JPWO2019031444A1 - 細胞集団における特異的結合物質の占有率を測定する方法 - Google Patents

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Abstract

細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法であって、細胞集団に第２及び第３の特異的結合物質を接触させることと、第２及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、第１、第２及び第３の特異的結合物質はいずれも対象細胞表面タンパク質に結合するものであり、占有率は、対象細胞表面タンパク質発現細胞のうち、第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、第２の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質と競合するものであり、第３の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質と競合しないものであり、式：（１−（第２の特異的結合物質が結合した細胞数／第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００により計算される値が占有率（％）である、方法。

Description

本発明は、細胞集団における特異的結合物質の占有率を測定する方法に関する。より具体的には、特異的結合物質に接触した細胞集団における前記特異的結合物質の占有率を測定する方法、特異的結合物質に接触した細胞集団における前記特異的結合物質の占有率を測定するためのキット、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法に関する。本願は、２０１７年８月７日に、日本に出願された特願２０１７−１５２７３５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
ニボルマブは、細胞表面に存在するｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）に特異的に結合する抗体医薬である。ニボルマブに代表される免疫チェックポイント阻害薬は、悪性黒色腫や非小細胞肺がん、腎細胞がん、ホジキンリンパ腫、頭頸部がんに対して承認され、高い治療効果を持つことから社会的注目を浴びている。
一方で、免疫チェックポイント阻害薬は、非常に高額な薬剤費がかかること、一部の患者に重篤な免疫関連有害事象を引き起こすことが知られている。このため、免疫チェックポイント阻害薬の動態を解析する技術が求められている。例えば、非特許文献１には、ニボルマブの体内動態を検討した結果が報告されている。
Brahmer J. R., Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics,andimmunologic correlates., J. Clin. Oncol., 28 (19), 3167-3175, 2010.
しかしながら、非特許文献１に記載された方法は煩雑であり、また、高価な抗体製剤を使用する必要があることから、一般的な普及は困難であると考えられる。そこで、本発明は、特異的結合物質の動態を簡便に測定する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法であって、前記細胞集団に、第２の特異的結合物質を接触させることと、前記細胞集団に、第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（１）により計算される値が、前記占有率である、方法。
第１の特異的結合物質の占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（１）
［２］前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、［１］に記載の方法。
［３］前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記第１の特異的結合物質が抗体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記対象細胞表面タンパク質がヒトｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）であり、前記第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１抗体である、［４］に記載の方法。
［６］前記第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、［５］に記載の方法。
［７］細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定するためのキットであって、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を含み、前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である、キット。
［８］前記第１の特異的結合物質が抗体である、［７］に記載のキット。
［９］前記対象細胞表面タンパク質がヒトＰＤ−１であり、前記第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１抗体である、［８］に記載のキット。
［１０］前記第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、［９］に記載のキット。
［１１］患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、抗体医薬が投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、抗体医薬が投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合せずに前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（２）により計算される前記抗体医薬の占有率が、患者への前記抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである、方法。
前記抗体医薬の占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（２）
［１２］前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、［１１］に記載の方法。
［１３］前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］前記占有率が基準値よりも高いことが、患者への前記抗体医薬の投与間隔を長くすべきこと又は投与量を減少させるべきことを示し、前記占有率が基準値よりも低いことが、患者への前記抗体医薬の投与間隔を短くすべきこと又は投与量を増大させるべきことを示す、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれもヒトＰＤ−１に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合せずにヒトＰＤ−１に結合する特異的結合物質であり、下記式（３）により計算されるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータである、方法。
ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（３）
［１６］前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、［１５］に記載の方法。
［１７］前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］前記占有率が基準値よりも高いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くすべきこと若しくは投与量を減少させるべきことを示し、前記占有率が基準値よりも低いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を短くすべきこと若しくは投与量を増大させるべきことを示す、［１５］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、［１５］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、特異的結合物質の動態を簡便に測定する技術を提供することができる。
