WO2018235822A1 - 蛍光相関分光装置 - Google Patents

蛍光相関分光装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2018235822A1
WO2018235822A1 PCT/JP2018/023321 JP2018023321W WO2018235822A1 WO 2018235822 A1 WO2018235822 A1 WO 2018235822A1 JP 2018023321 W JP2018023321 W JP 2018023321W WO 2018235822 A1 WO2018235822 A1 WO 2018235822A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
optical fiber
port
fluorescence
correlation spectroscopy
excitation light
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/023321
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
政孝 金城
条太郎 山本
Original Assignee
国立大学法人北海道大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人北海道大学 filed Critical 国立大学法人北海道大学
Priority to JP2019525631A priority Critical patent/JP6667868B2/ja
Publication of WO2018235822A1 publication Critical patent/WO2018235822A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence correlation spectroscopy apparatus.
  • Fluorescence correlation spectroscopy measures an increase or decrease in fluorescence intensity caused by a fluorescent molecule moving in and out in a minute measurement area.
  • FCS Fluorescence correlation spectroscopy
  • information such as the movement (for example, the diffusion rate) and the number of molecules of the fluorescent molecule passing through the measurement region.
  • FCS information such as the diffusion rate and the number of molecules of the fluorescently labeled probe protein can be obtained, and from this information, information on the interaction between proteins can also be obtained.
  • FCS can detect biomolecular interactions in real time in living cells with single molecule sensitivity.
  • a general fluorescence correlation spectroscopy apparatus is complicated and large because it includes confocal laser optics.
  • a fluorescence correlation spectroscopy apparatus using a confocal laser optical system it is difficult to set a measurement region at a position away from the objective lens. From these things, it was difficult to apply FCS to animal experiments and medical treatment.
  • Patent Document 1 discloses a fluorescence correlation spectroscopy apparatus having a light source, an optical fiber coupler, a spectral filter, a detector, a first optical fiber, a second optical fiber, and a third optical fiber.
  • the excitation light emitted from the light source passes through the first optical fiber, the optical fiber coupler, and the second optical fiber in order, and is irradiated to the sample. This causes the sample to emit fluorescence.
  • the fluorescence is detected by the detector, passing sequentially through the second optical fiber, the optical fiber coupler, the third optical fiber and the spectral filter.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus described in Patent Document 1 adopts an optical system using an optical fiber instead of the confocal optics, and thus is smaller than the fluorescence correlation spectroscopy apparatus including the confocal laser optics. is there.
  • the end of the second optical fiber waveguide can be freely moved, the position of the measurement area can be set freely to some extent.
  • Patent Document 1 discloses a fluorescence correlation spectroscopy apparatus having an optical fiber and an optical fiber coupler.
  • this fluorescence correlation spectroscopy apparatus has room for further improvement in terms of fluorescence detection efficiency and miniaturization.
  • an object of the present invention is to provide a fluorescence correlation spectroscopy device that can detect fluorescence more efficiently than a conventional fluorescence correlation spectroscopy device and can also be miniaturized.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus comprises a light source for emitting excitation light, a first port and a second port provided on one side, and a third port and a fourth port provided on the other side.
  • a detector for detecting fluorescence a first optical fiber for guiding the excitation light emitted from the light source to the first port, and the excitation light emitted from the fourth port For directing the fluorescence emitted from the object to the fourth port, and for inducing the fluorescence emitted from the second port to the detector.
  • R is in the range of 1-R (provided that 0.6 ⁇ R ⁇ 1).
  • a fluorescence correlation spectroscopy device that can detect fluorescence more efficiently than a conventional fluorescence correlation spectroscopy device, and can also be miniaturized.
  • FIG. 1 is a schematic view showing the configuration of a fluorescence correlation spectroscopy apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 2A to 2D are schematic views showing the configuration of a condensing lens.
  • FIG. 3 is a schematic view showing the configuration of a fluorescence correlation spectroscopy apparatus according to a modification.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between bead size and autocorrelation function.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between bead diameter and diffusion time (DT).
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between bead concentration and autocorrelation function.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between bead concentration and particle number (NP).
  • FIG. 1 is a schematic view showing the configuration of a fluorescence correlation spectroscopy apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 2A to 2D are schematic views showing the configuration of a condensing lens.
  • FIG. 3 is a schematic view showing the configuration
  • FIG. 8A is a graph showing an autocorrelation function when using a 800-fold diluted solution of beads with a diameter of 100 nm as a sample
  • FIG. 8B shows an autocorrelation function when using a 1600-fold dilution of beads with a 100 nm diameter as a sample Is a graph
  • FIG. 9A is a graph showing an autocorrelation function when using a 800-fold diluted solution of beads having a diameter of 200 nm as a sample
  • FIG. 9B is a graph showing an autocorrelation function when using a 1600-fold diluting solution of beads having a diameter of 200 nm as a sample Is a graph showing
  • FIG. 1 is a schematic view showing the configuration of a fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 according to an embodiment of the present invention.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 includes a light source 110, an optical fiber coupler 120, a condenser lens 130, a fluorescence filter 140, a detector 150, a correlator 160, a first optical fiber 170, a second optical fiber 180 and a second optical fiber 3 includes an optical fiber 190.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 irradiates excitation light to the object (fluorescent molecule) 10 from the end of the second optical fiber 180 through the condenser lens 130.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 detects the fluorescence emitted from the object 10 through the condenser lens 130, and calculates an autocorrelation function or a cross correlation function from the detection result of the fluorescence. Desired information can be obtained from this correlation function.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 detects the fluorescence emitted from the object 10 through the condenser lens 130, and calculates an autocorrelation function or a cross correlation function from the detection result of the fluorescence. Desired information can be obtained from this correlation function.
  • the light source 110 emits excitation light.
  • the excitation light enters the first optical fiber 170 at the end of the first optical fiber 170.
  • the type of the light source 110 is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of the target 10 (the excitation wavelength of the fluorescent molecule).
  • Examples of light sources 110 include laser diodes, light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources. In the present embodiment, it is a laser diode.
  • the excitation light filter include a reflection type filter, an absorption type filter, and a fiber Bragg grating (hereinafter also referred to as "FBG").
  • the optical fiber coupler 120 has a first port 121 and a second port 122 provided on one side, and a third port 123 and a fourth port 124 provided on the other side. In the present embodiment, it is a 2 ⁇ 2 optical fiber coupler.
  • the excitation light emitted from the light source 110 reaches the first port 121 via the first optical fiber 170.
  • the excitation light incident at the first port 121 is emitted from the third port 123 and the fourth port 124 at a predetermined branching ratio.
  • the fluorescence emitted from the object 10 reaches the fourth port 124 via the second optical fiber 180.
  • the fluorescence incident at the fourth port 124 is emitted from the first port 121 and the second port 122 at a predetermined branching ratio.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 is characterized in that the branching ratio of the optical fiber coupler 120 is not 50:50. More specifically, in the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 according to the present embodiment, most of the excitation light (for example, 99%) incident at the first port 121 is emitted from the third port 123, and only one of the excitation light is A part (for example, 1%) is emitted from the fourth port 124. In addition, most (for example, 99%) of the fluorescence incident at the fourth port 124 is emitted from the second port 122, and a small portion (for example, 1%) of the fluorescence is emitted from the first port 121.
  • the branching ratio of the optical fiber coupler 120 is not 50:50. More specifically, in the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 according to the present embodiment, most of the excitation light (for example, 99%) incident at the first port 121 is emitted from the third port 123, and only one of the excitation light is
  • the condensing lens 130 disposed between the second optical fiber 180 and the object 10 condenses the excitation light, so that the excitation light is prevented from the viewpoint of preventing fading. It is necessary to reduce the amount of light.
