WO2019031444A1 - 細胞集団における特異的結合物質の占有率を測定する方法 - Google Patents

細胞集団における特異的結合物質の占有率を測定する方法 Download PDF

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豊史 柳原
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Definitions

  • the present invention relates to a method of measuring the occupancy of a specific binding substance in a cell population. More specifically, a method of measuring the occupancy of the specific binding substance in the cell population in contact with the specific binding substance, and measuring the occupancy of the specific binding substance in the cell population in contact with the specific binding substance Kit, method for obtaining data for optimizing administration interval or dose of antibody drug to a patient, method for obtaining data for optimizing administration interval or dose of nivolumab or pembrolizumab to a patient About.
  • Priority is claimed on Japanese Patent Application No. 2017-152735, filed Aug. 7, 2017, the content of which is incorporated herein by reference.
  • Nivolumab is an antibody drug that specifically binds to programmed death-1 (PD-1) present on the cell surface.
  • Immune checkpoint inhibitors such as nivolumab are approved for malignant melanoma, non-small cell lung cancer, renal cell cancer, Hodgkin's lymphoma, head and neck cancer, and have high social efficacy due to their high therapeutic effect. Bathed.
  • Non-Patent Document 1 reports the results of examining the pharmacokinetics of nivolumab.
  • Non-patent Document 1 since the method described in Non-patent Document 1 is complicated and it is necessary to use an expensive antibody preparation, it is considered that general spread is difficult. Then, this invention aims at providing the technique which measures the dynamics of a specific binding substance simply.
  • a method of measuring the occupancy rate of a first specific binding substance in a cell population comprising contacting the cell population with a second specific binding substance; Contacting the specific binding substance, measuring the number of cells bound by the second specific binding substance, and measuring the number of cells bound by the third specific binding substance
  • Each of the first, second and third specific binding substances is a specific binding substance that binds to a target cell surface protein, and the occupancy rate is that of cells expressing the target cell surface protein Among them, a ratio of cells to which the first specific binding substance is bound, and the second specific binding substance is a specific binding substance which competes with the first specific binding substance, and the third specific binding substance
  • the specific binding substance of A specific binding agent that binds to the target cell surface protein does not compete with the substance, the value calculated by the following formula (1) is the occupancy process.
  • Occupancy rate of first specific binding substance (%) (1 ⁇ (number of cells bound by the second specific binding substance / number of cells bound by the third specific binding substance)) ⁇ 100 (1)
  • the target cell surface protein is human programmed death-1 (PD-1), and the first specific binding substance is an anti-human PD-1 antibody.
  • PD-1 human programmed death-1
  • the first specific binding substance is nivolumab or pembrolizumab
  • the second specific binding substance is an anti-human PD-1 monoclonal antibody (clone EH12.2H7)
  • the third specific binding The method according to [5], wherein the substance is an anti-human PD-1 monoclonal antibody (clone MIH4).
  • a kit for measuring occupancy of a first specific binding substance in a cell population comprising a second specific binding substance and a third specific binding substance, said first, said first 2 and the third specific binding substance are both specific binding substances that bind to the target cell surface protein, and the occupancy rate is the first specificity among the cells expressing the target cell surface protein
  • the percentage of cells bound by the specific binding substance, the second specific binding substance is a specific binding substance that competes with the first specific binding substance
  • the third specific binding substance is A kit that is a specific binding substance that binds to the target cell surface protein without competing with the first specific binding substance.
  • the first specific binding substance is an antibody.
  • the first specific binding substance is nivolumab or pembrolizumab
  • the second specific binding substance is an anti-human PD-1 monoclonal antibody (clone EH12.2H7)
  • the third specific binding The kit according to [9], wherein the substance is an anti-human PD-1 monoclonal antibody (clone MIH4).
  • a method for obtaining data for optimizing the administration interval or dose of antibody drug to a patient comprising contacting cells derived from the patient to which the antibody drug is administered with a second specific binding substance Contacting a third specific binding substance with the cells derived from the patient to which the antibody drug has been administered, measuring the number of cells bound by the second specific binding substance, and Measuring the number of cells to which the specific binding substance of the present invention is bound, and the second and third specific binding substances are both specific binding substances which bind to the target protein of the antibody drug,
  • the second specific binding substance is a specific binding substance that competes with the antibody drug
  • the third specific binding substance binds to a target protein of the antibody drug without competing with the antibody drug.
  • Specific binding substance, and Occupancy of the antibody drugs which is calculated by the equation (2) is data for optimizing dose interval or dosage of the antibody drug to the patient, method.
  • Occupation ratio of the antibody drug (%) (1 ⁇ (number of cells bound to the second specific binding substance / number of cells bound to the third specific binding substance)) ⁇ 100 (2)
  • simultaneously measuring the number of cells bound by the second specific binding substance and counting the number of cells bound by the third specific binding substance, [11] or [12] The method described in.
  • Occupation ratio (%) of nivolumab or pembrolizumab (1-(number of cells bound by the second specific binding substance / number of cells bound by the third specific binding substance)) x 100 ... (3) [16] The method according to [15], wherein simultaneously contacting the second specific binding substance and contacting the third specific binding substance are carried out. [17] simultaneously measuring the number of cells bound by the second specific binding substance, and counting the number of cells bound by the third specific binding substance, [15] or [16] The method described in.
  • Experimental Example 1 it is a graph which shows the result of having analyzed the reactivity of anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7).
  • Experimental Example 1 it is a graph which shows the result of having analyzed the reactivity of anti-PD-1 antibody (clone MIH4).
  • FIG. 16 is a graph showing the results of calculating the competition rate of anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7 or clone MIH4) with nivolumab in Experimental Example 1.
  • FIG. In Experimental example 2 it is a graph which shows the result of having evaluated the reactivity of anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) after pretreating with various concentrations of anti-PD-1 antibody (clone MIH4).
  • Experimental example 3 it is a graph which shows the result of having evaluated the reactivity of anti-PD-1 antibody (clone MIH4) after pre-treating with various concentrations of anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7).
  • (A) to (e) are graphs showing the results of measurement of the occupancy rate of nivolumab in the MIT 9 cell line in Experimental Example 4. It is a graph which shows the occupancy rate of nivolumab measured in Experimental example 4, and the occupancy rate of actual nivolumab.
  • (A) to (e) are anti-PD-1 antibodies to T cells from healthy subjects prepared so that the occupancy rate of nivolumab becomes 0, 25, 50, 75, 100% in Experimental Example 5.
  • (A) to (d) are graphs showing the results of measurement of the occupancy rate of nivolumab in peripheral blood T cells of patients who did not receive nivolumab in Experimental Example 8.
  • (A) and (b) is a graph which shows the result of having measured the occupancy rate of nivolumab in peripheral blood T cells of a renal cancer patient who received nivolumab in Experimental Example 9.
  • (A) and (b) is a graph which shows the result of having measured the occupancy rate of pembrolizumab in peripheral blood T cells of a lung cancer patient who received pembrolizumab in Experimental Example 10.
  • the present invention is a method of measuring occupancy of a first specific binding substance in a cell population, comprising contacting the cell population with a second specific binding substance; Contacting a population with a third specific binding substance, measuring the number of cells bound by the second specific binding substance, and counting the number of cells bound by the third specific binding substance
  • the first, second and third specific binding substances are all specific binding substances that bind to a target cell surface protein, and the occupancy rate is the target cell surface
  • the percentage of cells in which the first specific binding substance is bound among the cells expressing the protein, and the second specific binding substance is a specific binding substance that competes with the first specific binding substance
  • the third specific binder Is a specific binding substance that binds to the target cell surface protein without competing with the first specific binding substance, and provides a method in which the value calculated by the following formula (1) is the occupancy rate Do.
  • Occupancy rate of first specific binding substance (%) (1 ⁇ (number of cells bound by the second specific binding substance
  • the inventors revealed that the kinetics of the specific binding substance can be conveniently measured by the method of the present embodiment.
  • a specific binding substance means a substance that specifically binds to a target substance, and examples include antibodies, antibody fragments, aptamers and the like.
  • the target substance includes, for example, cell surface proteins.
  • the specific binding substance may be a medicine to be administered to human or non-human animal.
  • the antibody may be produced by immunizing an animal such as a mouse, or may be produced by screening an antibody library such as a phage library.
  • an antibody fragment F (ab ') 2 , Fab', Fab, Fv, scFv and the like can be mentioned.
  • human antibodies include chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies and the like.
  • a chimeric antibody means an antibody whose variable region is an antibody derived from non-human animals and at least a part of its constant region is an antibody derived from human.
  • a humanized antibody means an antibody in which only the heavy chain and light chain complementarity determining regions are antibodies derived from non-human animals, and the constant regions and framework regions are antibodies derived from human.
  • a fully human antibody means an antibody derived entirely from human including the complementarity determining region.
  • the aptamer is not particularly limited as long as it is a substance having specific binding ability to a target substance, and includes a nucleic acid aptamer, a peptide aptamer and the like.
  • the first specific binding substance is a target whose kinetic is to be measured, and is a specific binding substance that binds to a target cell surface protein.
  • Specific examples of the first specific binding substance include antibodies.
  • the antibody may be an antibody drug.
  • the antibody drug may be, for example but not limited to, an immune checkpoint inhibitor such as nivolumab, pembrolizumab and the like.
  • the target cell surface protein is human PD-1. That is, the target cell surface protein may be human PD-1 and the first specific binding substance may be an anti-human PD-1 antibody.
  • the kinetics of the first specific binding substance can be conveniently measured by the method of the present embodiment.
  • the dynamics of the first specific binding substance is the occupancy of the first specific binding substance in the cell population.
  • the occupancy rate refers to the percentage (%) of cells to which the specific binding substance of interest (first specific binding substance) is bound among the cells expressing the target cell surface protein.
  • the cell population means a cell population to be measured for the occupancy rate of the first specific binding substance.
  • the cell population is usually cells contacted with the first specific binding substance.
  • the cell population includes a cell population derived from a patient who has been administered the antibody drug.
  • the cell population includes a cell population including cells to which the first specific binding substance binds, and is appropriately set depending on the binding target of the first specific binding substance.
  • Specific cell populations include, but are not limited to, for example, peripheral blood lymphocytes, lymphocytes derived from pleural fluid, lymphocytes derived from alveolar lavage fluid, and the like.