実験例１において、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の反応性を解析した結果を示すグラフである。 実験例１において、抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の反応性を解析した結果を示すグラフである。 実験例１において、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７又はクローンＭＩＨ４）のニボルマブとの競合率を計算した結果を示すグラフである。 実験例２において、様々な濃度の抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）で前処置した後の、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の反応性を評価した結果を示すグラフである。 実験例３において、様々な濃度の抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）で前処置した後の、抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の反応性を評価した結果を示すグラフである。 （ａ）〜（ｅ）は、実験例４において、ＭＩＴ９細胞株におけるニボルマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 実験例４において測定されたニボルマブの占有率と、実際のニボルマブの占有率を示すグラフである。 （ａ）〜（ｅ）は、実験例５において、ニボルマブの占有率が、０，２５，５０，７５，１００％となるように調製した健常人由来のＴ細胞への、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の結合を測定した結果を示すグラフである。 実験例５において測定されたニボルマブの占有率と、実際のニボルマブの占有率を示すグラフである。 （ａ）〜（ｃ）は、実験例６において、ニボルマブの投与を受けている患者の体腔液由来のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）〜（ｅ）は、実験例７において、ＭＩＴ９細胞株におけるペムブロリズマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 実験例７において測定されたペムブロリズマブの占有率と、実際のペムブロリズマブの占有率を示すグラフである。 （ａ）〜（ｄ）は、実験例８において、ニボルマブの投与を受けていない患者の末梢血Ｔ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例９において、ニボルマブの投与を受けた腎癌患者の末梢血Ｔ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１０において、ペムブロリズマブの投与を受けた肺癌患者の末梢血Ｔ細胞におけるペムブロリズマブの占有率を測定した結果を示すグラフである。
［細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法］
１実施形態において、本発明は、細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法であって、前記細胞集団に、第２の特異的結合物質を接触させる工程と、前記細胞集団に、第３の特異的結合物質を接触させる工程と、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、を含み、前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（１）により計算される値が、前記占有率である方法を提供する。
第１の特異的結合物質の占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（１）
実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態の方法により、特異的結合物質の動態を簡便に測定することができることを明らかにした。
（特異的結合物質）
本明細書において、特異的結合物質とは、対象物質に特異的に結合する物質を意味し、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。対象物質としては、例えば細胞表面タンパク質等が挙げられる。特異的結合物質は、ヒト又は非ヒト動物に投与される医薬であってもよい。
抗体は、マウス等の動物を免疫することによって作製したものであってもよく、ファージライブラリ等の抗体ライブラリのスクリーニングにより作製したものであってもよい。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
抗体又は抗体断片が、ヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。ヒト型抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、可変領域が非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域の少なくとも一部がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のみが非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、完全ヒト抗体とは、相補性決定領域を含めて全体がヒト由来の抗体を意味する。
アプタマーとしては、対象物質に対する特異的結合能を有する物質であれば特に限定されず、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
（第１の特異的結合物質）
本実施形態の方法において、第１の特異的結合物質とは、動態を測定する対象であり、対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である。第１の特異的結合物質の具体的な例としては、抗体が挙げられる。抗体は、抗体医薬であってもよい。抗体医薬は、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ等の免疫チェックポイント阻害薬であってもよいがこれらに限定されない。ここで、第１の特異的結合物質がニボルマブ、ペムブロリズマブ等である場合、対象細胞表面タンパク質はヒトＰＤ−１である。すなわち、対象細胞表面タンパク質がヒトＰＤ−１であり、第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１抗体であってもよい。
（細胞集団）
実施例において後述するように、本実施形態の方法により、第１の特異的結合物質の動態を簡便に測定することができる。本実施形態の方法において、第１の特異的結合物質の動態とは、細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率である。ここで、占有率とは、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、着目する特異的結合物質（第１の特異的結合物質）が結合した細胞の割合（％）をいう。
本実施形態の方法において、細胞集団とは、第１の特異的結合物質の占有率を測定する対象とする細胞集団を意味する。細胞集団は、通常は、第１の特異的結合物質に接触した細胞である。例えば、第１の特異的結合物質が抗体医薬である場合、細胞集団としては、当該抗体医薬を投与された患者由来の細胞集団が挙げられる。
細胞集団としては、第１の特異的結合物質が結合する細胞が含まれる細胞集団が挙げられ、第１の特異的結合物質の結合対象に応じて適宜設定される。具体的な細胞集団としては、例えば、末梢血リンパ球、胸水由来のリンパ球、肺胞洗浄液由来のリンパ球等が挙げられるがこれらに限定されない。
（第２の特異的結合物質）
第２の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質が結合する細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である。また、第２の特異的結合物質は、対象細胞表面タンパク質への結合において、第１の特異的結合物質と競合する。すなわち、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合している場合、第２の特異的結合物質は対象細胞表面タンパク質に結合することが実質的にできない。
ここで、「実質的にできない」とは、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合していても、第１の特異的結合物質を解離させて、第２の特異的結合物質が対象細胞表面タンパク質に結合する場合がわずかに存在することを許容することを意味する。しかしながら、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合している場合、第２の特異的結合物質は対象細胞表面タンパク質に結合することができないことが好ましい。
いいかえると、第２の特異的結合物質のエピトープは、第１の特異的結合物質のエピトープと同一であるか近接しており、第１の特異的結合物質の対象細胞表面タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）は、第２の特異的結合物質の対象細胞表面タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）よりも小さいことが好ましい。なお、解離定数は小さいほど親和性が高い。
（第３の特異的結合物質）
第３の特異的結合物質は、第１の特異的結合物質が結合する細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である。また、第３の特異的結合物質は、対象細胞表面タンパク質への結合において、第１の特異的結合物質と競合しない。すなわち、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合していても、第３の特異的結合物質は対象細胞表面タンパク質に結合することができる。
いいかえると、第３の特異的結合物質のエピトープは、第１の特異的結合物質のエピトープと離れており、第３の特異的結合物質の対象細胞表面タンパク質への結合は、第１の特異的結合物質の対象細胞表面タンパク質への結合にほとんど影響しない。
（第１、第２、第３の特異的結合物質の組み合わせの具体例）
例えば、第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）であってもよい。実施例において後述するように、これらの抗体の組み合わせを用いることにより、ニボルマブ又はペムブロリズマブの動態を簡便に測定することができる。
（第２の特異的結合物質を接触させる工程）
本工程において、細胞集団に、第２の特異的結合物質を接触させる。その結果、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が既に結合していた場合には、第２の特異的結合物質は結合しない。また、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合していなかった場合には、第２の特異的結合物質が結合する。後述するように、本工程を実施するタイミングは適宜変更してもよい。
（第３の特異的結合物質を接触させる工程）
本工程において、細胞集団に、第３の特異的結合物質を接触させる。その結果、対象細胞表面タンパク質に第１の特異的結合物質が結合していても、結合していなくても、第３の特異的結合物質は対象細胞表面タンパク質結合する。したがって、第３の特異的結合物質は、細胞集団中の、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞全てに結合することになる。後述するように、本工程を実施するタイミングは適宜変更してもよい。
