WO2018235917A1 - メタノール資化性酵母内において高効率にベクターをアセンブルする方法 - Google Patents

メタノール資化性酵母内において高効率にベクターをアセンブルする方法 Download PDF

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WO2018235917A1
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seq
vector
yeast
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輝之 西
徹 渡邉
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株式会社カネカ
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Definitions

  • the present invention relates to a method of assembling a vector in a methanol-utilizing yeast in which the gene of DNL4 involved in non-homologous end joining is inactivated.
  • Non-patent Document 1 a method of assembling a vector in yeast using an autonomously replicating vector.
  • Pichia pastoris a kind of methanol utilization yeast which has been industrially used for a long time
  • Patent document 1 Non-Patent Documents 2 and 3
  • Patent Document 1 when assembling a vector in yeast using the method described in Patent Document 1 and Non-patent Documents 2 and 3, self-circularization of the vector by non-homologous end joining, low assembly efficiency, false positive strain There are new problems and complications such as selection of H. pylori, selective use of selective marker genes to suppress background of false positive strains, and the like.
  • Patent Document 1 uses a yeast in which the gene of KU70 involved in non-homologous end joining is inactivated, the vector can not suppress self-cyclization (Patent Document 1, Example 9, Figure 27).
  • the present invention provides a new means of assembling a vector in yeast with high efficiency by suppressing background of false positive strains in transformation of methanol assimilable yeast by completely suppressing vector self-cyclization. As an issue.
  • the present inventors have identified the protein DNL4 related to non-homologous end binding by comprehensive analysis of the nucleotide sequence of chromosomal DNA of Komagataella genus yeast. And, it was found that the inactivation of the gene encoding the protein completely suppresses the self circularization of the vector. Furthermore, they have also found that it is possible to assemble a vector in yeast with high efficiency, and the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following aspects.
  • (1) A method of assembling two or more types of vectors by a transformation method comprising the step of introducing two or more types of vectors into a methanol-utilizing yeast in which the gene of DNL4 is inactivated.
  • the DNL4 gene is any of the following genes (a) to (d): (a) a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, (b) a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25; (c) a gene comprising a nucleotide sequence having a sequence identity of 85% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, (d) A gene encoding an amino acid sequence having a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24.
  • the autonomously replicating vector further comprises an autonomously replicating sequence (ARS) and / or a centromere DNA sequence derived from P. cocciata or Ogataa yeast.
  • ARS autonomously replicating sequence
  • a method of producing an assembled vector comprising the method according to any one of (1) to (7).
  • (Ten) A method for producing a transformant, comprising the step of transforming with an assembled vector obtained by the method according to any one of (1) to (8).
  • (11) A transformant transformed by the assembled vector according to (9).
  • the present specification includes the disclosure contents of Japanese Patent Application Nos. 2017-122788 and 2017-246316 based on the priority of the present application.
  • the present invention it is possible to suppress the background of false positive strains in transformation of methanol utilization yeast by completely suppressing the self-cyclization of the vector. Furthermore, new means of assembling the vector in yeast with high efficiency are provided.
  • FIG. 1 is a schematic view for explaining the constitution of a fragment of a vector for genome integration in Production Example 7, Comparative Example 4 and Example 5.
  • non-homologous end joining refers to a mechanism in which the ends of DNA double strand break are joined, for example, the end sites are recognized by KU70 and KU80 dimers, and both ends are ligases DNL4 and LIF1. It refers to the mechanism by which the complex binds.
  • the gene involved in non-homologous end binding is a gene of a protein involved in the above-mentioned mechanism, and includes, for example, the gene for KU70, KU80, DNL4 or LIF1.
  • the KU70 gene has a nucleotide sequence encoding the polypeptide (KU70) represented by ACCESSION No. CCA 39 840, and the KU80 gene encodes a polypeptide (KU80) represented by ACCESSION No. CCA 40385
  • the nucleotide sequence, DNL4 gene is represented by the nucleotide sequence encoding the polypeptide (DNL4) represented by ACCESSION No. CCA39424.
  • the present invention relates to the gene of any one of the following (a) to (d): (a) a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, (b) a gene comprising a nucleotide sequence of a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25; (c) a gene comprising a nucleotide sequence having a sequence identity of 85% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, (d) A gene encoding an amino acid sequence having a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24.
  • hybridization of two nucleic acids under stringent conditions means, for example, the following.
  • a double concentration SSC solution When the nucleic acid Y can be obtained as a nucleic acid bound on the filter by washing the filter under the condition of 65 ° C.
  • nucleic acid Y can be referred to as "nucleic acid that hybridizes to nucleic acid X under stringent conditions", or nucleic acid X and nucleic acid Y are "hybridized to each other under stringent conditions” it can.
  • the nucleic acid Y is preferably washed with a 1 ⁇ SSC solution at 65 ° C., more preferably 0.5 ⁇ at 65 ° C., since the nucleic acid having high sequence identity can be expected to hybridize as the concentration of the SSC solution decreases.
  • nucleic acid Y is preferably washed with a double concentration SSC solution at 70 ° C., more preferably twice concentration at 75 ° C., since nucleic acids having high sequence identity can be expected to hybridize as the temperature is raised.
  • the nucleic acid can be obtained as a nucleic acid bound on the filter by washing with SSC solution, more preferably washing with double concentration SSC solution at 80 ° C., more preferably washing the filter with double concentration SSC solution at 85 ° C. It is.
  • the reference nucleic acid X may be nucleic acid X derived from a colony or plaque.
  • sequence identity of the nucleotide sequence or the amino acid sequence can be determined using methods well known to those skilled in the art, sequence analysis software and the like. For example, blastn program and blastp program of BLAST algorithm and fasta program of FASTA algorithm can be mentioned.
  • sequence identity of a certain evaluation target base sequence with the base sequence X refers to alignment (alignment) of the base sequence X with the evaluation target base sequence, introducing gaps as necessary, It is a value in which the frequency at which the same base appears at the same site in the base sequence including the gap portion when the degree of base identity between the two is maximized is represented by%.
  • sequence identity of an amino acid sequence to be evaluated with an amino acid sequence X of a certain amino acid sequence to be evaluated means aligning the amino acid sequence X with the amino acid sequence to be evaluated and introducing gaps as necessary. It is a value in which the frequency at which the same amino acid appears at the same site in the amino acid sequence including the gap portion when the amino acid identity between the two is maximized is represented by%.
  • sequence identity between the gene and the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more , 98% or more, or 99% or more is most preferable.
  • nucleic acid can also be referred to as "polynucleotide”, and refers to DNA or RNA, and typically refers to DNA.
  • the DNA may be double-stranded or single-stranded, and the DNA containing the predetermined base sequence may be double-stranded DNA containing the predetermined base sequence in one strand, or It may be a single-stranded DNA (sense strand) containing a predetermined base sequence or a single-stranded DNA (antisense strand) containing a complementary sequence of the predetermined base sequence.
  • a base sequence encoding an amino acid sequence refers to a base sequence designed based on a codon table for a polypeptide consisting of an amino acid sequence, said base sequence being produced by transcription and translation of the polypeptide Bring
  • polypeptide refers to peptide bonds of two or more amino acids, and includes proteins, as well as short chain length peptides called peptides and oligopeptides.
  • gene includes DNA and mRNA as a transcript thereof, and is typically DNA, and particularly preferably DNA contained in a host chromosome.
  • T thymine
  • U uracil
  • gene is to be indicated without distinction between the control region, the coding region, the exon and the intron unless otherwise mentioned.
  • activation refers to a state in which the function of a gene is lost or a state in which the function is reduced, and the expression amount of mRNA which is a transcription product of the gene or polypeptide which is a translation product. Also includes a state in which is decreased, and a state in which it does not function normally as mRNA or protein.
  • the expression level of mRNA can be quantified using real time PCR method, RNA-Seq method, Northern hybridization or hybridization method using DNA array, etc.
  • the expression level of polypeptide recognizes the polypeptide. It can quantify using the staining compound etc. which have binding property with an antibody or polypeptide. In addition to the above-described quantification methods, conventional methods used by those skilled in the art may be used.
  • DNA mutation treatment using a drug or ultraviolet light partial specific mutagenesis using PCR, RNAi, protease, homologous recombination and the like can be used.
  • the site for deletion, substitution, addition, or insertion, or the nucleotide sequence to be deleted, substituted, added, or inserted is not particularly limited as long as the normal function of the gene can be deleted.
  • the gene to be inactivated may be a gene on the chromosome of methanol utilization yeast, or may be an extra-chromosome gene of methanol utilization yeast. Among these, it is preferable to inactivate the gene on the chromosome.
  • inactivation of the gene of DNL4 is preferably at least 50%, preferably 50% or more of the number of bases of the base sequence of the coding region on the chromosome of the host, for example at least a part of the coding region of said gene Can be realized by deleting the region of the base sequence consisting of the number of bases of 60% or more, preferably 70% or more, preferably 80% or more, preferably 90% or more, preferably 100%.
  • the "modification of the base sequence" in the present invention can be carried out using techniques of gene insertion and site-directed mutagenesis using homologous recombination. For example, replacement of the gene upstream promoter with a less active promoter, modification to a codon not suitable for methanol-utilizing yeast, etc., upstream sequence of the gene to be deleted, selection marker gene sequence and deletion For example, introduction of a vector in which the downstream sequence of the target gene is linked can be mentioned.
  • the degree of expression level reduction due to inactivation in the present invention is not particularly limited, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, It is preferable to decrease by 80% or more, 90% or more, and 95% or more.
  • the gene product can be inactivated as long as the normal function of the gene product can be deleted even if the expression amount is not reduced. The degree of is just one of the criteria for inactivation.
  • the number of inactivated DNL4 genes is not particularly limited.
  • other genes involved in non-homologous end joining may be further inactivated, for example, those of KU70 gene and DNL4 gene, KU80 gene and DNL4 gene, DNL4 gene and LIF1 gene.
  • Double inactivation eg KU70 gene and KU80 gene and DNL4 gene, KU70 gene and DNL gene and LIF1 gene, KU80 gene and DNL4 gene and triple inactivation of LIF1 gene, eg KU70 gene and KU80 gene and DNL4 gene and LIF1 It may be quadruple inactivation of the gene.
  • the “gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25” is a nucleotide sequence of four chromosomal DNAs of C. pella pastoris (ATCC 76273 strain: ACCESSION No. FR839628 to FR839631 (J. Biotechnol. 154 (4), 312-320 ( 2011), and GS115 strain: It was found by exhaustive analysis of ACCESSION No. FN 392319 to FN 392 229 (Nat. Biotechnol. 27 (6), 561-566 (2009)).
  • inactivating the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, 1000 bp and 100% of the promoter located upstream of the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25
  • a nucleotide sequence having 100% sequence identity with 1007 bp of a terminator located downstream of a gene consisting of the nucleotide sequence having the sequence identity for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is prepared as a PCR product using primers 1 to 4 respectively, and the vector containing the PCR product is transformed into Komagataella yeast, and the selected strain is used for homologous recombination by homologous recombination.
  • the “gene encoding an amino acid sequence having a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24” is a poly consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 It refers to a gene consisting of a nucleotide sequence designed with reference to a codon table based on a peptide, and includes, for example, the gene shown in SEQ ID NO: 25. Then, by inactivating the gene, self-cyclization of the vector is suppressed, and the vector can be assembled in yeast with high efficiency.
  • the sequence identity is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, most preferably 98% or more, or 99% or more. preferable.
  • the methanol-utilizing yeast in which the gene of DNL4 of the present invention is inactivated is a nucleotide sequence having a region homologous to the gene of DNL4, a nucleotide sequence having a region homologous to the promoter of the gene of DNL4, and a terminator of the gene of DNL4 It is preferably obtained by transforming a vector containing at least one of the nucleotide sequences having a homologous region into a methanol-utilizing yeast.
  • the methanol-utilizing yeast in which the gene of DNL4 of the present invention is inactivated is, for example, a nucleotide sequence having a homologous region with any of the genes of (a) to (d), the above (a) to (d)
  • a methanol-containing vector comprising at least one of a nucleotide sequence having a promoter and a homologous region to any gene, and a nucleotide sequence having a homologous region to a terminator of any of the genes of (a) to (d)
  • they are obtained by transformation into virulent yeast.
  • the gene of DNL4 on the chromosome of a methanol assimilable yeast for example, any of the genes (a) to (d) can be inactivated by the above transformation.
  • a particularly preferred embodiment of inactivating the DNL 4 gene of any of the above (a) to (d) is a partial base sequence contained in the base sequence of the promoter located upstream of the gene on the host chromosome.
  • a DNA fragment 1 comprising a nucleotide sequence having a sequence identity of 85% or more with (partial nucleotide sequence 1), a partial nucleotide sequence contained in the nucleotide sequence of the terminator located downstream of the gene (partial nucleotide sequence 2 And a DNA fragment 2 containing a base sequence having a sequence identity of 85% or more, which is constructed by connecting a DNA fragment 1 upstream and a DNA fragment 2 downstream so as to transform a host into a host And methods of deleting the gene by homologous recombination.
  • the vector is preferably a linear vector obtained by cleaving a circular vector containing DNA fragment 1 and DNA fragment 2 at a restriction enzyme recognition site inside DNA fragment 1 or DNA fragment 2 to linearize the vector.
  • a base sequence of the said promoter the base sequence shown to sequence number 1 can be illustrated.
  • the base sequence shown to sequence number 2 can be illustrated.
  • the lengths of partial base sequence 1 and partial base sequence 2 may be any lengths that allow homologous recombination, preferably 100 bp or more, preferably 200 bp or more, preferably 300 bp or more, preferably 400 bp or more, preferably 500 bp or more, preferably 600 bp or more, preferably 700 bp or more, preferably 800 bp or more, preferably 900 bp or more, preferably 1000 bp or more.
  • the sequence identity of 85% or more is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more Sequence identity of
  • the methanol-utilizing yeast in the present invention is defined as a yeast which can be cultured using methanol as a sole carbon source, it was originally a methanol-utilizing yeast, but it is methanol by artificial modification or mutation. Yeasts that have lost assimilation performance are also included in the methanol-utilizing yeast of the present invention.
  • yeasts belonging to Pichia Pichia
  • Ogataea Ogataea
  • Candida Candida
  • Torulopsis Torulopsis
  • Komagataella and the like.
  • Pichia methanolica Pichia
  • Ogataea angusta Ogataea angusta
  • Ogataea polymorpha Ogataea morpha
  • Ogataea parapolymorpha Ogataea parapolymorpha
  • Oitaea In the genus Candida, Candida boidinii, and in the genus Komagataella, Komagataella pastoris, Komagataella phaffii, etc. are mentioned as preferable examples.
  • Komagata yeast or Ogataea yeast is particularly preferable.
  • Komagataella pastoris Komagataella pastoris
  • Komagataella phaffii are preferable. Both Komagataella pastoris and Komagataella fafy have the alias Pichia pastoris.
  • strains that can be used as a host include strains such as Komagataella pastoris ATCC 76273 (Y-11430, CBS 7435) and Komagataella pastoris X-33. These strains can be obtained from American Type Culture Collection, Thermo Fisher Scientific Co., etc.
  • Ogataea yeast
  • Ogataea angusta Ogataea angusta
  • Ogataea polymorpha Ogataea polymorpha
  • Ogataea parapolymorpha Ogataea parapolymorpha
  • strains that can be used include strains such as Ogataair Angsta NCYC 495 (ATCC 14754), Ogataair polymorpha 8V (ATCC 34438), Ogataair parapolymorpha DL-1 (ATCC 26012). These strains can be obtained from, for example, the American Type Culture Collection.
  • derivatives derived from strains of the genus Locustella and Ogataa can also be used, and for example, if the histidine auxotrophy is required, the Loblus komagata pastoris GS115 strain (available from Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), leucine If it is a requirement strain, BY4329 derived from NCYC495, BY5242 derived from 8V, BY5243 derived from DL-1 (these can be distributed from the National BioResource Project), and the like can be mentioned. In the present invention, derivatives from these strains can also be used.
  • the vector of the present invention (at least one of two or more kinds of vectors used in the present invention and / or a vector formed by assembling two or more kinds of vectors) is a circular vector, a linear vector, a plasmid, an artificial chromosome And so on.
