权利要求2的方法，其中底物的转化通过终点分析测量。

5.权利要求2的方法，其中底物的转化通过选自荧光光谱学、质谱分析、HPLC、比色法、荧光自显影、放射显影、凝胶电泳、层析和N端肽测序的方法来检测。

6.权利要求1的方法，其中caspase活性通过确定caspase的加工来检测，所述加工导致产生大caspase亚基和小caspase亚基。

7.权利要求6的方法，其中大、小caspase亚基通过选自荧光光谱学、质谱分析、HPLC、比色法、荧光自显影、放射显影、凝胶电泳、层析和N端肽测序的方法检测。

8.权利要求1-7之任意一项的方法，其中该膜组分来源于非凋亡细胞。

9.权利要求1-7之任意一项的方法，其中该膜组分来源于经细胞凋亡刺激物处理过的细胞。

10.权利要求9的方法，其中该细胞凋亡刺激物选自：生长因子剥夺、星形孢菌素、抗fas抗体、紫外辐射、γ辐射和肿瘤坏死因子。

11.用于鉴定膜来源caspase活性的抑制剂的方法，包括在至少一种候选抑制剂存在和不存在时，将膜组分与caspase底物接触；然后比较caspase底物转化的水平，并由此鉴定膜来源的caspase活性的抑制剂。

12.权利要求11的方法，其中该caspase底物含有可被caspase切割的位点，且该底物选自蛋白质、多肽、寡肽、肽模拟物和肽。

13.权利要求12的方法，其中该底物含有肽DEVD。

14.权利要求11的方法，其中该膜组分是从未经刺激的选自下组的组织培养细胞制备的：697类淋巴母细胞、E15初生大脑皮层细胞、MN9D细胞、Jurkat T细胞和FL5.12细胞。

15.权利要求11的方法，其中该膜组分含有选自重膜和核膜的膜。

16.权利要求11的方法，其中该膜组分含有重膜。

17.权利要求11的方法，其中底物转化通过时程分析来检测。

18.权利要求11的方法，其中底物转化通过终点分析来检测。

19.权利要求17或18的方法，其中通过选自荧光光谱学、质谱分析、HPLC、比色法、荧光自显影、放射显影、凝胶电泳、层析和N端肽测序的方法检测caspase底物的转化。

20.权利要求11的方法，其中该膜组分来源于表达促细胞凋亡多肽的细胞。

21.权利要求11的方法，还包括在加入所述caspase底物之前或同时将该膜组分与caspase的激活物一起孵育。

22.权利要求11的方法，其中该膜组分来源于非凋亡细胞。

23.权利要求11的方法，其中该膜组分来源于经细胞凋亡刺激物处理过的细胞。

24.权利要求23的方法，其中该细胞凋亡刺激物选自：生长因子剥夺、星形孢菌素、抗fas抗体、紫外辐射、γ辐射和肿瘤坏死因子。

25.用于鉴定膜来源caspase活性的增强剂的方法，包括在至少一种候选增强剂存在和不存在时用caspase底物接触膜组分，然后比较caspase底物转化的水平，由此鉴定膜来源的caspase活性的增强剂。

26.权利要求25的方法，其中该caspase底物含有可被caspase切割的位点，且该底物选自蛋白质、多肽、寡肽、肽模拟物和肽。

27.权利要求26的方法，其中该底物含有肽DEVD。

28.权利要求25的方法，其中该膜组分是从未经刺激的选自下组的组织培养细胞制备的：697类淋巴母细胞、E15初生大脑皮层细胞、MN9D细胞、Jurkat T细胞和FL5.12细胞。

29.权利要求25的方法，其中该膜组分含有选自重膜和核膜的膜。

30.权利要求25的方法，其中该膜组分含有重膜。

31.权利要求25的方法，其中底物转化通过时程分析来检测。

32.权利要求25的方法，其中底物转化通过终点分析来检测。

33.权利要求31或32的方法，其中通过选自荧光光谱学、质谱分析、HPLC、比色法、荧光自显影、放射显影、凝胶电泳、层析和N端肽测序的方法检测caspase底物的转化。