（第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程）
本工程において、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する。例えば、第２の特異的結合物質を蛍光色素で標識しておき、フローサイトメトリーにより第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することが簡便である。本工程は、第２の特異的結合物質を接触させる工程の後に実施すればよく、後述するように、本工程を実施するタイミングは適宜変更してもよい。
（第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程）
本工程において、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する。第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することにより、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞数を計測することができる。例えば、第３の特異的結合物質を蛍光色素で標識しておき、フローサイトメトリーにより第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することが簡便である。本工程は、第３の特異的結合物質を接触させる工程の後に実施すればよく、後述するように、本工程を実施するタイミングは適宜変更してもよい。
（占有率の算出）
本工程において、細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を算出する。占有率は、下記式（１）により計算される値である。
第１の特異的結合物質の占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（１）
例えば、占有率が１００％であることは、細胞集団中の、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞の全てに第１の特異的結合物質が結合していることを意味する。この場合、対象細胞表面タンパク質には第１の特異的結合物質が結合しているため、第２の特異的結合物質は結合することができない。
また、例えば、占有率が８０％であることは、細胞集団中の、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうちの８０％に第１の特異的結合物質が結合していることを意味する。この場合、対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、残りの２０％には、第１の特異的結合物質が結合しておらず、第２の特異的結合物質が結合することになる。
（上記各工程の実施の順序）
第２の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質を接触させる工程を実施した後に第３の特異的結合物質を接触させる工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に実施してもよい。例えば、同一の試験管内に、細胞集団、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を入れて接触させることにより、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に行うことができる。
また、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施した後に第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。
あるいは、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質をそれぞれ識別可能に標識しておき、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質に接触した細胞集団をフローサイトメトリーで解析すること等により、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施することができる。
あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。
あるいは、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。この場合、第３の特異的結合物質が結合した細胞を、セルソーター等を用いることにより回収し、その後、回収した細胞に対して第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよい。
（他の特異的結合物質）
また、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質の他にも、例えば、抗ＣＤ３抗体等の他の特異的結合物質を接触させる工程を実施し、当該他の特異的結合物質が結合した細胞集団について、第１の特異的結合物質の占有率を測定してもよい。例えば、他の特異的結合物質が結合した細胞集団に対してゲートをかけたうえで、第１の特異的結合物質の占有率を算出してもよい。
他の特異的結合物質としては、抗ＣＤ３抗体に限られず、あらゆる抗原に対する特異的結合物質を使用することができる。他の特異的結合物質を反応させることにより、第１の特異的結合物質の占有率を測定するのと同時に特定抗原の発現を解析することもできる。
本実施形態の方法は、例えば、患者への抗体医薬の投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法に適用することができる。具体的には、細胞集団として、抗体医薬が投与された患者由来の細胞を使用して上述した方法を実施するとよい。
この場合、第１の特異的結合物質が抗体医薬となる点以外は上述した方法と同様である。その結果、患者由来の細胞における抗体医薬の占有率を計算することが可能になる。そして、患者由来の細胞における抗体医薬の占有率に基づいて、患者への抗体医薬の投与間隔若しくは投与量を最適化することができる。
例えば、占有率が基準値よりも高い場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を長くするか、又は投与量を減少させるとよい。また、占有率が基準値よりも低い場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を短くするか、又は投与量を増大させるとよい。
［細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定するためのキット］
１実施形態において、本発明は、細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定するためのキットであって、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を含み、前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である、キットを提供する。
本実施形態のキットにおいて、細胞集団、第１、第２及び第３の特異的結合物質、対象細胞表面タンパク質については上述したものと同様である。すなわち、第１の特異的結合物質の具体的な例としては、抗体が挙げられる。
また、対象細胞表面タンパク質がヒトＰＤ−１であり、第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１抗体であってもよい。
更に、第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）であってもよい。このようなキットにより、細胞集団におけるニボルマブ又はペムブロリズマブの動態を簡便に測定することができる。
［患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法］
１実施形態において、本発明は、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、抗体医薬が投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させる工程と、抗体医薬が投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させる工程と、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合せずに前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（２）により計算される前記抗体医薬の占有率が、患者への前記抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである方法を提供する。
前記抗体医薬の占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（２）
本実施形態の方法により、抗体医薬の動態を簡便に測定し、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得することができる。本実施形態の方法は、医師が判断する工程を含まない。
本実施形態の方法において、抗体医薬の投与間隔又は投与量の最適化とは、抗体医薬の投与間隔又は投与量の個別化といいかえることができる。すなわち、本実施形態の方法により、個々の患者に応じて最適な抗体医薬の投与間隔又は投与量を決定するためのデータを提供することができる。これにより、例えば、患者が重篤な免疫関連有害事象を発症した場合に、有害事象がどれくらい遷延するリスクがあるかを予測することが可能になる。また、適切な量の抗体医薬の使用を可能にすることにより、高額な抗体医薬の費用を抑制すること等が可能になる。
（患者由来の細胞）