  • the optical fiber coupler 120 also has the function of reducing the light quantity of the excitation light, so the light quantity of the excitation light can be appropriately adjusted without separately using an ND filter or the like.
  • the branching ratio of the optical fiber coupler 120 is such that it is possible to irradiate the object 10 with excitation light of an intensity that causes no discoloration and sufficient fluorescence to be generated, and detects as much fluorescence emitted from the object 10 as possible It is preferable to appropriately set according to the condenser lens 130 and the like so that it can be led to the vessel 140.
  • the branching ratio of the optical fiber coupler 120 may be set as follows. First, depending on the type of the target (fluorescent molecule) 10, the excitation light intensity I ex (unit: W) to such an extent that the target 10 does not fade is determined. In consideration of not fading the object 10, the excitation light intensity I ex is preferably 100 ⁇ W or less. Introduce the determined excitation light intensity I ex (unit: W), the maximum output I 0 (unit: W) of the light source, and the optical loss ⁇ (0 ⁇ ⁇ 1) due to optical fiber propagation into the following equation (1) Thus, the branching ratio R (0 ⁇ R ⁇ 1) can be obtained.
  • the branching ratio R can be determined from the maximum output I 0 of the light source.
  • the branching ratio between the third port 123 and the fourth port 124 is R: 1-R.
  • the branching ratio between the third port 123 and the fourth port 124 when the excitation light is made incident from the first port 121 is in the range of R: 1-R (where 0.6 ⁇ R ⁇ 1). It is preferably within the range of 0.90: 0.10 to 0.99: 0.01, more preferably within the range of 0.95: 0.10 to 0.99: 0.01. It is further preferred that
  • the condenser lens 130 is disposed between the end of the second optical fiber 180 on the object 10 side and the object 10.
  • the condensing lens 130 condenses the excitation light emitted from the end of the second optical fiber 180 on the area where the object 10 is present, and increases the intensity of the excitation light and defines a minute measurement area.
  • the condensing lens 130 condenses the fluorescence emitted from the object 10 and makes the fluorescence enter the second optical fiber 180.
  • the configuration of the condenser lens 130 is not particularly limited.
  • the condenser lens 130 may be integral with the second optical fiber 180 or separate from the second optical fiber 180.
  • the second optical fiber 180 may be a lensed optical fiber whose end on the object 10 side functions as a condenser lens 130a.
  • the condenser lens 130 may be joined to the end of the second optical fiber 180 or is separated from the end of the second optical fiber 180. It is also good.
  • a GRIN lens 130 b may be cemented to the end of the second optical fiber 180. Also, as shown in FIG.
  • an objective lens 130 c may be disposed between the end of the second optical fiber 180 and the object 10.
  • one condenser lens 130 objective lens
  • the condenser lens 130 d may be integral with the container 11 for containing the object 10. By doing so, the condenser lens 130 can be made disposable.
  • a collimating lens 130 e for collimating the light emitted from the second optical fiber 180 be further disposed.
  • the condenser lens 130 may include a plurality of lenses.
  • the collimating lens 130e is not essential.
  • the scale of each member is changed in favor of easy understanding.
  • the fluorescence filter 140 is disposed on the optical path between the optical fiber coupler 120 and the detector 150, and reduces the excitation light (mainly the excitation light reflected by the object 10). When the excitation light reaching the detector 150 is sufficiently small, the fluorescence filter 140 may be omitted, but from the viewpoint of improving the detection accuracy of the fluorescence, it is preferable to install the fluorescence filter 140.
  • the type of the fluorescence filter 140 is not particularly limited as long as the fluorescence can be transmitted while reducing the excitation light. Examples of the fluorescence filter 140 include a reflection type filter, an absorption type filter, and a fiber Bragg grating.
  • FIG. 3 is a schematic view showing the configuration of a fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 'according to a modification.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 'according to the modification has a fiber Bragg grating (FBG) 171 formed in the first optical fiber 170 for narrowing the spectrum of excitation light as an excitation light filter, and a fluorescence filter 140 , And has a fiber Bragg grating (FBG) 191 formed in the third optical fiber 190 to reduce the excitation light.
  • the FBG 171 is a narrow band pass filter or notch filter that narrows the spectrum of the excitation light by reflecting light of a wavelength outside the center wavelength of the excitation light.
  • the FBG 191 reduces the excitation light reaching the detector 150 by reflecting the light of the wavelength of the excitation light.
  • the excitation light filter (FBG 171) in the first optical fiber 170 and providing the fluorescent filter 140 (FBG 191) in the third optical fiber 190 all of the optical system except the condenser lens 130 is composed of optical fibers.
  • the grating period ⁇ in the FBG 171 and the FBG 191 is appropriately set in accordance with the central wavelength of the excitation light.
  • the wavelength (Bragg wavelength) ⁇ b of the light reflected by the FBG 171 or FBG 191 is the effective refractive index n of the core of the first optical fiber 170 or the third optical fiber 190 and the grating period ⁇ . It depends on Thus, for FBG191, so that the center wavelength of the excitation light emitted from the light source 110 matches the Bragg wavelength lambda b, may be set grating period lambda. The smaller the excitation light reaching the detector 150, the better, so the reflectance of the excitation light by the FBG 191 is preferably as high as possible. In addition, although fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 'which concerns on a modification has two FBG of FBG171 and FBG191, you may have only any one FBG.
  • the detector 150 detects the fluorescence emitted from the object 10 and reached through the second optical fiber 180, the optical fiber coupler 120, the third optical fiber 190, and the fluorescence filter 140.
  • the type of detector 150 is not particularly limited as long as fluorescence can be detected with the required sensitivity in FCS.
  • Examples of detectors 150 include avalanche photodiodes and photomultipliers. In the present embodiment, the detector 150 is an avalanche photodiode.
  • the correlator 160 calculates an autocorrelation function or cross correlation function from the fluorescence intensity detected by the detector 150.
  • the correlator 160 may be a hardware correlator or a software correlator. In the present embodiment, correlator 160 is a hardware correlator.
  • the first optical fiber 170 guides the excitation light emitted from the light source 110 to the first port 121 of the optical fiber coupler 120.
  • the type of the first optical fiber 170 is not particularly limited as long as the excitation light can be appropriately guided to the optical fiber coupler 120.
  • the first optical fiber 170 may be a multimode optical fiber or a single mode optical fiber.
  • the second optical fiber 180 is preferably a single mode optical fiber.
  • the first optical fiber 170 also be a single mode optical fiber from the viewpoint of efficiently propagating light.
  • the first optical fiber 170 is a single mode optical fiber.
  • the second optical fiber 180 emits the excitation light emitted from the fourth port 124 of the optical fiber coupler 120 toward the object 10.
  • the excitation light emitted from the second optical fiber 180 is condensed by the condensing lens 130 and irradiated to the object 10. Thereby, the fluorescence is emitted from the object 10.
  • the fluorescence emitted from the object 10 is collected by the collecting lens 130 and enters the second optical fiber 180 from the end face of the second optical fiber 180.
  • the second optical fiber 180 directs fluorescence to the fourth port 124 of the optical fiber coupler 120.
  • the second optical fiber 170 is preferably a single mode optical fiber.
  • the second optical fiber 180 is a single mode optical fiber.
  • the third optical fiber 190 guides the fluorescence emitted from the second port 122 of the optical fiber coupler 120 to the detector 150.
  • the type of the third optical fiber 190 is not particularly limited as long as fluorescence can be appropriately guided to the detector 150.
  • the third optical fiber 190 may be a multimode optical fiber or a single mode optical fiber. From the viewpoint of guiding fluorescence to the detector 150 as much as possible, the third optical fiber 190 is preferably a multimode optical fiber. In the present embodiment, the third optical fiber 190 is a multimode optical fiber.
  • the excitation light emitted from the third port 123 of the optical fiber coupler 120 is not used. Therefore, an optical fiber or the like is not connected to the third port 123. From the viewpoint of preventing reflection of the excitation light at the third port 123, a light trap may be connected to the third port 123.
  • excitation light of a wavelength according to the object (fluorescent molecule) 10 is emitted from the light source 110.
  • the excitation light enters the first optical fiber 170 and enters the optical fiber coupler 120 from the first port 121.
  • Most of the excitation light (for example, 99%) is emitted from the third port 123, and a small portion (for example, 1%) of the excitation light is emitted from the fourth port 124.
  • the excitation light emitted from the fourth port 124 enters the second optical fiber 180, and is emitted toward the object 10 from the end of the second optical fiber 180 on the object 10 side.
  • the excitation light is collected by the collection lens 130 to form a minute measurement area. Since the object 10 in the measurement area is irradiated with excitation light, it emits fluorescence of a wavelength according to the type of the object (fluorescent molecule) 10.