  • vector is a nucleic acid molecule artificially constructed.
  • the nucleic acid molecule constituting the vector of the present invention (two or more types of vectors used in the present invention and / or a vector formed by assembling two or more types of vectors) is usually DNA, preferably double-stranded DNA And may be cyclic or linear.
  • the vector formed by assembling at least one of the two or more types of vectors used in the present invention and the two or more types of vectors usually has a cloning site, Clontech, which includes one or more restriction enzyme recognition sites.
  • An overlap region for using In-Fusion cloning system or New England Biolabs' Gibson Assembly system a base sequence of an endogenous gene, a base sequence encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a target protein, a selectable marker gene ( A nucleotide sequence of an auxotrophic complementation gene, a drug resistance gene, etc.) can be included.
  • linear vectors examples include auxotrophic complementation genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, ARG4 gene, G418 resistance gene, Zeocin (trade mark) resistance gene, hygromycin resistance gene, Clone NAT resistance A gene, a PCR product having a nucleotide sequence of a drug resistant gene such as blasticidin S resistant gene, or one obtained by cutting a circular vector or a plasmid with an appropriate restriction enzyme to make it linear may be mentioned.
  • auxotrophic complementation genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, ARG4 gene, G418 resistance gene, Zeocin (trade mark) resistance gene, hygromycin resistance gene, Clone NAT resistance A gene, a PCR product having a nucleotide sequence of a drug resistant gene such as blasticidin S resistant gene, or one obtained by cutting a circular vector or a plasmid with an appropriate restriction enzyme to make it linear may
  • Examples of the plasmid include YEp vector, YRp vector, YCp vector, pPICHOLI (http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/p_picholi_shuttle_vector.html), pHIP (Journal of General Microbioiogy (1992), 138, 2405-2416.
  • artificial chromosomes generally refer to artificial chromosome vectors including centromere DNA sequences, telomere DNA sequences, and autonomously replicating sequences (ARS), and in the case of yeast, yeast artificial chromosomes (YAC vectors) and the like can be mentioned. It is developed in Schizosaccharomyces pombe etc. In Komagataella pastoris, artificial chromosomes can be constructed by using the centromeric DNA sequences described in WO 2016/088824.
  • transformation refers to the introduction of the above vector into methanol assimilable yeast.
  • a known method can be used appropriately as a method for introducing a vector into methanol utilizing yeast, that is, a transformation method such as electroporation, lithium acetate method, spheroplast method, etc., but it is not particularly limited. It is not something to be done.
  • a transformation method of Komagataella pastoris the electroporation method described in High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol (Biotechniques. 2004 Jan; 36 (1): 152-4.) Is described. Is common.
  • a selective marker gene such as an auxotrophic complementation gene or a drug resistance gene.
  • the selection marker is not particularly limited, but in the case of methanol assimilable yeast, auxotrophic complementation genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, ARG4 gene, respectively, uracil, leucine, adenine, histidine Transformants can be selected by restoration of prototrophic phenotype in auxotrophic strains of arginine.
  • drug resistant genes such as G418 resistant gene, Zeocin (trademark) resistant gene, hygromycin resistant gene, Clone NAT resistant gene, and blasticidin S resistant gene, respectively, include G418, Zeocin (trademark), hygromycin and Clone.
  • Transformants can be selected by resistance on a medium containing NAT, Blasticidin S.
  • the auxotrophic selection marker used when producing a transformant can not be used when the selection marker is not destroyed in the host. In this case, the selection marker may be destroyed in the host, and methods known to those skilled in the art can be used.
  • the transformation method of the present invention includes the step of introducing two or more types of vectors because the vectors can be assembled in yeast with high efficiency.
  • the time to introduce two or more types of vectors is preferably sequential or simultaneous.
  • each of the two or more types of vectors contains, as a partial base sequence, a base sequence having sequence identity with each other at least one other vector.
  • the position of the base sequence having the sequence identity may be one or two or more.
  • a base sequence having sequence identity with each other has a base sequence in which at least a part of the base sequences with each other is identical, and preferably a base sequence having a sequence identity of 85% or more It is a nucleotide sequence having sequence identity, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 100%.
  • the length of the base sequence having the sequence identity is not particularly limited as long as it is capable of assembling two vectors containing it if it is a base sequence of 20 bp or more, specifically 20 bp or more, 30 bp or more, 40 bp or more, 50 bp or more, 60 bp or more, 70 bp or more, 80 bp or more, 90 bp or more, 100 bp or more, 200 bp or more, 300 bp or more, 400 bp or more, 500 bp or more, 1000 bp or more is preferable.
  • the molar ratio is not particularly limited.
  • 1: 1, 1: 1 or more, 1: 2 or more, 1: 3 or more 1: 4 or more, 1: 5 or more, 1:10 or more, 1:20 or more, 1:30 or more, 1:40 or more, 1:50 or more is preferable.
  • “Assembly” in the present invention refers to a mechanism in which two or more types of vectors introduced into yeast are linked via a base sequence having sequence identity.
  • each of the two or more types of vectors contains, as a partial base sequence, base sequences having sequence identity with each other and at least one other vector, and the above-mentioned homologous recombination among the partial base sequences is performed.
  • Two or more types of vectors are assembled to construct one linear or circular vector.
  • the one linear vector may be integrated into the host genomic DNA, in which case one of the two or more vectors is further upstream of the insertion site of the host genomic DNA.
  • Partial base sequences having sequence identity (preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, most preferably 100% sequence identity) to the base sequence of
  • the other one of the two or more types of vectors further includes sequence identity to the base sequence downstream of the insertion site of the host genomic DNA (preferably 85% or more, more preferably) as a sequence Contains 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 100% sequence identity) as a partial base sequence.
  • host refers to a cell into which a vector has been introduced and transformed, and a host after transformation may be referred to herein as a transformant.
  • the cell used as a host is not particularly limited as long as it is a methanol-utilizing yeast cell into which a vector can be introduced.
  • the vector of the present invention can include an autonomously replicating sequence (ARS).
  • ARS refers to prokaryotes (E.
  • the vectors of the invention may, for example, comprise more than one ARS in different species.
  • ARS which may be contained in the vector of the present invention, a centromere DNA sequence containing ARS in P.
  • This sequence is a centromere DNA sequence of chromosomal DNA No. 2 (ACCESSION No. FR839629) of Komagataella pastoris.
  • ARS which is an ARS of Komagataella pastoris consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 37
  • This sequence is a 164 bp ARS located at 1980709-1980872 of chromosomal DNA No. 2 (ACCESSION No. FR839629) of Komagataella pastoris.
  • the vector of the present invention may not contain an autonomously replicating sequence (ARS) .
  • ARS autonomously replicating sequence
  • vectors assembled in yeast may be integrated into the host chromosome.
  • each of the two or more types of vectors used in the present invention is a nucleic acid fragment not capable of autonomous replication, and a vector formed by assembling the two or more types of vectors is incorporated into host genomic DNA.
  • the two or more types of vectors used in the present invention are each a nucleic acid fragment not capable of autonomous replication, and the upper end and / or the bottom of the vector formed by assembling the two or more types of vectors.
  • Host genomic DNA regions having sequence identity with the ends are integrated into host genomic DNA by the homologous recombination mechanism.
  • the vector of the present invention (at least one of two or more types of vectors used in the present invention and / or a vector formed by assembling two or more types of vectors) is preferably an autonomously replicating vector. If the vector of the present invention is an autonomously replicating type, host improvement can be performed without changing the genome sequence or genome structure of the host. In a particularly preferred embodiment, one of the two or more vectors used in the present invention is an autonomously replicating vector, and the remainder of the two or more vectors is a nucleic acid fragment which alone has no autonomous replication ability, and A vector formed by assembling more than one kind of vector is an autonomously replicating vector.
  • an autonomously replicating vector is a vector that replicates independently of the host chromosome, and refers to a vector that replicates in the host without being integrated into the host chromosome.
  • the vector of this embodiment of the present invention can be used as an autonomously replicating vector in a methanol assimilable yeast, such as, for example, Komagata yeast or Ogataair yeast, preferably Komagataella pastoris. That is, the autonomously replicating vector preferably contains an ARS and / or centromere DNA sequence derived from a methanol-utilizing yeast, and an ARS and / or a centromere DNA sequence derived from a Komagataella or Ogataair yeast. Is more preferred.
  • the vector of the present invention (at least one of two or more types of vectors used in the present invention and / or a vector formed by assembling two or more types of vectors) is preferably used in host cells of multiple species. It is an autonomously replicable vector capable of autonomous replication.
  • Such autonomously replicating type vectors include, for example, an ARS and / or centromere DNA sequence derived from the above-mentioned Komagataella yeast or Ogataa yeast, and further, a biological species from which the ARS and / or centromere DNA sequence is derived Included are vectors comprising ARS and / or centromere DNA sequences derived from different species.
  • a centromere DNA sequence of a human chromosome is cloned into a vector containing a centromere DNA sequence including ARS in A. pratensis consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and used as a human artificial chromosome, or the nucleotide sequence shown in the above SEQ ID NO: 6
  • Is cloned into a vector containing the vector and used as an autonomously replicating vector in both genus species, or a vector containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 above is Saccharomyces cerevisiae or division.
  • Cloning of ARS and centromeric DNA sequences of yeast (Schizosaccharomyces pombe) and autonomous in both genus species It is used as a replication type vector, or a gene group encoding a protein group that composes the centromere of Pleurotus pastoris is cloned into a vector containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 and used as an autonomous replication type vector in other genera species. It is possible to do. Moreover, it is also possible to combine with an autonomously replicating vector of E. coli as in this example.
  • a centromeric DNA sequence is a base sequence to which a spindle is bound to form a structure called a centromere.
  • a centromere For example, in humans, it is a region where the long arm and short arm of a chromosome intersect, and is also called a centromere region because it is located approximately at the center of the chromosome.
  • the plasmid used for transformation of yeast was introduced by introducing the constructed vector into E. coli E. coli HST08 competent cells (Takara Bio Inc.), and culturing and amplifying the obtained transformants.
  • E. coli E. coli HST08 competent cells Teakara Bio Inc.
  • Prepared by Preparation of the plasmid from the plasmid holding strain was performed using FastGene Plasmid Mini Kit (manufactured by Japan Genetics).
  • DNL4 promoter (SEQ ID NO: 1), DNL4 terminator (SEQ ID NO: 2), promoter-controlled ADE1 gene sequence (SEQ ID NO: 3), GAP promoter (SEQ ID NO: 4), GAP1 terminator (SEQ ID NO: 5) used in vector construction ),
  • a centromere DNA sequence (SEQ ID NO: 6), PARS 1 (SEQ ID NO: 37), a mixture of the chromosomal DNA of the Coccataella pastoris strain ATCC 76273 (the base sequence is described in EMBL (The European Molecular Biology Laboratory) ACCESSION No. FR839628 to FR839631) Prepared by PCR.
  • the DNL4 promoter is Primer 1 (SEQ ID NO: 7) and Primer 2 (SEQ ID NO: 8), the DNL 4 terminator is Primer 3 (SEQ ID NO: 9) and Primer 4 (SEQ ID NO: 10), the promoter-controlled ADE1 gene sequence is Primer 5 SEQ ID NO: 11) and primer 6 (SEQ ID NO: 12), GAP promoter is primer 7 (SEQ ID NO: 13) and primer 8 (SEQ ID NO: 14), GAP1 terminator is primer 9 (SEQ ID NO: 15) and primer 10 (SEQ ID NO: 16) ,
  • the centromeric DNA sequences are Primer 11 (SEQ ID NO: 17) and Primer 12 (SEQ ID NO: 18) and Primer 13 (SEQ ID NO: 19) and Primer 14 (SEQ ID NO: 20); PARS1 is Primer 26 (SEQ ID NO: 38) and Primer 27 (SEQ ID NO: 38) It prepared by PCR using sequence number 39).
  • the promoter-controlled ZeocinTM resistant gene (SEQ ID NO: 21) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template.
  • the G418 resistance gene (SEQ ID NO: 22) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template.
  • the green fluorescent protein gene (SEQ ID NO: 23) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template.
  • PCR was performed using Prime STAR HS DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like under the reaction conditions described in the attached manual.
  • Preparation of chromosomal DNA was carried out using the Kaneka simple DNA extraction kit version 2 (manufactured by Kaneka Co., Ltd.) or the like from Komagataella pastoris strain ATCC 76273 under the conditions described therein.
  • Preparation Example 2 Construction of vector for inactivation of gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25
  • a nucleic acid fragment in which PstI recognition sequence and BamHI recognition sequence are added to the end of DNL4 promoter (SEQ ID NO: 1) is prepared by PCR using Primer 1 (SEQ ID NO: 7) and Primer 2 (SEQ ID NO: 8).
  • a nucleic acid fragment in which a BamHI recognition sequence and a KpnI recognition sequence are added to the end of SEQ ID NO: 2) is prepared by PCR using Primer 3 (SEQ ID NO: 9) and Primer 4 (SEQ ID NO: 10).
  • DNL4 terminator nucleic acid fragment was inserted between PstI-KpnI sites of pUC19 (Takara Bio Inc., Code No. 3219) after BamHI and KpnI treatment to construct pUC-Pdn4Tdnl4.
  • nucleic acid fragment having KpnI recognition sequence added to both sides of the promoter-controlled ADE1 gene sequence (SEQ ID NO: 3) is prepared by PCR using Primer 5 (SEQ ID NO: 11) and Primer 6 (SEQ ID NO: 12). Then, it was inserted into the KpnI site of pUC-Pdnl4Tdnl4 after KpnI treatment to construct pUC-Pdnl4Tdnl4ADE1.
  • This vector is the promoter 1000 bp and terminator 1007 bp of the gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 which codes for the amino acid sequence (ACCESSION No. CCA39424) shown in SEQ ID NO: 24 which is DNL4 of Komagataella pastoris ATCC 76273 strain.
  • DNL4 gene a vector to which an ADE1 gene controlled by a promoter is added as a homologous region, and a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 by transforming into a host of methanol assimilable yeast as in the examples described later (DNL4 gene) is designed to be inactivated.
  • Production Example 3 Construction of Green Fluorescent Protein Expressing Autonomous Replication Vector A nucleic acid fragment in which HindIII-XbaI-NotI-AscI-SfiI-PacI-AsiSI-SfiI recognition sequence and EcoRI recognition sequence were added to the end of the promoter-controlled ZeocinTM resistance gene (SEQ ID NO: 21) was used as Primer 15 ( PUC-Zeo was constructed by preparing it by PCR using SEQ ID NO: 26) and primer 16 (SEQ ID NO: 27), and after HindIII and EcoRI treatment, inserting between HindIII and EcoRI sites of pUC19.
  • nucleic acid fragment having AscI recognition sequence and SpeI recognition sequence added to the end of GAP promoter is prepared by PCR using Primer 7 (SEQ ID NO: 13) and Primer 8 (SEQ ID NO: 14).
  • a nucleic acid fragment in which SpeI recognition sequence and XhoI recognition sequence were added to the end of the fluorescent protein gene was prepared by PCR using Primer 17 (SEQ ID NO: 28) and Primer 18 (SEQ ID NO: 29).
  • a nucleic acid fragment having XhoI recognition sequence and PacI recognition sequence added to the end of SEQ ID NO: 5) is prepared by PCR using Primer 9 (SEQ ID NO: 15) and Primer 10 (SEQ ID NO: 16), GAP promoter treated with AscI and SpeI , The green fluorescent protein gene was inserted between AscI-PacI sites of pUC-Zeo after SpeI and XhoI treatment and GAP1 terminator after XhoI and PacI treatment to construct pUC-PgapGFPTgap1Zeo.
  • LOR_CC about half the region (LOR_CC) of the centromeric DNA sequence (SEQ ID NO: 6) is prepared by PCR using primer 11 (SEQ ID NO: 17) and primer 12 (SEQ ID NO: 18), and the remaining about half region CC_ROR) is prepared by PCR using primer 13 (SEQ ID NO: 19) and primer 14 (SEQ ID NO: 20), LOR_CC is treated with NotI and PstI, CC_ROR is treated with PstI and XbaI, and between XbaI-NotI sites of pUC-PgapGFPTgap1Zeo PUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo was constructed.
