WO2018212043A1 - 流路デバイスおよび微粒子濃縮方法 - Google Patents

流路デバイスおよび微粒子濃縮方法 Download PDF

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真楠 筒井
一道 横田
彰秀 有馬
正輝 谷口
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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Definitions

  • the present invention relates to a flow path device and a fine particle concentration method.
  • a fine particle concentration method using a flow channel device having a basic structure of a micro flow channel has been attracting attention.
  • a dielectrophoresis method combining a micro flow channel and a micro electrode is a typical fine particle manipulation technique in a liquid.
  • Non-Patent Document 1 reports that bacteria were separated from whole blood by dielectrophoresis.
  • Non-Patent Document 2 reports that living bacteria and dead bacteria were separated by dielectrophoresis.
  • Japanese Patent No. 5870323 (published on February 24, 2016) Japanese Patent Publication “JP 2004-354364 A (published on December 16, 2004)” Japanese Patent Publication “JP 2012-223683 A (published on November 15, 2012)”
  • fine particles may be adsorbed on the electrode surface.
  • the spatial effective electric field range is limited.
  • the migration parameters must be set according to the nature of the fine particles and / or the difference in dielectric ratio between the fine particles and the liquid.
  • One aspect of the present invention has been made in view of the above-described conventional problems, and an object thereof is to realize a flow channel device and a fine particle concentration method for concentrating fine particles in a liquid without using electrostatic interaction.
  • the present inventors have captured and collected fine particles only by hydrodynamic flow without using electrostatic interaction by a flow channel device having a specific flow channel structure.
  • the inventors have found that it can be concentrated and have completed the present invention. That is, the present invention includes the following configurations.
  • a main channel for flowing a liquid containing fine particles for flowing a liquid containing fine particles, a chamber for concentrating the fine particles provided at one end of the main channel, and a side surface of the main channel. And a side channel for discharging, wherein at least one of the height and width of the side channel is smaller than the particle size of the fine particles.
  • a liquid discharge path having a width greater than the width of the side channel and a height greater than the height of the side channel is connected to the side of the side channel opposite to the connection with the main channel.
  • ⁇ 3> The flow path device according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein a liquid stopper is provided between the main flow path and the chamber.
  • ⁇ 4> The flow path device according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein a plurality of the side flow paths are provided.
  • An introduction step of introducing a liquid containing fine particles into the main channel, and discharging the liquid to a side channel connected to a side surface of the main channel, and a connection portion between the side channel and the main channel A capturing step for capturing the fine particles, a releasing step for discharging the captured fine particles to the main flow channel, and a concentration step for concentrating the discharged fine particles in a chamber provided at one end of the main flow channel.
  • a liquid discharge path having a width greater than the width of the side channel and a height greater than the height of the side channel is connected to the side of the side channel opposite to the connection with the main channel.
  • ⁇ 8> The method for concentrating fine particles according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 7>, wherein a plurality of the side channels are provided.
  • a to B representing a numerical range means “A or more and B or less”.
  • members having the same function are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • a flow channel device includes a main flow channel for flowing a liquid containing fine particles, a chamber for concentrating fine particles provided at one end of the main flow channel, and a side surface of the main flow channel.
  • a side channel for discharging excess liquid, and at least one of the height and width of the side channel is smaller than the particle size of the fine particles.
  • the fine particles riding on the flow toward the side flow channel can be captured at the entrance of the side flow channel. Further, since excess liquid can be discharged to the side channel, the fine particles can be concentrated in a chamber connected to the main channel. Therefore, the flow channel device can concentrate the fine particles in the liquid without depending on the electrostatic interaction.
  • the flow channel device is different from the techniques described in Patent Documents 1 to 3 in that excess liquid can be discharged from the side flow channel and fine particles can be concentrated.
  • excess liquid can be discharged from the side flow channel and fine particles can be concentrated.
  • the automatic cancer cell separation device disclosed in Patent Document 1 provides a part having a flow path height lower than the representative diameter of cancer cells, thereby allowing cancer cells and cells other than cancer cells to mutually pass. It is introduced into a different flow path.
  • the fine particle manipulation unit disclosed in Patent Document 2 operates a flow direction of fine particles flowing in a flow path by providing a permeation restriction region for fine particles having a certain size or larger.
  • the fine particle separation device disclosed in Patent Document 3 introduces fine particles that can pass through a filter section and fine particles that cannot pass through to different outlets.
  • the devices described in the above documents introduce fine particles separated according to size into different flow paths, they separate and discharge excess liquid from liquid containing fine particles (that is, concentrate fine particles). ).
  • the flow path device according to an embodiment of the present invention includes the side flow path, so that the fine particles can be separated according to size, and the excess liquid can be discharged to concentrate the fine particles. it can.
  • excess liquid is, for example, a dispersion medium in which fine particles are dispersed.
  • One “excess liquid” may include fine particles that are not to be concentrated (fine particles having a smaller particle diameter than fine particles to be concentrated).
  • the flow channel device according to an embodiment of the present invention can discharge excess liquid through the side flow channel and store the concentrated fine particles in the chamber.
  • the channel device is intended to be a device having a channel structure for flowing a liquid.
  • This liquid flow is preferably by capillary flow.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a flow channel device 1 according to an embodiment of the present invention.
  • the flow channel device 1 includes a main flow channel 11, a side flow channel 12, a liquid discharge channel 13, a liquid introduction unit 14, a chamber 15, and a liquid stopper (water repellent flow channel 16).
  • connection such as a flow path is intended to communicate so that a liquid can circulate.
  • the main channel 11 is a channel through which a liquid containing fine particles flows.
  • the length, width, and height of the main channel 11 are appropriately set according to the particle size of the fine particles to be circulated through the channel device 1 and the amount of liquid, the number of side channels 12 connected to the main channel 11, and the like. sell.
  • the main channel 11 may have a length of 1 to 20 mm, a width of 100 to 500 ⁇ m, and a height of 10 to 200 ⁇ m.
  • the length of the main channel represents the length along the direction in which the liquid flowing through the main channel flows.
  • the shape of the main flow path 11 is not limited to a linear shape as shown in FIG.
  • the main flow path 11 may be a meandering flow path.
  • the shape of the main flow path 11 is preferably meandering.
  • the shape of the main channel 11 is preferably linear.
  • vertical to the flow direction of the main flow path 11 is not specifically limited, A rectangle may be sufficient and a circle may be sufficient.
  • a liquid introduction part 14 may be provided at one end of the main flow path 11.
  • the liquid introduction part 14 is a part for introducing the liquid containing the fine particles in order to distribute the liquid containing the fine particles through the main flow path 11.
  • the liquid introduction part 14 may have a configuration in which a hole is simply formed at one end of the main flow path 11 or may have a configuration like a liquid reservoir (reservoir) shown in FIG.
  • the volume of the liquid introduction part 14 can be appropriately set according to the amount of liquid containing fine particles to be introduced.
  • the surface of the main flow channel 11 (the surface in contact with the liquid) is preferably hydrophilic.
  • the surface of the main flow path 11 may be formed with a silicon oxide (SiO x ) film, and may have a functional group such as a hydroxyl group, a carbonyl group, an aldehyde group, or a carboxyl group.
  • the surface of the main channel 11 may be subjected to a surface treatment by an oxygen plasma method, a vacuum ultraviolet light treatment method, or a fluorine gas treatment method.
  • the surface of the main channel 11 is hydrophilic, when the introduced liquid is an aqueous dispersion, the aqueous dispersion can easily flow through the main channel 11 due to the effect of capillary flow. For this reason, the time required for concentration of fine particles is shortened.
  • a side channel 12 is connected to the side surface of the main channel 11.
  • the connection part of the main flow path 11 and the side flow path 12 is called the 1st connection part 12a. That is, the first connecting portion 12a can be said to be an inlet of a flow from the main flow path 11 to the side flow path 12.
  • the side channel 12 is a channel that guides the liquid flowing through the main channel 11 to the outside of the main channel 11. Excess liquid can be discharged by the side flow path 12. Further, at least one of the height and the width of the side channel 12 is smaller than the particle size of the fine particles 2. Therefore, the fine particles 2 riding on the flow toward the side flow path 12 can be captured by the first connection portion 12a.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a structure in the vicinity of the side channel 12 of the channel device 1 according to an embodiment of the present invention.
  • a liquid flow A ⁇ b> 1 in the main flow path 11 and a liquid flow A ⁇ b> 2 in the side flow path 12 are generated.
  • the direction of arrows A1 and A2 represents the direction in which the liquid flows.
  • the fine particles 2 that have moved on the flow A1 approach the vicinity of the side flow path 12 (the first connecting portion 12a)
  • the movement direction changes to the side flow path 12 on the flow A2.
  • the height h 12 of the side flow path 12 in the first connection part 12a is smaller than the particle diameter of the fine particles 2 to be concentrated.
  • the fine particles 2 having a particle diameter larger than the height h 12 of the side flow path 12 cannot pass through the first connection portion 12 a and cannot enter the side flow path 12. Therefore, the fine particles 2 stop moving (captured) at the first connecting portion 12a.
