WO2018159512A1 - 新規温度感受性納豆菌、及び胞子低含有納豆 - Google Patents

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WO2018159512A1
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篤志 石川
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株式会社Ｍｉｚｋａｎ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/50—Fermented pulses or legumes; Fermentation of pulses or legumes based on the addition of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/952—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from bacteria
    • G01N2333/954—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from bacteria bacteria being Bacillus
    • G01N2333/956—Bacillus subtilis or Bacillus licheniformis

Definitions

  • the present invention has a normal spore-forming ability in a temperature range usually used for liquid culture for obtaining a natto starter for inoculation, but a temperature sensitivity in which the spore-forming ability is reduced in a temperature range usually used for natto fermentation. No. natto mutants and natto with a small number of spores produced using the mutants. More specifically, since the spore-forming ability changes in a temperature-dependent manner, it has normal spore-forming ability during liquid culture for obtaining Bacillus natto starter, but the spore-forming ability is reduced during the fermentation process of natto production.
  • Bacillus natto mutants natto with fewer spores produced using the mutants, which can be heat-sterilized, a method for producing the same, and reduction of spore and vegetative cells of natto bacteria in the natto using the mutants Regarding the method.
  • Thread-drawn natto fermented with natto bacteria (hereinafter simply referred to as “natto”) is an ancient Japanese fermented food that is rich in soy protein, has high nutritional value, has a unique flavor and sticky texture.
  • natto has various health promotion effects (thrombus prevention action, blood pressure lowering action, cholesterol lowering action, bone formation promoting action, fat burning action, etc.) due to probiotic action, antibacterial action, functional ingredients, etc. It is a food that is increasingly expected to be in demand.
  • Natto is generally selected from raw soybean selection process, washing process, water immersion process, steaming process, inoculation (inoculation) process of natto, filling process in container, fermentation process, cooling / ripening process, packaging process, It is manufactured through.
  • a stringing component having a strong stickiness mainly composed of polyglutamic acid is generated by the fermentation action of Bacillus natto.
  • the stringing component has the property of giving natto a unique flavor and texture.
  • natto-specific aroma components mainly composed of diacetyl, acetoin, pyrazines and the like, which are described as natto odor, are produced.
  • natto odor with a moderate concentration contributes to improving the taste of natto as a unique flavor of natto.
  • ammonia is also produced, but excessive ammonia production causes a bad odor and causes a decrease in palatability.
  • spores such as natto bacillus spores
  • spores take two states, vegetative cells and spores, depending on the environment. It forms, maintains dormancy, and germinates to become vegetative cells and repeats cell division when the environment is suitable for growth.
  • inoculation with natto bacteria is performed on high-temperature soybeans after the steaming process, so when natto bacteria in the state of vegetative cells with low heat resistance are sprayed, natto bacteria die and are good. Fermentation cannot be obtained. Therefore, Bacillus natto in a physically and chemically stable spore state is usually used for inoculation with Bacillus natto.
  • Bacillus natto spores have very high heat resistance, Bacillus natto spores remain in the product even if the natto characteristics can be maintained by heat sterilization at 100 ° C. or lower.
  • it is a guideline to keep the number of viable bacteria per gram of processed food from 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 order or less within the consumption or expiration date. Yes.
  • natto fungal spores in the natto product are more natto fungal spores in the natto product than the above-mentioned range of the number of viable bacteria in general processed foods, when processing the natto itself in a general processed food production line, When using as a part for processed foods, there is a risk of natto fungal spores adhering to the processed food production line and mixing with other processed foods that do not use natto produced in that production line . As a result, the use of natto for processed foods is limited.
  • spores natto fungal spores
  • heat sterilization is used, but sterilization of spores in natto usually requires heating at about 120 ° C. Under such heating conditions, bitterness is lost, stringing is lost, and ammonia odor is emitted. It is difficult to maintain the quality of natto.
  • Patent Document 1 For example, a method of performing sterilization treatment on dried natto obtained by drying natto produced using natto bacteria having a low spore formation rate (see Patent Document 1), or a timing when the vegetative cell rate of natto bacteria is high and the spore rate is low A method of performing sterilization (see Patent Document 2) has been reported.
  • the method using dry natto is not raw natto, so a difference in texture occurs.
  • sterilization at low timing of spore formation mainly consists of sterilization of vegetative cells with low heat resistance, so if you do not germinate by special methods such as adding L-alanine, natto Since a considerable number of fungal spores remain, it was insufficient to reduce the number of spores. Therefore, none of the methods can sufficiently ensure the quality of natto, and the sterilization is not sufficient.
  • the present invention has a normal spore-forming ability in a temperature range usually used for liquid culture for obtaining a natto starter for inoculation, but a temperature sensitivity in which the spore-forming ability is reduced in a temperature range usually used for natto fermentation.
  • the present inventors have surprisingly found that when a Bacillus natto mutant is cultured at a specific gas phase temperature on a specific selective solid medium, a specific color is obtained.
  • natto mutants with reduced spore-forming ability are contained at a high rate in the temperature range normally used for natto fermentation, and natto is used at the normal fermentation temperature range using the natto mutant. It was found that natto with a small number of spores can be obtained when manufactured.
  • the Bacillus natto mutant strain has a normal spore-forming ability in a temperature range usually used for liquid culture for obtaining a Bacillus natto starter for inoculation.
  • concentration of natto spores will be low, so the culture time will be prolonged. It is necessary to take measures such as increasing the amount of liquid medium to be used, which increases costs that cannot be ignored in natto production.
  • the natto mutant is used in natto production, the above-mentioned problems do not occur.
  • the natto starter obtained by liquid culture of the natto bacillus mutant contains a high concentration of spores in the same way as the normal natto starter, natto bacillus even if inoculated into high-temperature steamed soybeans Since the spores remain sufficiently, fermented natto can be produced, and it is not necessary to add a step of lowering the temperature of soybeans after the cooking step, and there is no problem of contamination with bacteria.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • a Bacillus subtilis var. Natto mutant having the following properties (A) to (C): (A) In a selective solid medium containing biotin, the color of a single colony of the natto bacillus mutant grown by culturing at a gas phase temperature of 49 ° C. for 48 hours is 100% of the total surface area of the single colony. The area of the Munsell color system with a hue of yellow (Y), lightness of 9 or more, and saturation of 2 or less is 20% or less.
  • [2] A natto produced using the mutant of Bacillus natto according to [1].
  • [3] Natto according to [2], wherein the number of natto fungal spores is 5 ⁇ 10 5 or less per 1 g of natto.
  • the natto according to [2] which is sterilized by heating at 55 to 100 ° C. for 30 minutes to 2 hours after fermentation.
  • [5] The natto according to [4], wherein the total number of natto bacteria is 1 ⁇ 10 6 or less per 1 g of natto.
  • a method for producing natto, comprising a step of fermenting soybeans using the mutant of Bacillus natto according to [1].
  • [10] A method for reducing Bacillus natto spores and vegetative cells in natto, wherein the soybean is fermented using the mutant natto strain according to [1] and then sterilized by heating.
  • the method for reducing spore and vegetative cells of Bacillus natto in natto according to [10] which is sterilized by heating at 55 to 100 ° C. for 30 minutes to 2 hours after fermentation.
  • a screening method for Bacillus natto having reduced spore-forming ability in a natto fermentation temperature range comprising the following steps (1) and (2): (1) A step of culturing the test natto bacteria in a selected solid medium containing biotin at a gas phase temperature of 49 ° C. for 48 hours. (2) A test natto formed on the selected solid medium by the culture in step (1).
  • the present invention it is possible to provide natto with a low content of natto fungus spores by existing facilities and processes without problems such as poor fermentation and contamination with various bacteria.
