WO2018170708A1 - 人ila基因表达载体的构建方法及其应用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention belongs to the field of biotechnology, and relates to a method for constructing a human ILA gene expression vector and an application thereof.
- ILA belongs to the TNFR superfamily and is mainly expressed in activated T cells and is an inducible T cell surface receptor;
- TNLG5A belongs to the TNF superfamily and is mainly expressed in concentrated antigen presenting cells (APC).
- APC concentrated antigen presenting cells
- IL A/TNLG5A is another important costimulatory molecule other than CD28/B7, which may or may not be dependent on CD28/
- the B7 pathway mediates the production of costimulatory signals that induce T cell activation, proliferation, and cytokine secretion.
- ILA and its ligand system have two-way signal transduction, which can transmit cells to T cells through TNLG5A, and can transmit signals to cells expressing ligands, which plays an important role in tumor immunotherapy.
- Solid research can be put into practical use, but the lack of vectors for ILA expression genes in the prior art has hindered the progress of related research.
- the object of the present invention is to overcome the deficiencies in the prior art and to provide a method for constructing a human ILA gene expression vector.
- the overexpression vector p EGFP-C1/ILA was constructed, which laid a foundation for the subsequent study of human ILA gene function.
- a method for constructing a human ILA gene overexpression vector comprising the steps of:
- the purified PCR product and the eukaryotic expression vector pEGFP-Cl were digested with restriction enzymes Xho I and EcoR I, identified and recovered by 1% agarose gel electrophoresis;
- the target gene fragment was ligated with the same double-digested expression vector pEGFP-Cl; the reaction system was: 10XT4 DNA ligase Buffer 1 L, linearized pEGFP-Cl vector 1 L, PCR product 3 ⁇ 4
- DNA ligase 1 ⁇ , dH20 4 L, 4°C overnight transform the ligation product into E. coli DH5a sensed cells, ice bath for 30 min, heat shock at 42 °C for 90 s, immediately transferred to ice for standing 2
- the present invention constructs the overexpression vector pEGFP-Cl/ILA of the ILA gene. Subsequent development of overexpression of ILA genes will play an important role in ILA-related drug research and development.
- 1 is the relative level of ILA gene of 293T cells transfected with pEGFP-C 1/ILA vector.
- Jurkat cells and 293T cells were purchased from ATCC, Premix PrimeSTAR
- HS enzyme was purchased from Takara, RNeasy Mini Kit was purchased from QIAGEN, Endo-Free Plasmid
- Mini Kit II was purchased from Omega bio-tek.
- RNA of Jurkat cells was extracted, reverse-transcribed into cDNA, primers (ILA-F, ILA-R) were designed, and PCR amplification was carried out according to a conventional method using cDN A as a template, using primers and PrimeStar high-fidelity DNA polymerase.
- the reaction conditions were: 98 ° C 2 min; 98. C 10 s, 58. C 10 s, 72. C 50 s, 30 cycles; 72. C 5 min.
- the PCR amplification products were identified by agarose gel electrophoresis.
- the nucleotide sequence of ILA-F is shown in SEQ ID No: 1
- the nucleotide sequence of ILA-R is shown in SEQ ID No: 2.
- the purified PCR product and the eukaryotic expression vector pEGFP-Cl were digested with restriction enzymes Xho I and EcoR I, identified and recovered by 1% agarose gel electrophoresis;
- the target gene fragment was ligated with the same double-digested expression vector pEGFP-Cl; the reaction system was: 10XT4 DNA ligase Buffer 1 L, linearized pEGFP-Cl vector 1 L, PCR product 3 ⁇ 4
- DNA ligase 1 ⁇ , dH20 4 L, 4°C overnight transform the ligation product into E. coli DH5a sensed cells, ice bath for 30 min, heat shock at 42 °C for 90 s, immediately transferred to ice for standing 2
- the pEGFP-Cl/ILA plasmid was extracted. 293T cells in good growth were inoculated into six wells, 100 per well
- the pEGFP-Cl/ILA plasmid was transduced into 293T cells in 2000 and cultured for 48 h.
