WO2019000150A1 - 一种tl6高表达的重组cho细胞的构建方法 - Google Patents

一种tl6高表达的重组cho细胞的构建方法 Download PDF

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Definitions

  • the present invention belongs to the field of recombinant cell technology, and relates to a method for constructing recombinant CHO cells with high expression of TL6.
  • TL6 is a ligand for the surface molecule AITR on thymus-derived CD4+ CD25+ Treg cells. research shows
  • AITR/TL6 has many important biological activities, including cell proliferation, differentiation and survival. technical problem
  • the AITR/TL6 system is involved in the role of Treg cells in immunoregulation, plays an important role in tumor immunotherapy, and has a good clinical transformation prospect.
  • cells with high expression of TL6 have progressed in related research. Caused a certain obstacle.
  • the object of the present invention is to provide a method for constructing recombinant CHO cells with high expression of TL6, which is achieved by the following technical solutions:
  • a method for constructing recombinant CHO cells with high expression of TL6, recombinant CHO cells with high expression of TL6 are
  • the CHO cell is a host cell, and the exogenous expression vector for transfecting the host cell is an expression vector comprising the full-length gene of TL6.
  • the nucleotide sequence of the TL6 full-length gene is shown in SEQ ID No: 1.
  • the expression vector comprising the full-length gene of TL6 is pCAG(m)-IRESblast, and the expression vector is a full-length gene of TL6 cloned into eukaryotic expression vector pCAG(m) by EcoR I and Spel cleavage sites. -IRESblast.
  • the present invention constructs the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast of human TL6, which is confirmed by cloning and sequencing to be identical to the human TL6 sequence in the NCBI database; transfected CHO cells by liposome method, and killed by rice blast fungus Screening for stable growth and survival of cell lines, and screening by stable PCR
  • the recombinant CHO/TL6 cell line with high expression of TL6; the recombinant CH 0/TL6 cell line containing the full length of the TL6 gene constructed by the present invention can stably express TL6 and has a complete molecular structure.
  • CHO cells as host cells have many advantages, including relatively low expression of the cells themselves, while exogenous recombinant genes have higher amplification and expression ability, and TL6 expressed by recombinant CHO/TL6 cells.
  • the relative expression level was significantly higher than that of CHO, and TL6 occupied the dominant expression level compared with other expression products.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the results of detecting the expression level of TL6 by fluorescent quantitative PCR after screening for CHO cells by blasticidin.
  • the present invention is based on the construction of the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast-TL6 of the full-length gene of TL6, and transfects CHO cells to obtain a stable CHO/TL6 cell line stably expressing TL6, the following is the present The explanation of the embodiments of the invention is not to be construed as limiting.
  • the pCAG(m)-IRESblast-based vector was used, and the EcoR I and Spel cleavage sites were specifically selected as the multiple cloning site for the foreign gene.
  • TL6-F 5'- GGAATTCATGACATTGCATCCTTCACC - 3'
  • TL6-R 5'- GACTAGTCTAGGAGATGAATTGGGGA -3