  • the natto of the present invention since the natto of the present invention has a low content of natto fungal spores, it can be sterilized by heating at a temperature at which vegetative cells die (substantially reduce). Therefore, the natto of the present invention is less likely to be mixed with natto fungal spores in a production line other than natto and can be used for manufacturing various processed foods.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an embodiment of a screening method for Bacillus natto mutant strains having reduced spore-forming ability in the natto fermentation temperature zone using the color of the single colony as an index.
  • FIG. 2 shows photographs of colonies on a selected solid medium of a Bacillus natto mutant strain (S092 strain, S103 strain) of the present invention and a parent strain (No. 7 strain) which is a comparative example (region surrounded by a dotted line: Munsell table). (A region where the hue of the color system is yellow (Y), the lightness is 9 or more, and the saturation is 2 or less). It is a photograph figure which shows the mode of the stringing test of natto (A. State which stirred natto, B. State which lifted stirred natto, C. State which lifted natto falls).
  • Bacillus natto mutant of the present invention is a temperature zone usually used for liquid culture for obtaining a Bacillus natto starter (seed fungus) for inoculation.
  • Bacillus natto starter seed fungus
  • the “temperature zone usually used for liquid culture for obtaining Bacillus natto starter” is 28 ° C. to 37 ° C., preferably 30 ° C.
  • Temporal zone normally used for natto fermentation means a temperature zone in which the product temperature of soybean can be maintained substantially at 40 to 53 ° C., preferably 43 to 50 ° C. By maintaining the temperature range of ⁇ 51 ° C., preferably 38 ° C. to 47 ° C., the product temperature of soybean during fermentation can be maintained in the above temperature range. The reason why the temperature of the soybean product differs from the room temperature is that the product temperature of the beans rises due to the heat of fermentation and is maintained in the above temperature range.
  • the Bacillus natto mutant of the present invention has bacteriological properties equivalent to those of the parent Bacillus natto, as shown below, except for the ability to form spores. Therefore, like ordinary natto bacteria, it has the property of producing natto with good stringiness and appearance.
  • natto bacteria are bacteria classified into B. subtilis var. Natto and B. subtilis nat (natto) varieties of Bacillus subtilis. Depending on the classification system, it may be classified as a Bacillus subtilis B. natto.
  • the vegetative cells of the natto bacillus mutant of the present invention are koji molds of about 2 to 3 ⁇ m in size and have motility. Moreover, it has gram dyeability.
  • the spore has an elliptical shape and a size of about 1.12 to 1.28 ⁇ m.
  • the color tone (color) of the surface of the single colony is the entire surface of the single colony.
  • the area is defined as 100%, the Munsell color system satisfies the requirement that the hue is yellow (Y), the area of the lightness is 9 or more, and the saturation is 2 or less, the area is 20% or less.
  • the “surface of a single colony” refers to a surface that is visible when colonies grown on a selected solid medium containing biotin are viewed from the upper surface of the plate.
  • region may be scattered in several places, In that case, the total of the area of several places is said.
  • the area of the specific region is not limited as long as it is 20% or less, but is preferably 15% or less, more preferably 10% or less, even more preferably 5% or less, and most preferably 0%.
  • the above-mentioned “selective solid medium containing biotin” includes medium components such as carbon source, nitrogen source, and inorganic salts that are usually used for culturing Bacillus natto, and enables spore formation and growth of Bacillus natto. If it is a solid culture medium which can observe a colony, there will be no restriction
  • a spore-forming agar medium (containing B) (Table 4 of Example 1 described later) or the like can be used.
  • the concentration of biotin in the selected solid medium is preferably about 0.1 mg / l to 10 mg / l.
  • the surface color of the Bacillus natto colonies formed on the selected solid medium containing biotin is a yellowish milky white area of natto bacillus vegetative cells. Based on the fact that the main region is substantially white, and that normal natto bacteria form spores in the vicinity of the center of the colony after a certain period of time has elapsed since colony formation, the white area is widely formed.
  • mutant strain is a mutant strain that has reduced spore-forming ability at high temperatures, colonies formed in culture at a high temperature of 49 ° C at the gas phase have few areas that are almost white due to the factors described in the above requirements. It is presumed to be.
  • Bacillus natto mutant of the present invention has utilization properties for glucose and sucrose. On the other hand, it has no assimilability for lactose and arabinose.
  • the mutant of Bacillus natto of the present invention is an aerobic bacterium, exhibits biotin requirement, and can grow on a minimal medium. It also has protease activity. It can also grow using citrate.
  • the Bacillus natto mutant of the present invention has a suitable growth ability in the normal temperature range of 37 ° C. to 40 ° C., and grows at the same growth rate as that of normal Bacillus natto. To do.
  • the spore-forming ability of the Bacillus natto mutant of the present invention has temperature sensitivity.
  • the spore-forming ability can be determined using the measurement result of the number of spores in the culture solution as an index.
  • the number of spores can be measured by heat-treating the culture solution and then determining the number of heat-resistant bacteria using an agar medium.
  • a Bacillus natto mutant is inoculated into a liquid medium capable of forming spores (for example, a sporulation medium (YE) described in Table 1 of Example 1 described later), and the temperature of the medium is 37 ° C.
  • the culture solution obtained by shaking culture for 24 hours is heat-treated at 75 ° C. for 15 minutes, and then calculated from the number of colonies appearing after culturing on LB agar medium (Table 3 in Example 1 described later). Can do.
  • the Bacillus natto mutant of the present invention has normal spore-forming ability in a temperature range usually used for liquid culture for obtaining Bacillus natto starter.
  • the “normal spore-forming ability” refers to a spore-forming ability equivalent to that of ordinary natto bacteria, and specifically, a spore formation generally used for a natto-bacterium colony of the present invention. It means that the number of spores of the Bacillus natto mutant strain is 1 ⁇ 10 7 cells / ml or more when cultured at a liquid temperature of 37 ° C. using a liquid medium, and preferably the number of spores is 3 ⁇ 10 7.
  • the “spore-forming medium” is a liquid medium that allows spore formation and growth of Bacillus natto, and that is normally used for culturing Bacillus natto, and contains medium components such as a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts. There is no particular limitation, and it may be a synthetic medium or a natural medium.
  • the carbon source glucose, sucrose, galactose, mannose, starch, starch and other sugars, organic acids such as citric acid, as the nitrogen source, peptone, meat extract, casein hydrolyzate, Ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride and the like can be mentioned, and as inorganic salts, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium sulfate, sodium hydrogen sulfate, sodium nitrate, potassium phosphate, ferric chloride hexahydrate, sulfuric acid Magnesium heptahydrate, manganese chloride tetrahydrate, ferrous sulfate and the like can be mentioned.
  • the medium may contain yeast extract, malt extract, soybean flour, vitamins (such as biotin) and the like.
  • yeast extract malt extract
  • soybean flour vitamins (such as biotin) and the like.
  • the composition of the medium may be changed in a timely manner.
  • the culture time in a spore-forming liquid medium at a liquid temperature of 37 ° C. is not particularly limited. However, since the number of spores usually reaches a plateau within 48 hours, the culture time is generally about 24 to 48 hours.
  • the natto-bacterial mutant of the present invention has a reduced spore-forming ability in a temperature zone usually used for natto fermentation.
  • “spore-forming ability is reduced” means inoculating boiled soybeans or steamed soybeans so that the number of Bacillus natto spores per gram is 5 ⁇ 10 3 , and the temperature of the beans is 40-53 ° C. When maintained in the range, it means the property that the number of natto fungal spores is 5 ⁇ 10 5 or less per 1 g of natto when fermentation is continued until the scent unique to natto becomes good.