- the primer design software Oligo 7.0 was used to design the bow.
- the present invention constructs the overexpression vector pEGFP-Cl/ILA of the ILA gene. Subsequent development of overexpression of ILA genes will play an important role in ILA-related drug research and development.
Landscapes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
提供了一种人ILA基因表达载体的构建方法，步骤包括：（1）ILA基因的克隆；（2）过表达载体pEGFP-C1/ILA的构建。
Description
发明名称：人 ILA基因表达载体的构建方法及其应用 技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域， 涉及一种人 ILA基因表达载体的构建方法及其应用 背景技术
[0002] ILA属于 TNFR超家族， 主要表达于活化的 T细胞中， 是一种可诱导的 T细胞表 面受体； TNLG5A属于 TNF超家族， 主要表达在集中抗原呈递细胞 （APC) 。 IL A/TNLG5A是 CD28/B7之外的另一重要的共刺激分子， 可依赖或不依赖于 CD28/
B7途径而介导产生协同刺激信号， 诱导 T细胞的活化、 增殖与细胞因子的分泌。 技术问题
[0003] ILA及其配体系统存在双向信号传导， 既可通过 TNLG5A向 T细胞传递细胞， 又 可将信号传向表达配体的细胞， 其在肿瘤的免疫治疗中起重要的作用， 需进行 扎实的研究方可投入实际应用， 但现有技术中缺乏用于 ILA表达基因的载体， 对 相关研究的进展造成了一定的阻碍。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中的存在的缺陷， 提供一种人 ILA基因表达载 体的构建方法。 该方法在克隆人 ILA基因 cDNA序列的基础上， 构建过表达载体 p EGFP-C1/ILA, 为后续研究人 ILA基因功能奠定基础。
[0005] 其具体技术方案为：
[0006] 一种人 ILA基因过表达载体的构建方法， 包括以下步骤：
[0007] (1) ILA基因克隆
[0008] 提取 Jurkat细胞总 RNA， 逆转录为 cDNA， 设计引物 ILA-F、 ILA-R, 以 cDNA 为模板， 使用引物和 PrimeStar高保真 DNA聚合酶， 按常规方法进行 PCR扩增 ； 反应条件为： 98°C 2 min； 98。C 10 s、 58。C 10 s、 72。C 50 s， 30个循环; 72。C 5 min。 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0009] (2)过表达载体 pEGFP-Cl/ILA的构建
[0010] 利用限制酶 Xho I和 EcoR I对纯化后的 PCR扩增产物与真核表达载体 pEGFP-Cl 同吋进行双酶切， 经 1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收； 回收后的目的基因片段 和经同样双酶切的表达载体 pEGFP-Cl进行连接； 反应体系为： 10XT4 DNA连接 酶 Buffer 1 L、 线性化的 pEGFP-Cl载体 1 L、 PCR产物 3 Τ4
DNA连接酶 1μί、 dH20 4 L、 4°C连接过夜； 将连接产物转化大肠杆菌 DH5a感 受态细胞中， 冰浴 30 min， 42°C热激 90 s， 立即移入冰中静置 2
min， 之后加入 500 L 37°C预温的无抗性 LB培养基， 37°C摇床培养 lh， 最后将菌 液均匀涂布含有卡那霉素的 LB固体培养基上， 放入 37°C培养箱内过夜培养， 筛 选阳性菌落； 随机挑取 3株单克隆菌落， 菌落 PCR鉴定为阳性后将菌液送上海生 工测序； 所得到的重组真核表达质粒命名为 pEGFP-Cl/ILA。
发明的有益效果
有益效果
[0011] 本发明通过构建 ILA基因的过表达载体 pEGFP-Cl/ILA。 后续幵展过表达 ILA基 因在 ILA相关的药物研究和幵发中将起重要作用。
对附图的简要说明
附图说明
[0012] 图 1为转染 pEGFP-C 1/ILA载体的 293T细胞的 ILA基因相对水平。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0013] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0014] Jurkat细胞和 293T细胞购自 ATCC， Premix PrimeSTAR
HS酶购自 Takara公司， RNeasy Mini Kit购自 QIAGEN公司， Endo-Free Plasmid
Mini Kit II购自 Omega bio-tek公司。
[0015] 实施例一 ILA基因的克隆。
[0016] 提取 Jurkat细胞总 RNA， 逆转录为 cDNA， 设计引物 （ILA-F、 ILA-R) ， 以 cDN A为模板， 使用引物和 PrimeStar高保真 DNA聚合酶， 按常规方法进行 PCR扩增。