  • the fine particles 2 can be concentrated in the chamber 15 provided at the end of the main flow path 11.
  • FIG. 2 illustrates a case where the height of the side channel 12 is smaller than the particle size of the fine particles 2, but the width of the side channel 12 is smaller than the particle size of the fine particles 2 as described above. Also good. In addition, when the height of the side channel 12 is smaller than the particle size of the fine particles 2, the side channel 12 can be processed more easily than when the width of the side channel 12 is smaller than the particle size of the fine particles 2. There is.
  • the main channel 11 has such a size that the fine particles 2 can flow.
  • the height h 12 of the side channels 12 of the first connecting portion 12a is lower than the height h 11 of the main flow path 11 in the first connecting portion 12a. That is, a step is provided between the main channel 11 and the side channel 12.
  • the length, width, height, and number of the side flow paths 12 can be appropriately set according to the amount of liquid flowing through the flow path device 1, the number of fine particles contained in the liquid, and the like.
  • the length of the side channel represents the length along the direction in which the liquid flowing through the side channel flows. It is preferable that the width and height of the side flow path 12 are narrow so that the fine particles to be captured do not aggregate. For example, it is preferable that one fine particle is captured in one side channel 12. Also, in general, the shorter the length of the side channel 12 and the greater the number, the shorter the time required for discharging the liquid, which is preferable.
  • the length of the side channel 12 may be 1 to 100 ⁇ m or 1 to 50 ⁇ m.
  • the width and / or height of the side channel 12 may be 0.05 to 10 ⁇ m, 0.05 to 5 ⁇ m, 0.05 to 0.5 ⁇ m, 0.05 It may be up to 0.15 ⁇ m.
  • the number of the side flow paths 12 may be one or a plurality, for example, 1 to 1000, 100 to 800, 300 to 700. Also good.
  • the structure in which the width or height of the side flow path 12 is smaller than the particle diameter of the fine particles 2 is sufficient if it is satisfied in the first connection portion 12a. That is, the width or height of the side flow path 12 in a portion other than the first connection portion 12 a may be equal to or larger than the particle diameter of the fine particles 2.
  • a plurality of side flow paths 12 having different heights may be installed in the flow path device 1. According to such a configuration, fine particles having different particle diameters can be captured by one flow path device. Moreover, you may connect the several flow path device 1 from which the height of the side flow path 12 differs. According to such a configuration, fine particles having different particle diameters can be separated and concentrated in each flow channel device 1 from the same liquid sample (for example, red blood cells, white blood cells, and platelets are separated and concentrated from the blood). can do).
  • the fine particles flowing through the main flow channel 11 as a design that allows some of the fine particles to pass through the side flow channel 12, the fine particles may be separated according to the particle size.
  • fine particles that cannot pass through the side channel 12 remain in the main channel 11, whereas particles that can pass through the side channel 12 flow out of the main channel 11. In this way, only fine particles that cannot pass through the side channel 12 can be separated and concentrated.
  • the particles that can pass through the side channel 12 collect the liquid flowing out from the side channel 12, and again use the channel device 1 (the one in which at least one of the width and height of the first connecting portion 12a is changed). It can be recovered and concentrated.
  • the flow channel device 1 may have a configuration in which one row of a plurality of side flow channels 12 is provided on the side surface of the main flow channel 11 or a configuration in which two or more rows are provided.
  • FIG. 1 illustrates a configuration in which two rows including a plurality of side flow paths 12 are provided.
  • the surface of the side channel 12 (the surface in contact with the liquid) is preferably hydrophilic.
  • the liquid discharge path 13 may be connected to the side of the side flow path 12 opposite to the connection section (first connection section 12a) with the main flow path 11.
  • the connection part between the side flow path 12 and the liquid discharge path 13 is referred to as a second connection part 12b.
  • the liquid discharge path 13 is a flow path for discharging the liquid that flows from the main flow path 11 to the side flow path 12.
  • the shape of the liquid discharge path is not particularly limited.
  • the liquid discharge path 13 only needs to fulfill the function of discharging the liquid that has flowed from the main flow path 11 into the side flow path 12, and thus may not be formed as a flow path but may be a liquid reservoir. Further, in order to enhance the function of discharging the liquid from the main flow path 11, a tube or the like for discharging the liquid may be connected from the liquid discharge path 13 to the outside of the range shown in FIG.
  • the length, width, and height of the liquid discharge path 13 can be set as appropriate according to the amount of liquid flowing through the flow path device 1.
  • the length of the liquid discharge path represents the length along the direction in which the liquid flowing through the liquid discharge path flows.
  • the length of the liquid discharge path 13 may be 1 to 20 mm
  • the width may be 50 to 200 ⁇ m
  • the height may be 10 to 200 ⁇ m.
  • the liquid discharge path 13 has a width and a height at which liquid can be discharged by pressure, and preferably has a width greater than the width of the side flow path 12 and a height greater than the height of the side flow path 12.
  • fine particles particles having a size that can pass through the side flow path 12
  • the height of the liquid discharge path 13 and the height of the side flow path 12 are intended to be the height of the second connection portion 12b.
  • a configuration in which a plurality of side flow paths 12 are connected to one liquid discharge path 13 may be employed.
  • a configuration in which a plurality of side flow paths 12 are connected to one liquid discharge path 13 may be employed.
  • two or more sets of such configurations may be provided in the flow channel device 1.
  • the surface of the liquid discharge channel 13 (the surface in contact with the liquid) is preferably hydrophilic.
  • a chamber 15 for concentrating fine particles is provided at one end of the main flow path 11.
  • the chamber 15 is provided at the end of the main channel 11 opposite to the side where the liquid is introduced (liquid introducing portion 14). That is, the chamber 15 is provided downstream of the flow of the main flow path 11.
  • the chamber 15 is a portion into which fine particles to be concentrated are sent.
  • the volume of the chamber 15 can be appropriately set according to the particle size and / or number of the captured fine particles.
  • the fine particles 2 released from the first connection portion 12a reach the chamber 15 through the main flow path 11. As described above, the excess liquid is discharged to the side flow path 12, so that the concentration of the fine particles is increased in the chamber 15 as compared with the time of introduction.
  • the surface of the chamber 15 (surface in contact with the liquid) is preferably hydrophilic.
  • Liquid stop part The main flow path 11 and the chamber 15 are preferably connected via a liquid stopper.
  • the liquid stopper is a part having a function of temporarily preventing the liquid from flowing between the main flow path 11 and the chamber 15. By providing the liquid stopper, the liquid can be prevented from flowing into the chamber 15 while the liquid is discharged and the fine particles are captured.
  • the liquid stopper is the water-repellent channel 16. Since the surface of the water repellent flow path 16 is water repellent, when the liquid introduced into the main flow path 11 is an aqueous dispersion, the water repellent flow path 16 cannot normally be overcome. It is preferable that the water repellent flow channel 16 has a water repellent surface (surface in contact with the liquid) and a flow channel design that allows the liquid to get over when a pressure difference is generated.
  • the surface of the water repellent channel 16 may be formed with, for example, a silicon carbide (SiC X ) film, may have a functional group such as a methyl group, or may be formed with a fluorine compound. Good (for example, introducing a trifluoromethyl group on the surface).
  • the hydrophilic channel can be used as a liquid stopper.
  • the surfaces of the main flow path 11, the side flow path 12, the liquid discharge path 13, and the chamber 15 are nonpolarity. It is preferable to make the surface in contact with the dispersion liquid hydrophobic. In order to make these surfaces hydrophobic, for example, a silicon carbide (SiC X ) film is formed, a functional group such as a methyl group is introduced, or a surface is formed with a fluorine compound (for example, a trivalent surface is formed on the surface). A fluoromethyl group is introduced).
  • the liquid stopper is a mechanism for temporarily closing the main flow path 11.
  • An example of such a mechanism is a diaphragm type microvalve driven by air pressure.
  • a liquid pressure difference is generated so that the liquid introduction side (liquid introduction part 14 side) in the main flow path 11 becomes high pressure, or the main flow path 11 11 may be released.
  • the flow channel device 1 may have a configuration in which a pressure difference between the liquids is generated in the main flow channel 11 so that the liquid introduction side becomes a high pressure (that is, a configuration in which a positive pressure is generated).
  • a fluid pressure control device may be connected to the side of the main channel 11 where the liquid is introduced (liquid introduction unit 14).
  • the following advantages are obtained by generating a pressure difference of the liquid so that the liquid introduction side becomes a high pressure. That is, in a state where the liquid is discharged to the side flow path 12 and the fine particles are captured by the first connection portion 12a, the captured fine particles 2 are released by flowing an additional liquid by applying a positive pressure. And can be moved to the chamber 15. Further, by applying a positive pressure, the fine particles 2 can be fed into the chamber 15 over the liquid stopper (water repellent flow path 16 or the like).
  • the flow channel device 1 may have a configuration that causes a pressure difference of the liquid between the first connection portion 12a and the second connection portion 12b of the side flow channel 12.