  • natto-specific scent refers to a scent of natto-specific aroma components mainly composed of diacetyl, acetoin, pyrazines and the like described as natto odor.
  • the temperature-sensitive Bacillus natto mutant of the present invention can be screened from the natural world, but it is preferable to use an artificial mutagenesis method because the mutant can be efficiently obtained.
  • methods for artificially introducing mutations include chemical methods such as chemical mutagen treatment, physical methods such as ultraviolet rays and X-ray irradiation, and genetic engineering methods.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • MMS methyl methanesulfonate
  • ENU N-ethyl-N-nitrosourea
  • NNU N-methyl-N'-nitrosoguanidine
  • NNG N-methyl-N'-nitro-N-nitroguanidine
  • BrdU brominated deoxyuridine
  • mitomycin sodium azide, bisulfite Sodium, hydroxylamine, nucleotide analogs and the like can be mentioned, and one of these mutants may be used, or a mixture of two or more thereof may be used.
  • Any Bacillus natto can be adopted as the parent strain of the Bacillus natto mutant.
  • Miyagino fungus (trade name: Miyagino Natto fungus) (manufactured by Miyagino Factory)
  • Takahashi fungus (trade name: Natto Motobu) (manufactured by Yuzo Takahashi Laboratories Ltd.)
  • Bran name: Bacillus natto) manufactured by Naruse Fermentation Chemical Laboratories
  • various strains such as mutant strains and genetically modified strains having specific properties can also be used.
  • NPMD Institutional Patent Microorganism Deposit Center
  • natto mutant of the present invention include S092, S103, S125, S215, S219, and S238.
  • These strains are natto bacillus mutations on a specific selected solid medium from among the strains randomly introduced mutations by a chemical method to natto bacillus No. 7 strain by the method described in Example 1 described later. After cultivating the strain at a specific gas phase temperature, after selecting the strain exhibiting a specific color, how many stages are used, based on the spore-forming ability and natto fermentation quality under the conditions assuming natto starter and natto production It is a strain selected through selection of things.
  • the selected strain has a normal spore-forming ability in the temperature range usually used for liquid culture for the acquisition of natto starter, but has a temperature sensitivity with a reduced spore-forming ability in the temperature range normally used for natto fermentation. And, it is a Bacillus natto mutant strain with excellent quality characteristics of the produced natto.
  • the S103 strain which has the most comprehensive properties overall, was patented by the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD) (February 292-0818) on February 16, 2017. 2-10-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba, Japan) is deposited internationally under the accession number NITE BP-02423 (indication of identification: S103).
  • the natto mutant of the present invention has a natto mutant derived from the selected bacterium and natto produced by mutating the selected bacterium as long as it retains the spore-forming ability and fermentation quality of the selected bacterium. Also included are fungal mutants, or Bacillus natto mutants produced by gene transfer into the selected bacteria and transformed.
  • the mutation refers to a mutation caused by a mutagenesis treatment, and the mutagenesis treatment can be performed using any appropriate mutagen. Examples of mutagens include drugs having mutagenic effects, UV irradiation, and the like.
  • the Bacillus natto mutant of the present invention has normal spore-forming ability in a temperature range usually used for liquid culture for obtaining Bacillus natto
  • the Bacillus natto starter obtained by liquid culture of the Bacillus natto mutant The number of Bacillus natto spores is the same as that of ordinary Bacillus natto, specifically, the number of spores is 1 ⁇ 10 7 cells / ml or more, preferably 3 ⁇ 10 7 cells / ml or more, more preferably 5 ⁇ 10 7 pieces / ml or more.
  • natto Production method of natto
  • natto can be produced according to a conventional method, except that the natto mutant is used as natto.
  • any raw material that can be used for producing ordinary natto can be used.
  • whole soybeans, half soybeans, broken soybeans (raw ground natto raw material), defatted soybeans, and the like can be used.
  • Particularly preferred are medium and large grains used in the production of high quality natto.
  • These soybeans can be used as they are, but it is common to use those that have been dried (dried products).
  • the raw material soybean is cooked in the liquid to be cooked soybean or boiled soybean by a conventional method.
  • Steamed soybeans are preferable in terms of preventing the component from flowing away.
  • the specific procedure for preparing steamed soybeans is to immerse the soybeans in normal temperature water for about 6 to 24 hours, drain the water, and steam it for 10 to 30 minutes with steam at 100 to 135 ° C. Can be adopted.
  • a method of pressure steaming under a high pressure condition of 0.12 to 0.22 MPa can be employed.
  • a specific procedure for preparing boiled soybeans a method in which soybeans are immersed in water at room temperature for about 6 to 24 hours and then boiled in hot water at 90 to 100 ° C. for 20 to 50 minutes can be employed.
  • spore-shaped Bacillus natto can be germinated quickly after inoculation with soybeans by heat shock caused by heat.
  • Inoculation of the above-mentioned natto bacillus mutants into soybean is desirable to carry out mixing uniformly after adding soy and natto starter (inoculation or spraying) so that the fermentation is uniform. It is preferable to prepare a spore suspension of the above-mentioned Bacillus natto mutant as a Bacillus natto starter and add it in a liquid state for use.
  • spore suspension a culture solution obtained by culturing the Bacillus natto mutant strain in the above-described general spore-forming liquid medium can be used.
  • the number of Bacillus natto to be inoculated is not particularly limited by the bacterial concentration according to the conventional method, but 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 per 1 g of soybean, preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 5 More preferably, the number is 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 .
  • the temperature of soybean during inoculation should be 55 to 95 ° C, preferably 60 to 95 ° C, more preferably 65 to 95 ° C, still more preferably 70 to 90 ° C, and particularly preferably 75 to 90 ° C. it can. If the product temperature of soybean is lower than the above range, there is a risk of contamination with germs, and if the product temperature of soybean is higher than the above range, natto fungal spores may be killed, resulting in poor fermentation.
  • the soybean inoculated with the natto bacillus mutant is filled in an individual container for one to several meals and then subjected to fermentation described later in the individual container.
  • a traditional method it is also possible to fill a boiled straw (warazuto; straw straw wrapper). It is also possible to perform fermentation in a container of several liters volume, etc., but considering that the temperature change is difficult to be transmitted to the beans in the center when the volume value relative to the surface area increases, a larger container is used. It is not desirable to use it.
  • any container can be used as long as it can be filled with soybeans. Moreover, when performing the heat sterilization mentioned later, the container which can endure the heat processing is used. Specifically, styrene-modified polyolefin resins commonly used in natto, polystyrene resins such as polystyrene, high impact polystyrene, styrene-ethylene copolymer, polyolefins such as polyethylene, polypropylene, ethylene-vinyl acetate copolymer Containers made of foamed sheets made of various synthetic resins such as polyester resins such as polyethylene resins and polyethylene terephthalate, and cup-shaped paper containers can be used. Moreover, the thing of the shape which can be stirred (stirring) for eating directly using the said container as a shape of a container is suitable. Moreover, the thing of the aspect which can be sealed by a lid
  • the fermentation of natto is performed by maintaining the product temperature of soybean at a normal natto fermentation temperature range of substantially 40 to 53 ° C, preferably 43 to 50 ° C. Is possible.
  • the room temperature in a temperature range of 35 to 51 ° C., preferably 38 to 47 ° C.
  • the temperature of soybean during fermentation can be maintained in the above temperature range. This is because the product temperature of the beans rises due to the heat of fermentation and is maintained in the above temperature range.
  • the predetermined time (fermentation time) for maintaining the product temperature of soybean in the fermentation temperature range is not particularly limited, but is 10 to 24 hours, preferably 12 to 22 hours, particularly preferably 15 to 20 hours. Can do. By proceeding with fermentation in the temperature range, imparting natto-specific aroma and flavor, imparting a soft texture like natto, imparting stringiness (giving stickiness), and the like are promoted.