  • This vector is an autonomously replicating vector based on a centromere DNA sequence containing an autonomously replicating sequence (ARS) in Pleurotus pastoris, the green fluorescent protein is controlled by the GAP promoter, and the transformant is resistant to Zeocin (trademark).
  • ARS autonomously replicating sequence
  • PARS1 (SEQ ID NO: 37) is prepared by PCR using primer 26 (SEQ ID NO: 38) and primer 27 (SEQ ID NO: 39), and after NotI treatment, inserted into the NotI site of pUC-PgapGFPTgap1Zeo, pUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeo Built.
  • This vector is an autonomously replicating vector according to PARS1, which is ARS of A. pratensis.
  • the green fluorescent protein is controlled by the GAP promoter, and the transformant has ZeocinTM resistance.
  • G418 Resistance Gene Vector A nucleic acid fragment of G418 resistant gene (SEQ ID NO: 22) was prepared by PCR using primer 19 (SEQ ID NO: 30) and primer 20 (SEQ ID NO: 31) to construct 0_G418_0.
  • a nucleic acid fragment of G418 resistant gene (SEQ ID NO: 22) was prepared by PCR using primer 21 (SEQ ID NO: 32) and primer 22 (SEQ ID NO: 33) to construct 30_G418_30.
  • This vector is designed to contain a 30 bp base sequence having 100% sequence identity with the GAP promoter and GAP1 terminator at the end.
  • a nucleic acid fragment of G418 resistant gene (SEQ ID NO: 22) was prepared by PCR using Primer 23 (SEQ ID NO: 34) and Primer 24 (SEQ ID NO: 35) to construct 60_G418_60.
  • This vector is designed to contain a 60 bp nucleotide sequence having 100% sequence identity with the GAP promoter and GAP1 terminator at the end.
  • ⁇ Production Example 5 Construction of an autonomously replicating vector having a multiple cloning site> A nucleic acid fragment in which AOX1 promoter (SEQ ID NO: 41) and GAP1 terminator (SEQ ID NO: 5) are added to the end of the multiple cloning site (Acc65I-AvrII-EcoRV-MluI-BsrGI) (SEQ ID NO: 40) is used as a template for synthetic DNA It was prepared by PCR using Primer 28 (SEQ ID NO: 42) and Primer 29 (SEQ ID NO: 43), and inserted between AscI-PacI sites of pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo constructed in Preparation Example 3 after AscI and PacI treatment, Cen2Paox1 MCSTgap1Zeo was constructed.
  • AOX1 promoter SEQ ID NO: 41
  • GAP1 terminator SEQ ID NO: 5
  • This vector is an autonomously replicating vector based on a centromere DNA sequence containing an autonomously replicating sequence (ARS) in Pleurocystis pastoris, and has a multicloning site (Acc65I-AvrII-EcoRV-MluI-BsrGI) downstream of the AOX1 promoter, The GAP1 terminator is located downstream of the cloning site, and the transformant has ZeocinTM resistance.
  • ARS autonomously replicating sequence
  • nucleic acid fragment containing Position 856357-858859 of chromosome No. 6 (AECK01000006) is prepared by PCR using Primer 32 (SEQ ID NO: 47) and Primer 33 (SEQ ID NO: 48), Fragment 2 (SEQ ID NO: 49) It built 2503 bp.
  • nucleic acid fragment containing Position 858744-861310 of chromosome 6 (AECK01000006) is prepared by PCR using primer 34 (SEQ ID NO: 50) and primer 35 (SEQ ID NO: 51), Fragment 3 (SEQ ID NO: 52) It built 2567 bp.
  • nucleic acid fragment containing Position 861181-863668 of chromosome No. 6 (AECK01000006) is prepared by PCR using Primer 36 (SEQ ID NO: 53) and Primer 37 (SEQ ID NO: 54), Fragment 4 (SEQ ID NO: 55) The 2488 bp was constructed.
  • nucleic acid fragment containing Position 863538-866113 of chromosome 6 (AECK01000006) is prepared by PCR using primer 38 (SEQ ID NO: 56) and primer 39 (SEQ ID NO: 57), Fragment 5 (SEQ ID NO: 58) It built 2624 bp.
  • a nucleic acid fragment containing the base sequence 1-195 of the green fluorescent protein gene linked to the GAP promoter (SEQ ID NO: 4) is used as a template for the synthetic DNA as a primer 40 (SEQ ID NO: 59) and primer 41 (SEQ ID NO: 60)
  • the DNA was prepared by PCR using pGapGFP1 (SEQ ID NO: 61) 735 bp.
  • a nucleic acid fragment containing the 101st-720th nucleotide sequence of the green fluorescent protein gene was prepared by PCR using primer 42 (SEQ ID NO: 62) and primer 43 (SEQ ID NO: 63) with synthetic DNA as a template, GFP2 (sequence The number 64) 696 bp was constructed.
  • Fragment 1 contains a 77 bp base sequence with 100% sequence identity with the AOX1 promoter and multicloning site at the top end, and a 121 bp base sequence with 100% sequence identity with Fragment 2 at the bottom end It is designed.
  • Fragment 2 is designed to contain a 121 bp base sequence having 100% sequence identity with Fragment 1 at the upper end, and a 116 bp base sequence having 100% sequence identity to Fragment 3 at the lower end. .
  • Fragment 3 is designed to contain at its upper end a 116 bp base sequence with 100% sequence identity with Fragment 2 and at its lower end contain a 130 bp base sequence with 100% sequence identity with Fragment 4 .
  • Fragment 4 is designed to contain a 130 bp base sequence having 100% sequence identity with Fragment 3 at the upper end, and a 131 bp base sequence having 100% sequence identity with Fragment 5 at the lower end. .
  • Fragment 5 is designed to contain a 131 bp base sequence having 100% sequence identity with Fragment 4 at the upper end, and a 95 bp base sequence having 100% sequence identity with PgapGFP1 at the lower end.
  • PgapGFP1 is designed to contain a 95 bp base sequence having 100% sequence identity with Fragment 5 at the upper end, and a 95 bp base sequence having 100% sequence identity to GFP2 at the lower end.
  • GFP2 is designed to contain a 95 bp base sequence having 100% sequence identity with PgapGFP1 at the upper end, and a 76 bp base sequence having 100% sequence identity with the multicloning site and GAP1 terminator at the lower end ing.
  • Example 1 Acquisition of transformed yeast in which a gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 has been inactivated>
  • a methanol assimilable yeast host was transformed as follows.
  • Adenine auxotrophic strain derived from Komagataella pastoris ATCC 76273 is inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% hipolypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose) at 30 ° C. An overnight shaking culture was performed to obtain a preculture solution. Inoculate 500 ⁇ l of the obtained pre-culture solution into 50 ml of YPD medium, shake culture until the OD600 reaches 1 to 1.5, collect bacteria (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and 250 ⁇ l of 1 M DTT (final concentration) ) In 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5.
  • the suspension is incubated at 30 ° C. for 15 minutes, collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.) and previously ice-cold 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5).
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5
  • the washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer to make a competent cell solution.
  • E. coli was transformed using the vector pUC-Pdnl4Tdnl4ADE1 for inactivation of the gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 constructed in Production Example 2, and the resulting transformant was transformed into 5 ml of ampicillin-containing 2YT. Obtained by culturing in a medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson), 1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (Wako Pure Chemical Industries)) PUC-Pdnl4Tdnl4ADE1 was obtained from the cells using Fast Gene Plasmid Mini Kit (manufactured by Japan Genetics). This plasmid was linearized by BglII treatment using the BglII recognition sequence in the DNL4 terminator.
  • DNL4 gene the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 constructed in Production Example 2YT.
  • the cells After standing for 1 hour, the cells are collected (3000 ⁇ g, 5 minutes, 20 ° C.), suspended in 1 ml of YNB medium (0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (Becton Dickinson)) and collected again ( 3000 ⁇ g, 5 minutes, 20 ° C.). After resuspending the cells in an appropriate amount of YNB medium, spread on YNB selective agar plate (0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (Becton Dickinson), 1.5% agarose, 2% glucose) at 30 ° C., 3 The strain which grew by stationary culture of the day was selected.
  • YNB medium 0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (Becton Dickinson)
  • the selected strain was subjected to homologous recombination in which a gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a promoter-controlled ADE1 gene were eliminated to obtain a ⁇ dnl4 ⁇ ade1 strain.
  • a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a promoter-controlled ADE1 gene were eliminated to obtain a ⁇ dnl4 ⁇ ade1 strain.
  • ADE1 gene was introduced into the HIS4 gene region of the ⁇ dnl4 ⁇ ade1 strain to obtain the ⁇ dnl4 ⁇ his4 strain.
  • This strain is a histidine auxotrophic transformed yeast in which a gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 has been inactivated.
  • Comparative Example 1 Acquisition of Transformed Yeast, Calculation of Transformation Efficiency, Confirmation of Self-Cyclization
  • a green fluorescent protein-expressing autonomously replicating vector pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo constructed in Production Example 3 was used to transform a wild strain of the strain T. pratensis ATCC 76273 as follows.
  • the wild strain is inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% hipolypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose), shake cultured overnight at 30 ° C., and precultured I got a liquid.
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% hipolypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose
  • the suspension is incubated at 30 ° C. for 15 minutes, collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.) and previously ice-cold 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5).
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5
  • the washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer to make a competent cell solution.
  • E. coli was transformed using the green fluorescent protein expression autonomously replicating vector pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo constructed in Production Example 3 and the resulting transformant was transformed into 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson))
  • the cells were cultured in 1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the obtained bacterial cells were subjected to FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics Co., Ltd.).
  • PUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo was obtained. This plasmid was linearized by BsrGI treatment using the BsrGI recognition sequence in the green fluorescent protein gene.
  • 60 ⁇ l of this competent cell solution and 3 ⁇ l of a linear pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo solution, or 60 ⁇ l of this competent cell solution and 3 ⁇ l of BsrGI untreated pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo solution are mixed to prepare an electroporation cuvette (dispo cuvette electrode, electrode spacing)
  • the cells were transferred to 2 mm (manufactured by BM Instruments Co., Ltd.) and subjected to 7.5 kV / cm, 25 ⁇ F, 200 ⁇ , and then the cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour.
  • YPDZeocinTM selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% hippopetone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.01% Zeocin
  • the strain is applied to a trademark (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), strains grown by stationary culture at 30 ° C. for 3 days are selected, and transformation efficiency (number of colonies per ⁇ g of vector, cfu / ⁇ g) is calculated. (Table 2).
  • Ten transformed yeast strains obtained by Condition 1 were inoculated on a YPD ZeocinTM selective agar plate, and statically cultured at 30 ° C. for 1 day.
  • a plasmid solution was obtained from the grown strain using Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (manufactured by Clontech), and introduced into E. coli E. coli HST08 competent cells (manufactured by Takara Bio).
  • the resulting E. coli transformant was cultured and amplified to prepare a plasmid, and the plasmid was examined by electrophoresis, sequence analysis or the like.
  • pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo linearized by BsrGI treatment was obtained for all samples. It turned out that it is self-cycling.
  • Example 2 Acquisition of transformed yeast, calculation of transformation efficiency> Using the green fluorescent protein expression autonomously replicating vector pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo constructed in Production Example 3, the gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 constructed in Example 1 as described below was inactivated The histidine auxotrophic transformed yeast ⁇ dnl4 ⁇ his4 strain was transformed.
  • the suspension is incubated at 30 ° C. for 15 minutes, collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.) and previously ice-cold 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5).
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5
  • the washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer to make a competent cell solution.
  • E. coli was transformed using the green fluorescent protein expression autonomously replicating vector pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo constructed in Production Example 3 and the resulting transformant was transformed into 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson))
  • the cells were cultured in 1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the obtained bacterial cells were subjected to FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics Co., Ltd.).
  • PUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo was obtained. This plasmid was linearized by BsrGI treatment using the BsrGI recognition sequence in the green fluorescent protein gene.
  • 60 ⁇ l of this competent cell solution and 3 ⁇ l of a linear pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo solution, or 60 ⁇ l of this competent cell solution and 3 ⁇ l of BsrGI untreated pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo solution are mixed to prepare an electroporation cuvette (dispo cuvette electrode, electrode spacing)
  • the cells were transferred to 2 mm (manufactured by BM Instruments Co., Ltd.) and subjected to 7.5 kV / cm, 25 ⁇ F, 200 ⁇ , and then the cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour.
  • YPDZeocinTM selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% hippopetone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.01% Zeocin
  • the strain is applied to a trademark (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), strains grown by stationary culture at 30 ° C. for 3 days are selected, and transformation efficiency (number of colonies per ⁇ g of vector, cfu / ⁇ g) is calculated. (Table 3).
  • Comparative Example 2 Acquisition of Transformed Yeast, Calculation of Transformation Efficiency, Calculation of Assembly Efficiency
  • the wild strain is inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% hipolypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose), shake cultured overnight at 30 ° C., and precultured I got a liquid.
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% hipolypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose
  • the suspension is incubated at 30 ° C. for 15 minutes, collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.) and previously ice-cold 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5).
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5
  • the washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer to make a competent cell solution.
  • E. coli was transformed using the green fluorescent protein expression autonomously replicating vector pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo constructed in Production Example 3 and the resulting transformant was transformed into 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson))
  • the cells were cultured in 1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the obtained bacterial cells were subjected to FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics Co., Ltd.).
  • PUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo was obtained. This plasmid was linearized by BsrGI treatment using the BsrGI recognition sequence in the green fluorescent protein gene.
  • YPDZeocinTM selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% hippopetone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.01% Zeocin
  • the strain is applied to a trademark (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), strains grown by stationary culture at 30 ° C. for 3 days are selected, and transformation efficiency (number of colonies per ⁇ g of vector, cfu / ⁇ g) is calculated. (Table 4, condition 5).
  • the 20 transformed yeast strains obtained under this condition 5 were inoculated on a YPD ZeocinTM selective agar plate, and statically cultured at 30 ° C. for 1 day.
  • chromosomal DNA and a plasmid solution are obtained from the grown strain using Kaneka simple DNA extraction kit version 2 (manufactured by Kaneka), and this is used as a template for the G418 resistant gene.
  • PCR was carried out using forward primer Primer 19 (SEQ ID NO: 30) and Primer 25 (SEQ ID NO: 36), a reverse primer at a position 156 bp away from the start of the GAP1 terminator.
  • the PCR product was electrophoresed, and the assembly efficiency was calculated from the number of samples that had a band at the desired size (951 bp) (Table 4, condition 5).
  • Example 3 Acquisition of transformed yeast, calculation of transformation efficiency, calculation of assembly efficiency> Using the green fluorescent protein expression autonomously replicating vector pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo and pUC-PARS1 PgapGFPTgap1Zeo constructed in Production Example 3 and the G418 resistant gene vector 0_G418_0, 30_G418_30, 60_G418_60 constructed in Production Example 4 to assemble the vector, the following Thus, the histidine auxotrophic transformed yeast ⁇ dnl4 ⁇ his4 strain in which the gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 constructed in Example 1 was inactivated was transformed.
  • the gene DNL4 gene
  • the suspension is incubated at 30 ° C. for 15 minutes, collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.) and previously ice-cold 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5).
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7 Washed with .5
  • the washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer to make a competent cell solution.
  • E. coli is transformed with the green fluorescent protein expression autonomously replicating vector pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo or pUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeo constructed in Production Example 3, and the obtained transformant is 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton)
  • the cells are cultured in Dickinson, 1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the cells obtained are obtained from the FastGene Plasmid Mini Kit ( PUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo or pUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeo was obtained using Nippon Genetics).
  • This plasmid was linearized by BsrGI treatment using the BsrGI recognition sequence in the green fluorescent protein gene.
  • PCR was carried out using forward primer Primer 19 (SEQ ID NO: 30) and Primer 25 (SEQ ID NO: 36), a reverse primer at a position 156 bp away from the start of the GAP1 terminator.
  • the PCR product was electrophoresed, and the assembly efficiency was calculated from the number of samples that had a band at the desired size (951 bp) (Table 4, conditions 8 to 12).