  • Amplification was carried out by using the PrimeSTAR enzyme of Dalian Bao Biotechnology Co., Ltd., and the PCR reaction system was: upstream primer 4 ⁇ , downstream primer 4 L, 2 ⁇ Premix PrimeSTAR 25 L, cDNA: 1 ⁇ , supplement ddH20 to 50 L; 98 ° C 2 min After 30 cycles (denaturation at 98 °C for 10 s, annealing at 60 °C for 10 s, extension at 72 °C for 1 min), and finally extension at 72 °C for 5 min, a large number of target fragments were obtained, and the product was purified by commercial PCR. Test The kit is used to purify the amplified product.
  • the EcoC I, Spe I double-digested eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast and TL6 gene purified product The enzyme digestion system is: EcoRIl L, SpeI1.5 L, DNA/plasmid: 2 g, lOxFastDigest Buffer 2 L, add ddH20 to 20 ⁇ ; react at 37 ° C for 30 min, and purify the product by using a commercial PCR product purification kit.
  • Non-resistant LB liquid medium shaken at 37 ° C for 1 h, take all the bacterial solution, apply to LB solid medium containing ampicillin resistance (final concentration 100 g / mL), culture overnight at 37 ° C, pick Monoclonal cultures were expanded in LB liquid medium containing ampicillin resistance (final concentration 100 g/mL) and sent to Shanghai Biotech for sequencing to verify sequence bases, ensuring sequencing results and gene banks (GenBank) Consistent.
  • CHO cells were seeded in 6-well plates at 10 6 cells per well, 18
  • the cell density is about 60 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • 1 g of pCAG(m)-IRESblast-TL6 plasmid was transduced into CHO cells by Lipofectamine 3000. After 24 hours of culture, blasticidin was added to a final concentration of 5 g/mL to screen cells.
  • CHO cells and CHO TL6 cells were seeded separately into 6-well plates.
  • the cell density reached 80 ⁇ 3 ⁇ 4-90 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , and the total RNA of each group was extracted with RN easy Mini Kit.
  • the mRNA was reverse transcribed into cDNA using PrimeScrip RT reagent Kit and stored at -20 °C.
  • TL6 As a template, GAPDH was used as an internal reference, and the relative expression of TL6 was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.
  • the reaction conditions were set: 95. C30s, 1 cycle, 58. C30s40 cycle, 95. C5s, 60 ° C lmin, 95. C 15s, knot As shown in Figure 1. It can be seen that the expression level of TL6 gene of CHO/TL6 cells is more than 160 times higher than that of CHO cells, indicating that the TL6 gene cDNA sequence provided by the present invention is successfully inserted into the pCAG(m)-IRESblast vector, and the TL6 gene can be specifically and efficiently promoted. High expression.
  • the present inventors constructed the eukaryotic expression vector of pCAG human TL6 (m) -IRESbla S t, the consensus sequence was confirmed after cloning and sequencing the NCBI database with the human sequence TL6; after lipofectamine transfection of CHO cells, Blasticidin The sputum resistance was screened to obtain a cell line capable of stable growth and survival, and a recombinant CHO/TL6 cell line stably expressing TL6 was screened by quantitative PCR; the recombinant CH 0/ containing the full length of the TL6 gene constructed by the present invention was constructed.
  • the TL6 cell line stably expressed TL6 and had a complete molecular structure.
  • CHO cells as host cells have many advantages, including a relatively low amount of protein expression in the cell itself, and a higher amplification and expression ability of the foreign recombinant gene, and TL6 expressed by the recombinant CHO/TL6 cells.
  • the relative expression level was significantly higher than that of CHO, and TL6 occupied the dominant expression level compared with other expression products.