  • “maintaining substantially in the natto fermentation temperature range” does not mean that the temperature range is not completely deviated from, for example, a certain temperature range (for example, within 2 ° C., preferably 1 ° C. Within a short time (for example, within 10 minutes, preferably within 5 minutes), it means that the fermentation condition is satisfied even when the product temperature is out of the temperature range.
  • after fermentation means both “after the progress of fermentation” and “continuously from the end of fermentation”, and not necessarily after the fermentation is completely completed. good.
  • heat sterilization that can be performed on fermented natto means that the total number of Bacillus natto bacteria (about 1 ⁇ 10 8 natto g) generally contained in natto is heated. Means a process of 1 ⁇ 10 6 pcs / g natto or less.
  • the treatment condition in the heat sterilization of the present invention can be a condition capable of killing (substantially reducing) vegetative cells of normal natto bacteria (parent strain).
  • Specific treatment conditions are 55 to 100 ° C., preferably 60 to 90 ° C., more preferably 60 to 75 ° C., 30 to 200 minutes, preferably 60 to 180 minutes, more preferably 90 to 150 minutes, particularly preferably. Is 110-130 minutes. At this time, the relative humidity can be 0 to 60%.
  • the heat sterilization may be performed in a plurality of stages by changing processing conditions.
  • the temperature is usually 3 ° C. or higher and lower than 10 ° C., preferably 3 ° C. or higher and lower than 8 ° C., more preferably 3 ° C. or higher and lower than 6 ° C., for 6 hours to 3 days, preferably 8 hours to 2 days. More preferably, aging is performed for about 24 hours, and the production is completed.
  • the natto of the present invention produced by the above method has the following properties.
  • the natto of the present invention has a low natto fungal spore content as compared to normal natto. This is because the Bacillus natto mutant strain has a significantly low spore-forming ability during the fermentation process because the spore-forming ability is reduced in the temperature range normally used for natto fermentation.
  • the number of natto fungus spores in normal natto is about 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 per gram of natto, but the number of natto fungal spores in natto of the present invention is 5 per gram of natto immediately after the fermentation process is completed. ⁇ 10 5 or less, preferably 3 ⁇ 10 5 or less, more preferably 1 ⁇ 10 5 or less.
  • the natto of the present invention is used as a raw material for processed foods, it is less likely to contaminate the factory production line with spores, and thus can be applied to a wide range of processed foods.
  • the measurement of the spore number in natto can be performed by calculating
  • natto is put into a bag with a filter attached to a paddle-type blender “Stomacher TM ”, a phosphate buffer solution is injected, and the natto suspension suspended by the above-mentioned stomacher is further added. It can be calculated from the number of colonies that appear after dilution with a phosphate buffer, heat treatment at 75 ° C. for 15 minutes, smear culture on an LB agar medium (Table 3 described later).
  • the total number of natto bacteria can be measured by determining the number of bacteria in the natto suspension using an agar medium. Specifically, natto is put into a stomacher bag, a phosphate buffer solution is injected, the natto suspension suspended in the above stomacher is further diluted with a phosphate buffer solution, and then smeared on an LB agar medium. And can be calculated from the number of colonies appearing there.
  • the natto of the present invention produced by the above method has a sufficient stringiness (stickiness) and has a natto-specific scent.
  • Method for reducing natto fungus spores and vegetative cells in the present invention, by producing natto according to the method described above, natto with reduced contents of natto fungal spores and vegetative cells can be produced. Accordingly, the present invention provides a method for reducing the spore and vegetative cells of natto bacteria in natto, characterized in that natto is produced using the natto bacteria mutant.
  • the content of natto bacteria spores and vegetative cells, particularly vegetative cells, in natto can be significantly reduced.
  • the treatment conditions in the heat sterilization are as described above. For example, 55 to 100 ° C., preferably 60 to 90 ° C., more preferably 60 to 75 ° C., 30 to 200 minutes, preferably 60 to 180 minutes, more preferably. Can be 90 to 150 minutes, particularly preferably 110 to 130 minutes. At this time, the relative humidity can be 0 to 60%. Further, as described above, the heat sterilization can be performed in a plurality of stages by changing processing conditions.
  • Screening method for Bacillus natto According to the present invention, there is also provided a method for screening Bacillus natto having reduced spore-forming ability in the Bacillus natto fermentation temperature zone using the color of the single colony as an index.
  • the screening method of the present invention comprises a step of culturing test natto bacteria in a selected solid medium containing biotin at a gas phase temperature of 49 ° C. for 48 hours, and a test natto fungus formed on the selected solid medium by the culture. The process of analyzing the color of the single colony was selected.
  • the natto bacteria to be tested are strains isolated from the natural world, strains isolated from various fermented foods, chemical methods such as chemical mutagen treatment, physical methods such as ultraviolet rays and X-ray irradiation, genetic engineering methods, etc. Any of the mutant strains mutated by using may be used.
  • Example 1 Breeding of Bacillus natto mutants and evaluation of their spore-forming ability and natto production suitability
  • Bacillus subtilis No. 7 strain (NITE BP-01805) was used as a breeding parent strain of a Bacillus natto mutant.
  • the spore solution was prepared by inoculating the No. 7 strain into a spore-forming medium (YE) 10 ml / test tube shown in Table 1 and shaking culture at 37 ° C., 150 rpm for 24 hours.
  • YE spore-forming medium
  • the mutation treatment solution diluted to an appropriate concentration with 50 mM Na phosphate buffer (pH 7) was smeared and cultured on the LB agar medium shown in Table 3 below. This was calculated from the number of colonies that appeared after culturing for about 18 hours in an incubator set at a phase temperature of 37 ° C.
  • the total number of Bacillus natto mutants in the mutation treatment solutions containing 4 ⁇ g / ml and 8 ⁇ g / ml of the cocktail was 5.2 ⁇ 10 8 cells / ml and 3.3 ⁇ 10 7 cells / ml, respectively.
  • the color of single colonies having a diameter of 5 mm or more was evaluated.
  • the evaluation was carried out under an illuminance of about 1500 lux using natural light from a window away from the experimental table and a fluorescent lamp irradiated from directly above the plate as the light source, and the plate was placed on a black experimental table, At the time of the comparative evaluation with the color sample, the evaluation was performed in a state where the plate was observed obliquely from a 45 degree direction.
  • the color of the single colony was evaluated with the naked eye in comparison with the color sample attached to "Color ruler / enlarged version by Munsell system" (Nippon Color Research Co., Ltd. 2014).
  • the evaluation is that the color tone (color) of the surface of the single colony is “When the total area of the surface of the single colony is 100%, the hue of the Munsell color system is yellow (Y), the brightness is 9 or more, 270 strains of Bacillus natto mutants that meet the criteria were selected based on whether or not the criteria that the area of the saturation is 2 or less is 20% or less.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the above evaluation.
  • the area in which the hue of the Munsell color system is yellow (Y), the lightness is 9 or more, and the saturation 2 is the following may be divided into a plurality as shown in FIG.
  • FIG. 2 photographs taken of the S092 and S103 colonies and the parental No. 7 colony are shown in FIG.
  • the photograph was taken using a digital camera (finepix 31fd (Fuji Film)) under a fluorescent lamp.
  • the photographed image had the same color as when the colony was directly viewed.
  • a region surrounded by a dotted line indicates a region where the hue of the Munsell color system is yellow (Y), the lightness is 9 or more, and the saturation is 2 or less.
  • the No. 7 strain is concentric in the center of the colony, the Munsell color system is yellow (Y), lightness is 9 or more, and saturation is 2 or less.
