WO2019000144A1 - 一种表达aitr基因的cho细胞及其应用 - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Definitions

  • the present invention belongs to the field of recombinant cell technology, and relates to a CHO cell expressing an AITR gene and an application thereof.
  • AITR is the 18th member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily and is a thymus-derived C D4+
  • AITR/AITRL A surface molecule on CD25+Treg cells whose ligand is AITRL. Studies have shown that AITR/AITRL has many important biological activities, including cell proliferation, differentiation and survival. Because AITR is mainly expressed on resting Treg cells, anti-AITR antibody (DTA-1) abolishes the immunosuppressive effects of Treg cells. .
  • the AITR/AITRL system is involved in the role of Treg cells in the regulation of immune regulation, and has a good clinical transformation prospect.
  • the lack of cells expressing the AITR gene in the prior art has hindered the progress of related research.
  • a CHO cell expressing an AITR gene wherein the recombinant CHO cell with high expression of AITR is a CHO cell as a host cell, and an exogenous expression vector for transfecting the host cell is an expression vector comprising the full length gene of AITR.
  • the expression vector comprising the full-length gene of AITR is pCAG(m)-IRESblast, and the expression vector is via EcoR
  • the full-length AITR gene was cloned into the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast by I and Spel cleavage sites.
  • the present invention constructs the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast of human AITR, which is confirmed by clone sequencing to be identical to the human AITR sequence in the NCBI database; transfected CHO cells by liposome method, and killed by rice blast fungus A cell line capable of stably growing and surviving was obtained by screening for resistance, and a recombinant CHO/AITR cell line stably expressing and highly expressing AITR was screened by quantitative PCR; a recombinant CHO/AITR cell line containing the full length of the AITR gene constructed by the present invention was constructed. It can stably express AITR and has a complete molecular structure.
  • CHO cells as host cells have many advantages, including relatively low levels of protein expression in cells themselves, and higher amplification and expression ability of exogenous recombinant genes, and AITR expressed in recombinant CHO/AITR cells.
  • the relative expression level was significantly higher than that of CHO, and AITR occupied the dominant expression level compared with other expression products.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the results of detection of AITR expression levels by fluorescent quantitative PCR after screening for CHO cells by blasticidin. A preferred embodiment for carrying out the invention.
  • the present invention is based on the construction of the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast-AITR of the full-length gene of AITR, transfecting CHO cells to obtain a stable CHO/AITR cell line stably expressing AITR, the following is the present The explanation of the embodiments of the invention is not to be construed as limiting.
  • the pCAG(m)-IRESblast-based vector was used, and the EcoR I and Spel cleavage sites were specifically selected as the multiple cloning site for the foreign gene.
  • Amplification was carried out by using the PrimeSTAR enzyme of Dalian Bao Biotech Co., Ltd., and the PCR reaction system was: upstream primer 4 ⁇ , downstream primer 4 L, 2x Premix PrimeSTAR 25 L, cDNA: 1 ⁇ , plus ddH20 to 50 L; 98 ° C for 2 min, After 30 cycles (denaturation at 98 °C for 10 s, annealing at 60 °C for 10 s, extension at 72 °C for 1 min), and finally extension at 72 °C for 5 min, a large number of target fragments were obtained, and the product was expanded using a commercial PCR purification kit. The product is purified.
  • the purified product of pCAG(m)-IRESblast and AITR gene was digested with EcoR I and Spe I:
  • the enzyme digestion system was: EcoRIl L, SpeI1.5 L, DNA/plasmid: 2 g, lOxFastDigest Buffer 2 L, add ddH20 to 20 ⁇ ; react at 37 ° C for 30 min, and purify the product by using a commercial PCR product purification kit.
  • Non-resistant LB liquid medium shaken at 37 ° C for 1 h, take all the bacterial solution, apply to LB solid medium containing ampicillin resistance (final concentration 100 g / mL), culture overnight at 37 ° C, pick Monoclonal cultures were expanded in LB liquid medium containing ampicillin resistance (final concentration 100 g/mL) and sent to Shanghai Biotech for sequencing to verify sequence bases, ensuring sequencing results and gene banks (GenBank) Consistent.
  • CHO cells were seeded in 6-well plates at 10 6 cells per well, 18
  • Lipofectamine3000 was transduced into CHO cells, and after continuing to culture for 24 h, blasticidin was added to a final concentration of 5 g/mL, and the cells were selected.
  • Example 4 Detection of AITR Gene Expression by Real-time PCR
  • CHO cells and CHO/AITR cells were seeded separately into 6-well plates. The cell density reached 80 ⁇ 3 ⁇ 4-90 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , and the total RNA of each group was extracted with R Neasy Mini Kit. The mRNA was reverse transcribed into cDNA using PrimeScrip RT reagent Kit and stored at -20 °C.
  • the present invention constructs the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast of human AITR, which is confirmed by cloning and sequencing to be identical to the human AITR sequence in the NCBI database; transfected CHO cells by liposome method, and killed by rice blast fungus A cell line capable of stably growing and surviving was obtained by screening for resistance, and a recombinant CHO/AITR cell line stably expressing and highly expressing AITR was screened by quantitative PCR; a recombinant CHO/AITR cell line containing the full length of the AITR gene constructed by the present invention was constructed. It can stably express AITR and has a complete molecular structure.
  • CHO cells as host cells have many advantages, including relatively low protein expression in cells, and high amplification and expression ability of exogenous recombinant genes, and AITR expressed in recombinant CHO/AITR cells.
  • the relative expression level was significantly higher than that of CHO, and AITR occupied the dominant expression level compared with other expression products.