  • G418 resistant gene vector 60_G418 60 designed to contain pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo linearized by BsrGI treatment under condition 5, and a 60 bp base sequence having 100% sequence identity with the GAP promoter and GAP1 terminator.
  • the assembly efficiency was as low as 20%. It is considered that since the wild strain has non-homologous end binding activity, self-cyclization of linearized pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo occurs and 60_G418_60 is not efficiently assembled in yeast.
  • Conditions 6 and 7 are G418 resistance designed to not contain a nucleotide sequence having sequence identity with pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo linearized by BsrGI treatment using ⁇ dnl4 ⁇ his4 strain as a host and GAP promoter and GAP1 terminator.
  • transformation of gene vector 0_G418_0 self-cyclization of linearized pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo was suppressed as in the results of Table 3 in Example 3.
  • the assembling efficiency was high by pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo which was linearized under conditions 8 to 11 and G418 resistance gene vectors 30_G418_30 and 60_G418_60.
  • the ⁇ dnl4 ⁇ his4 strain loses non-homologous end binding activity by inactivating the gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, and the self-cyclization of linearized pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo is complete This indicates that the vector and the vector were efficiently assembled in yeast.
  • a plasmid solution was obtained from the strain in which the vector was confirmed to be assembled by PCR using Primer 19 (SEQ ID NO: 30) and Primer 25 (SEQ ID NO: 36) using Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (manufactured by Clontech). And E. coli HST08 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a plasmid was prepared by culturing and amplifying the obtained E. coli transformant, and as a result of sequencing analysis of this plasmid, the green fluorescent protein gene of pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo linearized by BsrGI treatment in all samples was G418. It turned out that the resistance gene has been replaced.
  • ⁇ Comparative example 3 Acquisition of transformed yeast, calculation of transformation efficiency, calculation of assembly efficiency>
  • the autonomously replicating vector pUC-Cen2Paox1 MCSTgap1 Zeo having the multicloning site constructed in Production Example 5 and Fragment 1, Fragment 2, Fragment 3, Fragment 4, Fragment 5, PgapGFP1, GFP2 constructed in Production Example 6 was used to transform a wild strain of Komagataella pastoris ATCC 76273 strain in the same manner as in Comparative Example 2.
  • E. coli was transformed using the autonomously replicating vector pUC-Cen2Paox1 MCSTgap1Zeo having the multicloning site constructed in Production Example 5, and the resulting transformant was transformed into 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson) ), 1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the cells obtained are labeled FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics). PUC-Cen2Paox1 MCSTgap1Zeo was obtained. This plasmid was linearized by MluI treatment using the MluI recognition sequence in the multicloning site.
  • YPDZeocinTM selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% hippopetone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.01% Zeocin
  • the strain is applied to a trademark (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), strains grown by stationary culture at 30 ° C. for 3 days are selected, and transformation efficiency (number of colonies per ⁇ g of vector, cfu / ⁇ g) is calculated. (Table 5, condition 13).
  • chromosomal DNA and a plasmid solution are obtained from the grown strain using Kaneka simple DNA extraction kit version 2 (manufactured by Kaneka), and this is used as a template to start the AOX1 promoter.
  • PCR was performed using primer 44 (SEQ ID NO: 65), which is a forward primer located 920 bp away from SEQ ID NO: and primer 25 (SEQ ID NO: 36), which is a reverse primer located 156 bp from the start of GAP1 terminator.
  • the PCR product was electrophoresed, and the assembly efficiency was calculated from the number of samples in which a band occurred at the desired size (about 12 kbp) (Table 5, condition 13).
  • the strain which emits fluorescence was counted from the transformed yeast strain 1123 obtained by the condition 13, and the ratio was calculated (Table 5, condition 13).
  • Example 4 Acquisition of transformed yeast, calculation of transformation efficiency, calculation of assembly efficiency>
  • the autonomously replicating vector pUC-Cen2Paox1 MCSTgap1 Zeo having the multicloning site constructed in Production Example 5 and Fragment 1, Fragment 2, Fragment 3, Fragment 4, Fragment 5, PgapGFP1, GFP2 constructed in Production Example 6
  • the histidine auxotrophic transformed yeast ⁇ dnl4 ⁇ his4 strain in which the gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 constructed in Example 1 was inactivated. did.
  • E. coli was transformed using the autonomously replicating vector pUC-Cen2Paox1 MCSTgap1Zeo having the multicloning site constructed in Production Example 5, and the resulting transformant was transformed into 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson) ), 1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the cells obtained are labeled FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics). PUC-Cen2Paox1 MCSTgap1Zeo was obtained. This plasmid was linearized by MluI treatment using the MluI recognition sequence in the multicloning site.
  • YPDZeocinTM selective agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% hippopetone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.01% Zeocin
  • the strain is applied to a trademark (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), strains grown by stationary culture at 30 ° C. for 3 days are selected, and transformation efficiency (number of colonies per ⁇ g of vector, cfu / ⁇ g) is calculated. (Table 5, Condition 14).
  • Ten transformed yeast strains obtained by condition 14 were inoculated on a YPD ZeocinTM selective agar plate, and statically cultured at 30 ° C. for 1 day.
  • chromosomal DNA and a plasmid solution are obtained from the grown strain using Kaneka simple DNA extraction kit version 2 (manufactured by Kaneka), and this is used as a template to start the AOX1 promoter.
  • PCR was performed using primer 44 (SEQ ID NO: 65), which is a forward primer located 920 bp away from SEQ ID NO: and primer 25 (SEQ ID NO: 36), which is a reverse primer located 156 bp from the start of GAP1 terminator.
  • the PCR product was electrophoresed, and the assembly efficiency was calculated from the number of samples that had a band at the desired size (about 12 kbp) (Table 5, condition 14).
  • the strain which emits fluorescence was counted from the transformed yeast 561 strain obtained by the condition 14 and the ratio was calculated (Table 5, condition 14).
  • the assembling efficiency by pUC-Cen2Paox1 MCSTgap1Zeo and Fragment 1, Fragment 2, Fragment 3, Fragment 4, Fragment 5, PgapGFP1, and GFP2 linearized by MluI treatment of Condition 13 is 20%, and the fluorescence ratio is also 13%. It was low. It is considered that since the wild strain has non-homologous end binding activity, self-cyclization and the like of linearized pUC-Cen2Paox1 MCSTgap1Zeo occur, and the vector is not efficiently assembled in yeast.
  • a plasmid solution was obtained using the Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (manufactured by Clontech) from a strain in which the vector was confirmed to be assembled by PCR using the primer 44 (SEQ ID NO: 65) and the primer 25 (SEQ ID NO: 36). And E. coli HST08 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.). A plasmid was prepared by culturing and amplifying the obtained E.
  • the present inventors have found that inactivation of the gene encoding protein DNL4 related to non-homologous end binding completely suppresses the self-cyclization of the vector. Furthermore, they have also found that it is possible to assemble the vector in yeast with high efficiency. That is, a vector is efficiently assembled in yeast by a transformation method including the step of introducing two or more types of vectors into methanol-utilizing yeast in which the gene of DNL4 involved in non-homologous end joining is inactivated. succeeded in.
  • Production Example 7 Construction of a vector for genome integration
  • a nucleic acid fragment containing a green fluorescent protein gene (SEQ ID NO: 23) linked to a GAP promoter (SEQ ID NO: 4) was used as a template with synthetic DNA as a primer 45 (SEQ ID NO: 66) and primer 46 (SEQ ID NO: 67).
  • the fragment was prepared by PCR, and Fragment G1 (SEQ ID NO: 68) 1309 bp was constructed.
  • a nucleic acid fragment containing the base sequence 1-238 of CCA 38473 terminator downstream of AOX1 terminator is prepared by PCR using primer 47 (SEQ ID NO: 69) and primer 48 (SEQ ID NO: 70) using synthetic DNA as a template, Fragment G2 (SEQ ID NO: 71) 584 bp was constructed.
  • a promoter-controlled G418 resistance gene (SEQ ID NO: 22) and a nucleic acid fragment containing the base sequence of pUC19 downstream of the CCA 38473 terminator base sequence 239-600 are used as a template for synthetic DNA as primer 49 (SEQ ID NO: 72) And Fragment 50 (SEQ ID NO: 73) to prepare Fragment G3 (SEQ ID NO: 74) 4095 bp.
  • Fragment G1 contains at its upper end a 50 bp base sequence with 100% sequence identity with the lower end of Fragment G3 and at its lower end contains a 46 bp base sequence with 100% sequence identity with the upper end of Fragment G2. It is designed as.
  • Fragment G2 contains a 46 bp base sequence with 100% sequence identity with the lower end of Fragment G1 at the upper end, and a 238 bp base sequence with 100% sequence identity with the genomic CCA 38473 terminator at the lower end It is designed.
  • Fragment G3 contains a 362 bp base sequence with 100% sequence identity with genomic CCA 38473 terminator at the upper end, and a 50 bp base sequence with 100% sequence identity with the upper end of Fragment G1 at the lower end It is designed.
  • YNB solution 0.17% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate (manufactured by Becton Dickinson), 0.1% sodium glutamate (manufactured by Nacalai Tesque)
  • the cells are collected (3000 ⁇ g, 5 minutes) 20 ° C.), and 950 ⁇ l of the supernatant was discarded.
  • SDG418 selective agar plate 0.17% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate (Becton Dickinson), 0.1% sodium glutamate (Nacalai Tesque), 2% glucose, 1.5% agarose , Apply to 0.05% G418 bisulfate (manufactured by Nacalai Tesque), select strains grown by stationary culture at 30 ° C. for 3 days, and select transformation efficiency (number of colonies per ⁇ g of vector, cfu / ⁇ g) Was calculated (Table 6, condition 15).
  • the transformed yeast 24 strain obtained by Condition 15 was inoculated on an SDG418 selective agar plate, and statically cultured at 30 ° C. for 1 day.
  • chromosomal DNA is obtained from the grown strain using Kaneka simple DNA extraction kit version 2 (manufactured by Kaneka), and this is used as a template for forward primer upstream of the CCA38473 terminator.
  • PCR was carried out using Primer 51 (SEQ ID NO: 75) and Primer 52 (SEQ ID NO: 76), which is a reverse primer downstream of the CCA 38473 terminator (FIG. 1).
  • Example 5 Acquisition of transformed yeast, calculation of transformation efficiency, calculation of assembly efficiency> Using Fragment G1, Fragment G2 and Fragment G3 constructed in Preparation Example 7 in the same manner as in Example 3 to assemble a vector for genome integration, the base shown in SEQ ID NO: 25 constructed in Example 1 A gene consisting of a sequence (DNL4 gene) was inactivated to transform the histidine auxotrophic transformed yeast ⁇ dnl4 ⁇ his4 strain.
  • YNB solution 0.17% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate (manufactured by Becton Dickinson), 0.1% sodium glutamate (manufactured by Nacalai Tesque)
  • the cells are collected (3000 ⁇ g, 5 minutes) 20 ° C.), and 950 ⁇ l of the supernatant was discarded.
  • SDG418His selective agar plate 0.17% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate (Becton Dickinson), 0.1% sodium glutamate (Nacalai Tesque), 2% glucose, 1.5% agarose Apply to 0.05% G418 disulfate (manufactured by Nacalai Tesque), 0.004% L-histidine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and select a strain grown by stationary culture at 30 ° C. for 3 days for transformation. The efficiency (number of colonies per ⁇ g of vector, cfu / ⁇ g) was calculated (Table 6, condition 16).
  • the transformed yeast 24 strain obtained by the condition 16 was inoculated on an SDG418His selective agar plate, and statically cultured at 30 ° C. for 1 day.
  • chromosomal DNA is obtained from the grown strain using Kaneka simple DNA extraction kit version 2 (manufactured by Kaneka), and this is used as a template for forward primer upstream of the CCA38473 terminator.
  • PCR was carried out using Primer 51 (SEQ ID NO: 75) and Primer 52 (SEQ ID NO: 76), which is a reverse primer downstream of the CCA 38473 terminator (FIG. 1).
  • the PCR product was electrophoresed, and the assembly efficiency was calculated from the number of samples that had a band at the desired size (about 7 kbp) (Table 6, condition 16).
  • the assembling efficiency based on the conditions 15 of Fragment G1, Fragment G2 and Fragment G3 was 62.5%. This is thought to be because the wild-type strain has non-homologous end binding activity, resulting in self-cyclization of the vector and the like, and the vector is not efficiently assembled in yeast. In addition, it is considered that genome integration beyond the purpose of the vector is taking place. On the other hand, the assembling efficiency by the conditions 16 of Fragment G1, Fragment G2 and Fragment G3 was as high as 100%.
  • ⁇ dnl4 ⁇ his4 strain loses non-homologous end binding activity by inactivating the gene (DNL4 gene) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, and the vector and the vector are completely suppressed from self-circularization. It is suggested that the assembly in Yeast is efficiently performed and integrated at the desired genomic site.
  • the present inventors efficiently inactivate the vector in yeast by inactivating the gene encoding protein DNL4 related to non-homologous end joining. Succeeded in assembling.

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Abstract

本発明は、非相同末端結合に関わるDNL4の遺伝子を不活性化させ、それによりベクターの自己環状化を完全に抑え、高効率に酵母内でベクターをアセンブルする新たな手段を提供することを解決すべき課題とする。　本発明によれば、本発明に記載のDNL4の遺伝子を不活性化することにより非相同末端結合が抑制されたメタノール資化性酵母が提供され、ベクターの自己環状化が完全に抑えられることによって高効率に酵母内でベクターのアセンブルが可能となり、上記課題を解決する。

Description

メタノール資化性酵母内において高効率にベクターをアセンブルする方法
　本発明は、非相同末端結合に関わるDNL4の遺伝子が不活性化されたメタノール資化性酵母内においてベクターをアセンブルする方法に関する。
　近年、産業利用目的で酵母など微生物を人為的に操作するために、遺伝子断片等のゲノム組込みや自律複製型ベクターの開発、最近ではゲノム編集、長鎖の人工染色体構築といった取り組みが行われている。しかし、ゲノム組込み等のゲノム編集は目的の位置に挿入されない課題やゲノム構造を大きく変化させてしまうことによる予期せぬ影響が懸念されている。ゲノム組込みのリスクが少ない自律複製型ベクターは大腸菌や酵母等の原核/真核生物において広く利用されているが、特に長鎖DNAの構築が依然として難易度が高いことが課題となっている。
　この課題を解決するために、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)においては、自律複製型ベクターを用いた酵母内のベクターのアセンブル方法が報告されている(非特許文献1)。また、古くから産業利用されてきたメタノール資化性酵母の一種であるピキア・パストリス(Pichia pastoris)においても、自律複製型ベクターを用いた酵母内のベクターのアセンブル方法が報告されている(特許文献1、非特許文献2、3)。
WO2017/055436
Nucleic Acids Res. 2009 Nov; 37(20): 6984-6990. Protein Expr Purif. 2011 May;77(1):1-8. Microb Cell Fact. 2016 Aug 11;15(1):139.