  • a configuration may be, for example, a configuration that causes a liquid pressure difference between the main channel 11 and the side channel 12.
  • a configuration in which a fluid pressure control device is connected to the main flow path 11, the side flow path 12 and / or the liquid discharge path 13 can be given.
  • the following advantages are produced.
  • the fluid pressure at the first connection portion 12a is higher than the fluid pressure at the second connection portion 12b (when the first connection portion 12a side is positive or the second connection portion 12b side is negative pressure)
  • the flow rate of the liquid flowing through the side flow path 12 toward the liquid discharge path 13 increases, and the time required to discharge the liquid can be shortened.
  • the fluid pressure in the first connection portion 12a is lower than the fluid pressure in the second connection portion 12b, the liquid flows backward from the liquid discharge passage 13 to the side passage 12, so that the first connection portion 12a The trapped fine particles can be released into the main flow path 11.
  • various sensors may be connected to the flow channel device 1.
  • the sensor can be connected to the chamber 15 or the like.
  • the concentration target may be a liquid containing fine particles, and the particle size, concentration and type of fine particles, the type of dispersion medium, and the like are not particularly limited.
  • a liquid containing the fine particles is also referred to as a dispersion.
  • the particle diameter of the fine particles is a value determined by a known method for calculating the particle diameter such as a major axis diameter, a minor axis diameter, a constant direction diameter, an equivalent diameter, an effective diameter, and the like. You can choose.
  • the particle diameter of the fine particles may be 100 ⁇ m or less.
  • the concentration of the fine particles can be measured by a measuring method such as an electrical detection band method.
  • the concentration of the fine particles may be, for example, 10 10 particles / mL or less.
  • the fine particles may be inorganic fine particles or organic fine particles.
  • the dispersion medium may be water or an organic dispersion medium. From the viewpoint of easy handling, the dispersion medium is preferably water.
  • the liquid containing fine particles may be derived from a living body such as blood, saliva, runny nose or urine.
  • a living body such as blood, saliva, runny nose or urine.
  • red blood cells, white blood cells, platelets, pollen, bacteria, viruses, and other cells can be regarded as fine particles.
  • the fine particle concentration method includes an introduction step of introducing a liquid containing fine particles into the main flow path, and discharging the liquid to a side flow path connected to a side surface of the main flow path.
  • the fine particle concentration method may be performed using the flow channel device according to the embodiment of the present invention described above.
  • the above-mentioned fine particle concentration method can concentrate a very small amount of fine particles contained in a liquid to a high concentration. Therefore, for example, when a virus is selected as the microparticle, the virus contained in the sample collected from the subject can be concentrated. For this reason, the detection of the said virus can be made easy and it is useful also for the early diagnosis of an infectious disease.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an outline of a fine particle concentration method according to an embodiment of the present invention.
  • the fine particle concentration method includes an introducing step of introducing a liquid containing fine particles into the main channel.
  • the liquid containing the fine particles 2 is introduced into the liquid introduction unit 14.
  • the fine particles 2 flow through the main channel 11 together with the liquid.
  • the fine particle concentration method includes a capturing step of discharging the liquid to a side flow channel connected to a side surface of the main flow channel and capturing the fine particles at a connection portion between the side flow channel and the main flow channel.
  • the fine particles 2 riding on the flow from which the liquid is discharged toward the side flow path 12 are captured at the first connecting portion 12a as shown in FIG. This is because the particle diameter of the fine particles 2 is larger than at least one of the height and the width of the side flow path 12 in the first connection portion 12a.
  • the pressure in the first connection portion 12a is higher than the pressure in the second connection portion 12b, the flow rate of the liquid flowing through the side flow path 12 toward the liquid discharge path 13 increases, and the liquid is discharged. The time required can be reduced. In the capturing step, it is preferable that all the liquid is discharged to the side channel 12.
  • the fine particle concentration method includes a release step of releasing the captured fine particles into the main channel.
  • the fine particles 2 captured by the first connecting portion 12a are discharged toward the main channel 11.
  • Examples of the method for releasing the fine particles 2 include the following: (1) Pressure that is applied to the side flow path 12 to promote the discharge of the liquid and at which the first connection portion 12a side has a high pressure (2) Apply pressure to the side flow path 12 so that the fluid pressure at the first connection portion 12a is lower than the fluid pressure at the second connection portion 12b; (3) the main flow path 11 And distribute additional liquid.
  • the fine particle concentration method includes a concentration step of concentrating the discharged fine particles in a chamber provided at one end of the main flow path.
  • the concentration step as shown in FIG. 3 (d), the fine particles 2 that have been discharged to the main flow path 11 are added to a small amount of liquid (for example, liquid that has flowed back from the side flow path 12 or added to the main flow path 11.
  • the liquid is moved to the chamber 15.
  • the fine particles 2 that have moved to the chamber 15 are in a concentrated state.
  • “concentrating fine particles” is intended to increase the number of fine particles contained in the liquid per unit volume as compared with the time of introducing the liquid.
  • the liquid containing fine particles can be concentrated usually 100 times or more, preferably 500 times or more, more preferably 1000 times or more.
  • a liquid stopper water repellent flow path 16 or the like
  • a liquid pressure difference is generated so that the liquid introduction side in the main flow path 11 has a high pressure.
  • the concentration step can be performed at an arbitrary timing.
  • the flow channel device may be a member having a micro flow channel according to a conventional method, and optionally connected to a fluid pressure control device, various sensors, or the like.
  • the manufacturing method of the flow channel device can be appropriately selected according to the material of the flow channel device.
  • the material of the flow path device may be a silicone resin such as polydimethylsiloxane, an olefin resin such as a polymethyl methacrylate resin, or a cyclic olefin copolymer, or glass.
  • the manufacturing method of the flow channel device may be based on soft lithography, nanoimprint, or thin film lamination, and is not particularly limited. Below, the manufacturing method by the soft lithography which used the silicone resin as an example is demonstrated based on FIG.
  • a flow path template is prepared as follows.
  • a photoresist is applied on a substrate 21 made of an appropriate material (silicon or the like) to form a resist film.
  • a flow path pattern is formed by exposure.
  • the pattern 23 corresponding to the main flow path may be formed as shown in FIG. 4B.
  • the step existing in the first connection portion can be produced by changing the thickness of the resist film.
  • a silicone resin is poured into the mold prepared in the above-described process. After the silicone resin is cured by thermosetting, as shown in FIG. 4C, a member 24 to which the flow path pattern is transferred is obtained.
  • the surface of the member 24 that comes into contact with the liquid may optionally be subjected to a hydrophilic treatment.
  • the hydrophilization treatment can be performed by forming a hydrophilic film by a pulse plasma CVD method, a surface treatment by an oxygen plasma method, a surface modification by vacuum ultraviolet light, or the like.
  • a substrate 25 corresponding to the bottom surface of the flow path is prepared.
  • the surface of the substrate 25 may be subjected to a hydrophilic treatment and / or a water repellent treatment.
  • a region other than the water-repellent region 26 may be subjected to a hydrophilic treatment as shown in FIG. .
  • the hydrophilization treatment can be performed by forming a hydrophilic film by a pulse plasma CVD method, a surface treatment by an oxygen plasma method, a surface modification by vacuum ultraviolet light, or the like.
  • the water repellent treatment can be performed by forming a water repellent film by a pulse plasma CVD method, a fluorine gas surface treatment method, or the like.
  • a negative photosensitive resist (SU-8 2000.5, manufactured by MicroChem) is applied onto a 100 mm diameter silicon substrate (4 inch silicon wafer, manufactured by Electronics End Materials Corporation), and a 0.5 ⁇ m thick resist is applied. A film was formed. Subsequently, the pattern of the side flow path was formed by LED drawing using a maskless exposure apparatus (high-intensity LED drawing apparatus, manufactured by PMT Corporation). The width of the side channel was 5 ⁇ m, the height was 0.5 ⁇ m, the length was 50 ⁇ m, and the number was 660. The interval between the side channels was 15 ⁇ m.
  • the size of the opening of the side channel in the first connection portion is 5 ⁇ m ⁇ 0.5 ⁇ m, fine particles larger than this cannot pass through the side channel. That is, fine particles having a particle size equal to or greater than the height of the side channel (0.5 ⁇ m) cannot pass through the side channel.
  • a negative photosensitive resist (SU-8-3050, manufactured by MicroChem) was applied on the silicon substrate to form a resist film having a thickness of 30 ⁇ m.
  • the pattern of the main flow path, the liquid discharge path, the liquid introduction part, and the chamber was formed using the exposure apparatus (mask aligner) (PEM-800, manufactured by Union Optical Co., Ltd.).
  • the main channel had a width of 200 ⁇ m, a height of 30 ⁇ m, and a length of 6 mm.
  • the liquid discharge channel had a width of 100 ⁇ m and a channel height of 30 ⁇ m.
  • Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 (registered trademark) Silicone Elastomer, manufactured by Toray Dow Corning Co., Ltd.) was poured into a mold having a flow path pattern produced by the above-described process, and was thermally cured. Thereafter, the polydimethylsiloxane channel structure to which the channel pattern was transferred was cut out from the mold.
  • Oxygen plasma surface treatment was performed on the surface of the above-described flow channel structure that mates with a glass substrate described later using a plasma cleaner apparatus (FEMTO-CUTE-MP, manufactured by Femto Science). Thereby, the surface of the above-mentioned channel structure was hydrophilized.
  • a SiC X water-repellent film is formed on the surface of a quartz glass substrate (4-inch synthetic quartz glass wafer, manufactured by Daiko Seisakusho Co., Ltd.) using a pulse plasma CVD method on the region corresponding to the water-repellent flow path. Formed.
  • a pulse plasma CVD apparatus experimental, manufactured by Shinko Seiki Co., Ltd.
  • a hydrophilic film of SiO X was formed on the surface of the quartz glass substrate other than the water-repellent film using a pulse plasma CVD method.
  • a pulse plasma CVD apparatus for experiment, manufactured by Shinko Seiki Co., Ltd. was used.
  • the obtained hydrophilized flow channel structure was bonded to a quartz glass substrate.
  • a hole with a diameter of 4 mm was made in the liquid introduction part and connected to a fluid pressure control device (ELVEFLOW OB1, manufactured by Elvesys) during the concentration process.
  • a hole with a diameter of 2 mm was formed in a part of the liquid discharge path and connected to a fluid pressure control device (ELVEFLOW OB1, manufactured by Elvesys).
  • Example 1 Concentration of carboxy group-modified polystyrene fine particles
  • a dispersion Polybead (registered trademark) Carboxylate Microspheres 6.00 ⁇ m, manufactured by Polysciences) containing carboxy group-modified polystyrene fine particles having a particle size of 6 ⁇ m was used.
  • a phosphate buffer By diluting the dispersion with a phosphate buffer to prepare a dispersion having a fine particle concentration of 10 4 cells / mL (liquid volume 30 [mu] L).
  • the dispersion was poured into the flow channel device produced in the above production example to concentrate the fine particles.
  • FIG. 5 is a diagram showing a result of observing a state in which fine particles are concentrated with a digital microscope (KH-8700, manufactured by Hilox Co., Ltd.).
  • FIG. 5A shows a flow channel device before introducing the dispersion. The dispersion prepared as described above was dropped into the liquid introduction part and circulated in the flow path.
  • FIGS. 5B to 5E the liquid flows into the side channel 12, so that each side channel is difficult to see due to the influence of the refractive index.
  • FIG. 5B shows a state in which the fine particles 2 are flowing through the main flow path 11.
  • FIG. 5C shows a state in which the fine particles 2 are captured by the side flow path 12. As a result, the liquid discharge was completed in about 10 minutes. Further, as shown in FIG. 5D, the fine particles 2 were captured in the opening of the side channel 12.
  • the concentration of the carboxy group-modified polystyrene fine particles transferred to the chamber was about 10 7 particles / mL, and was concentrated about 800 times.
  • Example 1-2 A flow channel device was fabricated in the same manner as in the above production example except that the length of the side flow channel was 100 ⁇ m. An experiment similar to Example 1-1 was performed using carboxy group-modified polystyrene fine particles having a particle diameter of 1 ⁇ m.
  • FIG. 6 is a diagram showing a result of observing captured fine particles with a digital microscope (KH-8700, manufactured by Hilox Co., Ltd.). The arrows in FIG. 6 indicate the captured carboxy group-modified polystyrene fine particles.
  • concentration of the carboxyl group modification polystyrene fine particle which moved to the chamber was about 10 ⁇ 7 > piece / mL, and was concentrated about 800 times.
  • Example 2 Isolation of E. coli
  • a phosphate buffer containing Escherichia coli Escherichia coli, 1 ⁇ m ⁇ 5 ⁇ m cylindrical shape
  • a flow channel device prepared in the same manner as in the above production example except that the length of the side flow channel is 100 ⁇ m. From which E. coli was captured.
  • FIG. 7 is a diagram showing a result of observing captured E. coli with a digital microscope (KH-8700, manufactured by Hilox Co., Ltd.). The arrows in FIG. 7 indicate captured E. coli.