本実施形態の方法において、患者由来の細胞は、抗体医薬の特性に応じて適切な細胞を適宜選択する。患者由来の細胞としては、例えば、末梢血リンパ球、胸水由来のリンパ球、肺胞洗浄液由来のリンパ球等が挙げられるがこれらに限定されない。
（第２及び第３の特異的結合物質）
本実施形態の方法において、第２及び第３の特異的結合物質としては、上述した「細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法」の実施形態における第１の特異的結合物質が抗体医薬である場合の第２及び第３の特異的結合物質と同様のものを用いることができる。
（第２、第３の特異的結合物質を接触させる工程、及び、第２、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程）
上述した「細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法」の実施形態における第１の特異的結合物質が抗体医薬である場合と同様に、本実施形態の方法において、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質を接触させる工程を実施した後に第３の特異的結合物質を接触させる工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に実施してもよい。例えば、同一の試験管内に、患者由来の細胞、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を入れて接触させることにより、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に行うことができる。
また、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施した後に第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。
あるいは、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質をそれぞれ識別可能に標識しておき、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質に接触した患者由来の細胞をフローサイトメトリーで解析すること等により、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施することができる。
あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。
あるいは、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。この場合、第３の特異的結合物質が結合した細胞を、セルソーター等を用いることにより回収し、その後、回収した細胞に対して第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよい。
（他の特異的結合物質）
また、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質の他にも、例えば、抗ＣＤ３抗体等の他の特異的結合物質を接触させる工程を実施し、当該他の特異的結合物質が結合した細胞集団について、抗体医薬の占有率を測定してもよい。例えば、他の特異的結合物質が結合した細胞集団に対してゲートをかけたうえで、抗体医薬の占有率を算出してもよい。
他の特異的結合物質としては、抗ＣＤ３抗体に限られず、あらゆる抗原に対する特異的結合物質を使用することができる。他の特異的結合物質を反応させることにより、抗体医薬の占有率を測定するのと同時に特定抗原の発現を解析することもできる。
（患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータ）
本実施形態の方法では、抗体医薬の占有率が、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである。そして、占有率が基準値よりも高いことが、患者への抗体医薬の投与間隔を長くすべきこと又は投与量を減少させるべきことを示す。
ここで、占有率の基準値は、例えば、予め設定した占有率の最適値である。占有率の最適値とは、例えば、抗体医薬による疾患の治療効果が最大となり、免疫関連有害事象等の副作用を最小となる占有率である。
本実施形態の方法により、抗体医薬の占有率が基準値よりも高いことが示された場合、抗体医薬の投与量が十分であるか過剰であることを意味する。そこで、このような場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を長くするか、又は患者への抗体医薬の投与量を減少させることにより、患者の細胞における抗体医薬の占有率を基準値に近づけることができる。
あるいは、本実施形態の方法により、抗体医薬の占有率が基準値よりも低いことが示された場合、抗体医薬の投与量が不十分であることを意味する。そこで、このような場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を短くするか、又は患者への抗体医薬の投与量を増大させることにより、患者の細胞における抗体医薬の占有率を基準値に近づけることができる。
［患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法］
１実施形態において、本発明は、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させる工程と、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させる工程と、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程と、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれもヒトＰＤ−１に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合せずにヒトＰＤ−１に結合する特異的結合物質であり、下記式（３）により計算されるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータである方法を提供する。
ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（３）
本実施形態の方法により、ニボルマブ又はペムブロリズマブの動態を簡便に測定し、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得することができる。本実施形態の方法は、医師が判断する工程を含まない。
本実施形態の方法において、ニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量の最適化とは、ニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量の個別化といいかえることができる。すなわち、本実施形態の方法により、個々の患者に応じて最適なニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量を決定するためのデータを提供することができる。これにより、例えば、患者が重篤な免疫関連有害事象を発症した場合に、有害事象がどれくらい遷延するリスクがあるかを予測することが可能になる。また、適切な量のニボルマブ又はペムブロリズマブの使用を可能にすることにより、高額な抗体医薬の費用を抑制すること等が可能になる。
（患者由来の細胞）
本実施形態の方法において、患者由来の細胞としては、例えば、末梢血リンパ球、胸水由来のリンパ球、肺胞洗浄液由来のリンパ球等が挙げられる。
（第２及び第３の特異的結合物質）
本実施形態の方法において、第２及び第３の特異的結合物質としては、上述した「細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法」の実施形態における第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブである場合の第２及び第３の特異的結合物質と同様のものを用いることができる。
より具体的な例としては、第２の特異的結合物質として、抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）が挙げられる。また、第３の特異的結合物質として、抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）が挙げられる。実施例において後述するように、発明者らは、これらの抗体を用いることにより、ニボルマブ及びペムブロリズマブの占有率を測定することができることを明らかにした。
（第２、第３の特異的結合物質を接触させる工程、及び、第２、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程）
上述した「細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法」の実施形態における第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブである場合と同様に、本実施形態の方法において、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質を接触させる工程を実施した後に第３の特異的結合物質を接触させる工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に実施してもよい。例えば、同一の試験管内に、患者由来の細胞、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を入れて接触させることにより、第２の特異的結合物質を接触させる工程及び前記第３の特異的結合物質を接触させる工程を同時に行うことができる。
また、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程は、いずれを先に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施した後に第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよく、逆の順序であってもよい。