  • the area of the area exceeded 20% of the total area of the colony surface.
  • the hue of the Munsell color system is yellow (Y), and there are slightly dotted areas where the lightness is 9 or more and the saturation is 2 or less. Even less than 10% of the total area of the colony surface.
  • a reproducibility test was performed to eliminate false positives from the above 270 candidate strains. Specifically, the colonies were streaked on the LB agar medium and cultured at a gas phase temperature of 37 ° C for about 18 hours, then again streaked on a spore-forming agar medium (containing B) and cultured at a gas phase temperature of 49 ° C for 48 hours. After that, the above-mentioned evaluation was performed again on the formed colonies, and only the Bacillus natto mutant strains that satisfied the same criteria were selected.
  • the candidate strain cultured on the LB agar medium was streaked using a platinum loop on the GSP agar medium described in Table 5 below, and the gas phase temperature was 37 ° C. Cultivation was carried out for about 18 hours in the set incubator, and those on which a viscous substance equivalent to or higher than the No. 7 strain of the breeding parent was formed on the colonies after the culture were regarded as acceptable.
  • the candidate strains were narrowed down to 112 strains by the colony coloration confirmation test on the two sporulation agar media (with B) and the mucus production test on the GSP agar medium.
  • the number of spores contained in the obtained spore solution was determined by heating the spore solution diluted to an appropriate concentration with 50 mM Na phosphate buffer (pH 7) at 75 ° C for 15 minutes, then LB This was calculated from the number of colonies that appeared after smearing on an agar medium and culturing for about 18 hours in an incubator set at a gas phase temperature of 37 ° C.
  • (B) Natto production test The natto production test was carried out by the following method. First of all, the spore solution of the selected Bacillus natto mutant is appropriately diluted to the soybean immediately cooked by conventional method (cooked for 24 minutes at a pressure of 0.16 MPa). After adding and mixing well, 45 g each was filled into polystyrene individual containers.
  • natto was also produced in the same manner for the No. 7 breeding parent strain. Fermented natto was aged in a refrigerator at 4 ° C for 24 hours, and then evaluated for natto quality (stringiness and odor unique to natto) according to the following criteria. The evaluation of stringiness and natto-specific fragrance was calculated by the average of the scores of a total of 6 skilled inspectors.
  • 5 points Very strong (When the natto grains are mixed and lifted with chopsticks, they are held in the air and do not fall for more than 5 seconds) 4 points: Strong (When the mixed natto grains are lifted with chopsticks, it is held in the air and takes 3 seconds to fall) 3 points: Ordinary (Natto grains fall without being held in the air when the mixed natto grains are lifted with chopsticks) 2 points: weak (nulls of natto grains are not formed) 1 point: very weak (do not pull the thread)
  • the number of spores in natto was measured by the following method. To about 45 g of natto, 50 mM phosphate buffer solution (pH 7) was added, suspended in a stomacher (organo-exiter 400) at 230 rpm for 1 minute, and diluted to an appropriate concentration with the same buffer solution. The diluted extract was heat-treated at 75 ° C. for 15 minutes, smeared on LB agar medium (37 ° C. for 16 hours), and the number of spores was determined from the number of colonies that appeared.
  • 50 mM phosphate buffer solution pH 7
  • the diluted extract was heat-treated at 75 ° C. for 15 minutes, smeared on LB agar medium (37 ° C. for 16 hours), and the number of spores was determined from the number of colonies that appeared.
  • a score of 3 or more for stringiness a score of 3 for natto-specific scent, 5 x 10 5 natto spores contained in natto / natto g or less, a spore solution (natto starter The natto mutants satisfying all requirements of 1 ⁇ 10 7 / ml or more contained in natto were included in the results.
  • the S103 strain which was highly evaluated based on the heating test described later, was deposited under the deposit number NITE BP-02423.
  • Example 2 Heating test after natto fermentation Among the mutants of Bacillus natto selected in Example 1, vegetative cells can be sterilized following fermentation for 4 strains, S092, S103, S125 and S219 It was confirmed whether the total number of bacteria could be reduced by heating at temperature.
  • the soybean spore solution of the above-mentioned Bacillus natto mutant was diluted with sterile water for soybeans (cooked for 24 minutes at a pressure of 0.16 MPa) immediately after cooking in a conventional method. After adding and mixing well so that it might become 1g of each piece / steamed soybean, 45g each was filled into an individual container made of polystyrene.
  • the filled individual containers were heated under conditions of 70 ° C. for 2 hours following fermentation at a gas phase temperature of 40 ° C. for 1 hour, 50.5 ° C. for 5 hours, and 47.5 ° C. for 6 hours.
  • the natto after heating was quickly transferred to a 4 ° C refrigerator and aged, and then the natto quality, the total number of natto bacteria and the number of spores were confirmed.
  • the No. 7 breeding parent strain was also subjected to a heating test in the same manner. For some samples, aging at 4 ° C before heating at 70 ° C and measuring the natto quality (stringiness, natto-specific scent), total natto bacteria, and spore count at the end of fermentation using the methods described above did. The results are shown in Table 8 and Table 9.
  • the total number of Bacillus natto at the end of fermentation was on the order of 1 ⁇ 10 8 , but the total number of Bacillus natto after heating at 70 ° C. was 1 ⁇ 10 6 / Not only natto g and below, but not only vegetative cells other than natto spores could be sterilized, but also meet the standards of stringiness and natto-specific fragrance, and the quality of manufactured natto is also good Met.
  • the present invention has a normal spore-forming ability in the temperature range usually used for liquid culture for the acquisition of natto starter for inoculation, but the spore-forming ability decreased in the temperature range usually used for natto fermentation.
  • New natto bacteria are provided.
  • the natto strain of the present invention it is possible to produce a natto starter containing a high concentration of natto fungus spores in the same manner as before, and the conventional natto production process has a small number of spores, but in other respects It is possible to produce natto with the same quality as conventional general natto.