  • a digital microscope KH-8700, manufactured by Hilox Co., Ltd.
  • the arrows in FIG. 7 indicate captured E. coli.
  • the present invention can be used, for example, in a technical field (such as early diagnosis of infectious diseases) in which detection of a minute amount of fine particles is useful.

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Abstract

静電相互作用によらずに流体力学的流動のみで液体中の微粒子を濃縮できる流路デバイスを提供する。本発明の一態様に係る流路デバイス（１）は、微粒子を含む液体を流動させるための主流路（１１）と、上記主流路（１１）の一端に設けられた、微粒子を濃縮するためのチャンバー（１５）と、上記主流路（１１）の側面に接続されており、余分な液体を排出するための側流路（１２）と、を備え、上記側流路（１２）の高さおよび幅の少なくともいずれか一方は上記微粒子の粒径に比べて小さい。

Description

流路デバイスおよび微粒子濃縮方法
　本発明は、流路デバイスおよび微粒子濃縮方法に関する。
　液体中に低濃度で含まれる微粒子を高感度で検出するための前処理として、微小流路を基本構造とする流路デバイスを用いた、微粒子濃縮方法が注目を集めている。とりわけ、微小流路と微小電極とを組み合わせた誘電泳動法は、液体中における代表的な微粒子操作技術である。
　例えば、非特許文献１は、誘電泳動法により、全血から細菌を分離したことを報告している。同様に、非特許文献２は、誘電泳動法により、生きている細菌と死んでいる細菌とを分離したことを報告している。これらの誘電泳動法は、電界強度が極大となる微小電極外縁部への微粒子の捕捉および脱離を基本原理としている。
　また、流路デバイスにおいて、流路を流れる微粒子の大きさに応じて、当該微粒子を異なる流路に分配する技術が知られている。このような技術は、例えば、特許文献１～３に開示されている。
日本国特許第５８７０３２３号明細書（２０１６年２月２４日公開） 日本国公開特許公報「特開２００４－３５４３６４号公報（２００４年１２月１６日公開）」 日本国公開特許公報「特開２０１２－２２３６８３号公報（２０１２年１１月１５日公開）」
L. D'Amico et al. (2017) Lab on a Chip, Vol.17 (Issue 7), pp.1340-1348 Blanca H. Lapizco-Encinas et al. (2004) Anal. Chem., Vol.76 (Issue 6), pp.1571-1579
　しかしながら、誘電泳動法のように静電相互作用を用いた微粒子濃縮方法では、電極表面に微粒子が吸着してしまう可能性がある。また、上記濃縮方法では、空間的な有効電場範囲が限定される。さらに、上記濃縮方法では、微粒子の性質および／または微粒子と液体との誘電比率の差に応じて泳動パラメータを設定しなければならない。
　本発明の一態様は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、静電相互作用によらずに液体中の微粒子を濃縮する流路デバイスおよび微粒子濃縮方法を実現することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、特定の流路構造を有する流路デバイスによって、静電相互作用を用いずに流体力学的流動のみで微粒子を捕捉および濃縮できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を包含している。
　＜１＞微粒子を含む液体を流動させるための主流路と、上記主流路の一端に設けられた、微粒子を濃縮するためのチャンバーと、上記主流路の側面に接続されており、余分な液体を排出するための側流路と、を備え、上記側流路の高さおよび幅の少なくともいずれか一方は上記微粒子の粒径に比べて小さいことを特徴とする流路デバイス。
　＜２＞上記側流路における上記主流路との接続部との反対側には、該側流路の幅以上の幅および該側流路の高さ以上の高さを有する液体排出路が接続されていることを特徴とする＜１＞に記載の流路デバイス。
　＜３＞上記主流路と上記チャンバーとの間に、液止め部が設けられていることを特徴とする＜１＞または＜２＞に記載の流路デバイス。
　＜４＞上記側流路が複数設けられていることを特徴とする＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の流路デバイス。
　＜５＞微粒子を含む液体を、主流路に導入する導入工程と、上記主流路の側面に接続された側流路へ上記液体を排出するとともに、上記側流路と上記主流路との接続部において上記微粒子を捕捉する捕捉工程と、上記捕捉された微粒子を上記主流路へと放出する放出工程と、上記放出された微粒子を上記主流路の一端に設けられたチャンバーにて濃縮する濃縮工程と、を含み、上記側流路の高さおよび幅の少なくともいずれか一方は上記微粒子の粒径に比べて小さいことを特徴とする微粒子濃縮方法。
　＜６＞上記側流路における上記主流路との接続部との反対側には、該側流路の幅以上の幅および該側流路の高さ以上の高さを有する液体排出路が接続されていることを特徴とする＜５＞に記載の微粒子濃縮方法。
　＜７＞上記主流路と上記チャンバーとの間に、液止め部が設けられていることを特徴とする＜５＞または＜６＞に記載の微粒子濃縮方法。
　＜８＞上記側流路が複数設けられていることを特徴とする＜５＞～＜７＞のいずれか１つに記載の微粒子濃縮方法。
　本発明の一態様によれば、静電相互作用によらずに液体中の微粒子を濃縮する流路デバイスおよび微粒子濃縮方法を提供することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る流路デバイスの構造を表す模式図である。 本発明の一実施形態に係る流路デバイスの側流路近傍の構造を表す模式図である。 本発明の一実施形態に係る微粒子濃縮方法の概要を表す模式図である。 本発明の一実施形態に係る流路デバイスの製造方法を表す模式図である。 実施例１－１にて微粒子が濃縮される様子をデジタルマイクロスコープで観察した結果を示す図である。 実施例１－２にて捕捉された微粒子をデジタルマイクロスコープで観察した結果を示す図である。 実施例２にて捕捉された大腸菌をデジタルマイクロスコープで観察した結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、説明の便宜上、同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
　〔１．流路デバイス〕
　本発明の一実施形態に係る流路デバイスは、微粒子を含む液体を流動させるための主流路と、上記主流路の一端に設けられた、微粒子を濃縮するためのチャンバーと、上記主流路の側面に接続されており、余分な液体を排出するための側流路と、を備え、上記側流路の高さおよび幅の少なくともいずれか一方は上記微粒子の粒径に比べて小さいことを特徴としている。
　上記流路デバイスにより、側流路へ向かう流れに乗った微粒子を、側流路の入り口にて捕捉することができる。また、余分な液体を側流路へ排出することができるため、主流路に接続されたチャンバー内にて微粒子を濃縮することができる。従って、上記流路デバイスにより、静電相互作用によらずに液体中の微粒子を濃縮することができる。
　側流路から余分な液体を排出し、微粒子を濃縮することができる点において、本発明の一実施形態に係る流路デバイスは、特許文献１～３に記載の技術とは異なっている。以下、簡潔に説明する。
　特許文献１に開示されているがん細胞自動分離装置は、がん細胞の代表径よりも流路高さが低い部分を設けることによって、がん細胞とがん細胞以外の細胞とを、互いに異なる流路に導入するものである。特許文献２に開示されている微粒子操作ユニットは、一定の大きさ以上の微粒子に対する透過制限領域などを備えることによって、流路内を流動する微粒子の流動方向を操作するものである。特許文献３に開示されている微粒子分離装置は、フィルタ部を通過できる微粒子と、通過できない微粒子とを、異なる排出口へと導入するものである。
　しかし、以上の文献に記載されている装置は、大きさによって分離した微粒子を、異なる流路に導入するものの、微粒子を含む液体から余分な液体を分離して排出する（すなわち、微粒子を濃縮する）という機能は有していない。一方、本発明の一実施形態に係る流路デバイスは、側流路を備えているので、微粒子を大きさによって分離することができる上に、余分な液体を排出して微粒子を濃縮することができる。
　ここで、「余分な液体」とは、例えば、微粒子を分散させている分散媒である。一「余分な液体」には、濃縮の対象でない微粒子（濃縮の対象となる微粒子よりも粒径の小さい微粒子）が含まれていてもよい。本発明の一実施形態に係る流路デバイスは、余分な液体を側流路を通じて排出し、濃縮した微粒子をチャンバーに溜めることができる。
　本明細書において、流路デバイスとは、液体を流動させる流路構造を備えたデバイスを意図している。この液体の流動は毛細管流動によるものであることが好ましい。
　本発明の一実施形態に係る流路デバイスの構造について、図１に基づいて説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る流路デバイス１の構造を表す模式図である。流路デバイス１は、主流路１１、側流路１２、液体排出路１３、液体導入部１４、チャンバー１５および液止め部（撥水性流路１６）を備えている。
　なお、本明細書において、流路等が「接続されている」とは、液体が流通可能なように連通していることを意図している。
　＜１－１．主流路＞
　主流路１１は、微粒子を含む液体が流れる流路である。主流路１１の長さ、幅および高さは、流路デバイス１に流通させる微粒子の粒径および液体の量、主流路１１と接続している側流路１２の本数などに応じて適宜設定されうる。一例を挙げると、主流路１１の長さは１～２０ｍｍ、幅は１００～５００μｍ、高さは１０～２００μｍとすることができる。なお、本明細書において、主流路の長さとは、主流路を流通する液体が流れる方向に沿った長さを表す。