  • the fluorescence emitted from the object 10 is collected by the collecting lens 130 and enters the second optical fiber 180.
  • the fluorescence enters the optical fiber coupler 120 from the fourth port 124.
  • Most of the fluorescence eg, 99%
  • a small portion eg, 1%) of the fluorescence is emitted from the first port 121.
  • the fluorescence emitted from the second port 122 is incident on the third optical fiber 190, the excitation light component is removed by the fluorescence filter 140, and the light is detected by the detector 150.
  • the correlator 160 calculates an autocorrelation function or cross correlation function from the fluorescence intensity detected by the detector 150. From this correlation function, it is possible to obtain desired information such as the movement (for example, the diffusion rate) and the number of molecules of the object (fluorescent molecule) 10 passing through the measurement region.
  • the branching ratio of the optical fiber coupler 120 As described above, in the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 according to the present embodiment, with regard to the branching ratio of the optical fiber coupler 120, the third port 123 and the fourth port 124 when the excitation light is made incident from the first port 121.
  • the branching ratio in the range of R: 1-R (where 0.6 ⁇ R ⁇ 1), the object 10 is irradiated with a sufficient amount of excitation light, and the light enters the second optical fiber 180. It is realized to lead most of the fluorescence to the detector 150.
  • the fluorescence detection efficiency is superior to that of the fluorescence correlation spectroscopy apparatus described in Patent Document 1.
  • the condensing lens 130 disposed between the second optical fiber 180 and the object 10 condenses the excitation light, so that the excitation light is prevented to prevent the color fading. It is necessary to reduce the amount of light.
  • the optical fiber coupler 120 also has the function of reducing the light quantity of the excitation light, so the light quantity of the excitation light can be appropriately adjusted without separately using an ND filter or the like. It can be reduced.
  • the branching ratio of the optical fiber coupler is set to about 1: 1 in order to irradiate the object with as much excitation light as possible. It is guessed that As described above, the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 according to the present embodiment is different from the fluorescence correlation spectroscopy apparatus described in Patent Document 1 both in terms of reducing the light quantity of excitation light and using the optical fiber coupler 120. It is a thing.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 can be miniaturized similarly to the fluorescence correlation spectroscopy apparatus described in Patent Document 1 because the optical system is configured by an optical fiber.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 ′ (see FIG. 3) having the FBG 191 formed in the third optical fiber 190 as the fluorescence filter 140 can be more miniaturized than the fluorescence correlation spectroscopy apparatus described in Patent Document 1.
  • Example 1 shows the results of measurement of fluorescent beads dispersed in ultrapure water using the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 shown in FIG.
  • a GRIN lens 130b joined to the end of the second optical fiber 180 was used (see FIG. 2B).
  • a single mode fiber output laser diode (LP488-SF20, Thorlabs) that emits laser light with a central wavelength of 488 nm was used.
  • the optical fiber coupler 120 a 2 ⁇ 2 optical fiber coupler (FC488-99B-FC-1, Thorlabs) with a branching ratio of 0.99: 0.01 for light of wavelength 488 nm was used.
  • the fluorescence filter 140 a single band pass filter (FF01-542 / 27-25, Semrock) having a center wavelength of 542 nm was used.
  • an avalanche photodiode SPCM-CD 3017, Perkin Elmer
  • correlator 160 a hardware correlator (Flex 02-01D, Correlator. Com) was used.
  • a single mode optical fiber GT-SMFP-100-SP4.5-cus-50-NC, S / N # CRS 2946-3-SP355-01 to which a GRIN lens is adhered. , GRINTECH
  • the power of the excitation light at the focusing point was 15.3 ⁇ W.
  • a multimode optical fiber M74L02, Thorlabs
  • a light trap FTFC1, Thorlabs
  • fluorescent beads with a diameter of 40 nm F8795, Thermo Fisher Scientific
  • fluorescent beads with a diameter of 100 nm F8803, Thermo Fisher Scientific
  • fluorescent beads with a diameter of 200 nm F8811, Thermo Fisher Scientific
  • the maximum excitation wavelength of these fluorescent beads is 505 nm
  • the maximum fluorescence wavelength is 515 nm.
  • a sample was prepared by diluting the purchased dispersion solution of fluorescent beads with ultrapure water.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between bead size and autocorrelation function.
  • the horizontal axis is time ⁇ (milliseconds), and the vertical axis is an autocorrelation function normalized so that the amplitude is 1. From this graph, it can be seen that the half width of the autocorrelation function increases as the bead size increases.
  • Table 1 shows the diffusion time (DT) and the number of particles (NP) obtained from the autocorrelation function of each sample.
  • the diffusion time (DT) is the average time for the beads to stay in the measurement area and corresponds to the half-width of the autocorrelation function.
  • Diffusion time (DT) is proportional to the diameter of the bead.
  • the number of particles (NP) is the average number of beads present in the measurement area and corresponds to the reciprocal of the amplitude of the autocorrelation function.
  • Particle number (NP) is proportional to the concentration of beads.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between bead diameter and diffusion time (DT). From this graph, it can be seen that the diffusion time (DT) is proportional to the bead diameter, that is, the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 can measure the bead size.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between bead concentration and autocorrelation function.
  • the horizontal axis is time ⁇ (milliseconds), and the vertical axis is an autocorrelation function.
  • fluorescent beads with a diameter of 100 nm were used. From this graph, it can be seen that the amplitude of the autocorrelation function increases as the bead concentration decreases.
  • Table 2 shows the diffusion time (DT) and the number of particles (NP) obtained from the autocorrelation function of each concentration sample. As mentioned above, the number of particles (NP) is proportional to the concentration of beads.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between bead concentration and particle number (NP). From this graph, it can be seen that the number of particles (NP) is proportional to the bead concentration, that is, the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 can measure the bead concentration.
  • Example 2 also shows the results of measurement of fluorescent beads dispersed in ultrapure water using the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 shown in FIG. A condenser lens was used as the condenser lens 130.
  • fluorescent beads of 100 nm in diameter F8803, Thermo Fisher Scientific
  • fluorescent beads of 200 nm in diameter F8811, Thermo Fisher Scientific
  • the maximum excitation wavelength of these fluorescent beads is 505 nm
  • the maximum fluorescence wavelength is 515 nm.
  • a sample was prepared by diluting the purchased dispersion solution of fluorescent beads with ultrapure water.
  • the light source 110, the first optical fiber 170, the optical fiber coupler 120, the third optical fiber 190, the fluorescence filter 140, the detector 150, and the correlator 160 are the same as in the first embodiment.
  • a single mode optical fiber 460 HP, Thorlabs
  • an aspheric condenser lens # 35-044, Edmund Optics
  • the power of the excitation light at the focusing point was 32.0 ⁇ W when the target 10 was a fluorescent bead with a diameter of 100 nm.
  • the power of excitation light at the focusing point was 23.3 ⁇ W when a fluorescent bead with a diameter of 200 nm was used as the target 10.
  • a light trap (FTFC1, Thorlabs) was connected to the third port 123 of the optical fiber coupler 120.
  • FIG. 8A is a graph showing an autocorrelation function when using a 800-fold diluted solution of beads with a diameter of 100 nm as a sample
  • FIG. 8B shows an autocorrelation function when using a 1600-fold dilution of beads with a 100 nm diameter as a sample
  • FIG. 9A is a graph showing an autocorrelation function when using a 800-fold diluted solution of beads having a diameter of 200 nm as a sample
  • FIG. 9B shows an autocorrelation function when using a 1600-fold diluting solution having a diameter of 200 nm as a sample It is a graph.
  • the horizontal axis is time ⁇ (milliseconds), and the vertical axis is an autocorrelation function.
  • the amplitude of the autocorrelation function was increased by increasing the dilution factor of the bead dispersion.
  • the half-width of the autocorrelation function became larger as the diameter of the bead became larger. From these results, it is understood that the fluorescence correlation spectroscopy apparatus 100 can measure the bead concentration and the bead size even when a condenser lens is used as the condenser lens 130.
  • the fluorescence correlation spectroscopy apparatus Since the fluorescence correlation spectroscopy apparatus according to the present invention is compact and can freely set the position of the measurement region, it can be used in various fields including animal experiments and medicine.
  • target fluorescent molecule
  • container 100, 100 'fluorescence correlation spectroscopy apparatus 110 light source 120 optical fiber coupler 121 first port 122 second port 123 third port 124 fourth port 130, 130a, 130d condenser lens 130b condenser lens (GRIN lens) 130c Condenser Lens (Objective Lens) 130e Condenser (collimate lens) 140 fluorescence filter 150 detector 160 correlator 170 first optical fiber 171 fiber Bragg grating 180 second optical fiber 190 third optical fiber 191 fiber Bragg grating