  • the second specific binding substance is a specific binding substance that binds to a cell surface protein to which the first specific binding substance binds. Also, the second specific binding substance competes with the first specific binding substance for binding to the target cell surface protein. That is, when the first specific binding substance is bound to the target cell surface protein, the second specific binding substance can not substantially bind to the target cell surface protein.
  • substantially impossible means that even if the target cell surface protein is bound to the first specific binding substance, the first specific binding substance is dissociated to obtain the second specific binding substance. Is meant to allow a slight presence of binding to the cell surface protein of interest. However, when the first specific binding substance is bound to the target cell surface protein, it is preferable that the second specific binding substance can not bind to the target cell surface protein.
  • the epitope of the second specific binding substance is identical to or close to the epitope of the first specific binding substance, and the dissociation constant (Kd) of the first specific binding substance to the target cell surface protein Is preferably smaller than the dissociation constant (Kd) of the second specific binding substance to the target cell surface protein.
  • Kd dissociation constant
  • the third specific binding substance is a specific binding substance that binds to a cell surface protein to which the first specific binding substance binds. Also, the third specific binding substance does not compete with the first specific binding substance for binding to the target cell surface protein. That is, even if the target cell surface protein is bound to the first specific binding substance, the third specific binding substance can bind to the target cell surface protein.
  • the epitope of the third specific binding substance is separated from the epitope of the first specific binding substance, and the binding of the third specific binding substance to the target cell surface protein is the first specific It hardly affects the binding of the binding substance to the target cell surface protein.
  • the first specific binding substance is nivolumab or pembrolizumab
  • the second specific binding substance is an anti-human PD-1 monoclonal antibody (clone EH12.2H7)
  • the third specific binding substance is an anti It may be a human PD-1 monoclonal antibody (clone MIH4).
  • the combination of these antibodies can be used to conveniently measure the kinetics of nivolumab or pembrolizumab.
  • Step of contacting the second specific binding substance In this step, the cell population is contacted with a second specific binding substance. As a result, when the first specific binding substance has already bound to the target cell surface protein, the second specific binding substance does not bind. In addition, when the first specific binding substance is not bound to the target cell surface protein, the second specific binding substance is bound. As described later, the timing at which this process is performed may be changed as appropriate.
  • Step of contacting the third specific binding substance In this step, the cell population is contacted with a third specific binding substance. As a result, regardless of whether or not the first specific binding substance is bound to the target cell surface protein, the third specific binding substance binds to the target cell surface protein. Thus, the third specific binding substance will bind to all cells in the cell population that have expressed the cell surface protein of interest. As described later, the timing at which this process is performed may be changed as appropriate.
  • Step of measuring the number of cells bound to the second specific binding substance In this step, the number of cells bound to the second specific binding substance is counted. For example, it is convenient to label the second specific binding substance with a fluorescent dye and measure the number of cells bound by the second specific binding substance by flow cytometry. This step may be performed after the step of contacting the second specific binding substance, and as described later, the timing of performing this step may be changed as appropriate.
  • Step of measuring the number of cells bound to the third specific binding substance In this step, the number of cells to which the third specific binding substance is bound is counted. By measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound, the number of cells expressing the target cell surface protein can be measured. For example, it is convenient to label the third specific binding substance with a fluorescent dye and measure the number of cells to which the third specific binding substance is bound by flow cytometry.
  • This step may be performed after the step of contacting the third specific binding substance, and as described later, the timing of performing this step may be changed as appropriate.
  • Occupancy rate of first specific binding substance (%) (1 ⁇ (number of cells bound by the second specific binding substance / number of cells bound by the third specific binding substance)) ⁇ 100 (1)
  • 100% occupancy means that the first specific binding substance is bound to all cells in the cell population that have expressed the target cell surface protein. In this case, since the first specific binding substance is bound to the target cell surface protein, the second specific binding substance can not bind.
  • an occupancy rate of 80% means that 80% of cells expressing the target cell surface protein in the cell population are bound to the first specific binding substance. In this case, in the remaining 20% of the cells expressing the target cell surface protein, the first specific binding substance is not bound, and the second specific binding substance is bound.
  • Either the step of contacting the second specific binding substance or the step of contacting the third specific binding substance may be performed first.
  • the step of contacting the second specific binding substance may be performed followed by the step of contacting the third specific binding substance, or the reverse order may be made.
  • the step of contacting the second specific binding substance and the step of contacting the third specific binding substance may be performed simultaneously.
  • contacting the second specific binding substance by putting the cell population, the second specific binding substance and the third specific binding substance into contact in the same test tube, and the third step The step of contacting a specific binding substance can be performed simultaneously.
  • any of the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed first.
  • the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound may be performed, and then the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed. May be
  • the steps of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed simultaneously.
  • the second specific binding substance and the third specific binding substance are distinguishably labeled, and the cell population in contact with the second specific binding substance and the third specific binding substance is flow site.
  • the analysis of the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of counting the number of cells to which the third specific binding substance is bound can be simultaneously carried out by analyzing by measurement etc.
  • the step of contacting the second specific binding substance, the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound, the step of contacting the third specific binding substance, the third specific binding substance may be performed in this order.
  • the step of contacting a third specific binding substance, the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound, the step of contacting a second specific binding substance, a second specific binding substance may be performed in this order.
  • the cells to which the third specific binding substance is bound are recovered by using a cell sorter or the like, and then the recovered cells are brought into contact with the second specific binding substance, the second specific A step of measuring the number of cells bound with the binding substance may be performed.
  • a step of contacting other specific binding substances such as an anti-CD3 antibody is carried out, and the other specific binding substance is carried out.
  • the occupancy of the first specific binding substance may be measured for the cell population to which is bound. For example, the occupancy of the first specific binding substance may be calculated after gating on a cell population to which another specific binding substance is bound.
  • specific binding substances are not limited to anti-CD3 antibodies, and specific binding substances to any antigen can be used. By reacting other specific binding substances, it is also possible to analyze the expression of a specific antigen while measuring the occupancy of the first specific binding substance.
  • the method of this embodiment can be applied to, for example, a method of acquiring data for optimizing the administration interval or dose of antibody drug to a patient.
  • the above-described method may be performed using cells derived from a patient to which an antibody drug has been administered as a cell population.
  • the method is the same as that described above except that the first specific binding substance is an antibody drug.
  • the first specific binding substance is an antibody drug.
  • the administration interval of the antibody drug to the patient when the occupancy rate is higher than the reference value, the administration interval of the antibody drug to the patient may be lengthened or the dosage may be decreased. In addition, when the occupancy rate is lower than the reference value, the administration interval of the antibody drug to the patient may be shortened or the dose may be increased.
  • the present invention is a kit for measuring occupancy of a first specific binding substance in a cell population, comprising a second specific binding substance and a third specific binding substance.
  • Each of the first, second, and third specific binding substances is a specific binding substance that binds to a target cell surface protein, and the occupancy rate is a percentage of cells expressing the target cell surface protein.
  • a ratio of cells to which the first specific binding substance is bound, and the second specific binding substance is a specific binding substance which competes with the first specific binding substance, and the third specific binding substance
  • the specific binding substance provides a kit, which is a specific binding substance that binds to the target cell surface protein without competing with the first specific binding substance.
  • the cell population, the first, second and third specific binding substances, and the target cell surface protein are the same as those described above. That is, specific examples of the first specific binding substance include antibodies.
  • the target cell surface protein may be human PD-1 and the first specific binding substance may be an anti-human PD-1 antibody.
  • the first specific binding substance is nivolumab or pembrolizumab
  • the second specific binding substance is an anti-human PD-1 monoclonal antibody (clone EH12.2H7)
  • the third specific binding substance is an anti-human It may be a PD-1 monoclonal antibody (clone MIH4).
  • kits can conveniently measure the kinetics of nivolumab or pembrolizumab in cell populations.
  • the present invention is a method of acquiring data for optimizing the administration interval or dose of antibody drug to a patient, wherein the second specificity to cells derived from the patient to which the antibody drug has been administered.
  • a specific binding substance contacting the cell from the patient to which the antibody drug is administered with a third specific binding substance, and measuring the number of cells bound by the second specific binding substance
  • a step of measuring the number of cells bound by the third specific binding substance wherein both the second and the third specific binding substances bind to a target protein of the antibody drug.
  • the specific binding substance, the second specific binding substance is a specific binding substance that competes with the antibody drug
  • the method of the present embodiment it is possible to simply measure the kinetics of the antibody drug and obtain data for optimizing the administration interval or dose of the antibody drug to the patient.
  • the method of the present embodiment does not include the steps determined by the doctor.
  • optimization of the administration interval or dose of the antibody drug can be referred to as individualization of the administration interval or dose of the antibody drug. That is, the method of the present embodiment can provide data for determining the optimal administration interval or dose of antibody drug depending on individual patients. This makes it possible, for example, to predict how long the risk of adverse events is at risk if the patient develops a serious immune related adverse event. In addition, by enabling the use of an appropriate amount of antibody drug, it becomes possible to suppress the cost of expensive antibody drug, and the like.
  • cells from patient are appropriately selected depending on the characteristics of the antibody drug, for cells derived from a patient.
  • cells derived from patients include, but are not limited to, peripheral blood lymphocytes, lymphocytes derived from pleural fluid, lymphocytes derived from alveolar lavage fluid, and the like.
  • the first specific binding substance in the embodiment of “the method of measuring the occupancy of the first specific binding substance in the cell population” described above is an antibody drug
  • Either the step of contacting two specific binding substances or the step of contacting a third specific binding substance may be performed first.
  • the step of contacting the second specific binding substance may be performed followed by the step of contacting the third specific binding substance, or the reverse order may be made.
  • the step of contacting the second specific binding substance and the step of contacting the third specific binding substance may be performed simultaneously.
  • contacting the second specific binding substance by placing cells from a patient, the second specific binding substance and the third specific binding substance in the same test tube, and bringing them into contact with each other; The step of contacting three specific binding substances can be performed simultaneously.
  • any of the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed first.
  • the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound may be performed, and then the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed. May be
  • the steps of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed simultaneously.
  • cells derived from a patient, which are distinguishably labeled with the second specific binding substance and the third specific binding substance, respectively, and contacted with the second specific binding substance and the third specific binding substance The steps of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound can be simultaneously performed by analyzing by flow cytometry or the like. .