　主流路１１の形状は、図１に示されているような直線状に限定されない。例えば、主流路１１は、蛇行した流路であってもよい。液体に含まれる微粒子が側流路に接触する機会が増加するという観点からは、主流路１１の形状は、蛇行していることが好ましい。一方、流路設計が容易であるという観点からは、主流路１１の形状は、直線状であることが好ましい。また、主流路１１の、液体の流れる方向に垂直な断面の形状も特に限定されず、矩形であってもよく、円形であってもよい。
　また、主流路１１の一端には液体導入部１４が設けられていてもよい。液体導入部１４は、主流路１１に微粒子を含む液体を流通させるために、上記微粒子を含む液体を導入する部分である。液体導入部１４は、主流路１１の一端に単に孔が形成された構成であってもよく、図１に示す液溜め（リザーバー）のような構成であってもよい。液体導入部１４の容量は、導入する微粒子を含む液体の量などに応じて、適宜設定されうる。
　流路デバイス１において、主流路１１の表面（液体と接する面）は、親水性であることが好ましい。例えば、主流路１１の表面は、酸化ケイ素（ＳｉＯＸ）膜が形成されていてもよく、ヒドロキシル基、カルボニル基、アルデヒド基またはカルボキシル基などの官能基を有していてもよい。また、主流路１１の表面は、酸素プラズマ法、真空紫外光処理法、フッ素ガス処理法によって表面処理を施されていてもよい。
　主流路１１の表面が親水性を示すことにより、導入された液体が水性分散液である場合に、毛細管流動の効果によって上記水性分散液が主流路１１を流れやすくなる。このため、微粒子の濃縮に要する時間が短縮される。
　＜１－２．側流路＞
　主流路１１の側面には、側流路１２が接続されている。以下、主流路１１と側流路１２の接続部を、第１の接続部１２ａと呼ぶ。すなわち、第１の接続部１２ａは、主流路１１から側流路１２へ向かう流れの入り口とも言える。側流路１２は、主流路１１を流れる液体を主流路１１外へと導く流路である。側流路１２によって、余分な液体を排出することができる。また、側流路１２の高さおよび幅の少なくともいずれか一方は微粒子２の粒径に比べて小さい。それゆえ、側流路１２へ向かう流れに乗った微粒子２を、第１の接続部１２ａにて捕捉することができる。
　図２は、本発明の一実施形態に係る流路デバイス１の側流路１２近傍の構造を表す模式図である。ここで、流路デバイス１内を液体が流通する際には、主流路１１における液体の流れＡ１と、側流路１２における液体の流れＡ２が生じる。Ａ１およびＡ２の矢印の方向は液体が流れる方向を表している。流れＡ１に乗って移動していた微粒子２が、側流路１２の近傍（第１の接続部１２ａ）に近づくと、流れＡ２に乗って側流路１２へと移動方向を変える。しかし、第１の接続部１２ａにおける側流路１２の高さｈ１２は、濃縮対象の微粒子２の粒径に比べて小さい。このような構造を取る結果、側流路１２の高さｈ１２よりも粒径の大きい微粒子２は、第１の接続部１２ａを通過できず、側流路１２へ入ることができない。そのため、微粒子２は、第１の接続部１２ａで移動を停止する（捕捉される）。
　その後、再度、微粒子２を流れＡ１に乗るように放出すれば、主流路１１の末端に設けられたチャンバー１５において微粒子２を濃縮することができる。
　図２では、側流路１２の高さが微粒子２の粒径に比べて小さい場合を例示しているが、上述のように側流路１２の幅が微粒子２の粒径に比べて小さくてもよい。なお、側流路１２の高さが微粒子２の粒径より小さい場合は、側流路１２の幅が微粒子２の粒径より小さい場合に比べて側流路１２の加工が容易であるという利点がある。
　なお、主流路１１は、微粒子２が流動できる大きさを有している。従って、図２において、第１の接続部１２ａにおける側流路１２の高さｈ１２は、第１の接続部１２ａにおける主流路１１の高さｈ１１よりも低い。すなわち、主流路１１と側流路１２の間に段差が設けられている。
　側流路１２の長さ、幅、高さおよび本数は、流路デバイス１に流通させる液体の量、上記液体に含まれる微粒子の数などに応じて、適宜設定されうる。なお、本明細書において、側流路の長さとは、側流路を流通する液体が流れる方向に沿った長さを表す。側流路１２の幅および高さは、捕捉したい微粒子が凝集しない程度に狭いことが好ましい。例えば、１本の側流路１２において１個の微粒子が捕捉されることが好ましい。また、一般的に、側流路１２の長さが短く、本数が多いほど、液体の排出に要する時間が短くなり、好ましい。
　一例を挙げると、側流路１２の長さは１～１００μｍであってもよく、１～５０μｍであってもよい。側流路１２の幅および／または高さは０．０５～１０μｍであってもよく、０．０５～５μｍであってもよく、０．０５～０．５μｍであってもよく、０．０５～０．１５μｍであってもよい。側流路１２の本数は１本であっても、複数であってもよく、例えば、１～１０００本であってもよく、１００～８００本であってもよく、３００～７００本であってもよい。
　なお、側流路１２の幅または高さが微粒子２の粒径よりも小さい構造は、第１の接続部１２ａにおいて満たされていれば充分である。すなわち、第１の接続部１２ａ以外の部分における、側流路１２の幅または高さは、微粒子２の粒径以上であってもよい。
　ここで、流路デバイス１中に、異なる高さを有する複数の側流路１２を設置してもよい。このような構成によれば、異なる粒径の微粒子を、１つの流路デバイスで捕捉することができる。また、側流路１２の高さが異なる複数の流路デバイス１を連結してもよい。このような構成によれば、同じ液体サンプルから、異なる粒径の微粒子を、それぞれの流路デバイス１において分離および濃縮することができる（例えば、血液中から、赤血球、白血球および血小板を分離および濃縮することができる）。
　また、主流路１１を流れる微粒子のうち、一部の微粒子が側流路１２を通過できる設計として、微粒子を粒径に応じて分離させてもよい。このような構成とすれば、側流路１２を通過できない微粒子が主流路１１に留まるのに対し、側流路１２を通過できる粒子は主流路１１から流出する。このようにして、側流路１２を通過できない微粒子のみを分離し、濃縮することができる。そして、側流路１２を通過できる粒子は、側流路１２から流出する液体を回収し、再度流路デバイス１（第１の接続部１２ａの幅および高さの少なくとも一方を変更したもの）を利用して、回収・濃縮することができる。
　また、流路デバイス１は、複数の側流路１２からなる列を、主流路１１の側面に１列設ける構成であってもよく、２列以上設ける構成であってもよい。図１では、複数の側流路１２からなる列が２列設けられている構成が例示されている。
　また、主流路１１と同様に、側流路１２の表面（液体と接する面）は、親水性であることが好ましい。
　＜１－３．液体排出路＞
　上記側流路１２における上記主流路１１との接続部（第１の接続部１２ａ）との反対側には、液体排出路１３が接続されていてもよい。以下、側流路１２と液体排出路１３との接続部を、第２の接続部１２ｂと呼ぶ。液体排出路１３は、主流路１１から側流路１２へ流入した液体を排出する流路である。
　液体排出路の形状は、特に限定されない。液体排出路１３は、主流路１１から側流路１２へ流入した液体を排出する機能を果たせばよいため、流路を形成せず、液溜め（リザーバー）であってもよい。また主流路１１から液体を排出する機能を高めるため、液体排出路１３から図１に示されている範囲の外部へと、液体を排出するチューブなどを接続してもよい。
　液体排出路１３の長さ、幅および高さは、流路デバイス１に流通させる液体の量などに応じて適宜設定されうる。なお、本明細書において、液体排出路の長さとは、液体排出路を流通する液体が流れる方向に沿った長さを表す。一例を挙げると、液体排出路１３の長さは１～２０ｍｍ、幅は５０～２００μｍ、高さは１０～２００μｍとすることができる。液体排出路１３は圧力で液体を排出可能な幅および高さを有し、側流路１２の幅以上の幅および側流路１２の高さ以上の高さを有することが好ましい。この場合、濃縮対象の微粒子よりも小さな微粒子（側流路１２を通過できる大きさの粒子）を液体排出路から排出することができる。なお、この場合の液体排出路１３の高さおよび側流路１２の高さは、第２の接続部１２ｂにおける高さを意図している。
　また、複数の側流路１２が１つの液体排出路１３に接続されている構成であってもよい。例えば、図１に示すように、流路デバイス１において、そのような構成が２組以上設けられていてもよい。
　また、主流路１１と同様に、液体排出路１３の表面（液体と接する面）は、親水性であることが好ましい。
　＜１－４．チャンバー＞
　主流路１１の一端には、微粒子を濃縮するためのチャンバー１５が設けられている。チャンバー１５は、主流路１１において液体が導入される側（液体導入部１４）とは反対側の端部に設けられている。すなわち、チャンバー１５は、主流路１１の流れの下流に設けられている。チャンバー１５は、濃縮対象となる微粒子が送り込まれる部分である。チャンバー１５の容量は、捕捉される微粒子の粒径および／または数などに応じて、適宜設定されうる。
　第１の接続部１２ａから放出された微粒子２は主流路１１を通ってチャンバー１５に到達する。上述のように余分な液体は側流路１２へ排出されるため、チャンバー１５においては、導入時に比べて微粒子の濃度が上昇した状態となる。
　また、主流路１１と同様に、チャンバー１５の表面（液体と接する面）は、親水性であることが好ましい。
　＜１－５．液止め部＞
　主流路１１とチャンバー１５とは、液止め部を介して接続されていることが好ましい。液止め部は、主流路１１とチャンバー１５との間における液体の流通を、一時的に妨げる機能を有する部位である。液止め部を設けることにより、液体の排出および微粒子の捕捉が行われている途中で、チャンバー１５へ液体が流入することを防ぐことができる。
　一例において、液止め部は、撥水性流路１６である。撥水性流路１６の表面は撥水性であるため、主流路１１に導入された液体が水性分散液である場合に、通常では撥水性流路１６を乗り越えられない。撥水性流路１６は、表面（液体と接する面）が撥水性であり、圧力差を生じさせた際に液体が乗り越える流路設計であることが好ましい。撥水性流路１６の表面は、例えば、炭化ケイ素（ＳｉＣＸ）膜が形成されていてもよく、メチル基などの官能基を有していてもよく、フッ素化合物で表面を形成されていてもよい（例えば、表面にトリフルオロメチル基を導入する）。