Abstract

蛍光相関分光装置は、光源と、光ファイバーカプラと、検出器と、光源と光ファイバーカプラの第１ポートとを接続する第１光ファイバーと、光ファイバーカプラの第４ポートと対象物とを接続する第２光ファイバーと、光ファイバーカプラの第２ポートと検出器とを接続する第３光ファイバーと、第２光ファイバーと対象物との間に配置された集光レンズとを有する。励起光を第１ポートから入射させたときの第３ポートと第４ポートとの分岐比は、Ｒ：１－Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）である。

Description

蛍光相関分光装置
　本発明は、蛍光相関分光装置に関する。
　蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy：以下「ＦＣＳ」ともいう）は、微小な測定領域を蛍光分子が出入りすることに起因する蛍光強度の増減を測定する。この蛍光強度の増減を相関関数により表現することで、測定領域を通過する蛍光分子の動き（例えば拡散速度）や分子数などの情報を得ることができる。ＦＣＳを利用することで、蛍光標識を行ったプローブタンパク質の拡散速度や分子数などの情報を得ることができ、これらの情報からさらにタンパク質間の相互作用の情報も得ることができる。ＦＣＳは、１分子レベルの感度で生体分子の相互作用を生きた細胞内でリアルタイムに検出することが可能である。しかしながら、一般的な蛍光相関分光装置は、共焦点レーザー光学系を含むため、複雑かつ大型である。また、共焦点レーザー光学系を用いた蛍光相関分光装置では、対物レンズから離れた位置に測定領域を設定することが困難である。これらのことから、ＦＣＳを動物実験や医療などに適用することが困難であった。
　このような問題を解消する手段として、光ファイバーを使用した蛍光相関分光装置が提案されている。たとえば、特許文献１には、光源、光ファイバーカプラ、スペクトルフィルタ、検知器、第１光ファイバー、第２光ファイバーおよび第３光ファイバーを有する蛍光相関分光装置が開示されている。この蛍光相関分光装置では、光源から出射された励起光は、第１光ファイバー、光ファイバーカプラおよび第２光ファイバーを順に通過して試料に照射される。これにより試料から蛍光が放出される。蛍光は、第２光ファイバー、光ファイバーカプラ、第３光ファイバーおよびスペクトルフィルタを順に通過して、検知器により検出される。このように特許文献１に記載の蛍光相関分光装置は、共焦点光学系の代わりに光ファイバーを用いた光学系を採用しているため、共焦点レーザー光学系を含む蛍光相関分光装置よりも小型である。また、第２光ファイバー導波管の端部を自由に移動させることが可能であるため、測定領域の位置をある程度自由に設定することができる。
特開平８－６８６９４号公報
　上記のとおり、特許文献１には、光ファイバーおよび光ファイバーカプラを有する蛍光相関分光装置が開示されている。しかしながら、この蛍光相関分光装置には、蛍光の検出効率および小型化の点でさらなる改善の余地がある。
　そこで、本発明は、従来の蛍光相関分光装置よりも、効率よく蛍光を検出することが可能であり、かつ小型化することも可能である蛍光相関分光装置を提供することを目的とする。
　本発明に係る蛍光相関分光装置は、励起光を出射するための光源と、一方の側に設けられた第１ポートおよび第２ポートと、他方の側に設けられた第３ポートおよび第４ポートとを含む光ファイバーカプラと、蛍光を検出するための検出器と、前記光源から出射された励起光を前記第１ポートに誘導するための第１光ファイバーと、前記第４ポートから出射された励起光を対象物に向けて出射させるとともに、前記対象物から放出された蛍光を前記第４ポートに誘導するための第２光ファイバーと、前記第２ポートから出射された蛍光を前記検出器に誘導するための第３光ファイバーと、前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部と前記対象物との間に配置された集光レンズと、を有し、励起光を前記第１ポートから入射させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、Ｒ：１－Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）の範囲内である。
　本発明によれば、従来の蛍光相関分光装置よりも、効率よく蛍光を検出することが可能であり、かつ小型化することも可能である蛍光相関分光装置を提供することができる。
図１は、本発明の一実施の形態に係る蛍光相関分光装置の構成を示す模式図である。 図２Ａ～Ｄは、集光レンズの構成を示す模式図である。 図３は、変形例に係る蛍光相関分光装置の構成を示す模式図である。 図４は、ビーズサイズと自己相関関数との関係を示すグラフである。 図５は、ビーズ直径と拡散時間（ＤＴ）との関係を示すグラフである。 図６は、ビーズ濃度と自己相関関数との関係を示すグラフである。 図７は、ビーズ濃度と粒子数（ＮＰ）との関係を示すグラフである。 図８Ａは、直径１００ｎｍのビーズの８００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフであり、図８Ｂは、直径１００ｎｍのビーズの１６００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフである。 図９Ａは、直径２００ｎｍのビーズの８００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフであり、図９Ｂは、直径２００ｎｍのビーズの１６００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　図１は、本発明の一実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、蛍光相関分光装置１００は、光源１１０、光ファイバーカプラ１２０、集光レンズ１３０、蛍光フィルター１４０、検出器１５０、相関器１６０、第１光ファイバー１７０、第２光ファイバー１８０および第３光ファイバー１９０を含む。蛍光相関分光装置１００は、第２光ファイバー１８０の端部から集光レンズ１３０を通して対象物（蛍光分子）１０に励起光を照射する。そして、蛍光相関分光装置１００は、対象物１０から放出された蛍光を集光レンズ１３０を通して検出し、蛍光の検出結果から自己相関関数または相互相関関数を算出する。この相関関数から、所望の情報が得られる。以下、各構成要素について説明する。
　光源１１０は、励起光を出射する。励起光は、第１光ファイバー１７０の端部で第１光ファイバー１７０内に入射する。光源１１０の種類は、特に限定されず、対象物１０の種類（蛍光分子の励起波長）に応じて適宜選択されうる。光源１１０の例には、レーザーダイオード、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。本実施の形態では、レーザーダイオードである。光源の種類によっては、光源１１０から出射された光は、励起光フィルターにより狭スペクトル化されることが好ましい。励起光フィルターの例には、反射型フィルター、吸収型フィルター、ファイバーブラッググレーティング（以下「ＦＢＧ」ともいう）が含まれる。
　光ファイバーカプラ１２０は、一方の側に設けられた第１ポート１２１および第２ポート１２２と、他方の側に設けられた第３ポート１２３および第４ポート１２４とを有する。本実施の形態では、２×２光ファイバーカプラである。光源１１０から出射された励起光は、第１光ファイバー１７０を介して第１ポート１２１に到達する。第１ポート１２１で入射した励起光は、第３ポート１２３および第４ポート１２４から所定の分岐比で出射される。一方、対象物１０から放出された蛍光は、第２光ファイバー１８０を介して第４ポート１２４に到達する。第４ポート１２４で入射した蛍光は、第１ポート１２１および第２ポート１２２から所定の分岐比で出射される。