  • the step of contacting the second specific binding substance, the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound, the step of contacting the third specific binding substance, the third specific binding substance may be performed in this order.
  • the step of contacting a third specific binding substance, the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound, the step of contacting a second specific binding substance, a second specific binding substance may be performed in this order.
  • the cells to which the third specific binding substance is bound are recovered by using a cell sorter or the like, and then the recovered cells are brought into contact with the second specific binding substance, the second specific A step of measuring the number of cells bound with the binding substance may be performed.
  • a step of contacting other specific binding substances such as an anti-CD3 antibody is carried out, and the other specific binding substance is carried out.
  • the occupancy rate of antibody drug may be measured for the cell population to which is bound. For example, the occupancy rate of antibody drug may be calculated after gating on a cell population to which another specific binding substance is bound.
  • specific binding substances are not limited to anti-CD3 antibodies, and specific binding substances to any antigen can be used. By reacting other specific binding substances, it is also possible to analyze the expression of a specific antigen while measuring the occupancy rate of antibody drug.
  • the occupancy rate of the antibody drug is data for optimizing the administration interval or dose of the antibody drug to the patient. And, if the occupancy rate is higher than the reference value, it indicates that the administration interval of the antibody drug to the patient should be lengthened or the dosage should be decreased.
  • the reference value of the occupancy rate is, for example, an optimum value of the occupancy rate set in advance.
  • the optimal value of the occupancy rate is, for example, the occupancy rate at which the therapeutic effect of the disease by the antibody drug is maximized and side effects such as immune related adverse events are minimized.
  • the occupancy rate of the antibody drug in the cells of the patient can be set as a reference value by prolonging the administration interval of the antibody drug to the patient or decreasing the dose of the antibody drug to the patient. It can be approached.
  • the occupancy rate of the antibody drug in the cells of the patient can be set as a reference value by shortening the administration interval of the antibody drug to the patient or increasing the dose of the antibody drug to the patient. It can be approached.
  • the present invention is a method of obtaining data for optimizing the administration interval or dose of nivolumab or pembrolizumab to a patient, wherein the second method is performed on cells derived from a patient to whom nivolumab or pembrolizumab has been administered.
  • the method of the present embodiment it is possible to simply measure the kinetics of nivolumab or pembrolizumab and obtain data for optimizing the administration interval or dose of nivolumab or pembrolizumab to a patient.
  • the method of the present embodiment does not include the steps determined by the doctor.
  • optimization of the administration interval or dose of nivolumab or pembrolizumab can be referred to as individualizing the administration interval or dose of nivolumab or pembrolizumab. That is, the method of the present embodiment can provide data for determining the optimal administration interval or dose of nivolumab or pembrolizumab depending on individual patients. This makes it possible, for example, to predict how long the risk of adverse events is at risk if the patient develops a serious immune related adverse event. In addition, by enabling the use of appropriate amounts of nivolumab or pembrolizumab, it becomes possible to suppress the cost of expensive antibody medicine and the like.
  • cells from patient examples include peripheral blood lymphocytes, lymphocytes derived from pleural fluid, and lymphocytes derived from alveolar lavage fluid.
  • the first specific in the embodiment of the “method of measuring the occupancy of the first specific binding substance in the cell population” described above Similar second and third specific binding agents can be used where the binding agent is nivolumab or pembrolizumab.
  • the second specific binding substance includes anti-human PD-1 monoclonal antibody (clone EH12.2H7).
  • an anti-human PD-1 monoclonal antibody (clone MIH4) can be mentioned.
  • the inventors revealed that the occupancy rate of nivolumab and pembrolizumab can be measured by using these antibodies.
  • the step of contacting the second specific binding substance or the step of contacting the third specific binding substance may be performed first.
  • the step of contacting the second specific binding substance may be performed followed by the step of contacting the third specific binding substance, or the reverse order may be made.
  • the step of contacting the second specific binding substance and the step of contacting the third specific binding substance may be performed simultaneously. For example, contacting the second specific binding substance by placing cells from a patient, the second specific binding substance and the third specific binding substance in the same test tube, and bringing them into contact with each other; The step of contacting three specific binding substances can be performed simultaneously.
  • any of the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed first.
  • the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound may be performed, and then the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed. May be
  • the steps of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound may be performed simultaneously.
  • cells derived from a patient, which are distinguishably labeled with the second specific binding substance and the third specific binding substance, respectively, and contacted with the second specific binding substance and the third specific binding substance The steps of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound and the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound can be simultaneously performed by analyzing by flow cytometry or the like. .
  • the step of contacting the second specific binding substance, the step of measuring the number of cells to which the second specific binding substance is bound, the step of contacting the third specific binding substance, the third specific binding substance may be performed in this order.
  • the step of contacting a third specific binding substance, the step of measuring the number of cells to which the third specific binding substance is bound, the step of contacting a second specific binding substance, a second specific binding substance may be performed in this order.
  • the cells to which the third specific binding substance is bound are recovered by using a cell sorter or the like, and then the recovered cells are brought into contact with the second specific binding substance, the second specific A step of measuring the number of cells bound with the binding substance may be performed.
  • a step of contacting other specific binding substances such as an anti-CD3 antibody is carried out, and the other specific binding substance is carried out.
  • the occupancy rate of antibody drug may be measured for the cell population to which is bound. For example, occupancy rates of nivolumab or pembrolizumab may be calculated after gating on cell populations to which other specific binding substances are bound.
  • specific binding substances are not limited to anti-CD3 antibodies, and specific binding substances to any antigen can be used. By reacting other specific binding substances, it is also possible to analyze the expression of a specific antigen while measuring the occupancy rate of nivolumab or pembrolizumab.
  • the occupancy rate of nivolumab or pembrolizumab is data for optimizing the administration interval or dose of nivolumab or pembrolizumab to a patient. And, if the occupancy rate is higher than the reference value, it indicates that the administration interval of nivolumab or pembrolizumab to the patient should be extended or that the dosage should be decreased.
  • the reference value of the occupancy rate is, for example, an optimum value of the occupancy rate set in advance.
  • the optimal value of occupancy rate is, for example, an occupancy rate at which the treatment effect of the disease with nivolumab or pembrolizumab is maximized and side effects such as immune related adverse events are minimized.
  • the optimal value of the nivolumab or pembrolizumab occupancy rate can be appropriately set according to the condition of the patient etc., and may be, for example, 90%, for example, 95%, for example, 98%.
  • the occupancy rate of nivolumab or pembrolizumab is higher than the reference value, this means that the dose of nivolumab or pembrolizumab is sufficient or excessive. Therefore, in such a case, the occupancy rate of nivolumab or pembrolizumab in the cells of the patient can be increased by prolonging the administration interval of nivolumab or pembrolizumab to the patient, or decreasing the dose of nivolumab or pembrolizumab to the patient. It can be close to the reference value.
  • the occupancy rate of the antibody drug in the cells of the patient can be set as a reference value by shortening the administration interval of the antibody drug to the patient or increasing the dose of the antibody drug to the patient. It can be approached.
  • the present invention is a method of optimizing the administration interval or dose of antibody drug to a patient, wherein cells derived from the patient to which the antibody drug is administered are contacted with a second specific binding substance.
  • a third specific binding substance with the cells derived from the patient to which the antibody drug has been administered, measuring the number of cells bound by the second specific binding substance, and Measuring the number of cells to which the specific binding substance of the present invention is bound, and the second and third specific binding substances are both specific binding substances which bind to the target protein of the antibody drug
  • the second specific binding substance is a specific binding substance that competes with the antibody drug
  • the third specific binding substance binds to a target protein of the antibody drug without competing with the antibody drug.
  • Occupation ratio of the antibody drug (%) (1 ⁇ (number of cells bound to the second specific binding substance / number of cells bound to the third specific binding substance)) ⁇ 100 (2)
  • contacting the second specific binding substance and contacting the third specific binding substance may be performed simultaneously. Also, it may be performed simultaneously to count the number of cells bound by the second specific binding substance and to count the number of cells bound by the third specific binding substance.
  • the present invention is a method of optimizing the administration interval or dose of nivolumab or pembrolizumab to a patient, wherein the second specific binding substance is applied to cells derived from a patient to whom nivolumab or pembrolizumab has been administered.
  • nivolumab or pembrolizumab Contacting, contacting the cells from the patient to whom nivolumab or pembrolizumab has been administered with a third specific binding substance, counting the number of cells bound by the second specific binding substance, Measuring the number of cells to which the third specific binding substance has bound, and the second and third specific binding substances are both specific binding substances that bind to human PD-1
  • said second specific binding substance is a specific binding substance which competes with nivolumab or pembrolizumab
  • said third specific binding substance is nivolumab or A specific binding substance that binds to human PD-1 without competing with mubrolizumab, and the nivolumab or pembrolizumab occupancy rate calculated by the following formula (3) is higher than a reference value, the nivolumab or patient to the patient
  • contacting the second specific binding substance and contacting the third specific binding substance may be performed simultaneously. Also, it may be performed simultaneously to count the number of cells bound by the second specific binding substance and to count the number of cells bound by the third specific binding substance.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L of phosphate buffer (PBS). Subsequently, 1 ⁇ g / mL of PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7, Biolegend) was added to each cell, and reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • PBS phosphate buffer
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, the binding of PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) to each cell was analyzed using a flow cytometer (model “FACS Verse”, BD Biosciences).
  • FIG. 1 is a graph showing analysis results. As a result, it was revealed that the binding amount of PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) to MIT9 cells decreased as the concentration of nivolumab initially reacted increases.
  • PE-labeled anti-PD-1 antibody clone EH12.2H7
  • anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) competes with nivolumab.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS.
  • PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4, eBioscience) was added at 2 ⁇ g / mL to each cell, and reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, the binding of PE labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) to each cell was analyzed using a flow cytometer (model “FACS Verse”, BD Biosciences).
  • FIG. 2 is a graph showing the analysis result. As a result, it became clear that PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) binds to MIT 9 cells regardless of the concentration of nivolumab initially reacted.
  • PE-labeled anti-PD-1 antibody clone MIH4
  • FIG. 3 is a graph showing the result of calculating the competition rate of anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7 or clone MIH4) with nivolumab based on the analysis results shown in FIG. 1 and FIG.
  • the competition rate was calculated by the following equation (4).