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Abstract

一种表达AITR基因的CHO细胞，利用真核表达载体pCAG(m)-IRESblast构建全长AITR基因真核表达载体pCAG(m)-IRESblast-AITR，进而以其转染CHO细胞，利用杀稻瘟菌素筛选得到高表达全长AITR的基因的工程细胞系CHO/AITR，并证实该细胞系可大幅提高全长AITR的表达。

Description

说明书 发明名称：一种表达 AITR基因的 CHO细胞及其应用 技术领域
[0001] 本发明属于重组细胞技术领域， 涉及一种表达 AITR基因的 CHO细胞及其应用 背景技术
[0002] AITR是肿瘤坏死因子受体 （TNFR) 超家族中的第 18个成员， 是胸腺来源的 C D4+
CD25+Treg细胞上的一个表面分子， 其配体为 AITRL。 研究表明， AITR/AITRL 具有许多重要的生物学活性， 包括细胞的增殖、 分化和存活等。 因为 AITR主要 表达在静息性的 Treg细胞上， 故抗 AITR抗体 (DTA-1)可消除 Treg细胞的免疫抑制 作用。 。
技术问题
[0003] AITR/AITRL系统参与 Treg细胞发挥免疫调节的作用， 具有较好的临床转化前 景， 但现有技术中缺乏表达 AITR基因的细胞， 对相关研究的进展造成了一定的 阻碍。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明的目的在于提供一种表达 AITR基因的 CHO细胞， 通过以下技术方案来 实现：
[0005] 一种表达 AITR基因的 CHO细胞， AITR高表达的重组 CHO细胞是以 CHO细胞为 宿主细胞， 转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含 AITR全长基因的表达载体
[0006] 所述的 AITR全长基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示。
[0007] 所述的包含 AITR全长基因的表达载体是 pCAG(m)-IRESblast， 该表达载体是通 过 EcoR
I与 Spel酶切位点将 AITR全长基因克隆入真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast。 发明的有益效果
有益效果
[0008] 本发明构建了人 AITR的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast， 经过克隆测序证实 序列同 NCBI数据库中的人 AITR序列一致； 经过脂质体法转染 CHO细胞， 杀稻瘟 菌素抗性筛选获得能够稳定生长、 存活的细胞株， 经过定量 PCR检测， 筛选出稳 定、 高表达 AITR的重组 CHO/AITR细胞株； 本发明构建的包含 AITR基因全长的 重组 CHO/AITR细胞株能够稳定表达 AITR， 具有完整的分子结构。
[0009] 作为宿主细胞的 CHO细胞具有许多优势， 包括细胞本身蛋白表达量相对较低， 而对外源的重组基因则具有较高的扩增和表达能力， 重组后的 CHO/AITR细胞表 达的 AITR的相对表达量较 CHO空载明显升高， 相对于其他表达产物， AITR占据 优势表达量。
[0010] 通过定量 PCR检测技术， 证明 AITR表达量相比 CHO明显升高， 且其在细胞膜 上的表达较 CHO细胞表达量明显提高。
对附图的简要说明
附图说明
[0011] 图 1为杀稻瘟菌素筛选 CHO细胞后荧光定量 PCR检测 AITR表达水平结果示意图 实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0012] 下面结合附图及实施例对本发明做详细描述。
[0013] 本发明在构建 AITR全长基因的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast-AITR的基础 上， 转染 CHO细胞， 获得稳定、 高表达 AITR的重组 CHO/AITR细胞株， 下面是 对本发明实施例的解释而不是限定。
[0014] 本实施例以 pCAG(m)-IRESblast为基础载体， 具体选择 EcoR I与 Spel酶切位点作 为连接外源基因的多克隆位点。
[0015] 实施例一 AITR基因的克隆
[0016] 以 A375细胞的 cDNA为模板， 采用 Premier Primer 6.0软件设计相应的特异性弓 | 物， 并在两端分别加入 EcoRI和 Spel酶切位点： AITR-F: 5'- GTGAATTCATGGCACAGCACGGGGCG -3'； AITR-R: 5'- GACTAGTTCACACCCACAGGTCTCCCAG -3，。