  • the natto of the present invention can be sterilized under heating conditions that do not impair the quality of natto, and therefore it is possible to promote the development of various processed foods using high-quality natto. Therefore, the present invention can be used in the manufacture of natto and processed foods using the same. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Abstract

本発明は、植菌用の納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯では通常の胞子形成能を有するが、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能の低下した温度感受性の納豆菌を取得すること、及び当該納豆菌を用いて発酵不良や雑菌汚染といった問題がなく、既存の設備及び工程によって、納豆菌胞子の含有量が少ない納豆を提供することを課題とする。　本発明によれば、以下の(A)～(C)の性質を有する納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)変異株が提供される。 (A)ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養して生育した前記納豆菌変異株のシングルコロニーの表色が、該シングルコロニーの表面の全面積を100％としたときに、マンセル表色系の色相が黄系（Y）、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20％以下であるという性質。 (B) 胞子形成培地において、培地の液温37℃で培養した際に、前記納豆菌変異株の胞子数が1×107個/ml以上となる性質。 (C) 前記納豆菌変異株を、煮大豆又は蒸煮大豆に1gあたり納豆菌胞子数5×103個となるように植菌し、豆の品温を40～53℃の範囲に維持した際に、糸引き、納豆特有の香りが良好で、かつ納豆1gあたり納豆菌胞子数が5×105個以下の納豆を製造できる性質。

Description

新規温度感受性納豆菌、及び胞子低含有納豆
　本発明は、植菌用の納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯では通常の胞子形成能を有するが、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能が低下した温度感受性の納豆菌変異株、及び、当該変異株を用いて製造された胞子数の少ない納豆に関する。より詳しくは、胞子形成能が温度依存的に変化するため、納豆菌スターター取得のための液体培養の際は通常の胞子形成能を有するが、納豆製造の発酵工程時には胞子形成能が低下している納豆菌変異株、当該変異株を用いて製造された胞子数が少なく、加熱殺菌が可能な納豆、その製造方法、並びに、当該変異株を用いる納豆中の納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法に関する。
　大豆を納豆菌で発酵させた糸引き納豆(以下、単に「納豆」という）は、日本古来の発酵食品であり、大豆タンパク質を豊富に含み栄養価が高く、独特の風味と粘り気のある食感を有する。近年、納豆にはプロバイオティック作用、抗菌作用、機能性成分等による各種健康増進作用（血栓防止作用、血圧降下作用、コレステロール低下作用、骨形成促進作用、脂肪燃焼作用等）があることが報告されており、ますます需要が期待されている食品である。
　納豆は、一般に、原料大豆の選別工程、洗浄工程、水への浸漬工程、蒸煮工程、納豆菌の接種（植菌）工程、容器への充填工程、発酵工程、冷却・熟成工程、包装工程、を経て製造されている。発酵工程では、納豆菌による発酵作用によりポリグルタミン酸を主成分とした強い粘りを有する糸引き成分が生成される。当該糸引き成分は、独特の風味や食感を納豆に与える性質を有する。また、納豆菌による発酵作用の別の結果として、納豆臭と形容されるジアセチル、アセトイン、ピラジン類等を主体とした納豆特有の香気成分が産生される。適度な濃度の納豆臭は、納豆独特の風味として納豆の嗜好性向上に寄与する。一方、納豆発酵に伴い、アンモニアも生成されるが、過度なアンモニアの産生は異臭の原因となって嗜好性低下の要因となる。
　納豆菌胞子のような細菌胞子(芽胞）を形成する芽胞形成菌は、環境により栄養細胞と芽胞の２種の状態をとり、増殖に適さない環境になったときは、耐久性の高い芽胞を形成し、休眠状態を維持し、増殖に適した環境になったときは、発芽し、栄養細胞となって細胞分裂を繰り返す。上記の納豆の製造工程において、納豆菌の接種は、蒸煮工程後の高温の大豆に対して行うので、耐熱性の低い栄養細胞の状態の納豆菌を噴霧すると、納豆菌が死んでしまい良好な発酵が得られない。よって、納豆菌の接種には、物理的、化学的に安定な胞子状態の納豆菌が通常用いられる。
　しかしながら、納豆菌胞子は、耐熱性が非常に高いため、１００℃以下の加熱殺菌では納豆の特性は維持できても、製品中には納豆菌胞子が残存する。一般的な加工食品では、変敗防止のために、消費又は賞味期限内において、加工食品１ｇあたりの生菌数を、１×１０５から１×１０６オーダー以下に抑えることが目安となっている。納豆製品における納豆菌胞子が、上記の一般の加工食品における生菌数の目安と同等の範囲よりも多いと、一般の加工食品の製造ラインで納豆そのものを加工する場合や、納豆を原料の一部として加工食品に利用する場合に、当該加工食品の製造ラインに納豆菌胞子が付着し、その製造ラインで製造した納豆を利用しない他の加工食品への納豆菌胞子の混入の危険性がある。その結果、納豆の加工食品への利用が制限されることになる。
　これまで納豆中の納豆菌胞子（以下、単に「胞子」ともいう）を減らすために様々なアプローチがとられている。代表的には加熱殺菌であるが、納豆中の胞子の殺菌には、通常１２０℃程度の加熱が必要であり、当該加熱条件では苦味が出たり、糸引きがなくなったり、アンモニア臭が出たりして、納豆の品質を保持することは困難である。また、胞子を形成し難い納豆菌の使用により、あるいは、胞子を形成させない発酵条件によって、納豆中の胞子数を減らす方法がある。
　例えば、胞子形成率が低い納豆菌を用いて製造された納豆を乾燥させた乾燥納豆に殺菌処理を施すという方法（特許文献１参照）や、納豆菌の栄養細胞率が高く芽胞率が低いタイミングで殺菌を施すという方法（特許文献２参照）が報告されている。しかしながら、乾燥納豆を利用した方法では、生の納豆ではないため、食感の違いが出てしまう。また、胞子形成率の低いタイミングでの殺菌は、耐熱性の低い栄養細胞の殺菌を主とするものであることから、L-アラニンの添加など特別な方法で発芽処理を行わない場合には納豆菌胞子が相当数残存するため、胞子数を減少させるのには不十分であった。よって、いずれの方法も納豆の品質は十分には確保し難く、殺菌も十分ではない。
　さらに、sigK遺伝子などの胞子形成遺伝子が欠損されている納豆菌変異株を用いて納豆を製造する方法が報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、上記胞子形成遺伝子は胞子の最外部層であるスポアコート形成など多くの胞子形成期特異的遺伝子の発現制御に関与するため、当該遺伝子破壊株では正常な胞子形成能を回復することができない。よって、当該納豆菌変異株を用いて培養を行っても、納豆菌胞子を形成させることは困難であり、培養された納豆菌は栄養細胞の状態となる。
　そのため、前述したように、通常の納豆の製造工程において、納豆菌の接種は、蒸煮工程後の高温の大豆に対して行うので、上記のような胞子形成遺伝子を破壊した栄養細胞の状態である納豆菌変異株を高温条件で植菌すると、耐熱性の低い栄養細胞が死滅（大幅に低減）してしまい納豆発酵ができない。そのため、納豆菌の植菌の際には、蒸煮した大豆の温度を下げて低温条件にする工程を追加する必要がある上に、低温条件であるために雑菌汚染が生じやすく、衛生面で問題があった。
特開２００６－６１１７号公報 特開２００６－１４１２０９号公報 特開２０１１－１０６３４号公報
　本発明は、植菌用の納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯では通常の胞子形成能を有するが、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能が低下した温度感受性の納豆菌を取得すること、及び当該納豆菌を用いて発酵不良や雑菌汚染といった問題がなく、既存の設備及び工程によって、納豆菌胞子の含有量が少ない納豆を製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに特定の選択固体培地上で納豆菌変異株を特定の気相温度で培養した際に、特定の表色を呈するコロニーを選抜すると、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能が低下する納豆菌変異株が高率に含まれており、当該納豆菌変異株を用いて通常の発酵温度帯で納豆を製造すると胞子数が少ない納豆が得られることを見出した。