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Abstract

一种TL6高表达的重组CHO细胞的构建方法，利用真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast构建全长TL6基因真核表达载体pCAG(m)-IRESblast-TL6，进而以其转染CHO细胞，利用杀稻瘟菌素筛选得到高表达全长TL6的基因的工程细胞系 CHO/TL6，并证实该细胞系可大幅提高全长 TL6的表达。

Description

说明书 发明名称：一种 TL6高表达的重组 CHO细胞的构建方法 技术领域
[0001] 本发明属于重组细胞技术领域， 涉及一种 TL6高表达的重组 CHO细胞的构建方 法。
背景技术
[0002] TL6是胸腺来源的 CD4+ CD25+Treg细胞上的表面分子 AITR的配体。 研究表明
， AITR/TL6具有许多重要的生物学活性， 包括细胞的增殖、 分化和存活等。 技术问题
[0003] AITR/TL6系统参与 Treg细胞发挥免疫调节的作用， 在肿瘤的免疫治疗中起重要 作用， 具有较好的临床转化前景， 但现有技术中 TL6高表达的细胞， 对相关研究 的进展造成了一定的阻碍。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明的目的在于提供一种 TL6高表达的重组 CHO细胞的构建方法， 通过以下 技术方案来实现：
[0005] 一种 TL6高表达的重组 CHO细胞的构建方法， TL6高表达的重组 CHO细胞是以
CHO细胞为宿主细胞， 转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含 TL6全长基因的 表达载体。
[0006] 所述的 TL6全长基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示。
[0007] 所述的包含 TL6全长基因的表达载体是 pCAG(m)-IRESblast， 该表达载体是通过 EcoR I与 Spel酶切位点将 TL6全长基因克隆入真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast。 发明的有益效果
有益效果
[0008] 本发明构建了人 TL6的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast， 经过克隆测序证实序 列同 NCBI数据库中的人 TL6序列一致； 经过脂质体法转染 CHO细胞， 杀稻瘟菌 素抗性筛选获得能够稳定生长、 存活的细胞株， 经过定量 PCR检测， 筛选出稳定 、 高表达 TL6的重组 CHO/TL6细胞株； 本发明构建的包含 TL6基因全长的重组 CH 0/TL6细胞株能够稳定表达 TL6， 具有完整的分子结构。
[0009] 作为宿主细胞的 CHO细胞具有许多优势， 包括细胞本身蛋白表达量相对较低， 而对外源的重组基因则具有较高的扩增和表达能力， 重组后的 CHO/TL6细胞表 达的 TL6的相对表达量较 CHO空载明显升高， 相对于其他表达产物， TL6占据优 势表达量。
[0010] 通过定量 PCR检测技术， 证明 TL6表达量相比 CHO明显升高， 且其在细胞膜上 的表达较 CHO细胞表达量明显提高。
对附图的简要说明
附图说明
[0011] 图 1为杀稻瘟菌素筛选 CHO细胞后荧光定量 PCR检测 TL6表达水平结果示意图。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0012] 下面结合附图及实施例对本发明做详细描述。
[0013] 本发明在构建 TL6全长基因的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast-TL6的基础上， 转染 CHO细胞， 获得稳定、 高表达 TL6的重组 CHO/TL6细胞株， 下面是对本发明 实施例的解释而不是限定。
[0014] 本实施例以 pCAG(m)-IRESblast为基础载体， 具体选择 EcoR I与 Spel酶切位点作 为连接外源基因的多克隆位点。
[0015] 实施例一 TL6基因的克隆
[0016] 以 A375细胞的 cDNA为模板， 采用 Premier Primer 6.0软件设计相应的特异性弓 | 物， 并在两端分别加入 EcoR I和 Spe l酶切位点： TL6-F: 5'- GGAATTCATGACATTGCATCCTTCACC -3'； TL6-R: 5'- GACTAGTCTAGGAGATGAATTGGGGA -3，。