[0017] 采用大连宝生物公司 PrimeSTAR酶进行扩增， PCR反应体系为： 上游引物 4μί 、 下游引物 4 L、 2xPremix PrimeSTAR 25 L、 cDNA: 1μΙ^、 补加 ddH20至 50 L ； 98°C2min， 再经过 30个循环作用 (98°C变性 10 s， 60°C退火 10s， 72°C延伸 1 min), 最后 72°C延伸 5min， 得到大量目的片段， 对产物采用商品化 PCR纯化试 剂盒将扩增产物纯化。
[0018] 实施例二重组表达载体构建
[0019] 利用 EcoR I、 Spe I双酶切真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast和 AITR基因纯化产 物： 酶切体系为： EcoRIl L、 SpeI1.5 L、 DNA/质粒： 2 g、 lOxFastDigest Buffer 2 L、 补加 ddH20至 20μί; 37°C反应 30min， 对酶切产物采用商品化 PCR 产物纯化试剂盒纯化。
[0020] 将线性化载体与酶切后的 AITR扩增片段 4°C条件下， T4 DNA连接酶作用下过 夜连接， 反应体系为： 酶切后的线性 pCAG(m)-IRESblast2 L、 酶切后的 AITR片 段 5μί、 T4DNA连接酶 1μί、 10xT4 DNA连接酶 Buffer
Ιμί, 获得重组 pCAG(m)-IRESblast-AITR表达载体。
[0021] 将 5 重组 pCAG(m)-IRESblast-AITR质粒加入 5( L
ToplO感受态细胞中， 冰浴 30min， 42°C热激 60s， 冰浴 2min， 加入 50
无抗性 LB液体培养基， 37°C振摇 lh， 取全部菌液， 涂布至含有氨苄霉素抗性 (终浓度 100 g/mL) LB固体培养基中， 37°C过夜培养， 挑取单克隆在含有氨苄 霉素抗性 （终浓度 100 g/mL) LB液体培养基中扩大培养， 并送上海生工进行测 序， 验证序列碱基， 确保测序结果与基因库 （GenBank) 中的一致。
[0022] 实施例三重组载体转导 CHO细胞
[0023] 接种 CHO细胞于 6孔板中， 每孔 106个细胞， 18
h后细胞密度约为 60<¾。 取 pCAG(m)-IRESblast-AITR质粒 1
g， 应用 Lipofectamine3000转导至 CHO细胞中， 继续培养 24 h后， 加入杀稻瘟 菌素至终浓度为 5 g/mL， 筛选细胞。 [0024] 实施例四荧光定量 PCR检测 AITR基因表达量
[0025] 分别接种 CHO细胞和 CHO/AITR细胞至 6孔板。 细胞密度达到 80<¾-90<¾吋， 用 R Neasy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent Kit将 mRNA逆 转录为 cDNA， -20°C保存。
[0026] 取各组细胞的 cDNA 1
为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR检测 AITR相对表达量， 设置反 应条件： 95。C 30s， 1循环， 58。C 30s 40循环， 95。C 5s， 60°C lmin, 95。C 15s， 结 果如图 1所示。 可以看到， CHO/AITR细胞的 AITR基因表达水平较 CHO细胞高 14 0倍， 说明本发明提供的 AITR基因 cDNA序列成功插入至 pCAG(m)-IRESblast载体 中， 能特异、 高效地促进 AITR基因高表达。
工业实用性
[0027] 本发明构建了人 AITR的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast， 经过克隆测序证实 序列同 NCBI数据库中的人 AITR序列一致； 经过脂质体法转染 CHO细胞， 杀稻瘟 菌素抗性筛选获得能够稳定生长、 存活的细胞株， 经过定量 PCR检测， 筛选出稳 定、 高表达 AITR的重组 CHO/AITR细胞株； 本发明构建的包含 AITR基因全长的 重组 CHO/AITR细胞株能够稳定表达 AITR， 具有完整的分子结构。
[0028] 作为宿主细胞的 CHO细胞具有许多优势， 包括细胞本身蛋白表达量相对较低， 而对外源的重组基因则具有较高的扩增和表达能力， 重组后的 CHO/AITR细胞表 达的 AITR的相对表达量较 CHO空载明显升高， 相对于其他表达产物， AITR占据 优势表达量。
[0029] 通过定量 PCR检测技术， 证明 AITR表达量相比 CHO明显升高， 且其在细胞膜 上的表达较 CHO细胞表达量明显提高。