あるいは、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施してもよい。例えば、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質をそれぞれ識別可能に標識しておき、第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質に接触した患者由来の細胞をフローサイトメトリーで解析すること等により、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程及び第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を同時に実施することができる。
あるいは、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。
あるいは、第３の特異的結合物質を接触させる工程、第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程、第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程をこの順に実施してもよい。この場合、第３の特異的結合物質が結合した細胞を、セルソーター等を用いることにより回収し、その後、回収した細胞に対して第２の特異的結合物質を接触させる工程、第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測する工程を実施してもよい。
（他の特異的結合物質）
また、第２の特異的結合物質、第３の特異的結合物質の他にも、例えば、抗ＣＤ３抗体等の他の特異的結合物質を接触させる工程を実施し、当該他の特異的結合物質が結合した細胞集団について、抗体医薬の占有率を測定してもよい。例えば、他の特異的結合物質が結合した細胞集団に対してゲートをかけたうえで、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率を算出してもよい。
他の特異的結合物質としては、抗ＣＤ３抗体に限られず、あらゆる抗原に対する特異的結合物質を使用することができる。他の特異的結合物質を反応させることにより、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率を測定するのと同時に特定抗原の発現を解析することもできる。
（患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量を最適化するためのデータ）
本実施形態の方法では、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである。そして、占有率が基準値よりも高いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くすべきこと又は投与量を減少させるべきことを示す。
ここで、占有率の基準値は、例えば、予め設定した占有率の最適値である。占有率の最適値とは、例えば、ニボルマブ又はペムブロリズマブによる疾患の治療効果が最大となり、免疫関連有害事象等の副作用が最小となる占有率である。ニボルマブ又はペムブロリズマブ占有率の最適値は、患者の症状等により適宜設定することができ、例えば９０％であってもよく、例えば９５％であってもよく、例えば９８％であってもよい。
本実施形態の方法により、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が基準値よりも高いことが示された場合、ニボルマブ又はペムブロリズマブの投与量が十分であるか過剰であることを意味する。そこで、このような場合には、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くするか、又は患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与量を減少させることにより、患者の細胞におけるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率を基準値に近づけることができる。
あるいは、本実施形態の方法により、ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が基準値よりも低いことが示された場合、ニボルマブ又はペムブロリズマブの投与量が不十分であることを意味する。そこで、このような場合には、患者への抗体医薬の投与間隔を短くするか、又は患者への抗体医薬の投与量を増大させることにより、患者の細胞における抗体医薬の占有率を基準値に近づけることができる。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化する方法であって、抗体医薬が投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、抗体医薬が投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合せずに前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、下記式（２）により計算される前記抗体医薬の占有率が、基準値よりも高い場合に、患者への前記抗体医薬の投与間隔を長くし、前記占有率が基準値よりも低い場合に、患者への前記抗体医薬の投与間隔を短くする、方法を提供する。
前記抗体医薬の占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（２）
本実施形態の方法において、前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行ってもよい。また、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行ってもよい。
１実施形態において、本発明は、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化する方法であって、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれもヒトＰＤ−１に結合する特異的結合物質であり、前記第２の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合する特異的結合物質であり、前記第３の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合せずにヒトＰＤ−１に結合する特異的結合物質であり、下記式（３）により計算されるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、基準値よりも高い場合に、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くし、前記占有率が基準値よりも低い場合に、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を短くする、方法を提供する。
ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（３）
本実施形態の方法において、前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行ってもよい。また、前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行ってもよい。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（抗ＰＤ−１抗体の評価１）
《クローンＥＨ１２．２Ｈ７》
ヒトＰＤ−１を強制発現させたマウス線維芽細胞由来の細胞株であるＭＩＴ９細胞を用いて抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）の反応性を評価した。
まず、ＭＩＴ９細胞株を２×１０５個ずつチューブに分注した。続いて、分注した各細胞に抗ＰＤ−１抗体医薬であるニボルマブを、０，０．１１，０．３３，１，３．３，１０μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で３０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのリン酸バッファー（ＰＢＳ）で２回洗浄した。続いて、各細胞に、ＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を１μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図１は、解析結果を示すグラフである。その結果、最初に反応させたニボルマブの濃度が高くなるにしたがって、ＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）のＭＩＴ９細胞への結合量が低下することが明らかとなった。
この結果から、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）がニボルマブと競合することが明らかとなった。
《クローンＭＩＨ４》
ＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）の代わりにＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた点以外は上記と同様にして、抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の反応性を評価した。
まず、ＭＩＴ９細胞株を２×１０５個ずつチューブに分注した。続いて、分注した各細胞に抗ＰＤ−１抗体医薬であるニボルマブを、０，０．１１，０．３３，１，３．３，１０μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で３０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞に、ＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を２μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図２は、解析結果を示すグラフである。その結果、最初に反応させたニボルマブの濃度に関わらず、ＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）がＭＩＴ９細胞に結合することが明らかとなった。