反应条件为： 98°C 2 min； 98。C 10 s、 58。C 10 s、 72。C 50 s， 30个循环; 72。C 5 min。 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确。 ILA-F的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示， ILA-R的核苷酸序列如 SEQ ID No: 2所示。
[0017] 实施例二 过表达载体 pEGFP-Cl/ILA的构建
[0018] 利用限制酶 Xho I和 EcoR I对纯化后的 PCR扩增产物与真核表达载体 pEGFP-Cl 同吋进行双酶切， 经 1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收； 回收后的目的基因片段 和经同样双酶切的表达载体 pEGFP-Cl进行连接； 反应体系为： 10XT4 DNA连接 酶 Buffer 1 L、 线性化的 pEGFP-Cl载体 1 L、 PCR产物 3 Τ4
DNA连接酶 1μί、 dH20 4 L、 4°C连接过夜； 将连接产物转化大肠杆菌 DH5a感 受态细胞中， 冰浴 30 min， 42°C热激 90 s， 立即移入冰中静置 2
min, 之后加入 500 L 37°C预温的无抗性 LB培养基， 37°C摇床培养 lh， 最后将菌 液均匀涂布含有卡那霉素的 LB固体培养基上， 放入 37°C培养箱内过夜培养， 筛 选阳性菌落； 随机挑取 3株单克隆菌落， 菌落 PCR鉴定为阳性后将菌液送上海生 工测序； 所得到的重组真核表达质粒命名为 pEGFP-Cl/ILA。
[0019] 实施例三 293T细胞的转导
[0020] 大量培养含 pEGFP-Cl/ILA质粒的大肠杆菌， Endo-Free Plasmid Mini Kit
II提取 pEGFP-Cl/ILA质粒。 取生长状态良好的 293T细胞接种到六孔中， 每孔 100
0000个细胞， 培养 18 h后， 用 Lipofectamine
2000将 pEGFP-Cl/ILA质粒转导至 293T细胞中， 继续培养 48 h。
[0021] 实施例四荧光定量 PCR检测 ILA基因表达量
[0022] 根据 GAPDH和 ILA基因 mRNA序列， 利用引物设计软件 Oligo 7.0设计弓 |物。
[0023]
[0024] 分别接种 293T细胞、 转导 pEGFP-Cl/ILA质粒的 293T细胞至 6孔板。 细胞密度达 到 δΟ^^Ο^吋， 用 RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， -20。C保存。
[0025] 取各组细胞的 cDNA 1 为模板， 以 GAPDH为内参， 荧光定量 PCR检测 ILA相 对表达量， 设置反应条件： 95°C 30s， 1循环， 95°C 10s， 54°C 30s
40循环。 利用 SYBR Primescript RT-PCR Kit检测各组细胞 ILA基因相对表达量， 结果如图 1所示。 可以看到， 转导 pEGFP-Cl/ILA质粒的 293T细胞的 ILA基因的表 达量较正常 293T细胞都有 210倍以上的升高， 说明本发明提供 pEGFP-Cl/ILA质 粒能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 ILA基因高表达。
[0026] 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 本发明的保护范围不限于此， 任 何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内， 还可以做出若干简 单推演或替换， 均落入本发明的保护范围内。
工业实用性
[0027] 本发明通过构建 ILA基因的过表达载体 pEGFP-Cl/ILA。 后续幵展过表达 ILA基 因在 ILA相关的药物研究和幵发中将起重要作用。
Claims
(1) ILA基因克隆
提取 Jurkat细胞总 RNA， 逆转录为 cDNA， 设计引物 ILA-F、 ILA-R, 以 cDNA为模板， 使用引物和 PrimeStar高保真 DNA聚合酶， 按常规 方法进行 PCR扩增； 反应条件为： 98°C 2 min； 98°C 10 s、 58°C 10 s、 72°C 50 s , 30个循环； 72°C 5 min。 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶 电泳鉴定。
(2)过表达载体 pEGFP-Cl/ILA的构建
利用限制酶 Xho I和 EcoR