  • Competition rate (%) (total cell number-anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7 or clone MIH4) positive cell number) / total cell number ⁇ 100 (4)
  • PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4, eBioscience) is added at 0, 1.25, 2.5, 5, 10 and 20 ⁇ g / mL to each of the aliquoted cells, and the mixture is added at 4 ° C. It was made to react for 20 minutes.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, 4 ⁇ g / mL of AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7, Biolegend) was added to each cell, and reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody clone EH12.2H7, Biolegend
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, the binding of AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) to each cell was analyzed using a flow cytometer (model “FACS Verse”, BD Biosciences).
  • FIG. 4 is a graph showing the analysis result. As a result, it became clear that the AlexaFluor 488 labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) binds to MIT 9 cells regardless of the concentration of the PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) initially reacted .
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, 10 ⁇ g / mL of PE labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4, eBioscience) was added to each cell, and reacted at 4 ° C. for 20 minutes.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, the binding of PE labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) to each cell was analyzed using a flow cytometer (model “FACS Verse”, BD Biosciences).
  • FIG. 5 is a graph showing the analysis result.
  • PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) binds to MIT 9 cells regardless of the concentration of AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) initially reacted .
  • nivolumab 10 ⁇ g / mL nivolumab was added to MIT 9 cell line and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Subsequently, cells were washed three times with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, the MIT 9 cell line reacted with nivolumab is mixed with the MIT 9 cell line not reacted with nivolumab such that the ratio of the MIT 9 cell line reacted with nivolumab is 0, 25, 50, 75, 100%. Then, 2 ⁇ 10 5 pieces were dispensed into each tube. This resulted in an MIT 9 cell line with an occupancy rate of nivolumab of 0, 25, 50, 75, 100%, respectively.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, binding of AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) and PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) to each cell was performed using a flow cytometer (model "FACS Verse", BD Biosciences, Inc. ) was used to analyze.
  • FIGS. 6 (a) to 6 (e) are graphs showing analysis results.
  • FIGS. 6 (a) to 6 (e) show the results of MIT 9 cell lines prepared so that the occupancy rate of nivolumab is 0, 25, 50, 75, 100%, respectively.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity of AlexaFluor 488
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of PE.
  • nivolumab (1- (proportion of cells bound by anti-PD-1 antibody (EH12.2H7) / proportion of cells bound by anti-PD-1 antibody (clone MIH4)) ⁇ 100 3A)
  • FIG. 7 is a graph showing the occupancy rate of nivolumab calculated by the above equation (3A) and the occupancy rate of actual nivolumab. As a result, it was confirmed that the occupancy rate of nivolumab calculated by the above equation (3A) matches well with the actual occupancy rate of nivolumab. This result shows that the occupancy rate of nivolumab can be measured by the method of the present experimental example.
  • nivolumab 10 ⁇ g / mL nivolumab was added to peripheral blood lymphocytes and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Subsequently, to peripheral blood lymphocytes reacted with nivolumab, the percentage of peripheral blood lymphocytes reacted with nivolumab becomes 0, 25, 50, 75, 100%. The mixture was mixed as such, and aliquoted 5 ⁇ 10 5 into tubes. This resulted in peripheral blood lymphocytes with nivolumab occupancy of 0, 25, 50, 75, 100%, respectively.
  • Human BD Fc Block (0.5 ⁇ g / mL, BD Biosciences) was added to each cell and reacted at 4 ° C. for 10 minutes.
  • APC allophycocyanin
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, binding of AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) and PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) to each cell was performed using a flow cytometer (model "FACS Verse", BD Biosciences, Inc. ) was used to analyze.
  • FIGS. 8 (a) to 8 (e) are graphs showing analysis results.
  • CD3 positive cells were gated to show the analysis results of only T cells.
  • FIGS. 8 (a) to 8 (e) show the results of peripheral blood lymphocytes prepared so that the occupancy rate of nivolumab is 0, 25, 50, 75, 100%, respectively.
  • the vertical axis indicates the number of cells, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of AlexaFluor 488.
  • the occupancy rate of nivolumab was calculated by following formula (3A) based on the analysis result by a flow cytometer.
  • Occupation ratio of nivolumab (%) (1- (proportion of cells bound by anti-PD-1 antibody (EH12.2H7) / proportion of cells bound by anti-PD-1 antibody (clone MIH4)) ⁇ 100 3A)
  • FIG. 9 is a graph showing the occupancy rate of nivolumab calculated by the above formula (3A) and the occupancy rate of actual nivolumab. As a result, it was confirmed that the occupancy rate of nivolumab calculated by the above equation (3A) matches well with the actual occupancy rate of nivolumab. The results show that the method of the present experimental example can measure the occupancy rate of nivolumab in human T cells.
  • the patient's pleural fluid-derived lymphocytes 12 days after the administration of nivolumab, and the lymphocytes derived from the alveolar lavage fluid of the patient 21 days after the administration of nivolumab were collected. Also, for comparison, lymphocytes derived from pleural fluid of patients who did not receive nivolumab were collected. Subsequently, 5 ⁇ 10 5 lymphocytes were dispensed into each tube.
  • Human BD Fc Block (0.5 ⁇ g / mL, BD Biosciences) was added to each cell and reacted at 4 ° C. for 10 minutes.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, binding of AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) and PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) to each cell was performed using a flow cytometer (model "FACS Verse", BD Biosciences, Inc. ) was used to analyze.
  • FIGS. 10 (a) to 10 (c) are graphs showing analysis results.
  • CD3 positive cells were gated to show the analysis results of only T cells.
  • Fig. 10 (a) shows the results of analysis of pleural fluid-derived T cells from patients who did not receive nivolumab
  • Fig. 10 (b) shows the pleural fluid-derived T cells of patients 12 days after administration of nivolumab.
  • FIG. 10 (c) shows the results of analysis of T cells derived from the alveolar lavage fluid of the patient 21 days after administration of nivolumab.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity of AlexaFluor 488
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of PE.
  • the occupancy rate of nivolumab was calculated by following formula (3A) based on the analysis result by a flow cytometer.
  • Occupation ratio of nivolumab (%) (1- (proportion of cells bound by anti-PD-1 antibody (EH12.2H7) / proportion of cells bound by anti-PD-1 antibody (clone MIH4)) ⁇ 100 3A)
  • the occupancy rate of nivolumab was calculated to be 1%. This value was considered to be an error.
  • the occupancy rate of nivolumab was calculated to be 99.9% in the pleural fluid-derived T cells 12 days after the administration of nivolumab.
  • the occupancy rate of nivolumab was calculated to be 96.0% in the alveolar lavage fluid-derived T cells of the patient 21 days after administration of nivolumab.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, binding of AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) and PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) to each cell was performed using a flow cytometer (model "FACS Verse", BD Biosciences, Inc. ) was used to analyze.
  • FIGS. 11 (a) to 11 (e) are graphs showing analysis results.
  • FIGS. 11 (a) to 11 (e) show the results of MIT 9 cell lines prepared so that the occupancy rate of pembrolizumab is 0, 25, 50, 75, and 100%, respectively.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity of AlexaFluor 488
  • the horizontal axis shows the fluorescence intensity of PE.
  • Pembrolizumab occupancy rate (%) (1- (proportion of cells bound by anti-PD-1 antibody (EH12.2H7) / proportion of cells bound by anti-PD-1 antibody (clone MIH4)) ⁇ 100 ... 3B)
  • FIG. 12 is a graph showing the occupancy rate of pembrolizumab calculated by the above equation (3B) and the occupancy rate of actual pembrolizumab. As a result, it was confirmed that the occupancy rate of pembrolizumab calculated by the above equation (3B) closely matches the actual occupancy rate of pembrolizumab. This result shows that the occupancy rate of pembrolizumab can be measured by the method of the present experimental example.
  • peripheral blood lymphocytes were collected from blood samples of each patient. Subsequently, 5 ⁇ 10 5 lymphocytes were dispensed into each tube.
  • Human BD Fc Block (0.5 ⁇ g / mL, BD Biosciences) was added to each cell and reacted at 4 ° C. for 10 minutes.
  • each cell was washed twice with 600 ⁇ L PBS. Subsequently, binding of AlexaFluor 488-labeled anti-PD-1 antibody (clone EH12.2H7) and PE-labeled anti-PD-1 antibody (clone MIH4) to each cell was performed using a flow cytometer (model "FACS Verse", BD Biosciences, Inc. ) was used to analyze.
  • FIG. 13 (a) to 13 (d) are graphs showing analysis results.
  • 13 (a) shows the analysis results of peripheral blood lymphocytes of patient 1
  • FIG. 13 (b) shows the analysis results of peripheral blood lymphocytes of patient 2.
  • FIG. 13 (c) is a graph showing an analysis result of only the T cell of the patient 1 with the gated CD3 positive cells.
  • FIG. 13 (d) is a graph showing an analysis result of only T cells of patient 2 with the gated CD3 positive cells.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity of AlexaFluor 488
  • the horizontal axis shows the fluorescence intensity of PE.
  • the occupancy rate of nivolumab was calculated by the above equation (3A).
  • the occupancy rate of nivolumab in T cells was calculated to be 0%.
  • blood samples were collected from the patients 3 weeks after the ninth administration of nivolumab. Subsequently, peripheral blood lymphocytes were collected from the blood sample. Subsequently, 5 ⁇ 10 5 lymphocytes were dispensed into each tube.
  • Human BD Fc Block (0.5 ⁇ g / mL, BD Biosciences) was added to each cell and reacted at 4 ° C. for 10 minutes.
  • FIGS. 14A and 14B are graphs showing analysis results.
  • FIG. 14 (a) shows the analysis results of peripheral blood lymphocytes.
  • FIG. 14 (b) is a graph showing an analysis result of only patient T cells by gating on CD3 positive cells.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity of AlexaFluor 488, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of PE.
  • the occupancy rate of nivolumab was calculated by the above equation (3A) based on the results of FIG. 14 (b). As a result, the occupancy rate of nivolumab in T cells was calculated to be 95.47%.
  • peripheral blood lymphocytes were collected from the blood sample. Subsequently, 5 ⁇ 10 5 lymphocytes were dispensed into each tube.
  • Human BD Fc Block (0.5 ⁇ g / mL, BD Biosciences) was added to each cell and reacted at 4 ° C. for 10 minutes.
  • FIGS. 15A and 15B are graphs showing analysis results.