　しかしながら、特許文献1、非特許文献2、3に記載されている方法を用いて酵母内でベクターをアセンブルする場合、非相同末端結合によるベクターの自己環状化、アセンブル効率の低さ、偽陽性株の選択、偽陽性株のバックグラウンドを抑えるための選択マーカー遺伝子の分割利用、といった新たな問題と煩雑性が生じる。特に特許文献1では非相同末端結合に関わるKU70の遺伝子を不活性化した酵母を用いているにも関わらず、ベクターの自己環状化を抑えることが出来ていない(特許文献1、Example 9、Figure 27)。
　本発明は、ベクターの自己環状化を完全に抑えることによりメタノール資化性酵母の形質転換における偽陽性株のバックグラウンドを抑え、高効率に酵母内でベクターをアセンブルする新たな手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、コマガタエラ属酵母の染色体DNAの塩基配列の網羅的解析により、非相同末端結合に関するタンパク質DNL4を同定した。そして、該タンパク質をコードする遺伝子を不活性化することで、ベクターの自己環状化が完全に抑えられることを見出した。更に、高効率に酵母内でベクターのアセンブルが可能となることも見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
(1)
DNL4の遺伝子が不活性化されたメタノール資化性酵母に二種類以上のベクターを導入する工程を含む形質転換法によって、該二種類以上のベクターをアセンブルする方法。
(2)
前記DNL4の遺伝子が以下の(a)～(d)のいずれかの遺伝子である、(1)に記載の方法：
(a)配列番号25に示す塩基配列を含む遺伝子、
(b)配列番号25に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
(c)配列番号25に示す塩基配列と85％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
(d)配列番号24に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
(3)
前記メタノール資化性酵母がコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母である、(1)～(2)に記載の方法。
(4)
前記二種類以上のベクターが互いに85％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む(1)～(3)のいずれかに記載の方法。
(5)
前記二種類以上のベクターのうち少なくとも1つが自律複製配列(ARS)を含む(1)～(4)のいずれかに記載の方法。
(6)
前記二種類以上のベクターのうち少なくとも1つが自律複製型ベクターである、(1)～(5)のいずれかに記載の方法。
(7)
前記自律複製型ベクターが、コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母に由来する自律複製配列(ARS)及び／又はセントロメアDNA配列を更に含む、(6)に記載の方法。
(8)
(1)～(7)のいずれかの記載の方法を含む、アセンブルされたベクターの製造方法。
(9)
(1)～(8)のいずれかに記載の方法によって得られた、アセンブルされたベクター。
(10)
(1)～(8)のいずれかに記載の方法によって得られた、アセンブルされたベクターにより形質転換する工程を含む、形質転換体の製造方法。
(11)
(9)に記載のアセンブルされたベクターにより形質転換された形質転換体。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-122788号、2017-246316号の開示内容を包含する。
　本発明により、ベクターの自己環状化を完全に抑えることによりメタノール資化性酵母の形質転換における偽陽性株のバックグラウンドを抑えることができる。さらに、高効率に酵母内でベクターをアセンブルする新たな手段が提供される。
図1は、製造例7、比較例4及び実施例5における、ゲノム組込み用ベクターの断片の構成を説明するための模式図である。
　以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
　本発明において「非相同末端結合」とはDNA二重鎖切断の末端同士が結合する機構を指し、例えば末端部位をKU70及びKU80の二量体が認識し、両末端をリガーゼであるDNL4及びLIF1複合体が結合させる機構の事を言う。
　非相同末端結合に関わる遺伝子とは上記機構に関わるタンパク質の遺伝子であり、例えばKU70、KU80、DNL4又はLIF1の遺伝子が挙げられる。例えば、コマガタエラ・パストリスATCC76273株であれば、KU70遺伝子はACCESSION No. CCA39840で示されるポリペプチド(KU70)をコードする塩基配列、KU80遺伝子はACCESSION No. CCA40385で示されるポリペプチド(KU80)をコードする塩基配列、DNL4遺伝子はACCESSION No. CCA39424で示されるポリペプチド(DNL4)をコードする塩基配列で表される。
　一態様において、本発明は、前記DNL4の遺伝子が以下の(a)～(d)のいずれかの遺伝子：
(a)配列番号25に示す塩基配列を含む遺伝子、
(b)配列番号25に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
(c)配列番号25に示す塩基配列と85％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
(d)配列番号24に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
　本発明において、2つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、例えば以下の意味である。例えば、核酸Xを固定化したフィルターを用いて、0.7～1.0MのNaCl存在下、65℃で配列同一性が85％以上の核酸Yとハイブリダイゼーションを行った後、2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃の条件下でフィルターを洗浄することにより、核酸Yがフィルター上に結合した核酸として取得できる場合に、核酸Yを「核酸Xにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸」と言うことができ、或いは核酸Xと核酸Yとが「ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズする」ということができる。SSC溶液の濃度を下げるほど、高い配列同一性を有する核酸がハイブリダイズすることが期待できることから、核酸Yは好ましくは65℃で1倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは65℃で0.5倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは65℃で0.2倍濃度のSSC溶液で洗浄、更に好ましくは65℃で0.1倍濃度のSSC溶液で前記フィルターを洗浄することによりフィルター上に結合した核酸として取得できる核酸である。また、温度を上げるほど高い配列同一性を有する核酸がハイブリダイズすることが期待できることから、核酸Yは好ましくは70℃で2倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは75℃で2倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは80℃で2倍濃度のSSC溶液で洗浄、更に好ましくは85℃で2倍濃度のSSC溶液で前記フィルターを洗浄することによりフィルター上に結合した核酸として取得できる核酸である。基準となる核酸Xは、コロニー又はプラーク由来の核酸Xであってよい。
　本発明において塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、BLASTアルゴリズムのblastnプログラムやblastpプログラム、FASTAアルゴリズムのfastaプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象塩基配列の、塩基配列Xとの「配列同一性」とは、塩基配列Xと評価対象塩基配列とを整列(アラインメント)させ、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだ塩基配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を％で表示した値である。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Xとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Xと評価対象アミノ酸配列とを整列(アラインメント)させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
　前記遺伝子と配列番号25に示す塩基配列との配列同一性は、85％以上であり、90%以上が好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がさらにより好ましく、97%以上が特に好ましく、98%以上、又は99%以上が最も好ましい。
　本発明において「核酸」とは、「ポリヌクレオチド」と呼ぶこともでき、DNA又はRNAを指し、典型的にはDNAを指す。DNAは二本鎖であっても一本鎖であってもよく、所定の塩基配列を含むDNAは、前記所定の塩基配列を一方の鎖に含む二本鎖DNAであってもよいし、前記所定の塩基配列を含む一本鎖DNA（センス鎖）であってもよいし、前記所定の塩基配列の相補配列を含む一本鎖DNA（アンチセンス鎖）であってもよい。
　本発明において「アミノ酸配列をコードする塩基配列」とは、アミノ酸配列からなるポリペプチドに対してコドン表に基づいて設計された塩基配列を指し、該塩基配列は、転写及び翻訳によってポリペプチドの生成をもたらす。
　本発明において、「ポリペプチド」とは、2個以上のアミノ酸がペプチド結合したものを指し、タンパク質の他、ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものが含まれる。
　本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、DNAや、その転写物であるmRNAを含み、典型的にはDNAであり、特に好ましくは、宿主の染色体に含まれるDNAである。遺伝子がmRNAである実施形態では、所定の塩基配列（配列番号25等）におけるT(チミン)はU(ウラシル)と読み替えて理解すればよい。本明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
　本発明において「不活性化」とは、遺伝子の機能が失われている状態、または機能が減少している状態を指し、当該遺伝子の転写産物であるmRNAや翻訳産物であるポリペプチドの発現量が低下している状態やmRNAやタンパク質として正常に機能しない状態も包含する。なお、mRNAの発現量はリアルタイムPCR法、RNA-Seq法、ノーザンハイブリダイゼーション又はDNAアレイを利用したハイブリダイゼーション法等を用いて定量することができ、ポリペプチドの発現量は、ポリペプチドを認識する抗体やポリペプチドと結合性を有する染色化合物等を用いて定量することができる。また、上記に挙げた定量方法以外にも、当業者で用いられている従来法であってもよい。
　遺伝子を不活性化させる手段としては、薬剤や紫外線を用いたDNA変異処理、PCRを用いた部分特異的変異導入、RNAi、プロテアーゼ、相同組み換え等を利用することができる。遺伝子を不活性化させる場合は、当該遺伝子のORF内の塩基配列の改変(欠失、置換、付加、挿入)、及び／又はプロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域などの転写開始または停止を制御する領域内の塩基配列の改変(欠失、置換、付加、挿入)により行う。なお、前記欠失、置換、付加、挿入を行う部位や、欠失、置換、付加、挿入される塩基配列は、当該遺伝子の正常な機能が欠損し得る限り、特に限定されない。不活性化させる遺伝子は、メタノール資化性酵母の染色体上の遺伝子であってもよく、メタノール資化性酵母の染色体外の遺伝子であってもよい。このうち、染色体上の遺伝子を不活性化させることが好ましい。典型的には、DNL4の遺伝子の不活性化は、宿主の染色体上の、前記遺伝子のコード領域の少なくとも一部の領域（例えば、コード領域の塩基配列の塩基数に対して50％以上、好ましくは60％以上、好ましくは70％以上、好ましくは80％以上、好ましくは90％以上、好ましくは100％の塩基数からなる塩基配列の領域）が欠失することで実現できる。
　本発明における「塩基配列の改変」とは、相同組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施することができる。例えば、遺伝子上流プロモーターのより活性の低いプロモーターへの置換や、メタノール資化性酵母に適していないコドンへの改変等、また、欠失させたい遺伝子の上流配列、選択マーカー遺伝子配列及び欠失させたい遺伝子の下流配列を連結させたベクターの導入などが挙げられる。
　本発明における不活性化による発現量低下の度合は特に限定されないが、5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上低下していることが好ましい。なお、発現量が低下していなくとも、上述のとおり、遺伝子産物の正常な機能が欠損し得る限り、不活性化することができることは、当業者であれば周知であるから、発現量の低下の度合は、あくまで不活性化の判断基準の1つにすぎない。
　不活性化されたDNL4の遺伝子の数は特に限定されない。また、本発明のメタノール資化性酵母はその他の非相同末端結合に関わる遺伝子が更に不活性化されていても良く、例えばKU70遺伝子及びDNL4遺伝子、KU80遺伝子及びDNL4遺伝子、DNL4遺伝子及びLIF1遺伝子の二重不活性化、例えばKU70遺伝子及びKU80遺伝子及びDNL4遺伝子、KU70遺伝子及びDNL4遺伝子及びLIF1遺伝子、KU80遺伝子及びDNL4遺伝子及びLIF1遺伝子の三重不活性化、例えばKU70遺伝子及びKU80遺伝子及びDNL4遺伝子及びLIF1遺伝子の四重不活性化でも良い。
　「配列番号25に示す塩基配列を含む遺伝子」は、コマガタエラ・パストリスの4本の染色体DNAの塩基配列(ATCC76273株：ACCESSION No. FR839628～FR839631(J. Biotechnol. 154 (4), 312-320 (2011)、及びGS115株：ACCESSION No. FN392319～FN392322(Nat. Biotechnol. 27 (6), 561-566 (2009)))の網羅的解析により見出された。具体的には、本発明者らは、不活性化によってベクターの自己環状化が抑えられるポリペプチド、及びそのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを探索した。その結果、ATCC76273株において配列番号24で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA39424)で示されるポリペプチド(DNL4)、及び該ポリペプチドをコードする配列番号25で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドを見出した。後述する実施例において、本発明者らは上記の塩基配列からなる遺伝子が不活性化されたメタノール資化性酵母を宿主とし、高効率に酵母内でベクターのアセンブルが可能となる方法を見出した。
　配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)を不活性化する例として、後述する実施例のように配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子の上流に位置するプロモーターの1000bpと100％の配列同一性を有する塩基配列(例えば、配列番号1の塩基配列)及び、配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子の下流に位置するターミネーターの1007bpと100％の配列同一性を有する塩基配列(例えば、配列番号2の塩基配列)をそれぞれプライマー1～4を用いてPCR産物として調製し、該PCR産物を含むベクターをコマガタエラ属酵母に形質転換し、選択した株を用いて相同組換えにより該遺伝子を欠損させる方法が挙げられる。
　「配列番号24に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子」とは、配列番号24に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づきコドン表を参照して設計される塩基配列からなる遺伝子のことを指し、例えば、配列番号25に示す遺伝子が挙げられる。そして、当該遺伝子を不活性化させることで、ベクターの自己環状化が抑えられ、高効率に酵母内でベクターのアセンブルが可能となる。前記配列同一性は、85％以上であり、90%以上が好ましく、95%以上がより好ましく、96%以上がさらにより好ましく、97%以上が特に好ましく、98%以上、又は99%以上が最も好ましい。
　本発明のDNL4の遺伝子が不活性化されたメタノール資化性酵母は、DNL4の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、DNL4の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及びDNL4の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも1つ含有するベクターをメタノール資化性酵母に形質転換することにより得られることが好ましい。
　本発明のDNL4の遺伝子が不活性化されたメタノール資化性酵母は、例えば前記(a)～(d)のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記(a)～(d)のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記(a)～(d)のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも1つ含有するベクターをメタノール資化性酵母に形質転換することにより得られることが好ましい。
　本発明では、上記形質転換によりメタノール資化性酵母の染色体上におけるDNL4の遺伝子、例えば前記(a)～(d)のいずれかの遺伝子を不活性化させることができる。
　前記(a)～(d)のいずれかのDNL4の遺伝子を不活性化する特に好適な実施形態としては、宿主の染色体上で前記遺伝子の上流に位置するプロモーターの塩基配列に含まれる部分塩基配列(部分塩基配列1とする)と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むDNA断片1と、前記遺伝子の下流に位置するターミネーターの塩基配列に含まれる部分塩基配列(部分塩基配列2とする)と85%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むDNA断片2とを、DNA断片1が上流側、DNA断片2が下流側となるように接続して構築したベクターを宿主に形質転換し、相同組換えにより前記遺伝子を欠損させる方法が挙げられる。前記ベクターは、好ましくは、DNA断片1とDNA断片2とを含む環状ベクターを、DNA断片1又はDNA断片2の内部の制限酵素認識部位で切断して直鎖化した直鎖状ベクターである。前記プロモーターの塩基配列としては、配列番号1に示す塩基配列が例示できる。前記ターミネーターの塩基配列としては、配列番号2に示す塩基配列が例示できる。部分塩基配列1及び部分塩基配列2の長さは相同組み換えが可能な長さであれば良く、それそれ、好ましくは100bp以上、好ましくは200bp以上、好ましくは300bp以上、好ましくは400bp以上、好ましくは500bp以上、好ましくは600bp以上、好ましくは700bp以上、好ましくは800bp以上、好ましくは900bp以上、好ましくは1000bp以上である。前記85%以上の配列同一性は、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の配列同一性である。
　本発明におけるメタノール資化性酵母とは、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母と定義されるが、本来メタノール資化性酵母であったが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化性能を喪失した酵母も、本発明におけるメタノール資化性酵母に包含される。
　メタノール資化性酵母としては、ピキア(Pichia)属、オガタエア(Ogataea)属、キャンディダ(Candida)属、トルロプシス(Torulopsis)属、コマガタエラ(Komagataella)属等に属する酵母が挙げられる。ピキア(Pichia)属ではピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、オガタエア(Ogataea)属ではオガタエア・アングスタ(Ogataea angusta)、オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、オガタエア・パラポリモルファ(Ogataea parapolymorpha)、オガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)、キャンディダ(Candida)属ではキャンディダ・ボイディニ(Candida boidinii)、コマガタエラ(Komagataella)属ではコマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)、コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)等が好ましい例として挙げられる。
　上記のメタノール資化性酵母のなかでも、コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母が特に好ましい。
　コマガタエラ属酵母としては、コマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)、コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)が好ましい。コマガタエラ・パストリス及びコマガタエラ・ファフィはどちらもピキア・パストリス(Pichia pastoris)の別名を有する。
　具体的に宿主として使用できる菌株として、コマガタエラ・パストリスATCC76273(Y-11430、CBS7435)、コマガタエラ・パストリスX-33等の株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションやサーモフィッシャーサイエンティフィック社等から入手することができる。
　オガタエア(Ogataea)属酵母としては、オガタエア・アングスタ(Ogataea angusta)、オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、オガタエア・パラポリモルファ(Ogataea parapolymorpha)が好ましい。これら3つは近縁種であり、いずれも、別名ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、又は別名ピキア・アングスタ(Pichia angusta)でも表される。
　具体的に使用できる菌株として、オガタエア・アングスタNCYC495(ATCC14754)、オガタエア・ポリモルファ8V(ATCC34438)、オガタエア・パラポリモルファDL-1(ATCC26012)等の菌株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手することができる。
　また、本発明においては、これらコマガタエラ属酵母やオガタエア属酵母の菌株からの誘導株も使用でき、例えばヒスチジン要求性であればコマガタエラ・パストリスGS115株(サーモフィッシャーサイエンティフィック社より入手可能)、ロイシン要求性株であれば、NCYC495由来のBY4329、8V由来のBY5242、DL-1由来のBY5243(これらはNational BioResource Projectから分譲可能)等が挙げられる。本発明においては、これらの菌株からの誘導株等も使用できる。