[0017] 采用大连宝生物公司 PrimeSTAR酶进行扩增， PCR反应体系为： 上游引物 4μί 、 下游引物 4 L、 2xPremix PrimeSTAR 25 L、 cDNA: 1μΙ^、 补加 ddH20至 50 L ； 98°C 2 min， 再经过 30个循环作用 (98°C变性 10 s， 60°C退火 10 s， 72°C延伸 1 min) , 最后 72°C延伸 5 min， 得到大量目的片段， 对产物采用商品化 PCR纯化试 剂盒将扩增产物纯化。
[0018] 实施例二重组表达载体构建
[0019] 利用 EcoR I、 Spe I双酶切真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast和 TL6基因纯化产物 ： 酶切体系为： EcoRIl L、 SpeI1.5 L、 DNA/质粒： 2 g、 lOxFastDigest Buffer 2 L、 补加 ddH20至 20μί; 37°C反应 30min， 对酶切产物采用商品化 PCR 产物纯化试剂盒纯化。
[0020] 将线性化载体与酶切后的 TL6扩增片段 4°C条件下， T4 DNA连接酶作用下过夜 连接， 反应体系为： 酶切后的线性 pCAG(m)-IRESblast2 L、 酶切后的 TL6片段 5 μί、 T4DNA连接酶 1μί、 10xT4 DNA连接酶 Buffer
Ιμί, 获得重组 pCAG(m)-IRESblast-TL6表达载体。
[0021] 将 5 重组 pCAG(m)-IRESblast-TL6质粒加入 5( L
ToplO感受态细胞中， 冰浴 30min， 42°C热激 60s， 冰浴 2min， 加入 50
无抗性 LB液体培养基， 37°C振摇 lh， 取全部菌液， 涂布至含有氨苄霉素抗性 (终浓度 100 g/mL) LB固体培养基中， 37°C过夜培养， 挑取单克隆在含有氨苄 霉素抗性 （终浓度 100 g/mL) LB液体培养基中扩大培养， 并送上海生工进行测 序， 验证序列碱基， 确保测序结果与基因库 （GenBank) 中的一致。
[0022] 实施例三重组载体转导 CHO细胞
[0023] 接种 CHO细胞于 6孔板中， 每孔 106个细胞， 18
h后细胞密度约为 60<¾。 取 pCAG(m)-IRESblast-TL6质粒 1 g， 应用 Lipofectamine 3000转导至 CHO细胞中， 继续培养 24 h后， 加入杀稻瘟菌素至终浓度为 5 g/mL ， 筛选细胞。
[0024] 实施例四荧光定量 PCR检测 TL6基因表达量
[0025] 分别接种 CHO细胞和 CHO TL6细胞至 6孔板。 细胞密度达到 80<¾-90<¾吋， 用 RN easy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent Kit将 mRNA逆 转录为 cDNA， -20°C保存。
[0026] 取各组细胞的 cDNA 1
为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR检测 TL6相对表达量， 设置反 应条件： 95。C30s， 1循环， 58。C30s40循环， 95。C5s， 60°C lmin, 95。C 15s， 结 果如图 1所示。 可以看到， CHO/TL6细胞的 TL6基因表达水平较 CHO细胞高 160倍 以上， 说明本发明提供的 TL6基因 cDNA序列成功插入至 pCAG(m)-IRESblast载体 中， 能特异、 高效地促进 TL6基因高表达。
[0027] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护范围。
工业实用性
[0028] 本发明构建了人 TL6的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblaSt， 经过克隆测序证实序 列同 NCBI数据库中的人 TL6序列一致； 经过脂质体法转染 CHO细胞， 杀稻瘟菌 素抗性筛选获得能够稳定生长、 存活的细胞株， 经过定量 PCR检测， 筛选出稳定 、 高表达 TL6的重组 CHO/TL6细胞株； 本发明构建的包含 TL6基因全长的重组 CH 0/TL6细胞株能够稳定表达 TL6， 具有完整的分子结构。
[0029] 作为宿主细胞的 CHO细胞具有许多优势， 包括细胞本身蛋白表达量相对较低， 而对外源的重组基因则具有较高的扩增和表达能力， 重组后的 CHO/TL6细胞表 达的 TL6的相对表达量较 CHO空载明显升高， 相对于其他表达产物， TL6占据优 势表达量。
[0030] 通过定量 PCR检测技术， 证明 TL6表达量相比 CHO明显升高， 且其在细胞膜上 的表达较 CHO细胞表达量明显提高。
[0031] 。