この結果から、抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）は、ニボルマブと競合せずにＰＤ−１に結合することが明らかとなった。
図３は、図１及び図２に示した解析結果に基づいて、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７又はクローンＭＩＨ４）のニボルマブとの競合率を計算した結果を示すグラフである。競合率は下記式（４）により算出した。
競合率（％）＝（全細胞数−抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７又はクローンＭＩＨ４）陽性細胞数）／全細胞数×１００ …（４）
［実験例２］
（抗ＰＤ−１抗体の評価２）
抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）と抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）との競合性を評価した。
まず、ＭＩＴ９細胞株を２×１０５個ずつチューブに分注した。続いて、分注した各細胞に、ＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、０，１．２５，２．５，５，１０，２０μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を４μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図４は、解析結果を示すグラフである。その結果、最初に反応させたＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の濃度に関わらず、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）がＭＩＴ９細胞に結合することが明らかとなった。
この結果から、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）は抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）と競合せずにＰＤ−１に結合することが明らかとなった。
［実験例３］
（抗ＰＤ−１抗体の評価３）
実験例２とは抗体を反応させる順序を逆にして、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）と抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）との競合性を評価した。
まず、ＭＩＴ９細胞株を２×１０５個ずつチューブに分注した。続いて、分注した各細胞に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を、０，０．５，１，２，４，８μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞に、ＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を１０μｇ／ｍＬずつ添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図５は、解析結果を示すグラフである。その結果、最初に反応させたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）の濃度に関わらず、ＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）がＭＩＴ９細胞に結合することが明らかとなった。
この結果は、抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）が抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）と競合せずにＰＤ−１に結合することを更に支持するものである。
［実験例４］
（ニボルマブの占有率の測定１）
抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ＭＩＴ９細胞株におけるニボルマブの占有率を測定した。
まず、ＭＩＴ９細胞株に１０μｇ／ｍＬのニボルマブを添加し、４℃で３０分間反応させた。続いて、細胞を６００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。続いて、ニボルマブと反応させたＭＩＴ９細胞株に、ニボルマブと反応させていないＭＩＴ９細胞株を、ニボルマブと反応させたＭＩＴ９細胞株の割合が０，２５，５０，７５，１００％となるように混合し、２×１０５個ずつチューブに分注した。これにより、ニボルマブの占有率が、それぞれ、０，２５，５０，７５，１００％であるＭＩＴ９細胞株が得られた。
続いて、各細胞に、それぞれ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図６（ａ）〜（ｅ）は、解析結果を示すグラフである。図６（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、ニボルマブの占有率が、０，２５，５０，７５，１００％となるように調製したＭＩＴ９細胞株の結果である。図６（ａ）〜（ｅ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
その結果、ニボルマブの占有率が上昇するにつれて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が低下する傾向が認められた。一方、ニボルマブの占有率が変化してもＰＥの蛍光強度は変化しない傾向が認められた。
続いて、図６（ａ）〜（ｅ）の結果に基づいて、下記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。
ニボルマブの占有率（％）＝（１−（抗ＰＤ−１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）が結合した細胞の割合／抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）が結合した細胞の割合））×１００ …（３Ａ）
図７は、上記式（３Ａ）により計算されたニボルマブの占有率と、実際のニボルマブの占有率を示すグラフである。その結果、上記式（３Ａ）により計算されたニボルマブの占有率が実際のニボルマブの占有率によく一致することが確認された。この結果は、本実験例の方法により、ニボルマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例５］
（ニボルマブの占有率の測定２）
抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、健常人の末梢血リンパ球中のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した。
まず、末梢血リンパ球に１０μｇ／ｍＬのニボルマブを添加し、４℃で３０分間反応させた。続いて、ニボルマブと反応させた末梢血リンパ球に、ニボルマブと反応させていない末梢血リンパ球を、ニボルマブと反応させた末梢血リンパ球の割合が０，２５，５０，７５，１００％となるように混合し、５×１０５個ずつチューブに分注した。これにより、ニボルマブの占有率が、それぞれ、０，２５，５０，７５，１００％である末梢血リンパ球が得られた。
続いて、各細胞にＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図８（ａ）〜（ｅ）は、解析結果を示すグラフである。図８（ａ）〜（ｅ）では、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、Ｔ細胞のみの解析結果を示した。図８（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、ニボルマブの占有率が、０，２５，５０，７５，１００％となるように調製した末梢血リンパ球の結果である。図８（ａ）〜（ｅ）中、縦軸は細胞数を示し、横軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示す。
その結果、ニボルマブの占有率が上昇するにつれて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が低下する傾向が認められた。
また、フローサイトメーターによる解析結果に基づいて、下記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。
ニボルマブの占有率（％）＝（１−（抗ＰＤ−１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）が結合した細胞の割合／抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）が結合した細胞の割合））×１００ …（３Ａ）
図９は、上記式（３Ａ）により計算されたニボルマブの占有率と、実際のニボルマブの占有率を示すグラフである。その結果、上記式（３Ａ）により計算されたニボルマブの占有率が実際のニボルマブの占有率によく一致することが確認された。この結果は、本実験例の方法により、ヒトのＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例６］
（ニボルマブの占有率の測定３）
抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ニボルマブの投与を受けている患者の体腔液由来のリンパ球中のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した。体腔液としては、胸水及び肺胞洗浄液を使用した。
まず、ニボルマブの投与を受けてから１２日後の患者の胸水由来のリンパ球、ニボルマブの投与を受けてから２１日後の患者の肺胞洗浄液由来のリンパ球を採取した。また、比較のために、ニボルマブの投与を受けていない患者の胸水由来のリンパ球も採取した。続いて、各リンパ球を５×１０５個ずつチューブに分注した。