　一方、上記納豆菌変異株は、植菌用の納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯では、通常の胞子形成能を有する。植菌用の納豆菌スターター取得のための液体培養において十分な胞子形成能を有さない納豆菌であると、納豆菌胞子の含有濃度が低くなるため、培養時間を長くする、納豆菌スターターに用いる液体培地量を増やすなどの対応が必要となり、納豆製造において無視できないコスト増となるが、当該納豆菌変異株を納豆製造に用いた場合は、上述のような問題は生じない。
　また、当該納豆菌変異株の液体培養にて取得した納豆菌スターターは、通常の納豆菌スターターと同じく高濃度の胞子を含有しているため、高温の蒸煮大豆に植菌を行っても納豆菌胞子が十分に残存するため、十分に発酵の進んだ納豆が製造でき、蒸煮工程後に大豆を低温化する工程を追加する必要がなく、雑菌汚染の問題もない。本発明はかかる知見により完成したものである。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[１] 以下の(A)～(C)の性質を有する納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)変異株。
 (A) ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養して生育した前記納豆菌変異株のシングルコロニーの表色が、該シングルコロニーの表面の全面積を100％としたときに、マンセル表色系の色相が黄系（Y）、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20％以下であるという性質。
 (B) 胞子形成培地において、培地の液温37℃で培養した際に、前記納豆菌変異株の胞子数が1×107個/ml以上となる性質。
 (C) 前記納豆菌変異株を、煮大豆又は蒸煮大豆に1gあたり納豆菌胞子数5×103個となるように植菌し、豆の品温を40～53℃の範囲に維持した際に、糸引き、納豆特有の香りが良好で、かつ納豆1gあたり納豆菌胞子数が5×105個以下の納豆を製造できる性質。
[２] [１]に記載の納豆菌変異株を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
[３]納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下である、[２]に記載の納豆。
[４]発酵後、55℃～100℃で30分～2時間加熱殺菌されたことを特徴とする、[２]に記載の納豆。
[５]納豆菌総菌数が納豆1gあたり1×106個以下である、[４]に記載の納豆。
[６] [１]に記載の納豆菌変異株を用いて大豆を発酵させる工程を含む、納豆の製造方法。
[７] 発酵工程終了後の納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下である、[６]に記載の納豆の製造方法。
[８] 発酵後に55℃～100℃で30分～2時間加熱殺菌する工程をさらに含む、[７]に記載の納豆の製造方法。
[９] 加熱殺菌後の納豆菌総菌数が納豆1gあたり1×106個以下である、[８]に記載の納豆の製造方法。
[１０] [１]に記載の納豆菌変異株を用いて大豆を発酵させた後に加熱殺菌することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
[１１] 発酵後に、55℃～100℃で30分～2時間加熱殺菌する、[１０]に記載の納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
[１２] 以下の(1)及び(2)の工程を含む、納豆発酵温度帯において胞子形成能が低下した納豆菌のスクリーニング方法。
 (1) 被検納豆菌を、ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養する工程
 (2) 工程（1)の培養で選択固体培地上に形成された被検納豆菌のシングルコロニーの表色を解析し、該シングルコロニーの表面の全面積を100％としたときに、マンセル表色系の色相が黄系（Y）、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20％以下である要件を満たす被検納豆菌を選抜する工程
　本願は、２０１７年２月２８日に出願された日本国特許出願２０１７－０３６６５２号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、発酵不良や雑菌汚染といった問題がなく、既存の設備及び工程によって容易に納豆菌胞子の含有量が少ない納豆を提供することができる。また、本発明の納豆は、納豆菌胞子の含有量が少ないため、栄養細胞が死滅する(大幅に低減）温度で加熱殺菌が可能である。それゆえ、本発明の納豆は、納豆以外の製造ラインなどにおいて納豆菌胞子の混入の危険性が少なく、各種加工食品の製造に供することができる。
図１は、シングルコロニーの表色を指標とする、納豆発酵温度帯において胞子形成能が低下した納豆菌変異株のスクリーニング方法の一態様の模式図を示す ((a): 略白色の領域が１箇所、(b): 略白色の領域が複数箇所）。 図２は、本発明の納豆菌変異株（S092株、S103株）及び比較例である親株（No.7株）の選択固体培地上のコロニーの写真を示す（点線で囲んだ領域：マンセル表色系の色相が黄系（Y）であり、明度が9以上、彩度が2以下となった領域）。 納豆の糸引き試験の様子を示す写真図である（Ａ．納豆を攪拌した状態、Ｂ．攪拌した納豆を持ち上げた状態、Ｃ．持ち上げた納豆が落下する状態）。
　以下、具体的な実施形態を挙げて本発明を詳細に説明する。
１．納豆菌変異株
　本発明の新規納豆菌変異株（以下、「本発明の納豆菌変異株」という）は、植菌用の納豆菌スターター（種菌）取得のための液体培養に通常用いられる温度帯では、通常の胞子形成能を有するが、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能の低下した温度感受性の納豆菌変異株である。本発明において、「納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯」とは、28℃～37℃、好ましくは30℃～37℃である。「納豆発酵に通常用いられる温度帯」とは、大豆の品温を実質的に40～53℃、好ましくは43～50℃に維持できる温度帯を意味し、通常の製造方法では、室温を35～51℃、好ましくは38～47℃の温度帯に維持することによって、発酵中の大豆の品温を上記温度帯に維持することが可能となる。大豆品温と室温が異なるのは、発酵熱によって豆の品温が上昇し、上記温度帯に維持されるためである。
［本発明の納豆菌変異株の菌学的性質］
　本発明の納豆菌変異株は、胞子形成能以外の点においては、以下に示す通り、親株である納豆菌と同等の菌学的性質を有している。したがって、通常の納豆菌と同様に、糸引き及び外観が良好な納豆を製造できる性質を有している。
　ここで納豆菌とは、枯草菌バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）の変種（B. subtilis var.natto、B. subtilis (natto)）に分類される細菌である。分類体系によっては、枯草菌の近縁種バチルス・ナットウ（B. natto）として分類される場合もある。
(a)形態的特徴
　本発明の納豆菌変異株の栄養細胞は、大きさ2～3μm程度の桿菌であり、運動性を有する。また、グラム染色性を有する。胞子の形状は楕円形であり、大きさは1.12～1.28μm程度である。
(b)培養的性質
　本発明の納豆菌変異株のLB寒天培地上(後述の実施例１の表３）でのコロニーの形状は環状である。当該コロニーは、表面に皺があり、光沢が無く、色調が不透明～乳白色であり、中央部の隆起がない特徴を有する。なお、グルタミン酸に富む培地上でのコロニーは粘調性を有する。
　当該納豆菌変異株を液体培地で培養すると、培養後の培地表面に菌膜が形成される。また、培養液は混濁する。
　本発明の納豆菌変異株は、ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養した際に、シングルコロニーの表面の色調（表色）が、該シングルコロニーの表面の全面積を100％としたときに、マンセル表色系の色相が黄系（Y）、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20％以下という要件を満たすものである。ここで、「シングルコロニーの表面」とは、ビオチンを含有する選択固体培地上で生育したコロニーをプレート上面から目視した際に視認可能な面を指す。また、上記の特定の領域は複数箇所に点在していてもよく、その場合は複数箇所の面積の合計をいう。上記の特定の領域の面積は、20％以下であれば限定されないが、15％以下が好ましく、10％以下がより好ましく、5％以下がさらにより好ましく、0％が最も好ましい。
　上記の「ビオチンを含有する選択固体培地」は、納豆菌の培養に通常使用される、炭素源、窒素源、無機塩類等の培地成分を含み、納豆菌の胞子形成と成育を可能にし、そのコロニーを観察できる固体培地であれば特に制限はない。例えば、胞子形成寒天培地（Ｂ入り）（後述の実施例１の表４）等を用いることができる。選択固体培地におけるビオチンの濃度は、0.1mg/l～10mg/l程度が好ましい。
　上記表色の確認は、肉眼による色見本との比較、色差計などの光学機器による測定のいずれでも実施可能であるが、多検体を評価する場合は、肉眼で確認するのが効率的である。色見本としては、「マンセルシステムによる　色彩の定規・拡充版」（日本色研事業株式会社　2014）、光学機器としては、CR-400（コニカミノルタ）を例示できる。また、納豆菌変異株のコロニーが小さいと表色が分かりづらいため、直径5mm以上のコロニーについて確認を行うのが好ましい。ここで、「直径」は、コロニーを楕円として近似した際に、楕円の中心を通る径のうち最長の径を意味する。