Claims

权利要求书 [权利要求 1] 一种 TL6高表达的重组 CHO细胞的构建方法， 其特征在于： TL6高表 达的重组 CHO细胞是以 CHO细胞为宿主细胞， 转染宿主细胞的外源 性表达载体的是包含 TL6全长基因的表达载体。 [权利要求 2] 根据权利要求 1所述的一种 TL6高表达的重组 CHO细胞的构建方法， 其特征在于： 所述的 TL6全长基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示 [权利要求 3] 根据权利要求 1所述的一种 TL6高表达的重组 CHO细胞的构建方法， 其特征在于： 所述的包含 TL6全长基因的表达载体是 pCAG(m)-IRESbl ast, 该表达载体是通过 EcoR I和 Spe I酶切位点将 TL6全长基因克隆入 真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast。 [权利要求 4] 根据权利要求 1至 3任一权利要求所述的一种 TL6高表达的重组 CHO细 胞的构建方法， 其特征在于： 包括以下步骤：
(1) TL6基因的克隆
以 A375细胞的 cDNA为模板， 采用 Premier Primer 6.0软件设计相应的 特异性引物， 并在两端分别加入 EcoR I和 Spe I酶切位点： TL6-F: 5'- GGAATTCATGACATTGCATCCTTCACC -3'； TL6-R: 5'- GACTAGTCTAGGAGATGAATTGGGGA -3，。
采用大连宝生物公司 PrimeSTAR酶进行扩增， PCR反应体系为： 上游 引物 4μί、 下游引物 4 L、 2xPremix PrimeSTAR 25 L、 cDNA: 1μΙ^、 补加 ddH20至 50μί; 98°C 2 min, 再经过 30个循环作用 (98°C变性 10 s ， 60°C退火 10 s， 72°C延伸 l min)， 最后 72°C延伸 5 min， 得到大量目 的片段， 对产物采用商品化 PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化。
(2) 重组表达载体构建
利用 EcoR I、 Spe I双酶切真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast和 TL6基因 纯化产物： 酶切体系为： EcoR I l L、 Spe I 1.5 L、 DNA/质粒： 2μβ 、 lOxFastDigest Buffer 2μ^ 补加 ddH20至 2(^L; 37°C反应 30 min， 对酶切产物采用商品化 PCR产物纯化试剂盒纯化。 将线性化载体与酶切后的 TL6扩增片段 4°C条件下， T4 DNA连接酶作 用下过夜连接， 反应体系为： 酶切后的线性 pCAG(m)-IRESblast 2μί 、 酶切后的 TL6片段 5μί、 T4 DNA连接酶 1 μί、 10xT4
DNA连接酶 Buffer Ιμί, 获得重组 pCAG(m)-IRESblast-TL6表达载体 将 5 重组 pCAG(m)-IRESblast-TL6质粒加入 5( L ToplO感受态细胞 中， 冰浴 30 min， 42°C热激 60 s， 冰浴 2 min， 加入 50 无抗性 LB液 体培养基， 37°C振摇 l h， 取全部菌液， 涂布至含有氨苄霉素抗性 （ 终浓度 100 g/mL) LB固体培养基中， 37°C过夜培养， 挑取单克隆在 含有氨苄霉素抗性 （终浓度 100 g/mL) LB液体培养基中扩大培养， 并送上海生工进行测序， 验证序列碱基， 确保测序结果与基因库 （G enBank) 中的一致。
(3) 重组载体转导 CHO细胞
接种 CHO细胞于 6孔板中， 每孔 10 6个细胞， 18 h后细胞密度约为 60% 。 取 pCAG(m)-IRESblast-TL6质粒 1 g， 应用 Lipofectamine 3000转导 至 CHO细胞中， 继续培养 24 h后， 加入杀稻瘟菌素至终浓度为 5
筛选细胞。
(4) 荧光定量 PCR检测 TL6基因表达量
分别接种 CHO细胞和 CHO/TL6细胞至 6孔板。 细胞密度达到 80<¾-90<¾ 吋， 用 RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， -20。C保存。
取各组细胞的 cDNA 1
为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR检测 TL6相对表达 量， 设置反应条件： 95。C 30s， 1循环， 58。C 30s 40循环， 95。C 5s， 60 °C lmin, 95°C
15s, 结果如图 1所示。 可以看到， CHO/TL6细胞的 TL6基因表达水平 较 CHO细胞高 160倍以上。
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