続いて、各細胞にＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図１０（ａ）〜（ｃ）は、解析結果を示すグラフである。図１０（ａ）〜（ｃ）では、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、Ｔ細胞のみの解析結果を示した。図１０（ａ）はニボルマブの投与を受けていない患者の胸水由来のＴ細胞の解析結果であり、図１０（ｂ）はニボルマブの投与を受けてから１２日後の患者の胸水由来のＴ細胞の解析結果であり、図１０（ｃ）はニボルマブの投与を受けてから２１日後の患者の肺胞洗浄液由来のＴ細胞の解析結果である。図１０（ａ）〜（ｃ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
また、フローサイトメーターによる解析結果に基づいて、下記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。
ニボルマブの占有率（％）＝（１−（抗ＰＤ−１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）が結合した細胞の割合／抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）が結合した細胞の割合））×１００ …（３Ａ）
その結果、図１０（ａ）に示すように、ニボルマブの投与を受けていない患者の胸水由来のＴ細胞では、ニボルマブの占有率は１％と算出された。この値は誤差であると考えられた。これに対し、図１０（ｂ）に示すように、ニボルマブの投与を受けてから１２日後の患者の胸水由来のＴ細胞では、ニボルマブの占有率は９９．９％と算出された。また、図１０（ｃ）に示すように、ニボルマブの投与を受けてから２１日後の患者の肺胞洗浄液由来のＴ細胞では、ニボルマブの占有率は９６．０％と算出された。
この結果は、本実験例の方法により、実際の治療中の患者のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例７］
（ペムブロリズマブの占有率の測定）
抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ＭＩＴ９細胞株におけるペムブロリズマブの占有率を測定した。
まず、ＭＩＴ９細胞株に１０μｇ／ｍＬのペムブロリズマブを添加し、４℃で３０分間反応させた。続いて、細胞を６００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。続いて、ペムブロリズマブと反応させたＭＩＴ９細胞株に、ペムブロリズマブと反応させていないＭＩＴ９細胞株を、ペムブロリズマブと反応させたＭＩＴ９細胞株の割合が０，２５，５０，７５，１００％となるように混合し、２×１０５個ずつチューブに分注した。これにより、ペムブロリズマブの占有率が、それぞれ、０，２５，５０，７５，１００％であるＭＩＴ９細胞株が得られた。
続いて、各細胞に、それぞれ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図１１（ａ）〜（ｅ）は、解析結果を示すグラフである。図１１（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ、ペムブロリズマブの占有率が、０，２５，５０，７５，１００％となるように調製したＭＩＴ９細胞株の結果である。図１１（ａ）〜（ｅ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
その結果、ペムブロリズマブの占有率が上昇するにつれて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が低下する傾向が認められた。一方、ペムブロリズマブの占有率が変化してもＰＥの蛍光強度は変化しない傾向が認められた。
続いて、図１１（ａ）〜（ｅ）の結果に基づいて、下記式（３Ｂ）によりペムブロリズマブの占有率を計算した。
ペムブロリズマブの占有率（％）＝（１−（抗ＰＤ−１抗体（ＥＨ１２．２Ｈ７）が結合した細胞の割合／抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）が結合した細胞の割合））×１００ …（３Ｂ）
図１２は、上記式（３Ｂ）により計算されたペムブロリズマブの占有率と、実際のペムブロリズマブの占有率を示すグラフである。その結果、上記式（３Ｂ）により計算されたペムブロリズマブの占有率が実際のペムブロリズマブの占有率によく一致することが確認された。この結果は、本実験例の方法により、ペムブロリズマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例８］
（ニボルマブの占有率の測定４）
抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ニボルマブの投与を受けていない肺癌患者２例（以下、「患者１」、「患者２」という。）の血液サンプルを試料として、末梢血リンパ球中のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した。
まず、各患者の血液サンプルから、それぞれ末梢血リンパ球を回収した。続いて、各リンパ球を５×１０５個ずつチューブに分注した。
続いて、各細胞にＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、各細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、各細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図１３（ａ）〜（ｄ）は、解析結果を示すグラフである。図１３（ａ）は患者１の末梢血リンパ球の解析結果を示し、図１３（ｂ）は患者２の末梢血リンパ球の解析結果を示す。また、図１３（ｃ）は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、患者１のＴ細胞のみの解析結果を示したグラフである。また、図１３（ｄ）は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、患者２のＴ細胞のみの解析結果を示したグラフである。図１３（ａ）〜（ｄ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
続いて、図１３（ｃ）及び（ｄ）の結果に基づいて、上記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。その結果、いずれの患者においても、Ｔ細胞におけるニボルマブの占有率は０％と算出された。
この結果は、本実験例の方法により、血液サンプルを試料として、患者のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定できることを示す。
［実験例９］
（ニボルマブの占有率の測定５）
抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ニボルマブの投与を受けた腎癌患者の血液サンプルを試料として、末梢血リンパ球中のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定した。この患者は、ニボルマブの投与による治療を９コース受けたが、薬剤性肺炎を発症し、ニボルマブの投与を中止した患者であった。ニボルマブを１回投与して２週間が１コースに相当する。
まず、９回目のニボルマブの投与後３週間経過した時に、患者から血液サンプルを採取した。続いて、血液サンプルから末梢血リンパ球を回収した。続いて、各リンパ球を５×１０５個ずつチューブに分注した。
続いて、各細胞にＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図１４（ａ）及び（ｂ）は、解析結果を示すグラフである。図１４（ａ）は末梢血リンパ球の解析結果を示す。また、図１４（ｂ）は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、患者のＴ細胞のみの解析結果を示したグラフである。図１３（ａ）及び（ｂ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
続いて、図１４（ｂ）の結果に基づいて、上記式（３Ａ）によりニボルマブの占有率を計算した。その結果、Ｔ細胞におけるニボルマブの占有率は９５．４７％と算出された。
この結果は、本実験例の方法により、血液サンプルを試料として、患者のＴ細胞におけるニボルマブの占有率を測定できることを更に支持するものである。
［実験例１０］
（ペムブロリズマブの占有率の測定２）
抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及び抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）を使用して、ペムブロリズマブの投与を受けた肺癌患者の血液サンプルを試料として、末梢血リンパ球中のＴ細胞におけるペムブロリズマブの占有率を測定した。この患者は、ペムブロリズマブの投与による治療を２コース受けたが、薬剤性肺炎を発症し、ペムブロリズマブの投与を中止した患者であった。ペムブロリズマブを１回投与して３週間が１コースに相当する。
まず、２回目のペムブロリズマブの投与後３週間経過した時に、患者から血液サンプルを採取した。続いて、血液サンプルから末梢血リンパ球を回収した。続いて、各リンパ球を５×１０５個ずつチューブに分注した。
続いて、各細胞にＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（０．５μｇ／ｍＬ、ＢＤバイオサイエンス社）を添加して、４℃で１０分間反応させた。続いて、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３抗体１μｇ／ｍＬ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）４μｇ／ｍＬ及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１０μｇ／ｍＬを添加し、４℃で２０分間反応させた。