　本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００は、光ファイバーカプラ１２０の分岐比が５０：５０ではないことを一つの特徴とする。より具体的には、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、第１ポート１２１で入射した励起光の大部分（例えば９９％）は第３ポート１２３から出射され、励起光のごく一部（例えば１％）が第４ポート１２４から出射される。また、第４ポート１２４で入射した蛍光の大部分（例えば９９％）は第２ポート１２２から出射され、蛍光のごく一部（例えば１％）が第１ポート１２１から出射される。このように、分岐比を大きくすることで、励起光の光量を適切に低減させることが可能となり、かつ対象物１０から放出された蛍光の大部分を検出器１４０に導くことが可能となる。本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、第２光ファイバー１８０と対象物１０との間に配置されている集光レンズ１３０が励起光を集光するため、退色を防ぐ観点からは励起光の光量を低減させる必要がある。この点について、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、光ファイバーカプラ１２０が励起光の光量を低減させる機能も担っているため、別途ＮＤフィルターなどを用いることなく励起光の光量を適切に低減させることができる。光ファイバーカプラ１２０の分岐比は、退色が生じず、かつ蛍光が十分に発生する強度の励起光を対象物１０に照射することが可能であり、かつ対象物１０から放出された蛍光をできるだけ多く検出器１４０に導くことが可能であるように、集光レンズ１３０などに応じて適宜設定されることが好ましい。
　たとえば、光ファイバーカプラ１２０の分岐比は、以下のように設定してもよい。まず、対象物（蛍光分子）１０の種類に応じて、対象物１０が退色しない程度の励起光強度Ｉｅｘ（単位：Ｗ）を決定する。対象物１０を退色させないことを考慮すると、励起光強度Ｉｅｘは、１００μＷ以下であることが好ましい。決定した励起光強度Ｉｅｘ（単位：Ｗ）、光源の最大出力Ｉ０（単位：Ｗ）、および光ファイバー伝搬による光損失α（０＜α＜１）を以下の式（１）に導入することにより、分岐比Ｒ（０＜Ｒ＜１）を求めることができる。すなわち、対象物１０が退色しない程度の励起光強度Ｉｅｘを決定すれば、光源の最大出力Ｉ０から分岐比Ｒを決定することができる。なお、第３ポート１２３と第４ポート１２４との分岐比は、Ｒ：１－Ｒである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　具体的には、励起光を第１ポート１２１から入射させたときの第３ポート１２３と第４ポート１２４との分岐比は、Ｒ：１－Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）の範囲内であることが好ましく、０.９０：０.１０～０.９９：０.０１の範囲内であることがより好ましく、０.９５：０.１０～０.９９：０.０１の範囲内であることがさらに好ましい。
　集光レンズ１３０は、第２光ファイバー１８０の対象物１０側の端部と対象物１０との間に配置されている。集光レンズ１３０は、第２光ファイバー１８０の端部から出射された励起光を対象物１０が存在する領域に集光して、励起光の強度を高めるとともに微小な測定領域を規定する。また、集光レンズ１３０は、対象物１０から放出された蛍光を集光して第２光ファイバー１８０に入射させる。集光レンズ１３０を設けることで、励起光の利用効率および蛍光の検出効率を向上させることができる。
　集光レンズ１３０の構成は、特に限定されない。集光レンズ１３０は、第２光ファイバー１８０と一体であってもよいし、第２光ファイバー１８０と別体であってもよい。たとえば、図２Ａに示されるように、第２光ファイバー１８０は、対象物１０側の端部が集光レンズ１３０ａとして機能するレンズド光ファイバーであってもよい。集光レンズ１３０が第２光ファイバー１８０と別体である場合、集光レンズ１３０は、第２光ファイバー１８０の端部に接合されていてもよいし、第２光ファイバー１８０の端部から離間していてもよい。たとえば、図２Ｂに示されるように、ＧＲＩＮレンズ１３０ｂが、第２光ファイバー１８０の端部に接合されていてもよい。また、図２Ｃに示されるように、対物レンズ１３０ｃが、第２光ファイバー１８０の端部と対象物１０との間に配置されていてもよい。このようにすることで、異なる蛍光相関分光装置１００において、または異なる測定において、１つの集光レンズ１３０（対物レンズ）を使いまわすことができる。また、図２Ｄに示されるように、集光レンズ１３０ｄは、対象物１０を収容する容器１１と一体であってもよい。このようにすることで、集光レンズ１３０をディスポーザブルのものとすることができる。図２Ｃおよび図２Ｄに示される態様では、第２光ファイバー１８０から出射された光を平行光にするためのコリメートレンズ１３０ｅがさらに配置されていることが好ましい。このように、集光レンズ１３０は、複数のレンズを含んでいてもよい。ただし、図２Ｃおよび図２Ｄに示される態様において、コリメートレンズ１３０ｅは必須ではない。なお、図２Ａ～Ｄでは、わかりやすさを優先して各部材の縮尺を変えている。
　蛍光フィルター１４０は、光ファイバーカプラ１２０と検出器１５０との間の光路上に配置されており、励起光（主として対象物１０で反射した励起光）を低減させる。検出器１５０に到達する励起光が十分に少ない場合は、蛍光フィルター１４０は無くてもよいが、蛍光の検出精度を向上させる観点からは、蛍光フィルター１４０を設置することが好ましい。蛍光フィルター１４０の種類は、励起光を低減させつつ蛍光を透過させることができれば特に限定されない。蛍光フィルター１４０の例には、反射型フィルター、吸収型フィルター、ファイバーブラッググレーティングが含まれる。
　図３は、変形例に係る蛍光相関分光装置１００’の構成を示す模式図である。変形例に係る蛍光相関分光装置１００’は、励起光フィルターとして、第１光ファイバー１７０内に形成された、励起光を狭スペクトル化するためのファイバーブラッググレーティング（ＦＢＧ）１７１を有し、蛍光フィルター１４０として、第３光ファイバー１９０内に形成された、励起光を低減するためのファイバーブラッググレーティング（ＦＢＧ）１９１を有する。ＦＢＧ１７１は、励起光の中心波長から外れた波長の光を反射させることで、励起光を狭スペクトル化する、狭帯域バンドパスフィルタまたはノッチフィルタである。ＦＢＧ１９１は、励起光の波長の光を反射させることで、検出器１５０に到達する励起光を低減させる。このように第１光ファイバー１７０内に励起光フィルター（ＦＢＧ１７１）を設け、第３光ファイバー１９０内に蛍光フィルター１４０（ＦＢＧ１９１）を設けることで、集光レンズ１３０を除く光学系のすべてを光ファイバーで構成することとなり、蛍光相関分光装置１００’をより小型化することが可能となる。ＦＢＧ１７１およびＦＢＧ１９１におけるグレーティング周期Λは、励起光の中心波長に応じて適宜設定される。以下の式（２）に示されるように、ＦＢＧ１７１またはＦＢＧ１９１により反射される光の波長（ブラッグ波長）λｂは、第１光ファイバー１７０または第３光ファイバー１９０のコアの有効屈折率ｎおよびグレーティング周期Λにより決まる。したがって、ＦＢＧ１９１については、光源１１０から出射される励起光の中心波長がブラッグ波長λｂと一致するように、グレーティング周期Λを設定すればよい。検出器１５０に到達する励起光は少ないほど好ましいことから、ＦＢＧ１９１による励起光の反射率は高いほど好ましい。なお、変形例に係る蛍光相関分光装置１００’は、ＦＢＧ１７１およびＦＢＧ１９１の２つのＦＢＧを有しているが、どちらか一方のＦＢＧのみを有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　検出器１５０は、対象物１０から放出され、第２光ファイバー１８０、光ファイバーカプラ１２０、第３光ファイバー１９０および蛍光フィルター１４０を介して到達した蛍光を検出する。検出器１５０の種類は、ＦＣＳにおいて必要な感度で蛍光を検出することができれば特に限定されない。検出器１５０の例には、アバランシェフォトダイオードおよび光電子増倍管が含まれる。本実施の形態では、検出器１５０は、アバランシェフォトダイオードである。