  • FIG. 15 (a) shows the analysis results of peripheral blood lymphocytes.
  • FIG. 15 (b) is a graph showing an analysis result of only patient T cells by gating on CD3 positive cells.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity of AlexaFluor 488
  • the horizontal axis shows the fluorescence intensity of PE.
  • the occupancy rate of pembrolizumab was calculated by the above-mentioned equation (3B).
  • the occupancy rate of pembrolizumab in T cells was calculated to be 39.66%.
  • the results show that the method of the present experimental example can measure the occupancy of pembrolizumab in T cells of patients using blood samples as samples.

Abstract

細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法であって、細胞集団に第２及び第３の特異的結合物質を接触させることと、第２及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、第１、第２及び第３の特異的結合物質はいずれも対象細胞表面タンパク質に結合するものであり、占有率は、対象細胞表面タンパク質発現細胞のうち、第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、第２の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質と競合するものであり、第３の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質と競合しないものであり、式：（１－（第２の特異的結合物質が結合した細胞数／第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００により計算される値が占有率（％）である、方法。

Description

細胞集団における特異的結合物質の占有率を測定する方法
　本発明は、細胞集団における特異的結合物質の占有率を測定する方法に関する。より具体的には、特異的結合物質に接触した細胞集団における前記特異的結合物質の占有率を測定する方法、特異的結合物質に接触した細胞集団における前記特異的結合物質の占有率を測定するためのキット、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法に関する。本願は、２０１７年８月７日に、日本に出願された特願２０１７－１５２７３５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ニボルマブは、細胞表面に存在するｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｄｅａｔｈ－１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体医薬である。ニボルマブに代表される免疫チェックポイント阻害薬は、悪性黒色腫や非小細胞肺がん、腎細胞がん、ホジキンリンパ腫、頭頸部がんに対して承認され、高い治療効果を持つことから社会的注目を浴びている。
　一方で、免疫チェックポイント阻害薬は、非常に高額な薬剤費がかかること、一部の患者に重篤な免疫関連有害事象を引き起こすことが知られている。このため、免疫チェックポイント阻害薬の動態を解析する技術が求められている。例えば、非特許文献１には、ニボルマブの体内動態を検討した結果が報告されている。
Brahmer J. R., Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics,andimmunologic correlates., J. Clin. Oncol., 28 (19), 3167-3175, 2010.
　しかしながら、非特許文献１に記載された方法は煩雑であり、また、高価な抗体製剤を使用する必要があることから、一般的な普及は困難であると考えられる。そこで、本発明は、特異的結合物質の動態を簡便に測定する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法であって、前記細胞集団に、第２の特異的結合物質を接触させることと、前記細胞集団に、第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（１）により計算される値が、前記占有率である、方法。
　第１の特異的結合物質の占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（１）
［２］前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、［１］に記載の方法。
［３］前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記第１の特異的結合物質が抗体である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記対象細胞表面タンパク質がヒトｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｄｅａｔｈ－１（ＰＤ－１）であり、前記第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１抗体である、［４］に記載の方法。
［６］前記第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、［５］に記載の方法。
［７］細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定するためのキットであって、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を含み、前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である、キット。
［８］前記第１の特異的結合物質が抗体である、［７］に記載のキット。
［９］前記対象細胞表面タンパク質がヒトＰＤ－１であり、前記第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１抗体である、［８］に記載のキット。
［１０］前記第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、［９］に記載のキット。
［１１］患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、抗体医薬が投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、抗体医薬が投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合せずに前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（２）により計算される前記抗体医薬の占有率が、患者への前記抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである、方法。
　前記抗体医薬の占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（２）
［１２］前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、［１１］に記載の方法。
［１３］前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］前記占有率が基準値よりも高いことが、患者への前記抗体医薬の投与間隔を長くすべきこと又は投与量を減少させるべきことを示し、前記占有率が基準値よりも低いことが、患者への前記抗体医薬の投与間隔を短くすべきこと又は投与量を増大させるべきことを示す、［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれもヒトＰＤ－１に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合せずにヒトＰＤ－１に結合する特異的結合物質であり、下記式（３）により計算されるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータである、方法。
　ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（３）
［１６］前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、［１５］に記載の方法。
［１７］前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］前記占有率が基準値よりも高いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くすべきこと若しくは投与量を減少させるべきことを示し、前記占有率が基準値よりも低いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を短くすべきこと若しくは投与量を増大させるべきことを示す、［１５］～［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、［１５］～［１８］のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、特異的結合物質の動態を簡便に測定する技術を提供することができる。
実験例１において、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の反応性を解析した結果を示すグラフである。 実験例１において、抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の反応性を解析した結果を示すグラフである。 実験例１において、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７又はクローンＭＩＨ４）のニボルマブとの競合率を計算した結果を示すグラフである。 実験例２において、様々な濃度の抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）で前処置した後の、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の反応性を評価した結果を示すグラフである。 実験例３において、様々な濃度の抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）で前処置した後の、抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の反応性を評価した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例４において、ＭＩＴ９細胞株におけるニボルマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 実験例４において測定されたニボルマブの占有率と、実際のニボルマブの占有率を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例５において、ニボルマブの占有率が、０，２５，５０，７５，１００％となるように調製した健常人由来のＴ細胞への、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の結合を測定した結果を示すグラフである。 実験例５において測定されたニボルマブの占有率と、実際のニボルマブの占有率を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例６において、ニボルマブの投与を受けている患者の体腔液由来のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例７において、ＭＩＴ９細胞株におけるペムブロリズマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 実験例７において測定されたペムブロリズマブの占有率と、実際のペムブロリズマブの占有率を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、実験例８において、ニボルマブの投与を受けていない患者の末梢血Ｔ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例９において、ニボルマブの投与を受けた腎癌患者の末梢血Ｔ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１０において、ペムブロリズマブの投与を受けた肺癌患者の末梢血Ｔ細胞におけるペムブロリズマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。
［細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法］
　１実施形態において、本発明は、細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法であって、前記細胞集団に、第２の特異的結合物質を接触させる工程と、前記細胞集団に、第３の特異的結合物質を接触させる工程と、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、を含み、前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（１）により計算される値が、前記占有率である方法を提供する。
　第１の特異的結合物質の占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（１）
　実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態の方法により、特異的結合物質の動態を簡便に測定することができることを明らかにした。
（特異的結合物質）
　本明細書において、特異的結合物質とは、対象物質に特異的に結合する物質を意味し、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。対象物質としては、例えば細胞表面タンパク質等が挙げられる。特異的結合物質は、ヒト又は非ヒト動物に投与される医薬であってもよい。
　抗体は、マウス等の動物を免疫することによって作製したものであってもよく、ファージライブラリ等の抗体ライブラリのスクリーニングにより作製したものであってもよい。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
　抗体又は抗体断片が、ヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。ヒト型抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、可変領域が非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域の少なくとも一部がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のみが非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、完全ヒト抗体とは、相補性決定領域を含めて全体がヒト由来の抗体を意味する。
　アプタマーとしては、対象物質に対する特異的結合能を有する物質であれば特に限定されず、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
（第１の特異的結合物質）
　本実施形態の方法において、第１の特異的結合物質とは、動態を測定する対象であり、対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である。第１の特異的結合物質の具体的な例としては、抗体が挙げられる。抗体は、抗体医薬であってもよい。抗体医薬は、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ等の免疫チェックポイント阻害薬であってもよいがこれらに限定されない。ここで、第１の特異的結合物質がニボルマブ、ペムブロリズマブ等である場合、対象細胞表面タンパク質はヒトＰＤ－１である。すなわち、対象細胞表面タンパク質がヒトＰＤ－１であり、第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１抗体であってもよい。
（細胞集団）
　実施例において後述するように、本実施形態の方法により、第１の特異的結合物質の動態を簡便に測定することができる。本実施形態の方法において、第１の特異的結合物質の動態とは、細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率である。ここで、占有率とは、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、着目する特異的結合物質（第１の特異的結合物質）が結合した細胞の割合（％）をいう。
　本実施形態の方法において、細胞集団とは、第１の特異的結合物質の占有率を測定する対象とする細胞集団を意味する。細胞集団は、通常は、第１の特異的結合物質に接触した細胞である。例えば、第１の特異的結合物質が抗体医薬である場合、細胞集団としては、当該抗体医薬を投与された患者由来の細胞集団が挙げられる。
　細胞集団としては、第１の特異的結合物質が結合する細胞が含まれる細胞集団が挙げられ、第１の特異的結合物質の結合対象に応じて適宜設定される。具体的な細胞集団としては、例えば、末梢血リンパ球、胸水由来のリンパ球、肺胞洗浄液由来のリンパ球等が挙げられるがこれらに限定されない。
（第２の特異的結合物質）
　第２の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質が結合する細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である。また、第２の特異的結合物質は、対象細胞表面タンパク質への結合において、第１の特異的結合物質と競合する。すなわち、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合している場合、第２の特異的結合物質は対象細胞表面タンパク質に結合することが実質的にできない。
　ここで、「実質的にできない」とは、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合していても、第１の特異的結合物質を解離させて、第２の特異的結合物質が対象細胞表面タンパク質に結合する場合がわずかに存在することを許容することを意味する。しかしながら、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合している場合、第２の特異的結合物質は対象細胞表面タンパク質に結合することができないことが好ましい。
　いいかえると、第２の特異的結合物質のエピトープは、第１の特異的結合物質のエピトープと同一であるか近接しており、第１の特異的結合物質の対象細胞表面タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）は、第２の特異的結合物質の対象細胞表面タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）よりも小さいことが好ましい。なお、解離定数は小さいほど親和性が高い。
（第３の特異的結合物質）