34.权利要求25的方法，其中该膜组分来源于表达抗细胞凋亡多肽的细胞。

35.权利要求34的方法，其中该抗细胞凋亡多肽是Bcl-2 。

36.权利要求34的方法，还包括在加入所述caspase底物之前或同时将该膜组分与caspase的激活物一起孵育。

37.权利要求25的方法，其中该膜组分来源于非凋亡细胞。

38.权利要求25的方法，其中该膜组分来源于经细胞凋亡刺激物处理过的细胞。

39.权利要求38的方法，其中该细胞凋亡刺激物选自：生长因子剥夺、星形孢菌素、抗fas抗体、紫外辐射、γ辐射和肿瘤坏死因子。

40.权利要求25的方法，其中在加入该caspase底物之前或同时加入外源抗细胞凋亡多肽。

41.用于鉴定膜组分中caspase加工过程展开的抑制剂或增强剂的方法，包括用至少一种候选抑制剂或候选增强剂接触膜组分；和检测大、小caspase亚基的存在，并由此确定caspase加工的水平，其中加工水平的降低指示存在caspase加工抑制剂，而加工水平的增加则指示存在caspase加工增强剂。

42.权利要求41的方法，其中该膜组分是从未经刺激的选自下组的组织培养细胞制备的：697类淋巴母细胞、E15初生大脑皮层细胞、MN9D细胞、Jurkat T细胞和FL5.12细胞。

43.权利要求41的方法，其中该膜组分含有选自重膜和核膜的膜。

44.权利要求41的方法，其中该膜组分含有重膜。

45.权利要求41的方法，其中通过选自荧光光谱学、质谱分析、HPLC、比色法、荧光自显影、放射显影、凝胶电泳、层析和N端肽测序的方法检测大、小caspase亚基。

46.权利要求41的方法，其中该膜组分来源于表达抗细胞凋亡多肽的细胞。

47.权利要求46的方法，其中该抗细胞凋亡多肽是Bcl-2。

48.权利要求41的方法，其中该膜组分来源于非凋亡细胞。

49.权利要求41的方法，其中该膜组分来源于经细胞凋亡刺激物处理过的细胞。

50.权利要求49的方法，其中该细胞凋亡刺激物选自生长因子剥夺、星形孢菌素、抗fas抗体、紫外辐射、γ辐射和肿瘤坏死因子。

51.鉴定调节膜组分来源的caspase活性的化合物的方法，包括在足以允许caspase活性形成的条件和时间下，在至少一种候选化合物存在和不存在时，将膜组分、细胞凋亡抑制剂和caspase底物一起孵育；和比较caspase底物转化的水平，由此鉴定调节膜来源caspase活性的化合物。

52.权利要求51的方法，其中该caspase底物含有可被caspase切割的位点，且该底物选自蛋白质、多肽、寡肽、肽模拟物和肽。

53.权利要求52的方法，其中该底物含有肽DEVD-amc。

54.权利要求51的方法，其中该膜组分是从未经刺激的选自下组的组织培养细胞制备的：697类淋巴母细胞、E15初生大脑皮层细胞、MN9D细胞、Jurkat T细胞和FL5.12细胞。

55.权利要求51的方法，其中该膜组分含有选自重膜和核膜的膜。

56.权利要求51的方法，其中该膜组分含有重膜。

57.权利要求51的方法，其中底物转化通过时程分析来检测。

58.权利要求51的方法，其中底物转化通过终点分析来检测。

59.权利要求57或58的方法，其中通过选自荧光光谱学、质谱分析、HPLC、比色法、荧光自显影、放射显影、凝胶电泳、层析和N端肽测序的方法检测caspase底物的转化。

60.权利要求51的方法，其中该膜组分含有细胞凋亡的抑制剂。

61.权利要求60的方法，其中该膜组分来源于表达Bcl-2的细胞。

62.权利要求51的方法，其中该细胞凋亡抑制剂是Bcl-2多肽或其功能性片段。

63.权利要求51的方法，还包括在加入caspase底物之前或同时将该膜组分与caspase激活物一起孵育。

64.权利要求51的方法，其中该膜组分来源于非凋亡细胞。

65.权利要求51的方法，其中该膜组分来源于经细胞凋亡刺激物处理过的细胞。

66.权利要求65的方法，其中该细胞凋亡刺激物选自生长因子剥夺、星形孢菌素、抗fas抗体、紫外辐射、γ辐射和肿瘤坏死因子。

67.通过方法11和41之任意一种鉴定的膜来源caspase活性的抑制剂。

68.通过方法25和41之任意一种鉴定的膜来源caspase活性的增强剂。

Images