　相関器１６０は、検出器１５０により検出された蛍光強度から自己相関関数または相互相関関数を算出する。相関器１６０は、ハードウェア相関器であってもよいし、ソフトウェア相関器であってもよい。本実施の形態では、相関器１６０は、ハードウェア相関器である。
　第１光ファイバー１７０は、光源１１０から出射された励起光を光ファイバーカプラ１２０の第１ポート１２１に誘導する。第１光ファイバー１７０の種類は、励起光を光ファイバーカプラ１２０に適切に誘導することができれば特に限定されない。第１光ファイバー１７０は、マルチモード光ファイバーであってもよいし、シングルモード光ファイバーであってもよい。後述するように、測定領域を小さくして対象物１０の検出精度を高める観点からは、第２光ファイバー１８０は、シングルモード光ファイバーであることが好ましい。そして、第２光ファイバー１８０がシングルモード光ファイバーである場合は、効率的に光を伝搬する観点から、第１光ファイバー１７０もシングルモード光ファイバーであることが好ましい。本実施の形態では、第１光ファイバー１７０は、シングルモード光ファイバーである。
　第２光ファイバー１８０は、光ファイバーカプラ１２０の第４ポート１２４から出射された励起光を対象物１０に向けて出射させる。第２光ファイバー１８０から出射された励起光は、集光レンズ１３０により集光されて対象物１０に照射される。これにより、対象物１０から蛍光が放出される。対象物１０から放出された蛍光は、集光レンズ１３０により集光されて第２光ファイバー１８０の端面から第２光ファイバー１８０に入射する。第２光ファイバー１８０は、蛍光を光ファイバーカプラ１２０の第４ポート１２４に誘導する。測定領域を小さくして対象物１０の検出精度を高める観点からは、第２光ファイバー１７０は、シングルモード光ファイバーであることが好ましい。本実施の形態では、第２光ファイバー１８０は、シングルモード光ファイバーである。
　第３光ファイバー１９０は、光ファイバーカプラ１２０の第２ポート１２２から出射された蛍光を検出器１５０に誘導する。第３光ファイバー１９０の種類は、蛍光を検出器１５０に適切に誘導することができれば特に限定されない。第３光ファイバー１９０は、マルチモード光ファイバーであってもよいし、シングルモード光ファイバーであってもよい。蛍光をできるだけ多く検出器１５０に導く観点からは、第３光ファイバー１９０は、マルチモード光ファイバーであることが好ましい。本実施の形態では、第３光ファイバー１９０は、マルチモード光ファイバーである。
　なお、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、光ファイバーカプラ１２０の第３ポート１２３から出射される励起光は、利用されない。したがって、第３ポート１２３には、光ファイバーなどが接続されていない。第３ポート１２３での励起光の反射を防ぐ観点から、第３ポート１２３には、ライトトラップが接続されていてもよい。
　次に、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００の動作について説明する。まず、光源１１０から、対象物（蛍光分子）１０に応じた波長の励起光が出射される。励起光は、第１光ファイバー１７０に入射し、第１ポート１２１から光ファイバーカプラ１２０に入射する。励起光の大部分（例えば９９％）は第３ポート１２３から出射され、励起光のごく一部（例えば１％）が第４ポート１２４から出射される。第４ポート１２４から出射された励起光は、第２光ファイバー１８０内に入射し、第２光ファイバー１８０の対象物１０側の端部から対象物１０に向かって出射される。このとき、励起光は、集光レンズ１３０により集光され、微小な測定領域が形成される。測定領域内の対象物１０は、励起光を照射されるため、対象物（蛍光分子）１０の種類に応じた波長の蛍光を放出する。
　対象物１０から放出された蛍光は、集光レンズ１３０により集光され、第２光ファイバー１８０内に入射する。蛍光は、第４ポート１２４から光ファイバーカプラ１２０に入射する。蛍光の大部分（例えば９９％）は第２ポート１２２から出射され、蛍光のごく一部（例えば１％）が第１ポート１２１から出射される。第２ポート１２２から出射された蛍光は、第３光ファイバー１９０に入射し、蛍光フィルター１４０により励起光成分が除去され、検出器１５０により検出される。
　相関器１６０は、検出器１５０により検出された蛍光強度から自己相関関数または相互相関関数を算出する。この相関関数から、測定領域を通過する対象物（蛍光分子）１０の動き（例えば拡散速度）や分子数などの所望の情報を得ることができる。
　以上のように、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、光ファイバーカプラ１２０の分岐比について、励起光を第１ポート１２１から入射させたときの第３ポート１２３と第４ポート１２４との分岐比をＲ：１－Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）の範囲内とすることで、十分な量の励起光を対象物１０に照射しつつも、第２光ファイバー１８０内に入射した蛍光の大部分を検出器１５０に導くことを実現している。また、第２光ファイバー１８０の端部と対象物１０との間に集光レンズ１３０を設けることで、対象物１０が存在する領域に効率よく励起光を集光しつつ、対象物１０から放出された蛍光を効率よく第２光ファイバー１８０に入射させることを実現している。本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００は、これらの特徴を有しているため、特許文献１に記載の蛍光相関分光装置よりも蛍光の検出効率が優れている。
　また、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、第２光ファイバー１８０と対象物１０との間に配置されている集光レンズ１３０が励起光を集光するため、退色を防ぐために励起光の光量を低減させる必要がある。この点について、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、光ファイバーカプラ１２０が励起光の光量を低減させる機能も担っているため、別途ＮＤフィルターなどを用いることなく励起光の光量を適切に低減させることができる。特許文献１に記載の蛍光相関分光装置では、集光レンズを用いて励起光を集光しないため、なるべく多くの励起光を対象物に照射すべく、光ファイバーカプラの分岐比を１：１程度にしていると推察される。このように、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００は、励起光の光量を低減させる目的でも光ファイバーカプラ１２０を使用している点でも、特許文献１に記載の蛍光相関分光装置とは異なるものである。
　また、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００は、光学系が光ファイバーにより構成されているため、特許文献１に記載の蛍光相関分光装置と同様に小型化されうる。特に、蛍光フィルター１４０として第３光ファイバー１９０内に形成されたＦＢＧ１９１を有する蛍光相関分光装置１００’（図３参照）は、特許文献１に記載の蛍光相関分光装置よりもより小型化されうる。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