　第３の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質が結合する細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である。また、第３の特異的結合物質は、対象細胞表面タンパク質への結合において、第１の特異的結合物質と競合しない。すなわち、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合していても、第３の特異的結合物質は対象細胞表面タンパク質に結合することができる。
　いいかえると、第３の特異的結合物質のエピトープは、第１の特異的結合物質のエピトープと離れており、第３の特異的結合物質の対象細胞表面タンパク質への結合は、第１の特異的結合物質の対象細胞表面タンパク質への結合にほとんど影響しない。
（第１、第２、第３の特異的結合物質の組み合わせの具体例）
　例えば、第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）であってもよい。実施例において後述するように、これらの抗体の組み合わせを用いることにより、ニボルマブ又はペムブロリズマブの動態を簡便に測定することができる。
（第２の特異的結合物質を接触させる工程）
　本工程において、細胞集団に、第２の特異的結合物質を接触させる。その結果、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が既に結合していた場合には、第２の特異的結合物質は結合しない。また、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合していなかった場合には、第２の特異的結合物質が結合する。後述するように、本工程を実施するタイミングは適宜変更してもよい。
（第３の特異的結合物質を接触させる工程）
　本工程において、細胞集団に、第３の特異的結合物質を接触させる。その結果、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合していても、結合していなくても、第３の特異的結合物質は対象細胞表面タンパク質結合する。したがって、第３の特異的結合物質は、細胞集団中の、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞全てに結合することになる。後述するように、本工程を実施するタイミングは適宜変更してもよい。
（第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程）
　本工程において、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する。例えば、第２の特異的結合物質を蛍光色素で標識しておき、フローサイトメトリーにより第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することが簡便である。本工程は、第２の特異的結合物質を接触させる工程の後に実施すればよく、後述するように、本工程を実施するタイミングは適宜変更してもよい。
（第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程）
　本工程において、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する。第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することにより、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞数を計測することができる。例えば、第３の特異的結合物質を蛍光色素で標識しておき、フローサイトメトリーにより第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することが簡便である。本工程は、第３の特異的結合物質を接触させる工程の後に実施すればよく、後述するように、本工程を実施するタイミングは適宜変更してもよい。
（占有率の算出）
　本工程において、細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を算出する。占有率は、下記式（１）により計算される値である。
　第１の特異的結合物質の占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（１）
　例えば、占有率が１００％であることは、細胞集団中の、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞の全てに第１の特異的結合物質が結合していることを意味する。この場合、対象細胞表面タンパク質には第１の特異的結合物質が結合しているため、第２の特異的結合物質は結合することができない。
　また、例えば、占有率が８０％であることは、細胞集団中の、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうちの８０％に第１の特異的結合物質が結合していることを意味する。この場合、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、残りの２０％には、第１の特異的結合物質が結合しておらず、第２の特異的結合物質が結合することになる。
（上記各工程の実施の順序）
　第２の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質を接触させる工程を実施した後に第３の特異的結合物質を接触させる工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に実施してもよい。例えば、同一の試験管内に、細胞集団、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を入れて接触させることにより、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に行うことができる。
　また、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施した後に第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。
　あるいは、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質をそれぞれ識別可能に標識しておき、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質に接触した細胞集団をフローサイトメトリーで解析すること等により、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施することができる。
　あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。
　あるいは、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。この場合、第３の特異的結合物質が結合した細胞を、セルソーター等を用いることにより回収し、その後、回収した細胞に対して第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよい。
（他の特異的結合物質）
　また、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質の他にも、例えば、抗ＣＤ３抗体等の他の特異的結合物質を接触させる工程を実施し、当該他の特異的結合物質が結合した細胞集団について、第１の特異的結合物質の占有率を測定してもよい。例えば、他の特異的結合物質が結合した細胞集団に対してゲートをかけたうえで、第１の特異的結合物質の占有率を算出してもよい。
　他の特異的結合物質としては、抗ＣＤ３抗体に限られず、あらゆる抗原に対する特異的結合物質を使用することができる。他の特異的結合物質を反応させることにより、第１の特異的結合物質の占有率を測定するのと同時に特定抗原の発現を解析することもできる。
　本実施形態の方法は、例えば、患者への抗体医薬の投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法に適用することができる。具体的には、細胞集団として、抗体医薬が投与された患者由来の細胞を使用して上述した方法を実施するとよい。
　この場合、第１の特異的結合物質が抗体医薬となる点以外は上述した方法と同様である。その結果、患者由来の細胞における抗体医薬の占有率を計算することが可能になる。そして、患者由来の細胞における抗体医薬の占有率に基づいて、患者への抗体医薬の投与間隔若しくは投与量を最適化することができる。
　例えば、占有率が基準値よりも高い場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を長くするか、又は投与量を減少させるとよい。また、占有率が基準値よりも低い場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を短くするか、又は投与量を増大させるとよい。
［細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定するためのキット］
　１実施形態において、本発明は、細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定するためのキットであって、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を含み、前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である、キットを提供する。
　本実施形態のキットにおいて、細胞集団、第１、第２及び第３の特異的結合物質、対象細胞表面タンパク質については上述したものと同様である。すなわち、第１の特異的結合物質の具体的な例としては、抗体が挙げられる。
　また、対象細胞表面タンパク質がヒトＰＤ－１であり、第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１抗体であってもよい。
　更に、第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）であってもよい。このようなキットにより、細胞集団におけるニボルマブ又はペムブロリズマブの動態を簡便に測定することができる。
［患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法］
　１実施形態において、本発明は、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、抗体医薬が投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させる工程と、抗体医薬が投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させる工程と、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合せずに前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（２）により計算される前記抗体医薬の占有率が、患者への前記抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである方法を提供する。
　前記抗体医薬の占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（２）
　本実施形態の方法により、抗体医薬の動態を簡便に測定し、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得することができる。本実施形態の方法は、医師が判断する工程を含まない。
　本実施形態の方法において、抗体医薬の投与間隔又は投与量の最適化とは、抗体医薬の投与間隔又は投与量の個別化といいかえることができる。すなわち、本実施形態の方法により、個々の患者に応じて最適な抗体医薬の投与間隔又は投与量を決定するためのデータを提供することができる。これにより、例えば、患者が重篤な免疫関連有害事象を発症した場合に、有害事象がどれくらい遷延するリスクがあるかを予測することが可能になる。また、適切な量の抗体医薬の使用を可能にすることにより、高額な抗体医薬の費用を抑制すること等が可能になる。
（患者由来の細胞）
　本実施形態の方法において、患者由来の細胞は、抗体医薬の特性に応じて適切な細胞を適宜選択する。患者由来の細胞としては、例えば、末梢血リンパ球、胸水由来のリンパ球、肺胞洗浄液由来のリンパ球等が挙げられるがこれらに限定されない。
（第２及び第３の特異的結合物質）
　本実施形態の方法において、第２及び第３の特異的結合物質としては、上述した「細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法」の実施形態における第１の特異的結合物質が抗体医薬である場合の第２及び第３の特異的結合物質と同様のものを用いることができる。
（第２、第３の特異的結合物質を接触させる工程、及び、第２、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程）
　上述した「細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法」の実施形態における第１の特異的結合物質が抗体医薬である場合と同様に、本実施形態の方法において、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質を接触させる工程を実施した後に第３の特異的結合物質を接触させる工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に実施してもよい。例えば、同一の試験管内に、患者由来の細胞、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を入れて接触させることにより、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に行うことができる。
　また、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施した後に第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。
　あるいは、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質をそれぞれ識別可能に標識しておき、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質に接触した患者由来の細胞をフローサイトメトリーで解析すること等により、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施することができる。
　あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。
　あるいは、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。この場合、第３の特異的結合物質が結合した細胞を、セルソーター等を用いることにより回収し、その後、回収した細胞に対して第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよい。
（他の特異的結合物質）
　また、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質の他にも、例えば、抗ＣＤ３抗体等の他の特異的結合物質を接触させる工程を実施し、当該他の特異的結合物質が結合した細胞集団について、抗体医薬の占有率を測定してもよい。例えば、他の特異的結合物質が結合した細胞集団に対してゲートをかけたうえで、抗体医薬の占有率を算出してもよい。
　他の特異的結合物質としては、抗ＣＤ３抗体に限られず、あらゆる抗原に対する特異的結合物質を使用することができる。他の特異的結合物質を反応させることにより、抗体医薬の占有率を測定するのと同時に特定抗原の発現を解析することもできる。
（患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータ）
　本実施形態の方法では、抗体医薬の占有率が、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである。そして、占有率が基準値よりも高いことが、患者への抗体医薬の投与間隔を長くすべきこと又は投与量を減少させるべきことを示す。
　ここで、占有率の基準値は、例えば、予め設定した占有率の最適値である。占有率の最適値とは、例えば、抗体医薬による疾患の治療効果が最大となり、免疫関連有害事象等の副作用を最小となる占有率である。
　本実施形態の方法により、抗体医薬の占有率が基準値よりも高いことが示された場合、抗体医薬の投与量が十分であるか過剰であることを意味する。そこで、このような場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を長くするか、又は患者への抗体医薬の投与量を減少させることにより、患者の細胞における抗体医薬の占有率を基準値に近づけることができる。
　あるいは、本実施形態の方法により、抗体医薬の占有率が基準値よりも低いことが示された場合、抗体医薬の投与量が不十分であることを意味する。そこで、このような場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を短くするか、又は患者への抗体医薬の投与量を増大させることにより、患者の細胞における抗体医薬の占有率を基準値に近づけることができる。
［患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法］
　１実施形態において、本発明は、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させる工程と、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させる工程と、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれもヒトＰＤ－１に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合せずにヒトＰＤ－１に結合する特異的結合物質であり、下記式（３）により計算されるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータである方法を提供する。
　ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（３）
　本実施形態の方法により、ニボルマブ又はペムブロリズマブの動態を簡便に測定し、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得することができる。本実施形態の方法は、医師が判断する工程を含まない。
　本実施形態の方法において、ニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量の最適化とは、ニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量の個別化といいかえることができる。すなわち、本実施形態の方法により、個々の患者に応じて最適なニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量を決定するためのデータを提供することができる。これにより、例えば、患者が重篤な免疫関連有害事象を発症した場合に、有害事象がどれくらい遷延するリスクがあるかを予測することが可能になる。また、適切な量のニボルマブ又はペムブロリズマブの使用を可能にすることにより、高額な抗体医薬の費用を抑制すること等が可能になる。
（患者由来の細胞）
　本実施形態の方法において、患者由来の細胞としては、例えば、末梢血リンパ球、胸水由来のリンパ球、肺胞洗浄液由来のリンパ球等が挙げられる。
（第２及び第３の特異的結合物質）
　本実施形態の方法において、第２及び第３の特異的結合物質としては、上述した「細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法」の実施形態における第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブである場合の第２及び第３の特異的結合物質と同様のものを用いることができる。