I对纯化后的 PCR扩增产物与真核表达载体 pEGFP-Cl同吋进行双酶切 ， 经 1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收； 回收后的目的基因片段和经 同样双酶切的表达载体 pEGFP-Cl进行连接； 反应体系为： 10xT4 DNA连接酶 Buffer 1 μί、 线性化的 pEGFP-Cl载体 1 μί、 PCR产物 3 μί、 T4 DNA连接酶 1μί、 dH20 4μί、 4°C连接过夜； 将连接产物转 化大肠杆菌 DH5ot感受态细胞中， 冰浴 30 min， 42°C热激 90 s， 立即移 入冰中静置 2 min， 之后加入 500 L 37°C预温的无抗性 LB培养基， 37 °C摇床培养 lh， 最后将菌液均匀涂布含有卡那霉素的 LB固体培养基 上， 放入 37°C培养箱内过夜培养， 筛选阳性菌落； 随机挑取 3株单克 隆菌落， 菌落 PCR鉴定为阳性后将菌液送上海生工测序； 所得到的重 组真核表达质粒命名为 pEGFP-Cl/ILA。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2017/077395 WO2018170708A1 (zh) | 2017-03-20 | 2017-03-20 | 人ila基因表达载体的构建方法及其应用 |
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| PCT/CN2017/077395 WO2018170708A1 (zh) | 2017-03-20 | 2017-03-20 | 人ila基因表达载体的构建方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2018170708A1 true WO2018170708A1 (zh) | 2018-09-27 |
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ID=63584148
Family Applications (1)
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| PCT/CN2017/077395 WO2018170708A1 (zh) | 2017-03-20 | 2017-03-20 | 人ila基因表达载体的构建方法及其应用 |
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|---|---|
| WO (1) | WO2018170708A1 (zh) |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO2009115561A1 (fr) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Centre National De La Recherche Scientifique | Polynucléotides et polypeptides chimériques permettant la sécrétion d'un polypeptide d'intérêt en association avec des exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogènes |
| CN102061310A (zh) * | 2010-11-24 | 2011-05-18 | 中国人民解放军第四军医大学 | 人fhl1c真核表达载体的构建及其应用 |
| CN102337297A (zh) * | 2011-10-21 | 2012-02-01 | 南京医科大学 | 一种mbr-FPGS高效表达载体及其构建方法和应用 |
-
2017
- 2017-03-20 WO PCT/CN2017/077395 patent/WO2018170708A1/zh active Application Filing
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|---|---|---|---|---|
| WO2009115561A1 (fr) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Centre National De La Recherche Scientifique | Polynucléotides et polypeptides chimériques permettant la sécrétion d'un polypeptide d'intérêt en association avec des exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogènes |
| CN102061310A (zh) * | 2010-11-24 | 2011-05-18 | 中国人民解放军第四军医大学 | 人fhl1c真核表达载体的构建及其应用 |
| CN102337297A (zh) * | 2011-10-21 | 2012-02-01 | 南京医科大学 | 一种mbr-FPGS高效表达载体及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WAN, BING: "Advances in Research on Relationship Between 4-1BB ( CD 137/ILA) and Immune Cells", SECTION OF IMMUNOLOGY FOREIGN MEDICAL SCIENCES, vol. 25, no. 2, 31 December 2002 (2002-12-31), pages 85 - 88, ISSN: 1001-1137 * |
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