　［実施例１］
　実施例１では、図１に示される蛍光相関分光装置１００を用いて、超純水中に分散させた蛍光ビーズを測定した結果を示す。集光レンズ１３０としては、第２光ファイバー１８０の端部に接合されたＧＲＩＮレンズ１３０ｂを使用した（図２Ｂ参照）。
　光源１１０および第１光ファイバー１７０としては、中心波長４８８ｎｍのレーザー光を出射するシングルモードファイバー出力レーザーダイオード（LP488-SF20、Thorlabs社）を使用した。光ファイバーカプラ１２０としては、波長４８８ｎｍの光についての分岐比が０.９９：０.０１の２×２光ファイバーカプラ（FC488-99B-FC-1、Thorlabs社）を使用した。蛍光フィルター１４０としては、中心波長が５４２ｎｍのシングルバンドパスフィルター（FF01-542/27-25、Semrock社）を使用した。検出器１５０としては、アバランシェフォトダイオード（SPCM-CD 3017、Perkin Elmer社）を使用した。相関器１６０としては、ハードウェア相関器（Flex02-01D、Correlator.com社）を使用した。第２光ファイバー１８０および集光レンズ１３０としては、ＧＲＩＮレンズが接着されたシングルモード光ファイバー（GT-SMFP-100-SP4.5-cus-50-NC, S/N# CRS 2946-3-SP355-01、GRINTECH社）を使用した。集光点における励起光のパワーは１５.３μＷとなった。第３光ファイバー１９０としては、マルチモード光ファイバー（M74L02、Thorlabs社）を使用した。また、光ファイバーカプラ１２０の第３ポート１２３には、ライトトラップ（ＦＴＦＣ１、Thorlabs社）を接続した。
　測定対象の対象物１０としては、直径４０ｎｍの蛍光ビーズ（F8795、Thermo Fisher Scientific社）、直径１００ｎｍの蛍光ビーズ（F8803、Thermo Fisher Scientific社）または直径２００ｎｍの蛍光ビーズ（F8811、Thermo Fisher Scientific社）を使用した。これらの蛍光ビーズの最大励起波長は５０５ｎｍであり、最大蛍光波長は５１５ｎｍである。購入した蛍光ビーズの分散液を超純水で希釈したものを試料とした。
　図４は、ビーズサイズと自己相関関数との関係を示すグラフである。横軸は時間τ（ミリ秒）で、縦軸は振幅が１になるように規格化した自己相関関数である。このグラフから、ビーズサイズが大きくなると、自己相関関数の半値幅が大きくなることがわかる。
　表１に、各試料の自己相関関数から求められる拡散時間（ＤＴ）および粒子数（ＮＰ）を示す。拡散時間（ＤＴ）は、測定領域中にビーズが滞在する平均時間であり、自己相関関数の半値幅に対応する。拡散時間（ＤＴ）は、ビーズの直径に比例する。粒子数（ＮＰ）は、測定領域中に存在するビーズの平均個数であり、自己相関関数の振幅の逆数に対応する。粒子数（ＮＰ）は、ビーズの濃度に比例する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図５は、ビーズ直径と拡散時間（ＤＴ）との関係を示すグラフである。このグラフから、拡散時間（ＤＴ）がビーズ直径に比例すること、すなわち蛍光相関分光装置１００がビーズサイズを計測できることがわかる。
　図６は、ビーズ濃度と自己相関関数との関係を示すグラフである。横軸は時間τ（ミリ秒）で、縦軸は自己相関関数である。この実験では、直径１００ｎｍの蛍光ビーズを使用した。このグラフから、ビーズ濃度が下がると、自己相関関数の振幅が大きくなることがわかる。
　表２に、各濃度の試料の自己相関関数から求められる拡散時間（ＤＴ）および粒子数（ＮＰ）を示す。前述のとおり、粒子数（ＮＰ）は、ビーズの濃度に比例する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図７は、ビーズ濃度と粒子数（ＮＰ）との関係を示すグラフである。このグラフから、粒子数（ＮＰ）がビーズ濃度に比例すること、すなわち蛍光相関分光装置１００がビーズ濃度を計測できることがわかる。
　［実施例２］
　実施例２でも、図１に示される蛍光相関分光装置１００を用いて、超純水中に分散させた蛍光ビーズを測定した結果を示す。集光レンズ１３０としては、コンデンサーレンズを使用した。
　測定対象の対象物１０としては、直径１００ｎｍの蛍光ビーズ（F8803、Thermo Fisher Scientific社）または直径２００ｎｍの蛍光ビーズ（F8811、Thermo Fisher Scientific社）を使用した。これらの蛍光ビーズの最大励起波長は５０５ｎｍであり、最大蛍光波長は５１５ｎｍである。購入した蛍光ビーズの分散液を超純水で希釈したものを試料とした。
　光源１１０、第１光ファイバー１７０、光ファイバーカプラ１２０、第３光ファイバー１９０、蛍光フィルター１４０、検出器１５０および相関器１６０は、実施例１と同じものを使用した。第２光ファイバー１８０としては、シングルモード光ファイバー（460HP、Thorlabs社）を使用した。集光レンズ１３０としては、非球面コンデンサーレンズ（#35-044、Edmund Optics社）を使用した。直径１００ｎｍの蛍光ビーズを対象物１０としたときの集光点における励起光のパワーは３２.０μＷとなった。また、直径２００ｎｍの蛍光ビーズを対象物１０としたときの集光点における励起光のパワーは２３.３μＷとなった。光ファイバーカプラ１２０の第３ポート１２３には、ライトトラップ（ＦＴＦＣ１、Thorlabs社）を接続した。
　図８Ａは、直径１００ｎｍのビーズの８００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフであり、図８Ｂは、直径１００ｎｍのビーズの１６００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフである。図９Ａは、直径２００ｎｍのビーズの８００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフであり、図９Ｂは、直径２００ｎｍの１６００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフである。横軸は時間τ（ミリ秒）で、縦軸は自己相関関数である。これらのグラフに示されるように、自己相関関数の振幅は、ビーズの分散液の希釈倍率が増大することによって大きくなった。また、自己相関関数の半値幅は、ビーズの直径が大きくなることによって大きくなった。これらの結果から、集光レンズ１３０としてコンデンサーレンズを使用した場合であっても、蛍光相関分光装置１００がビーズ濃度およびビーズサイズを計測できることがわかる。
　本出願は、２０１７年６月１９日出願の特願２０１７－１１９５３２に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明に係る蛍光相関分光装置は、小型であり、かつ測定領域の位置を自由に設定することができるため、動物実験や医療などを含む様々な分野において利用されうる。
　１０　対象物（蛍光分子）
　１１　容器
　１００、１００’　蛍光相関分光装置
　１１０　光源
　１２０　光ファイバーカプラ
　１２１　第１ポート
　１２２　第２ポート
　１２３　第３ポート
　１２４　第４ポート
　１３０、１３０ａ、１３０ｄ　集光レンズ
　１３０ｂ　集光レンズ（ＧＲＩＮレンズ）
　１３０ｃ　集光レンズ（対物レンズ）
　１３０ｅ　集光レンズ（コリメートレンズ）
　１４０　蛍光フィルター
　１５０　検出器
　１６０　相関器
　１７０　第１光ファイバー
　１７１　ファイバーブラッググレーティング
　１８０　第２光ファイバー
　１９０　第３光ファイバー
　１９１　ファイバーブラッググレーティング