　より具体的な例としては、第２の特異的結合物質として、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）が挙げられる。また、第３の特異的結合物質として、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）が挙げられる。実施例において後述するように、発明者らは、これらの抗体を用いることにより、ニボルマブ及びペムブロリズマブの占有率を測定することができることを明らかにした。
（第２、第３の特異的結合物質を接触させる工程、及び、第２、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程）
　上述した「細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法」の実施形態における第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブである場合と同様に、本実施形態の方法において、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質を接触させる工程を実施した後に第３の特異的結合物質を接触させる工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に実施してもよい。例えば、同一の試験管内に、患者由来の細胞、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を入れて接触させることにより、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に行うことができる。
　また、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施した後に第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。
　あるいは、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質をそれぞれ識別可能に標識しておき、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質に接触した患者由来の細胞をフローサイトメトリーで解析すること等により、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施することができる。
　あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。
　あるいは、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。この場合、第３の特異的結合物質が結合した細胞を、セルソーター等を用いることにより回収し、その後、回収した細胞に対して第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよい。
（他の特異的結合物質）
　また、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質の他にも、例えば、抗ＣＤ３抗体等の他の特異的結合物質を接触させる工程を実施し、当該他の特異的結合物質が結合した細胞集団について、抗体医薬の占有率を測定してもよい。例えば、他の特異的結合物質が結合した細胞集団に対してゲートをかけたうえで、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率を算出してもよい。
　他の特異的結合物質としては、抗ＣＤ３抗体に限られず、あらゆる抗原に対する特異的結合物質を使用することができる。他の特異的結合物質を反応させることにより、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率を測定するのと同時に特定抗原の発現を解析することもできる。
（患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量を最適化するためのデータ）
　本実施形態の方法では、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである。そして、占有率が基準値よりも高いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くすべきこと又は投与量を減少させるべきことを示す。
　ここで、占有率の基準値は、例えば、予め設定した占有率の最適値である。占有率の最適値とは、例えば、ニボルマブ又はペムブロリズマブによる疾患の治療効果が最大となり、免疫関連有害事象等の副作用が最小となる占有率である。ニボルマブ又はペムブロリズマブ占有率の最適値は、患者の症状等により適宜設定することができ、例えば９０％であってもよく、例えば９５％であってもよく、例えば９８％であってもよい。
　本実施形態の方法により、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が基準値よりも高いことが示された場合、ニボルマブ又はペムブロリズマブの投与量が十分であるか過剰であることを意味する。そこで、このような場合には、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くするか、又は患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与量を減少させることにより、患者の細胞におけるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率を基準値に近づけることができる。
　あるいは、本実施形態の方法により、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が基準値よりも低いことが示された場合、ニボルマブ又はペムブロリズマブの投与量が不十分であることを意味する。そこで、このような場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を短くするか、又は患者への抗体医薬の投与量を増大させることにより、患者の細胞における抗体医薬の占有率を基準値に近づけることができる。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化する方法であって、抗体医薬が投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、抗体医薬が投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合せずに前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（２）により計算される前記抗体医薬の占有率が、基準値よりも高い場合に、患者への前記抗体医薬の投与間隔を長くし、前記占有率が基準値よりも低い場合に、患者への前記抗体医薬の投与間隔を短くする、方法を提供する。
　前記抗体医薬の占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（２）
　本実施形態の方法において、前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行ってもよい。また、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行ってもよい。
　１実施形態において、本発明は、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化する方法であって、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれもヒトＰＤ－１に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合せずにヒトＰＤ－１に結合する特異的結合物質であり、下記式（３）により計算されるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、基準値よりも高い場合に、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くし、前記占有率が基準値よりも低い場合に、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を短くする、方法を提供する。
　ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（３）
　本実施形態の方法において、前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行ってもよい。また、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行ってもよい。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（抗ＰＤ－１抗体の評価１）
《クローンＥＨ１２．２Ｈ７》
　ヒトＰＤ－１を強制発現させたマウス線維芽細胞由来の細胞株であるＭＩＴ９細胞を用いて抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）の反応性を評価した。
　まず、ＭＩＴ９細胞株を２×１０５個ずつチューブに分注した。続いて、分注した各細胞に抗ＰＤ－１抗体医薬であるニボルマブを、０，０．１１，０．３３，１，３．３，１０μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で３０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのリン酸バッファー（ＰＢＳ）で２回洗浄した。続いて、各細胞に、ＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を１μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図１は、解析結果を示すグラフである。その結果、最初に反応させたニボルマブの濃度が高くなるにしたがって、ＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）のＭＩＴ９細胞への結合量が低下することが明らかとなった。
　この結果から、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）がニボルマブと競合することが明らかとなった。
《クローンＭＩＨ４》
　ＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）の代わりにＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた点以外は上記と同様にして、抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の反応性を評価した。
　まず、ＭＩＴ９細胞株を２×１０５個ずつチューブに分注した。続いて、分注した各細胞に抗ＰＤ－１抗体医薬であるニボルマブを、０，０．１１，０．３３，１，３．３，１０μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で３０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞に、ＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を２μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
　　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図２は、解析結果を示すグラフである。その結果、最初に反応させたニボルマブの濃度に関わらず、ＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）がＭＩＴ９細胞に結合することが明らかとなった。
　この結果から、抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）は、ニボルマブと競合せずにＰＤ－１に結合することが明らかとなった。
　図３は、図１及び図２に示した解析結果に基づいて、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７又はクローンＭＩＨ４）のニボルマブとの競合率を計算した結果を示すグラフである。競合率は下記式（４）により算出した。
　競合率（％）＝（全細胞数－抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７又はクローンＭＩＨ４）陽性細胞数）／全細胞数×１００　…（４）
［実験例２］
（抗ＰＤ－１抗体の評価２）
　抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）と抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）との競合性を評価した。
　まず、ＭＩＴ９細胞株を２×１０５個ずつチューブに分注した。続いて、分注した各細胞に、ＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、０，１．２５，２．５，５，１０，２０μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を４μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図４は、解析結果を示すグラフである。その結果、最初に反応させたＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の濃度に関わらず、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）がＭＩＴ９細胞に結合することが明らかとなった。
　この結果から、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）は抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）と競合せずにＰＤ－１に結合することが明らかとなった。
［実験例３］
（抗ＰＤ－１抗体の評価３）
　実験例２とは抗体を反応させる順序を逆にして、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）と抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）との競合性を評価した。
　まず、ＭＩＴ９細胞株を２×１０５個ずつチューブに分注した。続いて、分注した各細胞に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を、０，０．５，１，２，４，８μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞に、ＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を１０μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図５は、解析結果を示すグラフである。その結果、最初に反応させたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の濃度に関わらず、ＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）がＭＩＴ９細胞に結合することが明らかとなった。
　この結果は、抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）が抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）と競合せずにＰＤ－１に結合することを更に支持するものである。
［実験例４］
（ニボルマブの占有率の測定１）
　抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ＭＩＴ９細胞株におけるニボルマブの占有率を測定した。
　まず、ＭＩＴ９細胞株に１０μｇ／ｍＬのニボルマブを添加し、４℃で３０分間反応させた。続いて、細胞を６００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。続いて、ニボルマブと反応させたＭＩＴ９細胞株に、ニボルマブと反応させていないＭＩＴ９細胞株を、ニボルマブと反応させたＭＩＴ９細胞株の割合が０，２５，５０，７５，１００％となるように混合し、２×１０５個ずつチューブに分注した。これにより、ニボルマブの占有率が、それぞれ、０，２５，５０，７５，１００％であるＭＩＴ９細胞株が得られた。
　続いて、各細胞に、それぞれ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図６（ａ）～（ｅ）は、解析結果を示すグラフである。図６（ａ）～（ｅ）は、それぞれ、ニボルマブの占有率が、０，２５，５０，７５，１００％となるように調製したＭＩＴ９細胞株の結果である。図６（ａ）～（ｅ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
　その結果、ニボルマブの占有率が上昇するにつれて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が低下する傾向が認められた。一方、ニボルマブの占有率が変化してもＰＥの蛍光強度は変化しない傾向が認められた。
　続いて、図６（ａ）～（ｅ）の結果に基づいて、下記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。
　ニボルマブの占有率（％）＝（１－（抗ＰＤ－１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）が結合した細胞の割合／抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）が結合した細胞の割合））×１００　…（３Ａ）
　図７は、上記式（３Ａ）により計算されたニボルマブの占有率と、実際のニボルマブの占有率を示すグラフである。その結果、上記式（３Ａ）により計算されたニボルマブの占有率が実際のニボルマブの占有率によく一致することが確認された。この結果は、本実験例の方法により、ニボルマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例５］
（ニボルマブの占有率の測定２）
　抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、健常人の末梢血リンパ球中のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した。
　まず、末梢血リンパ球に１０μｇ／ｍＬのニボルマブを添加し、４℃で３０分間反応させた。続いて、ニボルマブと反応させた末梢血リンパ球に、ニボルマブと反応させていない末梢血リンパ球を、ニボルマブと反応させた末梢血リンパ球の割合が０，２５，５０，７５，１００％となるように混合し、５×１０５個ずつチューブに分注した。これにより、ニボルマブの占有率が、それぞれ、０，２５，５０，７５，１００％である末梢血リンパ球が得られた。
　続いて、各細胞にＨｕｍａｎ　ＢＤ　Ｆｃ　Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図８（ａ）～（ｅ）は、解析結果を示すグラフである。図８（ａ）～（ｅ）では、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、Ｔ細胞のみの解析結果を示した。図８（ａ）～（ｅ）は、それぞれ、ニボルマブの占有率が、０，２５，５０，７５，１００％となるように調製した末梢血リンパ球の結果である。図８（ａ）～（ｅ）中、縦軸は細胞数を示し、横軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示す。
　その結果、ニボルマブの占有率が上昇するにつれて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が低下する傾向が認められた。