　逆に、主流路１１に導入される液体が無極性分散液である場合には、親水性流路を液止め部とすることができる。なお、主流路１１に導入される液体が無極性分散液である場合には、上記の説明とは逆に、主流路１１、側流路１２、液体排出路１３およびチャンバー１５の表面（無極性分散液と接触する面）を疎水性とすることが好ましい。これらの表面を疎水性とするには、例えば、炭化ケイ素（ＳｉＣＸ）膜を形成したり、メチル基などの官能基を導入したり、フッ素化合物で表面を形成したり（例えば、表面にトリフルオロメチル基を導入する）すればよい。
　他の例において、液止め部は、主流路１１を一時的に閉塞させるための機構である。このような機構の例としては、空気圧で駆動するダイヤフラム式のマイクロバルブが挙げられる。
　ここで、チャンバー１５へと微粒子を送り込むためには、例えば、主流路１１において液体が導入される側（液体導入部１４側）が高圧になるように液体の圧力差を生じさせたり、主流路１１の閉塞を解除したりすればよい。
　これにより、チャンバー１５へ微粒子を送り込むタイミングを容易に操作することができる。これによって、例えば、チャンバー１５にセンサーを接続した場合に、測定前のセンサーの汚れを防ぐことができ、濃縮した微粒子のより正確な測定が期待できる。
　＜１－６．その他の構造＞
　流路デバイス１は、主流路１１において、液体が導入される側が高圧になるように液体の圧力差を生じさせる構成（すなわち、陽圧を生じさせる構成）を有していてよい。例えば、主流路１１の液体が導入される側（液体導入部１４）に、流体圧力制御機器が接続されていてもよい。
　主流路１１において、液体が導入される側が高圧になるように液体の圧力差を生じさせることにより、以下の利点が生じる。すなわち、液体が側流路１２へと排出され、微粒子が第１の接続部１２ａに捕捉されている状態において、陽圧をかけて追加の液体を流すことにより、捕捉されている微粒子２を放出させ、チャンバー１５へと移動させることができる。また、陽圧をかけることにより、微粒子２を、上述の液止め部（撥水性流路１６など）を乗り越えさせてチャンバー１５へと送り込むこともできる。
　流路デバイス１は、側流路１２の、第１の接続部１２ａと第２の接続部１２ｂとの間で液体の圧力差を生じさせる構成を有していてよい。このような構成は、例えば、主流路１１と側流路１２との間で液体の圧力差を生じさせる構成でありうる。より具体的な例としては、主流路１１、側流路１２および／または液体排出路１３に、流体圧力制御機器を接続する構成が挙げられる。
　側流路１２の、第１の接続部１２ａと第２の接続部１２ｂとの間で液体の圧力差を生じさせることにより、以下の利点が生じる。第１の接続部１２ａにおける流体圧が、第２の接続部１２ｂにおける流体圧よりも高い場合（第１の接続部１２ａ側が陽圧となる場合、または第２の接続部１２ｂ側が陰圧となる場合）、液体が側流路１２を液体排出路１３へ向けて流れる流速が上昇し、液体の排出に要する時間が短縮され得る。一方、第１の接続部１２ａにおける流体圧を、第２の接続部１２ｂにおける流体圧よりも低くすると、液体排出路１３から側流路１２へ液体が逆流するため、第１の接続部１２ａに捕捉されている微粒子を、主流路１１中へ放出することができる。
　また、流路デバイス１には、各種のセンサーが接続されていてもよい。上記センサーは、チャンバー１５等に接続され得る。
　＜１－７．微粒子を含む液体＞
　濃縮対象は、微粒子を含む液体であればよく、微粒子の粒径、濃度および種類、分散媒の種類等は、特に限定されない。本明細書において、該微粒子を含む液体を分散液とも称する。なお、上記流路デバイスによって、所望の微粒子を濃縮することができればよく、液体中に含まれる全ての微粒子を濃縮する必要はない。例えば、不要な微粒子は、側流路を介して液体排出路等へ排出されてもよい。
　微粒子の粒径は、長軸径、短軸径、定方向径、相当径、有効径など、粒径を算出する公知の手法により定められる値であり、上記微粒子の性質により、適宜算出方法を選択することができる。例えば、微粒子の粒径は、１００μｍ以下であればよい。
　微粒子の濃度は、電気的検知帯法等の測定方法によって測定され得る。微粒子の濃度は、例えば、１０１０個／ｍＬ以下であればよい。
　微粒子は、無機微粒子であってもよく、有機微粒子であってもよい。また、分散媒は、水であってもよく、有機分散媒であってもよい。扱いやすいという観点からは、分散媒は、水であることが好ましい。
　微粒子を含む液体は、例えば、血液、唾液、鼻水または尿等の生体由来のものであってもよい。この場合、例えば、赤血球、白血球、血小板、花粉、細菌、ウイルスおよびその他の細胞等を微粒子とみなすことができる。
　〔２．微粒子濃縮方法〕
　本発明の一実施形態に係る微粒子濃縮方法は、微粒子を含む液体を、主流路に導入する導入工程と、上記主流路の側面に接続された側流路へ上記液体を排出するとともに、上記側流路と上記主流路との接続部において上記微粒子を捕捉する捕捉工程と、上記捕捉された微粒子を上記主流路へと放出する放出工程と、上記放出された微粒子を上記主流路の一端に設けられたチャンバーにて濃縮する濃縮工程と、を含み、上記側流路の高さおよび幅の少なくともいずれか一方は上記微粒子の粒径に比べて小さいことを特徴とする。上記微粒子濃縮方法は、上述の本発明の一実施形態に係る流路デバイスを用いて行われてもよい。
　上記微粒子濃縮方法によって、液体中に含まれる微量の微粒子を高濃度に濃縮することができる。それゆえ、例えば、微粒子としてウイルスを選択した場合、被験体から採取したサンプルに含まれるウイルスを濃縮することができる。このため、上記ウイルスの検出を容易にすることができ、感染症の早期診断にも役立つ。
　上記微粒子濃縮方法について、図３に基づいて説明する。図３は、本発明の一実施形態に係る微粒子濃縮方法の概要を表す模式図である。
　＜２－１．導入工程＞
　上記微粒子濃縮方法は、微粒子を含む液体を、主流路に導入する導入工程を含む。図３の（ａ）では、微粒子２を含む液体が、液体導入部１４に導入される。微粒子２は液体とともに、主流路１１を流れる。
　＜２－２．捕捉工程＞
　上記微粒子濃縮方法は、上記主流路の側面に接続された側流路へ上記液体を排出するとともに、上記側流路と上記主流路との接続部において上記微粒子を捕捉する捕捉工程を含む。捕捉工程では、側流路１２へ向かって液体が排出される流れに乗った微粒子２が、図３の（ｂ）に示すように、第１の接続部１２ａにおいて捕捉される。これは、微粒子２の粒径が、第１の接続部１２ａにおける側流路１２の高さおよび幅の少なくともいずれか一方よりも大きいためである。
　この際、第１の接続部１２ａにおける圧力を、第２の接続部１２ｂにおける圧力よりも高くすると、液体が側流路１２を液体排出路１３へ向けて流れる流速が上昇し、液体の排出に要する時間が短縮され得る。なお、捕捉工程において、液体は側流路１２へ全て排出されることが好ましい。
　＜２－３．放出工程＞
　上記微粒子濃縮方法は、上記捕捉された微粒子を上記主流路へと放出する放出工程を含む。放出工程では、図３の（ｃ）に示すように、第１の接続部１２ａに捕捉されていた微粒子２が、主流路１１へ向けて放出される。微粒子２を放出する方法としては、例えば、以下のものが挙げられる：（１）液体の排出を促進するために側流路１２に印加されていた、第１の接続部１２ａ側が高圧となる圧力を解除する；（２）第１の接続部１２ａにおける流体圧が、第２の接続部１２ｂにおける流体圧よりも低くなるように、側流路１２に圧力を印加する；（３）主流路１１に、追加の液体を流通させる。
　＜２－４．濃縮工程＞
　上記微粒子濃縮方法は、上記放出された微粒子を上記主流路の一端に設けられたチャンバーにて濃縮する濃縮工程を含む。濃縮工程では、図３の（ｄ）に示すように、主流路１１に放出されていた微粒子２が、少量の液体（例えば、側流路１２から逆流した液体または主流路１１に導入された追加の液体）を伴ってチャンバー１５へと移動させられる。チャンバー１５へ移動した微粒子２は、濃縮された状態にある。本明細書において、「微粒子を濃縮する」とは、液体導入時に比べて、単位体積あたりの液体に含まれる微粒子の数を増加させることを意図している。流路デバイス１によれば、通常は１００倍以上、好ましくは５００倍以上、より好ましくは１０００倍以上に、微粒子を含む液体を濃縮することができる。
　また、主流路１１とチャンバー１５との間に液止め部（撥水性流路１６など）を設け、かつ、主流路１１において液体が導入される側が高圧になるように液体の圧力差を生じさせる場合、濃縮工程を任意のタイミングで行うことができるため、好ましい。
　〔３．流路デバイスの製造方法〕
　以下に、本発明の一実施形態に係る流路デバイスの製造方法について説明する。本発明の一実施形態に係る流路デバイスは、常法に則って微小流路を有する部材を作製し、任意で、流体圧力制御機器、各種センサーなどと接続してもよい。
　流路デバイスの製造方法は、流路デバイスの材質に応じて、適宜選択しうる。流路デバイスの材質は、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン樹脂、ポリメタクリル酸メチル樹脂、または環状オレフィン・コポリマー等のオレフィン系樹脂であってもよく、ガラス等であってもよい。流路デバイスの製造方法は、ソフトリソグラフィ、ナノインプリント、または薄膜の積層によるものであってもよく、特に限定されない。以下では、一例としてシリコーン樹脂を用いたソフトリソグラフィによる製造方法を、図４に基づいて、説明する。
　まずは、以下のように流路の鋳型を作製する。適当な材質（シリコンなど）の基板２１上に、フォトレジストを塗布し、レジスト膜を形成する。露光により、流路パターンを形成する。ここで、図４の（ａ）に示すように側流路に対応するパターン２２を形成した後に、図４の（ｂ）に示すように主流路に対応するパターン２３を形成してもよい。第１の接続部に存在する段差は、レジスト膜の厚さを変更することにより、作製することができる。
　次に、上述の工程で作製した鋳型に、シリコーン樹脂を流し込む。熱硬化によりシリコーン樹脂を硬化させた後、図４の（ｃ）に示すように、流路パターンが転写された部材２４を得る。部材２４のうち、液体と接触する表面には、任意で親水化処理を行ってよい。上記親水化処理は、パルスプラズマＣＶＤ法による親水性膜の形成、酸素プラズマ法による表面処理、真空紫外光による表面改質などにより行うことができる。
　一方、図４の（ｄ）に示すように、流路の底面に相当する基板２５を用意する。基板２５の表面には、親水化処理および／または撥水化処理を施してよい。図４の（ｄ）に示すように、基板２５に撥水性領域２６を形成した後に、図４の（ｅ）に示すように、撥水性領域２６以外の領域に親水化処理を行ってもよい。上記親水化処理は、パルスプラズマＣＶＤ法による親水性膜の形成、酸素プラズマ法による表面処理、真空紫外光による表面改質などにより行うことができる。上記撥水化処理は、パルスプラズマＣＶＤ法による撥水性膜の形成、フッ素ガス表面処理法などにより行うことができる。