Claims (11)

  1. 　励起光を出射するための光源と、
    　一方の側に設けられた第１ポートおよび第２ポートと、他方の側に設けられた第３ポートおよび第４ポートとを含む光ファイバーカプラと、
    　蛍光を検出するための検出器と、
    　前記光源から出射された励起光を前記第１ポートに誘導するための第１光ファイバーと、
    　前記第４ポートから出射された励起光を対象物に向けて出射させるとともに、前記対象物から放出された蛍光を前記第４ポートに誘導するための第２光ファイバーと、
    　前記第２ポートから出射された蛍光を前記検出器に誘導するための第３光ファイバーと、
    　前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部と前記対象物との間に配置された集光レンズと、
    　を有し、
    　励起光を前記第１ポートから入射させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、Ｒ：１－Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）の範囲内である、
    　蛍光相関分光装置。
  2. 　励起光を前記第１ポートから入力させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、０.９０：０.１０～０.９９：０.０１の範囲内である、請求項１に記載の蛍光相関分光装置。
  3. 　励起光を前記第１ポートから入力させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、０.９５：０.１０～０.９９：０.０１の範囲内である、請求項１に記載の蛍光相関分光装置。
  4. 　前記集光レンズは、前記第２光ファイバーと一体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
  5. 　前記集光レンズは、前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部に接合されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
  6. 　前記集光レンズは、前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部から離間している、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
  7. 　前記集光レンズは、前記対象物を収容する容器と一体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
  8. 　前記第１光ファイバーおよび前記第２光ファイバーは、シングルモード光ファイバーであり、
    　前記第３光ファイバーは、マルチモード光ファイバーである、
    　請求項１～７のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
  9. 　前記第３光ファイバーは、励起光を低減するためのファイバーブラッググレーティングを有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
  10. 　前記第１光ファイバーは、励起光を狭スペクトル化するためのファイバーブラッググレーティングを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
  11. 　前記検出器により検出された蛍光強度から自己相関関数または相互相関関数を算出する相関器をさらに有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
PCT/JP2018/023321 2017-06-19 2018-06-19 蛍光相関分光装置 WO2018235822A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019525631A JP6667868B2 (ja) 2017-06-19 2018-06-19 蛍光相関分光装置

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-119532 2017-06-19
JP2017119532 2017-06-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018235822A1 true WO2018235822A1 (ja) 2018-12-27

Family

ID=64735673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/023321 WO2018235822A1 (ja) 2017-06-19 2018-06-19 蛍光相関分光装置

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6667868B2 (ja)
WO (1) WO2018235822A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0538551U (ja) * 1991-03-27 1993-05-25 安藤電気株式会社 高出力パルス光源を用いる光パルス試験器
JPH0868694A (ja) * 1994-08-18 1996-03-12 Basf Ag 蛍光相関分光学的分析方法およびこれを実施する装置
US20040061072A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Swinburne University Of Technology Apparatus
JP2007132792A (ja) * 2005-11-10 2007-05-31 Nippon Sheet Glass Co Ltd 光計測装置と試料との光結合系
JP2009287999A (ja) * 2008-05-28 2009-12-10 Nippon Sheet Glass Co Ltd 蛍光検出システム及びこれを利用した濃度測定方法
JP2016017876A (ja) * 2014-07-09 2016-02-01 日本板硝子株式会社 蛍光検出用光学装置

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0538551U (ja) * 1991-03-27 1993-05-25 安藤電気株式会社 高出力パルス光源を用いる光パルス試験器
JPH0868694A (ja) * 1994-08-18 1996-03-12 Basf Ag 蛍光相関分光学的分析方法およびこれを実施する装置
US20040061072A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Swinburne University Of Technology Apparatus
JP2007132792A (ja) * 2005-11-10 2007-05-31 Nippon Sheet Glass Co Ltd 光計測装置と試料との光結合系
JP2009287999A (ja) * 2008-05-28 2009-12-10 Nippon Sheet Glass Co Ltd 蛍光検出システム及びこれを利用した濃度測定方法
JP2016017876A (ja) * 2014-07-09 2016-02-01 日本板硝子株式会社 蛍光検出用光学装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NISHIZAWA, KOICHI: "Optical components : Lasers and optical fibers", JOURNAL OF THE SOCIETY OF INSTRUMENT AND CONTROL ENGINEERS, vol. 26, no. 4, April 1987 (1987-04-01), pages 18 - 24, XP055564671 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018235822A1 (ja) 2020-03-19
JP6667868B2 (ja) 2020-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7284114B2 (ja) 共焦点変位計
US8405048B2 (en) Fluorescence detection device and fluorescence detection method
CN108351304A (zh) 水质分析仪
JP5297887B2 (ja) 蛍光分析用光分波検出器及び蛍光検出システム
EP1637871B1 (en) Measuring apparatus including a light-receiving unit
KR20190115095A (ko) 광 검출 시스템 및 이의 사용 방법
JP6937697B2 (ja) 光検出システム及びその使用方法
JP2007132792A (ja) 光計測装置と試料との光結合系
KR20070102676A (ko) 에버네센트 카테터 시스템
JP5828440B1 (ja) 微小粒子測定装置
US20180306697A1 (en) Fine particle detection device
US8525988B2 (en) Miniaturized confocal spectrometer
CN106198951B (zh) 一种生物传感标定方法、标定系统及疾病检测系统
CN111771117B (zh) 粒子测定装置及粒子测定方法
WO2018235822A1 (ja) 蛍光相関分光装置
CA3074949C (en) Optical flow cytometer for epi-fluorescence measurement
US9134244B2 (en) Wiregrid monitor device
JPH0486546A (ja) 検体検査装置
JP7205190B2 (ja) 光学測定器
RU2320980C1 (ru) Способ спектрального анализа и определения концентрации компонент мутного вещества и устройство для его реализации
JPH03214038A (ja) 空気中に散布されたエアロゾルと粉麈などの測定装置
RU2460988C1 (ru) Способ измерения распределения частиц по размерам в расширенном диапазоне концентраций и устройство для реализации способа (варианты)
WO2013136891A1 (ja) 光分析装置、光分析用レンズおよび光分析用容器
JP6673336B2 (ja) 検出装置
KR101403065B1 (ko) 레이저 유발 형광을 이용한 모세관 전기영동을 위한 다채널 형광 검출기

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18820911

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019525631

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18820911

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1