続いて、細胞を、６００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。続いて、細胞へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）及びＰＥ標識抗ＰＤ−１抗体（クローンＭＩＨ４）の結合を、フローサイトメーター（型式「ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ」、ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析した。
図１５（ａ）及び（ｂ）は、解析結果を示すグラフである。図１５（ａ）は末梢血リンパ球の解析結果を示す。また、図１５（ｂ）は、ＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて、患者のＴ細胞のみの解析結果を示したグラフである。図１５（ａ）及び（ｂ）中、縦軸はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を示し、横軸はＰＥの蛍光強度を示す。
続いて、図１５（ｂ）の結果に基づいて、上記式（３Ｂ）によりペムブロリズマブの占有率を計算した。その結果、Ｔ細胞におけるペムブロリズマブの占有率は３９．６６％と算出された。
この結果は、本実験例の方法により、血液サンプルを試料として、患者のＴ細胞におけるペムブロリズマブの占有率を測定できることを示す。
本発明によれば、特異的結合物質の動態を簡便に測定する技術を提供することができる。

Claims (19)

  1. 細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定する方法であって、
    前記細胞集団に、第２の特異的結合物質を接触させることと、
    前記細胞集団に、第３の特異的結合物質を接触させることと、
    前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、
    前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、
    前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、
    前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、
    前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    下記式（１）により計算される値が、前記占有率である、方法。
    第１の特異的結合物質の占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（１）
  2. 前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記第１の特異的結合物質が抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記対象細胞表面タンパク質がヒトｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）であり、前記第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１抗体である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、請求項５に記載の方法。
  7. 細胞集団における第１の特異的結合物質の占有率を測定するためのキットであって、
    第２の特異的結合物質及び第３の特異的結合物質を含み、
    前記第１、前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    前記占有率は、前記対象細胞表面タンパク質を発現した細胞のうち、前記第１の特異的結合物質が結合した細胞の割合であり、
    前記第２の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合する特異的結合物質であり、
    前記第３の特異的結合物質は、前記第１の特異的結合物質と競合せずに前記対象細胞表面タンパク質に結合する特異的結合物質である、キット。
  8. 前記第１の特異的結合物質が抗体である、請求項７に記載のキット。
  9. 前記対象細胞表面タンパク質がヒトＰＤ−１であり、前記第１の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１抗体である、請求項８に記載のキット。
  10. 前記第１の特異的結合物質がニボルマブ又はペムブロリズマブであり、前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、請求項９に記載のキット。
  11. 患者への抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、
    抗体医薬が投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、
    抗体医薬が投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、
    前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、
    前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、
    前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれも前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    前記第２の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合する特異的結合物質であり、
    前記第３の特異的結合物質は、前記抗体医薬と競合せずに前記抗体医薬の標的タンパク質に結合する特異的結合物質であり、
    下記式（２）により計算される前記抗体医薬の占有率が、患者への前記抗体医薬の投与間隔又は投与量を最適化するためのデータである、方法。
    前記抗体医薬の占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（２）
  12. 前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 前記占有率が基準値よりも高いことが、患者への前記抗体医薬の投与間隔を長くすべきこと又は投与量を減少させるべきことを示し、前記占有率が基準値よりも低いことが、患者への前記抗体医薬の投与間隔を短くすべきこと又は投与量を増大させるべきことを示す、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータを取得する方法であって、
    ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の細胞に第２の特異的結合物質を接触させることと、
    ニボルマブ又はペムブロリズマブが投与された患者由来の前記細胞に第３の特異的結合物質を接触させることと、
    前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、
    前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することと、を含み、
    前記第２及び前記第３の特異的結合物質は、いずれもヒトＰＤ−１に結合する特異的結合物質であり、
    前記第２の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合する特異的結合物質であり、
    前記第３の特異的結合物質は、ニボルマブ又はペムブロリズマブと競合せずにヒトＰＤ−１に結合する特異的結合物質であり、
    下記式（３）により計算されるニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率が、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔若しくは投与量を最適化するためのデータである、方法。
    ニボルマブ又はペムブロリズマブの占有率（％）＝（１−（前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数／前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数））×１００ …（３）
  16. 前記第２の特異的結合物質を接触させること、及び前記第３の特異的結合物質を接触させることを同時に行う、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第２の特異的結合物質が結合した細胞数を計測すること、及び前記第３の特異的結合物質が結合した細胞数を計測することを同時に行う、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 前記占有率が基準値よりも高いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を長くすべきこと若しくは投与量を減少させるべきことを示し、前記占有率が基準値よりも低いことが、患者へのニボルマブ又はペムブロリズマブの投与間隔を短くすべきこと若しくは投与量を増大させるべきことを示す、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記第２の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）であり、前記第３の特異的結合物質が抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（クローンＭＩＨ４）である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
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