　また、フローサイトメーターによる解析結果に基づいて、下記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。
　ニボルマブの占有率（％）＝（１－（抗ＰＤ－１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）が結合した細胞の割合／抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）が結合した細胞の割合））×１００　…（３Ａ）
　図９は、上記式（３Ａ）により計算されたニボルマブの占有率と、実際のニボルマブの占有率を示すグラフである。その結果、上記式（３Ａ）により計算されたニボルマブの占有率が実際のニボルマブの占有率によく一致することが確認された。この結果は、本実験例の方法により、ヒトのＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例６］
（ニボルマブの占有率の測定３）
　抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ニボルマブの投与を受けている患者の体腔液由来のリンパ球中のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した。体腔液としては、胸水及び肺胞洗浄液を使用した。
　まず、ニボルマブの投与を受けてから１２日後の患者の胸水由来のリンパ球、ニボルマブの投与を受けてから２１日後の患者の肺胞洗浄液由来のリンパ球を採取した。また、比較のために、ニボルマブの投与を受けていない患者の胸水由来のリンパ球も採取した。続いて、各リンパ球を５×１０５個ずつチューブに分注した。
　続いて、各細胞にＨｕｍａｎ　ＢＤ　Ｆｃ　Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図１０（ａ）～（ｃ）は、解析結果を示すグラフである。図１０（ａ）～（ｃ）では、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、Ｔ細胞のみの解析結果を示した。図１０（ａ）はニボルマブの投与を受けていない患者の胸水由来のＴ細胞の解析結果であり、図１０（ｂ）はニボルマブの投与を受けてから１２日後の患者の胸水由来のＴ細胞の解析結果であり、図１０（ｃ）はニボルマブの投与を受けてから２１日後の患者の肺胞洗浄液由来のＴ細胞の解析結果である。図１０（ａ）～（ｃ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
　また、フローサイトメーターによる解析結果に基づいて、下記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。
　ニボルマブの占有率（％）＝（１－（抗ＰＤ－１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）が結合した細胞の割合／抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）が結合した細胞の割合））×１００　…（３Ａ）
　その結果、図１０（ａ）に示すように、ニボルマブの投与を受けていない患者の胸水由来のＴ細胞では、ニボルマブの占有率は１％と算出された。この値は誤差であると考えられた。これに対し、図１０（ｂ）に示すように、ニボルマブの投与を受けてから１２日後の患者の胸水由来のＴ細胞では、ニボルマブの占有率は９９．９％と算出された。また、図１０（ｃ）に示すように、ニボルマブの投与を受けてから２１日後の患者の肺胞洗浄液由来のＴ細胞では、ニボルマブの占有率は９６．０％と算出された。
　この結果は、本実験例の方法により、実際の治療中の患者のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例７］
（ペムブロリズマブの占有率の測定）
　抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ＭＩＴ９細胞株におけるペムブロリズマブの占有率を測定した。
　まず、ＭＩＴ９細胞株に１０μｇ／ｍＬのペムブロリズマブを添加し、４℃で３０分間反応させた。続いて、細胞を６００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。続いて、ペムブロリズマブと反応させたＭＩＴ９細胞株に、ペムブロリズマブと反応させていないＭＩＴ９細胞株を、ペムブロリズマブと反応させたＭＩＴ９細胞株の割合が０，２５，５０，７５，１００％となるように混合し、２×１０５個ずつチューブに分注した。これにより、ペムブロリズマブの占有率が、それぞれ、０，２５，５０，７５，１００％であるＭＩＴ９細胞株が得られた。
　続いて、各細胞に、それぞれ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図１１（ａ）～（ｅ）は、解析結果を示すグラフである。図１１（ａ）～（ｅ）は、それぞれ、ペムブロリズマブの占有率が、０，２５，５０，７５，１００％となるように調製したＭＩＴ９細胞株の結果である。図１１（ａ）～（ｅ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
　その結果、ペムブロリズマブの占有率が上昇するにつれて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が低下する傾向が認められた。一方、ペムブロリズマブの占有率が変化してもＰＥの蛍光強度は変化しない傾向が認められた。
　続いて、図１１（ａ）～（ｅ）の結果に基づいて、下記式（３Ｂ）によりペムブロリズマブの占有率を計算した。
　ペムブロリズマブの占有率（％）＝（１－（抗ＰＤ－１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）が結合した細胞の割合／抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）が結合した細胞の割合））×１００　…（３Ｂ）
　図１２は、上記式（３Ｂ）により計算されたペムブロリズマブの占有率と、実際のペムブロリズマブの占有率を示すグラフである。その結果、上記式（３Ｂ）により計算されたペムブロリズマブの占有率が実際のペムブロリズマブの占有率によく一致することが確認された。この結果は、本実験例の方法により、ペムブロリズマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例８］
（ニボルマブの占有率の測定４）
　抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ニボルマブの投与を受けていない肺癌患者２例（以下、「患者１」、「患者２」という。）の血液サンプルを試料として、末梢血リンパ球中のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した。
　まず、各患者の血液サンプルから、それぞれ末梢血リンパ球を回収した。続いて、各リンパ球を５×１０５個ずつチューブに分注した。
　続いて、各細胞にＨｕｍａｎ　ＢＤ　Ｆｃ　Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図１３（ａ）～（ｄ）は、解析結果を示すグラフである。図１３（ａ）は患者１の末梢血リンパ球の解析結果を示し、図１３（ｂ）は患者２の末梢血リンパ球の解析結果を示す。また、図１３（ｃ）は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、患者１のＴ細胞のみの解析結果を示したグラフである。また、図１３（ｄ）は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、患者２のＴ細胞のみの解析結果を示したグラフである。図１３（ａ）～（ｄ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
　続いて、図１３（ｃ）及び（ｄ）の結果に基づいて、上記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。その結果、いずれの患者においても、Ｔ細胞におけるニボルマブの占有率は０％と算出された。
　この結果は、本実験例の方法により、血液サンプルを試料として、患者のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例９］
（ニボルマブの占有率の測定５）
　抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ニボルマブの投与を受けた腎癌患者の血液サンプルを試料として、末梢血リンパ球中のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した。この患者は、ニボルマブの投与による治療を９コース受けたが、薬剤性肺炎を発症し、ニボルマブの投与を中止した患者であった。ニボルマブを１回投与して２週間が１コースに相当する。
　まず、９回目のニボルマブの投与後３週間経過した時に、患者から血液サンプルを採取した。続いて、血液サンプルから末梢血リンパ球を回収した。続いて、各リンパ球を５×１０５個ずつチューブに分注した。
　続いて、各細胞にＨｕｍａｎ　ＢＤ　Ｆｃ　Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図１４（ａ）及び（ｂ）は、解析結果を示すグラフである。図１４（ａ）は末梢血リンパ球の解析結果を示す。また、図１４（ｂ）は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、患者のＴ細胞のみの解析結果を示したグラフである。図１３（ａ）及び（ｂ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
　続いて、図１４（ｂ）の結果に基づいて、上記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。その結果、Ｔ細胞におけるニボルマブの占有率は９５．４７％と算出された。
　この結果は、本実験例の方法により、血液サンプルを試料として、患者のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定できることを更に支持するものである。
［実験例１０］
（ペムブロリズマブの占有率の測定２）
　抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ペムブロリズマブの投与を受けた肺癌患者の血液サンプルを試料として、末梢血リンパ球中のＴ細胞におけるペムブロリズマブの占有率を測定した。この患者は、ペムブロリズマブの投与による治療を２コース受けたが、薬剤性肺炎を発症し、ペムブロリズマブの投与を中止した患者であった。ペムブロリズマブを１回投与して３週間が１コースに相当する。
　まず、２回目のペムブロリズマブの投与後３週間経過した時に、患者から血液サンプルを採取した。続いて、血液サンプルから末梢血リンパ球を回収した。続いて、各リンパ球を５×１０５個ずつチューブに分注した。
　続いて、各細胞にＨｕｍａｎ　ＢＤ　Ｆｃ　Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
　続いて、細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ－１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
　図１５（ａ）及び（ｂ）は、解析結果を示すグラフである。図１５（ａ）は末梢血リンパ球の解析結果を示す。また、図１５（ｂ）は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、患者のＴ細胞のみの解析結果を示したグラフである。図１５（ａ）及び（ｂ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
　続いて、図１５（ｂ）の結果に基づいて、上記式（３Ｂ）によりペムブロリズマブの占有率を計算した。その結果、Ｔ細胞におけるペムブロリズマブの占有率は３９．６６％と算出された。
　この結果は、本実験例の方法により、血液サンプルを試料として、患者のＴ細胞におけるペムブロリズマブの占有率を測定できることを示す。
　本発明によれば、特異的結合物質の動態を簡便に測定する技術を提供することができる。

Claims (19)

  1. 　細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法であって、
    　前記細胞集団に、第２の特異的結合物質を接触させることと、
    　前記細胞集団に、第３の特異的結合物質を接触させることと、
    　前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、
    　前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、
    　前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    　前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、
    　前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、
    　前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    　下記式（１）により計算される値が、前記占有率である、方法。
    　第１の特異的結合物質の占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（１）
  2. 　前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記第１の特異的結合物質が抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記対象細胞表面タンパク質がヒトｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｄｅａｔｈ－１（ＰＤ－１）であり、前記第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１抗体である、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、請求項５に記載の方法。
  7. 　細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定するためのキットであって、
    　第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を含み、
    　前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    　前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、
    　前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、
    　前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である、キット。
  8. 　前記第１の特異的結合物質が抗体である、請求項７に記載のキット。
  9. 　前記対象細胞表面タンパク質がヒトＰＤ－１であり、前記第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１抗体である、請求項８に記載のキット。
  10. 　前記第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、請求項９に記載のキット。
  11. 　患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、
    　抗体医薬が投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、
    　抗体医薬が投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、
    　前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、
    　前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、
    　前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    　前記第２の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合する特異的結合物質であり、
    　前記第３の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合せずに前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    　下記式（２）により計算される前記抗体医薬の占有率が、患者への前記抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである、方法。
    　前記抗体医薬の占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（２）
  12. 　前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 　前記占有率が基準値よりも高いことが、患者への前記抗体医薬の投与間隔を長くすべきこと又は投与量を減少させるべきことを示し、前記占有率が基準値よりも低いことが、患者への前記抗体医薬の投与間隔を短くすべきこと又は投与量を増大させるべきことを示す、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、
    　ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、
    　ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、
    　前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、
    　前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、
    　前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれもヒトＰＤ－１に結合する特異的結合物質であり、
    　前記第２の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合する特異的結合物質であり、
    　前記第３の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合せずにヒトＰＤ－１に結合する特異的結合物質であり、
    　下記式（３）により計算されるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータである、方法。
    　ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率（％）＝（１－（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００　…（３）
  16. 　前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 　前記占有率が基準値よりも高いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くすべきこと若しくは投与量を減少させるべきことを示し、前記占有率が基準値よりも低いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を短くすべきこと若しくは投与量を増大させるべきことを示す、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
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