　本発明のベクター（本発明で用いる二種類以上のベクターの少なくとも１つ、及び／又は、二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクター）は環状ベクター、直鎖状ベクター、プラスミド、人工染色体等であることができる。
　本発明において「ベクター」とは人為的に構築された核酸分子である。本発明のベクター（本発明で用いる二種類以上のベクター、及び／又は、二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクター）を構成する核酸分子は、通常DNA、好ましくは二本鎖DNAであり、環状であっても、直鎖状であってもよい。本発明で用いる二種類以上のベクターの少なくとも１つ、及び、二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクターは、通常は、1つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイト、Clontech社のIn-FusionクローニングシステムやNew England Biolabs社のGibson Assemblyシステム等を利用するためのオーバーラップ領域、内在性遺伝子の塩基配列、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子(栄養要求性相補遺伝子、薬剤耐性遺伝子など)の塩基配列等を含むことができる。直鎖状ベクターの例としては、URA3遺伝子、LEU2遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、ARG4遺伝子等の栄養要求性相補遺伝子やG418耐性遺伝子、Zeocin(商標)耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Clone NAT耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の塩基配列を有するPCR産物、または環状ベクターやプラスミドを適当な制限酵素によって切断し、直鎖状としたものなどが挙げられる。プラスミドの例としては、YEpベクター、YRpベクター、YCpベクター、pPICHOLI(http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/p_picholi_shuttle_vector.html)、pHIP(Journal of General Microbioiogy (1992), 138, 2405-2416. Chromosomal targeting of replicating plasmids in the yeast Hansenula polymorpha)、pHRP(pHIPについて挙げた前記文献参照)、pHARS(Molecular and General Genetics MGG February 1986, Volume 202, Issue 2, pp 302-308, Transformation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration vectors)、大腸菌由来プラスミドベクター(pUC18、pUC19、pBR322、pBluescript、pQE)、枯草菌由来プラスミドベクター(pHY300PLK、pMTLBS72)等を使用することができる。人工染色体の例としては、一般に、セントロメアDNA配列、テロメアDNA配列、自律複製配列(ARS)を含む人工染色体ベクターを指し、酵母であれば酵母人工染色体(YACベクター)などが挙げられ、Saccharomyces cerevisiaeやSchizosaccharomyces pombeなどにおいて開発されている。コマガタエラ・パストリスにおいては国際公開第2016／088824号に記載されているセントロメアDNA配列を用いることによって人工染色体を構築することができる。
　本発明において「形質転換」とは、上記ベクターをメタノール資化性酵母に導入することを指す。ベクターをメタノール資化性酵母へ導入する方法、すなわち形質転換法は公知の方法を適宜用いることができ、例えばエレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法等が挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。例えば、コマガタエラ・パストリスの形質転換法としては、High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithiumacetate and dithiothreitol(Biotechniques. 2004 Jan;36(1):152-4.)に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。
　本発明において、ベクターをメタノール資化性酵母に形質転換する場合、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカーは特に限定されないが、メタノール資化性酵母であれば、URA3遺伝子、LEU2遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、ARG4遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子であれば、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジン、アルギニンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により形質転換体を選択することができる。また、G418耐性遺伝子、Zeocin(商標)耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Clone NAT耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子であれば、それぞれG418、Zeocin(商標)、ハイグロマイシン、Clone NAT、ブラストサイジンSを含む培地上における耐性により形質転換体を選択することができる。なお、形質転換体を作製するときに用いる栄養要求性選択マーカーは、宿主において該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、宿主において該選択マーカーを破壊すればよく、方法は当業者には公知の方法を用いることができる。
　本発明の形質転換法は、高効率に酵母内でベクターのアセンブルが可能であるため、二種類以上のベクターを導入する工程を含む。二種類以上のベクターを導入する時機は逐次または同時が好ましい。例えば、本実施例のように、形質転換を行う前にコンピテントセルと二種類以上のベクターを予め混合し、形質転換操作を行う方法が挙げられる。
　本発明において、二種類以上のベクターで形質転換する場合、後述する実施例のようにベクターは、互いに配列同一性を有する塩基配列を含むベクターとして作製することが好ましい。より好ましくは、二種類以上のベクターの各々は、他の少なくとも１つのベクターと、互いに配列同一性を有する塩基配列を部分塩基配列として含む。該配列同一性を有する塩基配列の箇所は、1箇所でもよいし、2箇所以上でもよい。
　本発明の「互いに配列同一性を有する塩基配列」とは、互いの塩基配列の少なくとも一部が同一である塩基配列を有し、好ましくは85％以上の配列同一性を有する塩基配列であればよく、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは100％の配列同一性を有する塩基配列である。また、該配列同一性を有する塩基配列の長さは、20bp以上の塩基配列であれば、それを含む2つのベクター同士をアセンブルすることができるため特に限定されないが、具体的には20bp以上、30bp以上、40bp以上、50bp以上、60bp以上、70bp以上、80bp以上、90bp以上、100bp以上、200bp以上、300bp以上、400bp以上、500bp以上、1000bp以上が好ましい。
　本発明において、二種類以上のベクターで形質転換する場合、そのモル比は特に限定されないが、例えば二種類のベクターであれば1：1、1：1以上、1：2以上、1：3以上、1：4以上、1：5以上、1：10以上、1：20以上、1：30以上、1：40以上、1：50以上が好ましい。
　本発明の「アセンブル」とは、酵母に導入された二種類以上のベクターが、配列同一性を有する塩基配列を介して連結する機構のことを指す。
　好ましい実施形態では、二種類以上のベクターの各々は、他の少なくとも１つのベクターと、互いに配列同一性を有する塩基配列を部分塩基配列として含み、該部分塩基配列間での相同組み換えを介して前記二種類以上のベクターがアセンブルされることで、１つの直鎖状又は環状のベクターが構築されるように構成されている。前記1つの直鎖状のベクターは、宿主ゲノムDNAに組み込まれたものであってもよく、その場合、前記二種類以上のベクターのうち1つは、更に、宿主ゲノムDNAの挿入箇所の上流側の塩基配列に対して、配列同一性を有する（好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは100％の配列同一性を有する）塩基配列を部分塩基配列として含み、前記二種類以上のベクターのうち他の1つは、更に、宿主ゲノムDNAの挿入箇所の下流側の塩基配列に対して、配列同一性を有する（好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは100％の配列同一性を有する）塩基配列を部分塩基配列として含む。
　本明細書において「宿主」とは、ベクターが導入され形質転換される細胞を指し、本明細書では形質転換後の宿主を形質転換体と呼ぶ場合がある。宿主として用いる細胞はベクターを導入することの出来るメタノール資化性酵母細胞であれば特に限定されない。
　本発明のベクター（本発明で用いる二種類以上のベクターの少なくとも１つ、及び／又は、二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクター）は自律複製配列 (ARS)を含むことができる。本発明においてARSとは、原核生物(大腸菌、細菌、放線菌、真正細菌、古細菌、ラン藻等)、ウィルス(DNAウィルス、RNAウィルス等)、真核生物(菌類、藻類、原生動物、酵母、植物、動物、鳥類、家禽、哺乳類、ヒト、マウス等)、好ましくは真核生物、より好ましくは酵母、例えばコマガタエラ・パストリス等のメタノール資化性酵母の複製起点のことであり、複製が開始される塩基配列の領域である。本発明のベクターは、例えば異なる種におけるARSを二以上含んでもよい。本発明のベクターに含まれ得るARSの例として、後述する実施例のように配列番号6に示す塩基配列からなるコマガタエラ・パストリスにおけるARSを含むセントロメアDNA配列が挙げられる。本配列はコマガタエラ・パストリスの染色体DNA2番(ACCESSION No. FR839629)のセントロメアDNA配列である。
　本発明のベクター（本発明で用いる二種類以上のベクターの少なくとも１つ、及び／又は、二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクター）に含まれ得るARSの別の例として、後述する実施例のように配列番号37に示す塩基配列からなるコマガタエラ・パストリスのARSであるPARS1が挙げられる。本配列はコマガタエラ・パストリスの染色体DNA2番(ACCESSION No. FR839629)の1980709-1980872に位置する164 bpのARSである。
　本発明のベクター（本発明で用いる二種類以上のベクターの少なくとも１つ、及び／又は、二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクター）は自律複製配列(ARS)を含まなくても良い。例えば酵母内でアセンブルされたベクターが宿主染色体に組み込まれても良い。好ましい実施形態では、本発明で用いる二種類以上のベクターはそれぞれ自律複製能を有さない核酸断片であり、前記二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクターが宿主ゲノムDNAに組み込まれる。さらに好ましい実施形態では、本発明で用いる二種類以上のベクターはそれぞれ自律複製能を有さない核酸断片であり、前記二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクターの上末端及び／又は下末端と配列同一性を有する宿主ゲノムDNA領域に、相同組換え機構により宿主ゲノムDNAに組み込まれる。
　本発明のベクター（本発明で用いる二種類以上のベクターの少なくとも１つ、及び／又は、二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクター）は、好ましくは自律複製型ベクターである。本発明のベクターが自律複製型であれば、宿主のゲノム配列やゲノム構造を変化させること無く、宿主改良を行うことが可能である。特に好ましい実施形態では、本発明で用いる二種類以上のベクターの１つが自律複製型ベクターであり、前記二種類以上のベクターの残りは単独では自律複製能を有さない核酸断片であり、前記二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクターが自律複製型ベクターである。
　本発明において自律複製型ベクターとは宿主の染色体とは独立に複製されるベクターであって、宿主染色体に組み込まれなくとも宿主内で複製されるベクターを指す。
　本発明のこの実施形態のベクターは、メタノール資化性酵母、例えばコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母、好ましくはコマガタエラ・パストリスにおける自律複製型ベクターとして利用することができる。つまり、前記自律複製型ベクターは、メタノール資化性酵母に由来するARS及び／又はセントロメアDNA配列を含むことが好ましく、コマガタエラ属酵母もしくはオガタエア属酵母に由来するARS及び／又はセントロメアDNA配列を含むことがより好ましい。
　本発明のベクター（本発明で用いる二種類以上のベクターの少なくとも１つ、及び／又は、二種類以上のベクターがアセンブルされて形成されるベクター）は、好ましくは、複数の生物種の宿主細胞において自律複製可能な自律複製型ベクターである。このような自律複製型ベクターとしては、例えば、前記コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母に由来するARS及び／又はセントロメアDNA配列を含み、更に、前記ARS及び／又はセントロメアDNA配列が由来する生物種とは異なる生物種に由来するARS及び／又はセントロメアDNA配列を含むベクターが挙げられる。具体的には、本発明のベクターをコマガタエラ・パストリスで自律複製可能であるだけでなく、他の種、或いは他の属を宿主として自律複製可能なベクターとするために考えられる手段としては、例えば配列番号6に示す塩基配列からなるコマガタエラ・パストリスにおけるARSを含むセントロメアDNA配列を含むベクターにヒト染色体のセントロメアDNA配列をクローニングしてヒト人工染色体として利用したり、上記配列番号6に示す塩基配列を含むベクターにオガタエア属酵母のARSやセントロメアDNA配列をクローニングして両属種での自律複製型ベクターとして利用したり、上記配列番号6に示す塩基配列を含むベクターに出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)や分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)のARSやセントロメアDNA配列をクローニングして両属種での自律複製型ベクターとして利用したり、上記配列番号6に示す塩基配列を含むベクターにコマガタエラ・パストリスのセントロメアを構成するタンパク質群をコードする遺伝子群をクローニングして他属種での自律複製型ベクターとして利用したりすることが考えられる。また、本実施例のように大腸菌の自律複製型ベクターと組み合わせることも可能である。
　本発明においてセントロメアDNA配列とは、動原体と呼ばれる構造を形成し、紡錘体が結合する塩基配列である。例えばヒトにおいて、染色体の長腕と短腕が交差する領域であり、染色体のほぼ中央に位置することからセントロメア領域とも呼ばれる。
　以下、製造例、比較例、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
　＜製造例1：ベクターの調製に用いた各種遺伝子の調製＞
　以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法等は、次の成書に記載されている：Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocolsin Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)。
　また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌E.coli HST08コンピテントセル(タカラバイオ社製)に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、FastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて行った。
　ベクターの構築において利用したDNL4プロモーター(配列番号1)、DNL4ターミネーター(配列番号2)、プロモーターで制御されたADE1遺伝子配列(配列番号3)、GAPプロモーター(配列番号4)、GAP1ターミネーター(配列番号5)、セントロメアDNA配列(配列番号6)、PARS1(配列番号37)はコマガタエラ・パストリスATCC76273株の染色体DNA(塩基配列はEMBL (The European Molecular Biology Laboratory) ACCESSION No. FR839628～FR839631に記載)混合物をテンプレートにしてPCRで調製した。DNL4プロモーターはプライマー1(配列番号7)及びプライマー2(配列番号8)、DNL4ターミネーターはプライマー3(配列番号9)及びプライマー4(配列番号10)、プロモーターで制御されたADE1遺伝子配列はプライマー5(配列番号11)及びプライマー6(配列番号12)、GAPプロモーターはプライマー7(配列番号13)及びプライマー8(配列番号14)、GAP1ターミネーターはプライマー9(配列番号15)及びプライマー10(配列番号16)、セントロメアDNA配列はプライマー11(配列番号17)及びプライマー12(配列番号18)及びプライマー13(配列番号19)及びプライマー14(配列番号20)、PARS1はプライマー26(配列番号38)及びプライマー27(配列番号39)を用いてPCRで調製した。
　ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子(配列番号21)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、G418耐性遺伝子(配列番号22)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、緑色蛍光タンパク質遺伝子(配列番号23)は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。
　PCRにはPrime STAR HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体DNAの調製は、コマガタエラ・パストリスATCC76273株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)等を用いて、これに記載の条件で実施した。
　＜製造例2：配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)の不活性化用ベクターの構築＞
　DNL4プロモーター(配列番号1)の末端にPstI認識配列及びBamHI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー1(配列番号7)及びプライマー2(配列番号8)を用いたPCRにより調製し、DNL4ターミネーター(配列番号2)の末端にBamHI認識配列及びKpnI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー3(配列番号9)及びプライマー4(配列番号10)を用いたPCRにより調製し、DNL4プロモーター核酸断片はPstI及びBamHI処理、DNL4ターミネーター核酸断片はBamHI及びKpnI処理後にpUC19(タカラバイオ社製、Code No． 3219)のPstI-KpnIサイト間に挿入して、pUC-Pdnl4Tdnl4を構築した。
　次に、プロモーターで制御されたADE1遺伝子配列(配列番号3)の両側にKpnI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー5(配列番号11)及びプライマー6(配列番号12)を用いたPCRにより調製し、KpnI処理後にpUC-Pdnl4Tdnl4のKpnIサイトに挿入して、pUC-Pdnl4Tdnl4ADE1を構築した。
　本ベクターはコマガタエラ・パストリスATCC76273株のDNL4である配列番号24で示されるアミノ酸配列(ACCESSION No. CCA39424)、をコードする配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)のプロモーター1000bp及びターミネーター1007bpを相同領域として、プロモーターで制御されたADE1遺伝子が付加されたベクターであり、後述する実施例のようにメタノール資化性酵母の宿主に形質転換することで配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されるように設計されている。
　＜製造例3：緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターの構築＞
　プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子(配列番号21)の末端にHindIII-XbaI-NotI-AscI-SfiI-PacI-AsiSI-SfiI認識配列及びEcoRI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー15(配列番号26)及びプライマー16(配列番号27)を用いたPCRにより調製し、HindIII及びEcoRI処理後にpUC19のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-Zeoを構築した。
　次に、GAPプロモーター(配列番号4)の末端にAscI認識配列及びSpeI認識配列を付加した核酸断片をプライマー7(配列番号13)及びプライマー8(配列番号14)を用いたPCRにより調製し、緑色蛍光タンパク質遺伝子(配列番号23)の末端にSpeI認識配列及びXhoI認識配列を付加した核酸断片をプライマー17(配列番号28)及びプライマー18(配列番号29)を用いたPCRにより調製し、GAP1ターミネーター(配列番号5)の末端にXhoI認識配列及びPacI認識配列を付加した核酸断片をプライマー9(配列番号15)及びプライマー10(配列番号16)を用いたPCRにより調製し、GAPプロモーターはAscI及びSpeI処理、緑色蛍光タンパク質遺伝子はSpeI及びXhoI処理、GAP1ターミネーターはXhoI及びPacI処理後にpUC-ZeoのAscI-PacIサイト間に挿入して、pUC-PgapGFPTgap1Zeoを構築した。
　次に、セントロメアDNA配列(配列番号6)の約半分の領域(LOR_CC)をプライマー11(配列番号17)及びプライマー12(配列番号18)を用いたPCRにより調製し、残りの約半分の領域(CC_ROR)をプライマー13(配列番号19)及びプライマー14(配列番号20)を用いてPCRで調製し、LOR_CCをNotI及びPstI処理、CC_RORをPstI及びXbaI処理後に、pUC-PgapGFPTgap1ZeoのXbaI-NotIサイト間に挿入して、pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを構築した。
　本ベクターはコマガタエラ・パストリスにおける自律複製配列 (ARS)を含むセントロメアDNA配列による自律複製型ベクターであり、緑色蛍光タンパク質がGAPプロモーターで制御され、形質転換体はZeocin(商標)耐性を有する。