　最後に、図４の（ｆ）に示すように、部材２４と基板２５とを貼り合わせる。
　上記各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できる。また、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例のみに限定されるものではない。
　〔製造例：流路デバイスの作製〕
　まず、直径１００ｍｍのシリコン基板（４インチシリコンウエハー、株式会社エレクトロニクス エンド マテリアルズ コーポレーション製）上に、ネガ型感光性レジスト（SU-8 2000.5、MicroChem製）を塗布し、厚さ０．５μｍのレジスト膜を形成した。次いで、マスクレス露光装置（高輝度ＬＥＤ描画装置、株式会社ピーエムティー製）を用いて、ＬＥＤ描画によって側流路のパターンを形成した。側流路の幅は５μｍ、高さは０．５μｍ、長さは５０μｍ、本数は６６０本であった。また、側流路の間隔は、１５μｍであった。
　ここで、第１の接続部における側流路の開口部の大きさは５μｍ×０．５μｍであるから、これよりも大きな微粒子は、側流路を通過できない。すなわち、粒径が側流路の高さ（０．５μｍ）以上の微粒子は、側流路を通過できない。
　次に、上記シリコン基板上に、ネガ型感光性レジスト（SU-8 3050、MicroChem製）を塗布し、厚さ３０μｍのレジスト膜を形成した。次いで、露光装置（マスクアライナー）（PEM-800、ユニオン光学株式会社製）を用いて、主流路、液体排出路、液体導入部およびチャンバーのパターンを形成した。上記主流路の幅は２００μｍ、高さは３０μｍ、長さは６ｍｍであった。上記液体排出路の幅は１００μｍ、流路高さは３０μｍであった。
　上述の工程により作製した流路パターンを有する鋳型に、ポリジメチルシロキサン（Sylgard 184（登録商標） Silicone Elastomer、東レ・ダウコーニング株式会社製）を流し込み、熱硬化させた。その後、流路パターンが転写されたポリジメチルシロキサン製流路構造を、鋳型から切り出した。
　上記流路構造の、後述のガラス基板と対合する表面に対して、プラズマクリーナー装置（FEMTO CUTE-MP、フェムトサイエンス社製）を用いて酸素プラズマ表面処理を施した。これにより、上記流路構造の表面を親水化処理した。
　また、石英ガラス基板（４インチ合成石英ガラスウエハー、株式会社大興製作所製）の表面のうち、撥水性流路に相当する領域に対して、パルスプラズマＣＶＤ法を用いてＳｉＣＸの撥水性膜を形成した。撥水性膜の形成には、パルスプラズマＣＶＤ装置（実験用、神港精機株式会社製）を用いた。
　次に、石英ガラス基板の表面の上記撥水性膜以外の領域に対して、パルスプラズマＣＶＤ法を用いてＳｉＯＸの親水性膜を形成した。親水性膜の形成には、パルスプラズマＣＶＤ装置（実験用、神港精機株式会社製）を用いた。
　得られた親水化処理済の流路構造と、石英ガラス基板とを貼り合わせた。
　液体導入部に直径４ｍｍの孔を空け、濃縮工程の際に流体圧力制御機器（ELVEFLOW OB1、Elvesys社製）と接続した。また、液体排出路の一部にも直径２ｍｍの孔を空け、流体圧力制御機器（ELVEFLOW OB1、Elvesys社製）と接続した。
　〔実施例１：カルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子の濃縮〕
　＜実施例１－１＞
　まず、粒径６μｍのカルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子を含む分散液（Polybead（登録商標） Carboxylate Microspheres 6.00μm、Polysciences社製）を用いた。上記分散液をリン酸緩衝液で希釈することにより、微粒子濃度１０４個／ｍＬ（液量３０μＬ）である分散液を調製した。上記製造例で作製した流路デバイスに、上記分散液を流し、上記微粒子を濃縮した。
　図５は、微粒子が濃縮される様子をデジタルマイクロスコープ（KH-8700、株式会社ハイロックス製）で観察した結果を示す図である。図５の（ａ）は分散液導入前の流路デバイスを示している。上述のように調製した分散液を、液体導入部に滴下し、流路内を流通させた。なお、図５の（ｂ）～（ｅ）においては、側流路１２に液体が流入することにより、屈折率の影響で一本一本の側流路は見えづらくなっている。図５の（ｂ）は、微粒子２が主流路１１を流れている様子を示している。ここで、流体圧力制御機器を用いて、主流路側の流体圧が高く、液体排出路側の流体圧が低くなるように、－８０ｋＰａの圧力を印加した。図５の（ｃ）は、微粒子２が側流路１２に捕捉されていく様子を示している。この結果、１０分間程度で、液体の排出は終了した。また、図５の（ｄ）のように、微粒子２は側流路１２の開口部に捕捉された。
　液体の排出が終了した時点で、上記の圧力の印加を停止した。この結果、側流路１２の開口部を通過できず捕捉されていたカルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子２は、図５の（ｅ）のように、主流路１１中へと放出された。
　次に、流体圧力制御機器を用いて、液体導入部側の流体圧が高く、チャンバー側の流体圧が低くなるように、１０ｋＰａの圧力を印加した。この結果、カルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子２は、微量の液体を伴い、図５の（ｆ）のように、撥水性流路１６を越えてチャンバー１５へと移動した。
　（結果）
　チャンバーに移動したカルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子の濃度は、約１０７個／ｍＬであり、約８００倍に濃縮されていた。
　＜実施例１－２＞
　側流路の長さを１００μｍとしたこと以外は、上述の製造例と同様にして流路デバイスを作製した。粒径１μｍのカルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子を用いて、実施例１－１と同様の実験を行った。
　具体的には、微粒子濃度４．５５×１０４個／ｍＬでカルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子を含む分散液を３０μＬ、液体導入部に滴下した。流体圧力制御機器を用いて、主流路側の流体圧が高く、液体排出路側の流体圧が低くなるように、－８０ｋＰａの圧力を印加した。この結果、約３３分間で、液体の排出は終了した。
　（結果）
　図６は、捕捉された微粒子をデジタルマイクロスコープ（KH-8700、株式会社ハイロックス製）で観察した結果を示す図である。図６中の矢印は、捕捉されたカルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子を示している。
　また、チャンバーに移動したカルボキシ基修飾ポリスチレン微粒子の濃度は、約１０７個／ｍＬであり、約８００倍に濃縮されていた。
　〔実施例２：大腸菌の分離〕
　側流路の長さを１００μｍとしたこと以外は上述の製造例と同様にして作製した流路デバイスを使用して、大腸菌（Escherichia coli、１μｍ×５μｍ程度の円柱状）を含むリン酸緩衝液から、大腸菌を捕捉した。
　具体的には、大腸菌を含むリン酸緩衝液を３０μＬ、液体導入部に滴下した。流体圧力制御機器を用いて、主流路側の流体圧が高く、液体排出路側の流体圧が低くなるように、－８０ｋＰａの圧力を印加した。この結果、約３０分間で、液体の排出は終了した。
　（結果）
　図７は、捕捉された大腸菌をデジタルマイクロスコープ（KH-8700、株式会社ハイロックス製）で観察した結果を示す図である。図７中の矢印は、捕捉された大腸菌を示している。このように、本発明の一実施形態に係る流路デバイスによれば、大腸菌（細胞）のように比較的軟らかい微粒子でも、捕捉することができる。
　本発明は、例えば、微量な微粒子の検出が有用である技術分野（感染症の早期診断など）に利用することができる。
　１　流路デバイス
　２　微粒子
　１１　主流路
　１２　側流路
　１３　液体排出路
　１５　チャンバー
　１６　撥水性流路（液止め部）

Claims (8)

  1. 　微粒子を含む液体を流動させるための主流路と、
    　上記主流路の一端に設けられた、微粒子を濃縮するためのチャンバーと、
    　上記主流路の側面に接続されており、余分な液体を排出するための側流路と、を備え、
    　上記側流路の高さおよび幅の少なくともいずれか一方は上記微粒子の粒径に比べて小さいことを特徴とする流路デバイス。
  2. 　上記側流路における上記主流路との接続部との反対側には、該側流路の幅以上の幅および該側流路の高さ以上の高さを有する液体排出路が接続されていることを特徴とする請求項１に記載の流路デバイス。
  3. 　上記主流路と上記チャンバーとの間に、液止め部が設けられていることを特徴とする請求項１または２に記載の流路デバイス。
  4. 　上記側流路が複数設けられていることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の流路デバイス。
  5. 　微粒子を含む液体を、主流路に導入する導入工程と、
    　上記主流路の側面に接続された側流路へ上記液体を排出するとともに、上記側流路と上記主流路との接続部において上記微粒子を捕捉する捕捉工程と、
    　上記捕捉された微粒子を上記主流路へと放出する放出工程と、
    　上記放出された微粒子を上記主流路の一端に設けられたチャンバーにて濃縮する濃縮工程と、を含み、
    　上記側流路の高さおよび幅の少なくともいずれか一方は上記微粒子の粒径に比べて小さいことを特徴とする微粒子濃縮方法。
  6. 　上記側流路における上記主流路との接続部との反対側には、該側流路の幅以上の幅および該側流路の高さ以上の高さを有する液体排出路が接続されていることを特徴とする請求項５に記載の微粒子濃縮方法。
  7. 　上記主流路と上記チャンバーとの間に、液止め部が設けられていることを特徴とする請求項５または６に記載の微粒子濃縮方法。
  8. 　上記側流路が複数設けられていることを特徴とする請求項５～７のいずれか１項に記載の微粒子濃縮方法。
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