Claims

权利要求书 [权利要求 1] 一种表达 AITR基因的 CHO细胞， 其特征在于： AITR高表达的重组 C HO细胞是以 CHO细胞为宿主细胞， 转染宿主细胞的外源性表达载体 的是包含 AITR全长基因的表达载体。 [权利要求 2] 根据权利要求 1所述的一种表达 AITR基因的 CHO细胞， 其特征在于： 所述的 AITR全长基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示。 [权利要求 3] 根据权利要求 1所述的一种表达 AITR基因的 CHO细胞， 其特征在于： 所述的包含 AITR全长基因的表达载体是 pCAG(m)-IRESblaSt， 该表 达载体是通过 EcoR I和 Spe I酶切位点将 AITR全长基因克隆入真核表 达载体 pCAG(m)-IRESblast。 [权利要求 4] 根据权利要求 1至 3任一权利要求所述的一种 AITR高表达的重组 CHO 细胞的构建方法， 其特征在于： 包括以下步骤：
(1) AITR基因的克隆
以 A375细胞的 cDNA为模板， 采用 Premier Primer 6.0软件设计相应的 特异性弓 I物， 并在两端分别加入 EcoR I和 Spe
I酶切位点： AITR-F: 5'- GTGAATTCATGGCACAGCACGGGGCG -3 '； AITR-R： 5， - GACTAGTTCACACCCACAGGTCTCCCAG -3，。 采用大连宝生物公司 PrimeSTAR酶进行扩增， PCR反应体系为： 上游 引物 4μί、 下游引物 4 L、 2xPremix PrimeSTAR 25 L、 cDNA: 1μΙ^、 补加 ddH20至 50μί; 98°C 2 min, 再经过 30个循环作用 (98°C变性 10 s ， 60°C退火 10 s， 72°C延伸 l min)， 最后 72°C延伸 5 min， 得到大量目 的片段， 对产物采用商品化 PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化。
(2) 重组表达载体构建
利用 EcoR I、 Spe I双酶切真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast和 AITR基 因纯化产物： 酶切体系为： EcoR I l L、 Spe l
1.5 L、 DNA/质粒： 2 g、 lOxFastDigest Buffer 2μ^ 补加 ddH20至 20 μί; 37°C反应 30 min， 对酶切产物采用商品化 PCR产物纯化试剂盒纯 化。 将线性化载体与酶切后的 AITR扩增片段 4°C条件下， T4 DNA连接酶 作用下过夜连接， 反应体系为： 酶切后的线性 pCAG(m)-IRESblaSt 2μί、 酶切后的 AITR片段 5μί、 T4 DNA连接酶 1 μί、 10xT4 DNA连 接酶 Buffer Ιμί, 获得重组 pCAG(m)-IRESblast-AITR表达载体。
将 5 重组 pCAG(m)-IRESblast-AITR质粒加入 5( L ToplO感受态细胞 中， 冰浴 30 min， 42°C热激 60 s， 冰浴 2 min， 加入 50 无抗性 LB液 体培养基， 37°C振摇 l h， 取全部菌液， 涂布至含有氨苄霉素抗性 （ 终浓度 100 g/mL) LB固体培养基中， 37°C过夜培养， 挑取单克隆在 含有氨苄霉素抗性 （终浓度 100 g/mL) LB液体培养基中扩大培养， 并送上海生工进行测序， 验证序列碱基， 确保测序结果与基因库 （G enBank) 中的一致。
(3) 重组载体转导 CHO细胞
接种 CHO细胞于 6孔板中， 每孔 10 6个细胞， 18 h后细胞密度约为 60% 。 取 pCAG(m)-IRESblast-AITR质粒 1 g， 应用 Lipofectamine 3000转导 至 CHO细胞中， 继续培养 24 h后， 加入杀稻瘟菌素至终浓度为 5
筛选细胞。
(4) 荧光定量 PCR检测 AITR基因表达量
分别接种 CHO细胞和 CHO/AITR细胞至 6孔板。 细胞密度达到 80<¾-90 <¾吋， 用 RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， -20。C保存。
取各组细胞的 cDNA 1
为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR检测 AITR相对表达 量， 设置反应条件： 95。C 30s， 1循环， 58。C 30s 40循环， 95。C 5s， 60 °C lmin, 95°C
15s, 结果如图 1所示。 可以看到， CHO/AITR细胞的 AITR基因表达水 平较 CHO细胞高 140倍。
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