　また、PARS1(配列番号37)をプライマー26(配列番号38)及びプライマー27(配列番号39)を用いたPCRにより調製し、NotI処理後に、pUC-PgapGFPTgap1ZeoのNotIサイトに挿入して、pUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeoを構築した。
　本ベクターはコマガタエラ・パストリスのARSであるPARS1による自律複製型ベクターであり、緑色蛍光タンパク質がGAPプロモーターで制御され、形質転換体はZeocin(商標)耐性を有する。
　＜製造例4：G418耐性遺伝子ベクターの構築＞
　G418耐性遺伝子(配列番号22)の核酸断片をプライマー19(配列番号30)及びプライマー20(配列番号31)を用いたPCRにより調製し、0_G418_0を構築した。
　G418耐性遺伝子(配列番号22)の核酸断片をプライマー21(配列番号32)及びプライマー22(配列番号33)を用いたPCRにより調製し、30_G418_30を構築した。本ベクターは末端にGAPプロモーター及びGAP1ターミネーターと100％の配列同一性を有する30bpの塩基配列を含むように設計されている。
　G418耐性遺伝子(配列番号22)の核酸断片をプライマー23(配列番号34)及びプライマー24(配列番号35)を用いたPCRにより調製し、60_G418_60を構築した。本ベクターは末端にGAPプロモーター及びGAP1ターミネーターと100％の配列同一性を有する60bpの塩基配列を含むように設計されている。
　＜製造例5：マルチクローニングサイトを有する自律複製型ベクターの構築＞
　マルチクローニングサイト(Acc65I-AvrII-EcoRV-MluI-BsrGI)(配列番号40)の末端にAOX1プロモーター(配列番号41)及びGAP1ターミネーター(配列番号5)を付加した核酸断片を、合成DNAをテンプレートにしてプライマー28(配列番号42)及びプライマー29(配列番号43)を用いたPCRにより調製し、AscI及びPacI処理後に製造例3で構築したpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo のAscI-PacIサイト間に挿入して、pUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeoを構築した。
本ベクターはコマガタエラ・パストリスにおける自律複製配列 (ARS)を含むセントロメアDNA配列による自律複製型ベクターであり、AOX1プロモーターの下流にマルチクローニングサイト(Acc65I-AvrII-EcoRV-MluI-BsrGI)を有し、マルチクローニングサイトの下流にGAP1ターミネーターを有し、形質転換体はZeocin(商標)耐性を有する。
　＜製造例6：ベクターの構築＞
　オガタエア・アングスタNCYC495株の染色体DNA(塩基配列はEMBL (The European Molecular Biology Laboratory) ACCESSION No. AECK01000001～AECK01000007に記載)混合物をテンプレートにして、染色体第6番 (AECK01000006) のPosition 855449-856477を含む核酸断片をプライマー30(配列番号44)及びプライマー31(配列番号45)を用いたPCRにより調製し、Fragment 1(配列番号46)1106bpを構築した。
　同様に、染色体第6番 (AECK01000006) のPosition 856357-858859を含む核酸断片をプライマー32(配列番号47)及びプライマー33(配列番号48)を用いたPCRにより調製し、Fragment 2(配列番号49)2503bpを構築した。
　同様に、染色体第6番 (AECK01000006) のPosition 858744-861310を含む核酸断片をプライマー34(配列番号50)及びプライマー35(配列番号51)を用いたPCRにより調製し、Fragment 3(配列番号52)2567bpを構築した。
　同様に、染色体第6番 (AECK01000006) のPosition 861181-863668を含む核酸断片をプライマー36(配列番号53)及びプライマー37(配列番号54)を用いたPCRにより調製し、Fragment 4(配列番号55)2488bpを構築した。
　同様に、染色体第6番 (AECK01000006) のPosition 863538-866113を含む核酸断片をプライマー38(配列番号56)及びプライマー39(配列番号57)を用いたPCRにより調製し、Fragment 5(配列番号58)2624bpを構築した。
　GAPプロモーター(配列番号4)が連結された緑色蛍光タンパク質遺伝子の1-195番目の塩基配列を含む核酸断片を、合成DNAをテンプレートにしてプライマー40(配列番号59)及びプライマー41(配列番号60)を用いたPCRにより調製し、PgapGFP1(配列番号61)735bpを構築した。
　緑色蛍光タンパク質遺伝子の101-720番目の塩基配列を含む核酸断片を、合成DNAをテンプレートにしてプライマー42(配列番号62)及びプライマー43(配列番号63)を用いたPCRにより調製し、GFP2(配列番号64)696bpを構築した。
　Fragment 1は上末端にAOX1プロモーター及びマルチクローニングサイトと100％の配列同一性を有する77bpの塩基配列を含み、下末端にFragment 2と100％の配列同一性を有する121bpの塩基配列を含むように設計されている。
　Fragment 2は上末端にFragment 1と100％の配列同一性を有する121bpの塩基配列を含み、下末端にFragment 3と100％の配列同一性を有する116bpの塩基配列を含むように設計されている。
　Fragment 3は上末端にFragment 2と100％の配列同一性を有する116bpの塩基配列を含み、下末端にFragment 4と100％の配列同一性を有する130bpの塩基配列を含むように設計されている。
　Fragment 4は上末端にFragment 3と100％の配列同一性を有する130bpの塩基配列を含み、下末端にFragment 5と100％の配列同一性を有する131bpの塩基配列を含むように設計されている。
　Fragment 5は上末端にFragment 4と100％の配列同一性を有する131bpの塩基配列を含み、下末端にPgapGFP1と100％の配列同一性を有する95bpの塩基配列を含むように設計されている。
　PgapGFP1は上末端にFragment 5と100％の配列同一性を有する95bpの塩基配列を含み、下末端にGFP2と100％の配列同一性を有する95bpの塩基配列を含むように設計されている。
　GFP2は上末端にPgapGFP1と100％の配列同一性を有する95bpの塩基配列を含み、下末端にマルチクローニングサイト及びGAP1ターミネーターと100％の配列同一性を有する76bpの塩基配列を含むように設計されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜実施例1：配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化された形質転換酵母の取得＞
　製造例2で構築した配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)の不活性化用ベクターpUC-Pdnl4Tdnl4ADE1を用いて、以下のようにメタノール資化性酵母宿主を形質転換した。
　コマガタエラ・パストリスATCC76273株由来アデニン要求性株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　製造例2で構築した配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)の不活性化用ベクターpUC-Pdnl4Tdnl4ADE1を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地(1.6% tryptone bacto(Becton Dickinson社製)、1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム(和光純薬工業社製))で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて、pUC-Pdnl4Tdnl4ADE1を取得した。本プラスミドをDNL4ターミネーター内のBglII認識配列を利用して、BglII処理により直鎖状にした。
　このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-Pdnl4Tdnl4ADE1溶液3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、1mlのYNB培地(0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid(Becton Dickinson社製))に懸濁後、再度集菌(3000×g、5分、20℃)した。菌体を適当量のYNB培地で再懸濁後、YNB選択寒天プレート(0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid(Becton Dickinson社製)、1.5%アガロース、2% glucose)に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択した。
　選択した株を用いて配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)及びプロモーターで制御されたADE1遺伝子を脱落させる相同組換えを行い、Δdnl4Δade1株を取得した。
　続いて、Δdnl4Δade1株のHIS4遺伝子領域にADE1遺伝子を導入することで、Δdnl4Δhis4株を取得した。本株は配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたヒスチジン要求性形質転換酵母である。
　＜比較例1：形質転換酵母の取得、形質転換効率の算出、自己環状化の確認＞
　製造例3で構築した緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスATCC76273株野生株を形質転換した。
　野生株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　製造例3で構築し緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地(1.6% tryptone bacto(Becton Dickinson社製)、1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム(和光純薬工業社製))で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて、pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを取得した。本プラスミドを緑色蛍光タンパク質遺伝子内のBsrGI認識配列を利用して、BsrGI処理により直鎖状にした。
　このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo溶液3μl、またはこのコンピテントセル溶液60μlとBsrGI未処理のpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo溶液3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDZeocin(商標)選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.01%Zeocin(商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、形質転換効率(ベクター1μgあたりのコロニー数、cfu/μg)を算出した(表2)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、条件1のBsrGI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoによる形質転換効率は、条件2のBsrGI未処理のpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoによる形質転換効率と同等であった。これは、野生株は非相同末端結合活性を有するため、直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoの自己環状化が生じたと考えられる。
　条件1によって得られた形質転換酵母10株をYPDZeocin(商標)選択寒天プレートに植菌し、30℃、1日間静置培養した。生育した株からEasy Yeast Plasmid Isolation Kit(クロンテック社製)を用いてプラスミド溶液を取得し、大腸菌E.coli HST08コンピテントセル(タカラバイオ社製)に導入した。得られた大腸菌形質転換体を培養して増幅することによってプラスミドを調製し、本プラスミドを電気泳動やシーケンス解析等で調べた結果、全てのサンプルにおいてBsrGI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoが自己環状化していることが分かった。
　＜実施例2：形質転換酵母の取得、形質転換効率の算出＞
　製造例3で構築した緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを用いて、以下のように実施例1で構築した配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたヒスチジン要求性形質転換酵母Δdnl4Δhis4株を形質転換した。
　Δdnl4Δhis4株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　製造例3で構築し緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地(1.6% tryptone bacto(Becton Dickinson社製)、1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム(和光純薬工業社製))で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて、pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを取得した。本プラスミドを緑色蛍光タンパク質遺伝子内のBsrGI認識配列を利用して、BsrGI処理により直鎖状にした。
　このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo溶液3μl、またはこのコンピテントセル溶液60μlとBsrGI未処理のpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo溶液3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDZeocin(商標)選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.01%Zeocin(商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、形質転換効率(ベクター1μgあたりのコロニー数、cfu/μg)を算出した(表3)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、条件3のBsrGI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoによる形質転換効率は、条件4のBsrGI未処理のpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoによる形質転換効率と比較して大きく減少し、コロニーは全く得られなかった。これは、Δdnl4Δhis4株は配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたことによって非相同末端結合活性を失い、直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoの自己環状化が完全に抑えられたことを示唆している。
　＜比較例2：形質転換酵母の取得、形質転換効率の算出、アセンブル効率の算出＞
　ベクターをアセンブルさせるために、製造例3で構築した緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo及び製造例4で構築したG418耐性遺伝子ベクター60_G418_60を用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスATCC76273株野生株を形質転換した。
　野生株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　製造例3で構築し緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地(1.6% tryptone bacto(Becton Dickinson社製)、1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム(和光純薬工業社製))で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて、pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoを取得した。本プラスミドを緑色蛍光タンパク質遺伝子内のBsrGI認識配列を利用して、BsrGI処理により直鎖状にした。
　このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo溶液(0.015 pmol)、G418耐性遺伝子ベクター60_G418_60(0.75 pmol)を混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDZeocin(商標)選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.01%Zeocin(商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、形質転換効率(ベクター1μgあたりのコロニー数、cfu/μg)を算出した(表4、条件5)。
　この条件5によって得られた形質転換酵母20株をYPDZeocin(商標)選択寒天プレートに植菌し、30℃、1日間静置培養した。ベクターがアセンブルされているかどうかを確認するため、生育した株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)を用いて、染色体DNA及びプラスミド溶液を取得し、これをテンプレートにしてG418耐性遺伝子のフォワードプライマーであるプライマー19(配列番号30)及びGAP1ターミネーターの開始から156bp離れた箇所のリバースプライマーであるプライマー25(配列番号36)を用いてPCRを行った。PCR産物を電気泳動し、所望のサイズ(951bp)にバンドが生じたサンプル数からアセンブル効率を算出した(表4、条件5)。
　＜実施例3：形質転換酵母の取得、形質転換効率の算出、アセンブル効率の算出＞
　ベクターをアセンブルさせるために、製造例3で構築した緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo及びpUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeo及び製造例4で構築したG418耐性遺伝子ベクター0_G418_0、30_G418_30、60_G418_60を用いて、以下のように実施例1で構築した配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたヒスチジン要求性形質転換酵母Δdnl4Δhis4株を形質転換した。
　Δdnl4Δhis4株を3mlのYPD培地(1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose)に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、250μlの1M DTT(終濃度25mM)を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌(3000×g、10分、20℃)し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー(270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5)で洗浄した。洗浄液を集菌(3000×g、10分、4℃)し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌(3000×g、10分、4℃)した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　製造例3で構築した緑色蛍光タンパク質発現自律複製型ベクターpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo又はpUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeoを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地(1.6% tryptone bacto(Becton Dickinson社製)、1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム(和光純薬工業社製))で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて、pUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo又はpUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeoを取得した。本プラスミドを緑色蛍光タンパク質遺伝子内のBsrGI認識配列を利用して、BsrGI処理により直鎖状にした。
　このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo溶液(0.015 pmol)又はpUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeo溶液(0.015 pmol)、G418耐性遺伝子ベクター0_G418_0又は30_G418_30又は60_G418_60(0.15 pmol又は0.75 pmol)を混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDZeocin(商標)選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.01%Zeocin(商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、形質転換効率(ベクター1μgあたりのコロニー数、cfu/μg)を算出した(表4、条件6～12)。
　条件8及び9によって得られた形質転換酵母10株、条件10及び11によって得られた形質転換酵母20株、条件12によって得られた形質転換酵母10株をYPDZeocin(商標)選択寒天プレートに植菌し、30℃、1日間静置培養した。ベクターがアセンブルされているかどうかを確認するため、生育した株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)を用いて、染色体DNA及びプラスミド溶液を取得し、これをテンプレートにしてG418耐性遺伝子のフォワードプライマーであるプライマー19(配列番号30)及びGAP1ターミネーターの開始から156bp離れた箇所のリバースプライマーであるプライマー25(配列番号36)を用いてPCRを行った。PCR産物を電気泳動し、所望のサイズ(951bp)にバンドが生じたサンプル数からアセンブル効率を算出した(表4、条件8～12)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　その結果、条件5のBsrGI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo及び、GAPプロモーター及びGAP1ターミネーターと100％の配列同一性を有する60bpの塩基配列を含むように設計されているG418耐性遺伝子ベクター60_G418_60によるアセンブル効率は20％と低かった。これは、野生株は非相同末端結合活性を有するため、直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoの自己環状化が生じ、60_G418_60と酵母内でのアセンブルが効率的に行われていないと考えられる。
　条件6、7は、Δdnl4Δhis4株を宿主とした、BsrGI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo及び、GAPプロモーター及びGAP1ターミネーターと配列同一性を有する塩基配列を含まないように設計されているG418耐性遺伝子ベクター0_G418_0の形質転換であるが、実施例3表3の結果と同様に、直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoの自己環状化が抑えられていた。
　一方、条件8～11の直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeo及び、G418耐性遺伝子ベクター30_G418_30、60_G418_60によるアセンブル効率は高かった。これは、Δdnl4Δhis4株は配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたことによって非相同末端結合活性を失い、直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoの自己環状化が完全に抑えられ、ベクターとベクターの酵母内でのアセンブルが効率よく行われたことを示唆している。
　条件12の直鎖状にしたpUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeo及び、G418耐性遺伝子ベクター60_G418_60によるアセンブル効率は高かった。これは、Δdnl4Δhis4株は配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたことによって非相同末端結合活性を失い、直鎖状にしたpUC-PARS1PgapGFPTgap1Zeoの自己環状化が完全に抑えられ、ARSの違いに関わらずベクターとベクターの酵母内でのアセンブルが効率よく行われたことを示唆している。
　プライマー19(配列番号30)及びプライマー25(配列番号36)を用いたPCRによってベクターがアセンブルされていることを確認した株からEasy Yeast Plasmid Isolation Kit(クロンテック社製)を用いてプラスミド溶液を取得し、大腸菌E.coli HST08コンピテントセル(タカラバイオ社製)に導入した。得られた大腸菌形質転換体を培養して増幅することによってプラスミドを調製し、本プラスミドをシーケンス解析した結果、全てのサンプルにおいてBsrGI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2PgapGFPTgap1Zeoの緑色蛍光タンパク質遺伝子がG418耐性遺伝子に置き換わっていることが分かった。
　＜比較例3：形質転換酵母の取得、形質転換効率の算出、アセンブル効率の算出＞
　ベクターをアセンブルさせるために、製造例5で構築したマルチクローニングサイトを有する自律複製型ベクターpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeo及び製造例6で構築したFragment 1、Fragment 2、Fragment 3、Fragment 4、Fragment 5、PgapGFP1、GFP2を用いて、比較例2と同等の方法でコマガタエラ・パストリスATCC76273株野生株を形質転換した。
　製造例5で構築したマルチクローニングサイトを有する自律複製型ベクターpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeoを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地(1.6% tryptone bacto(Becton Dickinson社製)、1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム(和光純薬工業社製))で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて、pUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeoを取得した。本プラスミドをマルチクローニングサイト内のMluI認識配列を利用して、MluI処理により直鎖状にした。
　比較例2で得たコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeo溶液(0.015 pmol)、製造例6で構築したFragment 1溶液(0.15 pmol)、Fragment 2溶液(0.15 pmol)、Fragment 3溶液(0.15 pmol)、Fragment 4溶液(0.15 pmol)、Fragment 5溶液(0.15 pmol)、PgapGFP1溶液(0.15 pmol)、GFP2溶液(0.15 pmol)を混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDZeocin(商標)選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.01%Zeocin(商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、形質転換効率(ベクター1μgあたりのコロニー数、cfu/μg)を算出した(表5、条件13)。
　条件13によって得られた形質転換酵母10株をYPDZeocin(商標)選択寒天プレートに植菌し、30℃、1日間静置培養した。ベクターがアセンブルされているかどうかを確認するため、生育した株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)を用いて、染色体DNA及びプラスミド溶液を取得し、これをテンプレートにしてAOX1プロモーターの開始から920bp離れた箇所のフォワードプライマーであるプライマー44(配列番号65)及びGAP1ターミネーターの開始から156bp離れた箇所のリバースプライマーであるプライマー25(配列番号36)を用いてPCRを行った。PCR産物を電気泳動し、所望のサイズ(約12kbp)にバンドが生じたサンプル数からアセンブル効率を算出した(表5、条件13)。
　条件13によって得られた形質転換酵母1123株から蛍光を発する株をカウントし、割合を算出した(表5、条件13)。
　＜実施例4：形質転換酵母の取得、形質転換効率の算出、アセンブル効率の算出＞
　ベクターをアセンブルさせるために、製造例5で構築したマルチクローニングサイトを有する自律複製型ベクターpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeo及び製造例6で構築したFragment 1、Fragment 2、Fragment 3、Fragment 4、Fragment 5、PgapGFP1、GFP2を用いて、実施例3と同等の方法で、実施例1で構築した配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたヒスチジン要求性形質転換酵母Δdnl4Δhis4株を形質転換した。
　製造例5で構築したマルチクローニングサイトを有する自律複製型ベクターpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeoを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地(1.6% tryptone bacto(Becton Dickinson社製)、1% yeast extract bacto(Becton Dickinson社製)、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム(和光純薬工業社製))で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit(日本ジェネティクス社製)を用いて、pUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeoを取得した。本プラスミドをマルチクローニングサイト内のMluI認識配列を利用して、MluI処理により直鎖状にした。
　実施例3で得たコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeo溶液(0.015 pmol)、製造例6で構築したFragment 1溶液(0.15 pmol)、Fragment 2溶液(0.15 pmol)、Fragment 3溶液(0.15 pmol)、Fragment 4溶液(0.15 pmol)、Fragment 5溶液(0.15 pmol)、PgapGFP1溶液(0.15 pmol)、GFP2溶液(0.15 pmol)を混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDZeocin(商標)選択寒天プレート(1% yeast extract(Becton Dickinson社製)、2% hipolypeptone(日本製薬社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.01%Zeocin(商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、形質転換効率(ベクター1μgあたりのコロニー数、cfu/μg)を算出した(表5、条件14)。
　条件14によって得られた形質転換酵母10株をYPDZeocin(商標)選択寒天プレートに植菌し、30℃、1日間静置培養した。ベクターがアセンブルされているかどうかを確認するため、生育した株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)を用いて、染色体DNA及びプラスミド溶液を取得し、これをテンプレートにしてAOX1プロモーターの開始から920bp離れた箇所のフォワードプライマーであるプライマー44(配列番号65)及びGAP1ターミネーターの開始から156bp離れた箇所のリバースプライマーであるプライマー25(配列番号36)を用いてPCRを行った。PCR産物を電気泳動し、所望のサイズ(約12kbp)にバンドが生じたサンプル数からアセンブル効率を算出した(表5、条件14)。
条件14によって得られた形質転換酵母561株から蛍光を発する株をカウントし、割合を算出した(表5、条件14)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　その結果、条件13のMluI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeo及び、Fragment 1、Fragment 2、Fragment 3、Fragment 4、Fragment 5、PgapGFP1、GFP2によるアセンブル効率は20％、蛍光割合も13％と低かった。これは、野生株は非相同末端結合活性を有するため、直鎖状にしたpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeoの自己環状化等が生じ、ベクターの酵母内でのアセンブルが効率的に行われていないと考えられる。
　一方、条件14のMluI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeo及び、Fragment 1、Fragment 2、Fragment 3、Fragment 4、Fragment 5、PgapGFP1、GFP2によるアセンブル効率100％、蛍光割合も95％と高かった。これは、Δdnl4Δhis4株は配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたことによって非相同末端結合活性を失い、直鎖状にしたpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeoの自己環状化が完全に抑えられ、ベクターとベクターの酵母内でのアセンブルが効率よく行われたことを示唆している。
　プライマー44(配列番号65)及びプライマー25(配列番号36)を用いたPCRによってベクターがアセンブルされていることを確認した株からEasy Yeast Plasmid Isolation Kit(クロンテック社製)を用いてプラスミド溶液を取得し、大腸菌E.coli HST08コンピテントセル(タカラバイオ社製)に導入した。得られた大腸菌形質転換体を培養して増幅することによってプラスミドを調製し、本プラスミドをシーケンス解析した結果、全てのサンプルにおいてMluI処理により直鎖状にしたpUC-Cen2Paox1MCSTgap1Zeoのマルチクローニングサイト領域にFragment 1、Fragment 2、Fragment 3、Fragment 4、Fragment 5、PgapGFP1、GFP2の7つの核酸断片が順に挿入されていることが分かった。
　以上の結果から、本発明者らは、非相同末端結合に関するタンパク質DNL4をコードする遺伝子を不活性化することで、ベクターの自己環状化が完全に抑えられることを見出した。更に、高効率に酵母内でベクターのアセンブルが可能となることも見出した。すなわち、非相同末端結合に関わるDNL4の遺伝子が不活性化されたメタノール資化性酵母に二種類以上のベクターを導入する工程を含む形質転換法により、高効率に酵母内でベクターをアセンブルさせることに成功した。
＜製造例7：ゲノム組込み用ベクターの構築＞
　GAPプロモーター(配列番号4)が連結された緑色蛍光タンパク質遺伝子(配列番号23)を含む核酸断片を、合成DNAをテンプレートにしてプライマー45(配列番号66)及びプライマー46(配列番号67)を用いたPCRにより調製し、Fragment G1(配列番号68)1309bpを構築した。
　AOX1ターミネーターの下流にCCA38473ターミネーターの1-238番目の塩基配列を含む核酸断片を、合成DNAをテンプレートにしてプライマー47(配列番号69)及びプライマー48(配列番号70)を用いたPCRにより調製し、Fragment G2(配列番号71)584bpを構築した。
　CCA38473ターミネーターの239-600番目の塩基配列の下流にプロモーターで制御されたG418耐性遺伝子(配列番号22)及びpUC19の塩基配列を含む核酸断片を、合成DNAをテンプレートにしてプライマー49(配列番号72)及びプライマー50(配列番号73)を用いたPCRにより調製し、Fragment G3(配列番号74)4095bpを構築した。
　Fragment G1は上末端にFragment G3の下末端と100%の配列同一性を有する50bpの塩基配列を含み、下末端にFragment G2の上末端と100%の配列同一性を有する46bpの塩基配列を含むように設計されている。
　Fragment G2は上末端にFragment G1の下末端と100%の配列同一性を有する46bpの塩基配列を含み、下末端にゲノムのCCA38473ターミネーターと100%の配列同一性を有する238bpの塩基配列を含むように設計されている。
　Fragment G3は上末端にゲノムのCCA38473ターミネーターと100%の配列同一性を有する362bpの塩基配列を含み、下末端にFragment G1の上末端と100%の配列同一性を有する50bpの塩基配列を含むように設計されている。
　各ベクターの関係を図1に示す。
＜比較例4：形質転換酵母の取得、形質転換効率の産出、アセンブル効率の算出＞
　ベクターをアセンブルさせてゲノム組込みさせるために、製造例7で構築したFragment G1、Fragment G2、Fragment G3を用いて、比較例2と同等の方法でコマガタエラ・パストリスATCC76273株野生株を形質転換した。
　比較例2で得たコンピテントセル溶液60μlと製造例7で構築したFragment G1溶液(0.3 pmol)、Fragment G2溶液(0.3 pmol)、Fragment G3溶液(0.015 pmol)を混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清を廃棄した。1 mlのYNB溶液(0.17% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、0.1% グルタミン酸ナトリウム(ナカライテスク社製))で再懸濁後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、SDG418選択寒天プレート(0.17% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、0.1% グルタミン酸ナトリウム(ナカライテスク社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.05% G418二硫酸塩(ナカライテスク社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、形質転換効率(ベクター1μgあたりのコロニー数、cfu/μg)を算出した(表6、条件15)。
　条件15によって得られた形質転換酵母24株をSDG418選択寒天プレートに植菌し、30℃、1日間静置培養した。ベクターがアセンブルされているかどうかを確認するため、生育した株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)を用いて、染色体DNAを取得し、これをテンプレートにしてCCA38473ターミネーターの上流のフォワードプライマーであるプライマー51(配列番号75)及びCCA38473ターミネーターの下流のリバースプライマーであるプライマー52(配列番号76)を用いてPCRを行った(図1)。PCR産物を電気泳動し、所望のサイズ(約7kbp)にバンドが生じたサンプル数からアセンブル効率を算出した(表6、条件15)。
＜実施例5：形質転換酵母の取得、形質転換効率の算出、アセンブル効率の算出＞
　ベクターをアセンブルさせてゲノム組込みさせるために、製造例7で構築したFragment G1、Fragment G2、Fragment G3を用いて、実施例3と同等の方法で、実施例1で構築した配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたヒスチジン要求性形質転換酵母Δdnl4Δhis4株を形質転換した。
　実施例3で得たコンピテントセル溶液60μlと製造例7で構築したFragment G1溶液(0.3 pmol)、Fragment G2溶液(0.3 pmol)、Fragment G3溶液(0.015 pmol)を混合し、エレクトロポレーション用キュベット(ディスポキュベット電極、電極間隔2mm(ビーエム機器社製))に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清を廃棄した。1 mlのYNB溶液(0.17% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、0.1% グルタミン酸ナトリウム(ナカライテスク社製))で再懸濁後、集菌(3000×g、5分、20℃)し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、SDG418His選択寒天プレート(0.17% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate(Becton Dickinson社製)、0.1% グルタミン酸ナトリウム(ナカライテスク社製)、2% glucose、1.5%アガロース、0.05% G418二硫酸塩(ナカライテスク社製)、0.004% L-ヒスチジン(和光純薬社製))に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、形質転換効率(ベクター1μgあたりのコロニー数、cfu/μg)を算出した(表6、条件16)。
　条件16によって得られた形質転換酵母24株をSDG418His選択寒天プレートに植菌し、30℃、1日間静置培養した。ベクターがアセンブルされているかどうかを確認するため、生育した株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2(カネカ社製)を用いて、染色体DNAを取得し、これをテンプレートにしてCCA38473ターミネーターの上流のフォワードプライマーであるプライマー51(配列番号75)及びCCA38473ターミネーターの下流のリバースプライマーであるプライマー52(配列番号76)を用いてPCRを行った(図1)。PCR産物を電気泳動し、所望のサイズ(約7kbp)にバンドが生じたサンプル数からアセンブル効率を算出した(表6、条件16)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
その結果、条件15のFragment G1、Fragment G2、Fragment G3によるアセンブル効率は62.5％であった。これは、野生株は非相同末端結合活性を有するため、ベクターの自己環状化等が生じ、ベクターの酵母内でのアセンブルが効率的に行われていないと考えられる。また、ベクターの目的外へのゲノム組込みが起きていると考えられる。
一方、条件16のFragment G1、Fragment G2、Fragment G3によるアセンブル効率は100％と高かった。これは、Δdnl4Δhis4株は配列番号25に示す塩基配列からなる遺伝子(DNL4遺伝子)が不活性化されたことによって非相同末端結合活性を失い、ベクターの自己環状化が完全に抑えられ、ベクターとベクターの酵母内でのアセンブルが効率よく行われ、目的のゲノム箇所に組込まれたことを示唆している。
　以上の結果から、本発明者らは、ゲノム組込みを目的とする形質転換法においても、非相同末端結合に関するタンパク質DNL4をコードする遺伝子を不活性化することで、高効率に酵母内でベクターをアセンブルさせることに成功した。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (11)

  1. DNL4の遺伝子が不活性化されたメタノール資化性酵母に二種類以上のベクターを導入する工程を含む形質転換法によって、該二種類以上のベクターをアセンブルする方法。
  2. 前記DNL4の遺伝子が以下の(a)～(d)のいずれかの遺伝子である、請求項1に記載の方法：
    (a)配列番号25に示す塩基配列を含む遺伝子、
    (b)配列番号25に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
    (c)配列番号25に示す塩基配列と85％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
    (d)配列番号24に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
  3. 前記メタノール資化性酵母がコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母である、請求項1～2に記載の方法。
  4. 前記二種類以上のベクターが互いに85％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む請求項1～3のいずれかに記載の方法。
  5. 前記二種類以上のベクターのうち少なくとも1つが自律複製配列(ARS)を含む請求項1～4のいずれかに記載の方法。
  6. 前記二種類以上のベクターのうち少なくとも1つが自律複製型ベクターである、請求項1～5のいずれかに記載の方法。
  7. 前記自律複製型ベクターが、コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母に由来する自律複製配列(ARS)及び／又はセントロメアDNA配列を更に含む、請求項6に記載の方法。
  8. 請求項1～7のいずれかに記載の方法を含む、アセンブルされたベクターの製造方法。
  9. 請求項1～8に記載の方法によって得られた、アセンブルされたベクター。
  10. 請求項1～8のいずれかに記載の方法によって得られた、アセンブルされたベクターにより形質転換する工程を含む、形質転換体の製造方法。
  11. 請求項9に記載のアセンブルされたベクターにより形質転換された形質転換体。
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