　表色の確認を色見本との比較観察により実施する際は、暗所は避け、適度な照度の自然光、人工照明下で測定するのが望ましい。照明や背景色の影響を抑えるため、人工照明を斜め45度から照射する際は真上から、真上から照射する際は斜め45度方向から確認するのが望ましい。
　本発明の納豆菌変異株が、上記表色を呈する要因については、詳細は不明である。理論には拘泥されるものではないが、ビオチンを含有する選択固体培地に形成される納豆菌コロニーの表面の色調は、納豆菌の栄養細胞主体の領域は黄色味がかった乳白色、納豆菌胞子が主体の領域は略白色となること、コロニー形成から一定時間経過すると通常の納豆菌はコロニー中央付近に胞子が形成されて白色の領域が広範に形成されることを踏まえると、本発明の納豆菌変異株は、高温下において胞子形成能が低下した変異株であるため、気相温度49℃という高温での培養において形成されたコロニーが、上記要件に記載した要因で略白色を呈する領域が少なくなるためと推測される。
(c)炭素源資化性
　本発明の納豆菌変異株は、グルコース、シュクロースに対する資化性を有する。一方、ラクトース、アラビノースに対する資化性を有さない。
(d)生理学的性質
　本発明の納豆菌変異株は、好気性細菌であり、ビオチン要求性を示し、最少培地での生育が可能である。また、プロテアーゼ活性を有する。また、クエン酸塩を利用して生育が可能である。
(e)温度特性
　本発明の納豆菌変異株は、通常の納豆菌の生育温度帯である37℃～40℃付近で好適な生育能を有し、通常の納豆菌と同等の増殖速度により増殖する。
［胞子形成能］
　本発明の納豆菌変異株の胞子形成能は、温度感受性を有する。胞子形成能は、培養液中の胞子数の測定結果を指標として判定することができる。胞子数の測定は、培養液を加熱処理した後、寒天培地を用いて耐熱性菌数を求めることにより行うことができる。
　具体的には、胞子を形成しうる液体培地（例えば後述の実施例１の表１に記載の胞子形成培地(YE））に納豆菌変異株を植菌し、培地の液温37℃にて24時間振盪培養して得られた培養液を、75℃で15分間加熱処理した後、LB寒天培地（後述の実施例１の表３）に塗末培養して出現したコロニー数から算出することができる。
　また、本発明の納豆菌変異株は、納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯で、正常な胞子形成能を有する。ここで「正常な胞子形成能」とは、通常の納豆菌と同等の胞子形成能を指し、具体的には、本発明の納豆菌変異株のコロニーを納豆菌に一般的に用いられる胞子形成液体培地を用いて培地の液温37℃で培養した場合に納豆菌変異株の胞子数が1×107個/ml以上となる性質を有することを意味し、好ましくは胞子数3×107個/ml以上、より好ましくは5×107個/ml以上となる性質である。ここで「胞子形成培地」としては、納豆菌の胞子形成と成育を可能にし、納豆菌の培養に通常使用される、炭素源、窒素源、無機塩類等の培地成分を含む液体培地であれば特に限定はされず、合成培地であっても天然培地であってもよい。培地成分のうち、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ガラクトース、マンノース、デンプン、デンプン分解物などの糖類、クエン酸などの有機酸類、窒素源としては、ペプトン、肉エキス、カゼイン加水分解物、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等が挙げられ、無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化第２鉄・６水和物、硫酸マグネシウム・７水和物、塩化マンガン・４水和物、硫酸第一鉄等が挙げられる。また、当該培地には、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、ビタミン類（ビオチン等）などを含有させてもよい。遺伝子欠損等で特定の栄養成分を要求する納豆菌変異株を育種親株に用いた場合は、適時培地組成を変更してもよい。液温37℃における胞子形成液体培地での培養時間は特に限定されないが、通常48時間以内に胞子数がプラトーに到達するため、一般的に培養時間は24時間～48時間程度が適当である。
　さらに、本発明の納豆菌変異株は、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能が低下する。ここで、「胞子形成能が低下する」とは、煮大豆又は蒸煮大豆に1gあたり納豆菌胞子数が5×103個となるように植菌し、豆の品温を40～53℃の範囲に維持した際に、糸引き、納豆特有の香りが良好となるまで発酵を継続した際の納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下となる性質を意味する。好ましくは、納豆1gあたり3×105個以下、より好ましくは納豆1gあたり1×105個以下となる性質である。ここで、「納豆特有の香り」とは、納豆臭と形容されるジアセチル、アセトイン、ピラジン類等を主体とした納豆特有の香気成分による香りをいう。
［選抜菌株］
　本発明の温度感受性の納豆菌変異株は、自然界からのスクリーニングも可能であるが、人為的な変異導入法を用いると効率的に変異株が取得できるため好ましい。人為的に変異を導入する方法としては、化学変異剤処理のような化学的手法、紫外線やX線照射などの物理的手法、又は、遺伝子工学的手法などが挙げられる。上記の化学変異剤としては、特に限定はされないが、メタンスルホン酸エチル（EMS）、メタンスルホン酸メチル（MMS）、N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）、N-メチル-N-ニトロソウレア（NNU）、N-メチル-N'-ニトロソグアニジン（NTG）、N-メチル-N'-ニトロ－N-ニトログアニジン（MNNG）、臭素化デオキシウリジン(BrdU)、マイトマイシン、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、ヌクレオチド類似体等が挙げられ、これらの変異剤は1種を用いてもよく、2種以上の混合物を用いてもよい。
　当該納豆菌変異株の親株としては、如何なる納豆菌も採用することができる。例えば、一般的な市販菌である宮城野菌（商品名：宮城野納豆菌）（有限会社宮城野製造所製）、高橋菌（商品名：納豆素）（有限会社高橋祐三研究所製）、成瀬菌（商品名：粉末納豆菌）（成瀬発酵化学研究所製）等を用いることができるが、特定の性質を有する突然変異株、遺伝子組み換え株などの各種菌株を利用することもできる。
　なお、後述する実施例で親株として用いた納豆菌 No.7株は、正常な胞子形成能を有する、出願人が自社開発した菌株であり、2014年2月25日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD)（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、受託番号 NITE BP-01805 (識別の表示：Bacillus subtilis No.7）として国際寄託されている。
　本発明の納豆菌変異株として具体的な菌株としては、S092、S103、S125、S215、S219、S238等を挙げることができる。これらの菌株は、後述する実施例1に記載の方法により、納豆菌 No.7株に対して化学的手法によりランダムに変異を導入した菌株の中から、特定の選択固体培地上で納豆菌変異株を特定の気相温度で培養した際に、特定の表色を呈する株を選抜した後、納豆菌スターター及び納豆製造を想定した条件での胞子形成能及び納豆発酵品質を指標として、何段階もの選抜を経て選抜された菌株である。当該選抜株は、納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯では通常の胞子形成能を有するが、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能の低下した温度感受性を有し、かつ、製造される納豆の品質特性が優れた納豆菌変異株である。
　上記の選抜株のうち、総合的に最も優れた性質を有する菌株であるS103株は、2017年2月16日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD)（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、受託番号 NITE BP-02423(識別の表示：S103）として国際寄託されている。
　また、本発明の納豆菌変異株には、前記選抜菌が有する胞子形成能及び発酵品質を保持する限り、前記選抜菌に由来する納豆菌変異株、前記選抜菌を突然変異させて作出した納豆菌変異株、又は、前記選抜菌に遺伝子導入し形質転換して作出した納豆菌変異株もまた包含される。前記突然変異は、変異誘発処理による突然変異をいい、変異誘発処理は、任意の適当な変異原を用いて行うことができる。変異原としては、変異原効果を有する薬剤や、UV照射などが含まれる。
　本発明の納豆菌変異株は、納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯で正常な胞子形成能を有するため、当該納豆菌変異株の液体培養によって取得された納豆菌スターターの納豆菌胞子数は通常の納豆菌と同等であり、具体的には、胞子数が1×107個/ml以上、好ましくは胞子数3×107個/ml以上、より好ましくは5×107個/ml以上である。
２．納豆の製造方法
　本発明では、上記納豆菌変異株を用いて納豆を製造することによって、加熱殺菌が可能な納豆を製造することが可能となる。
　本発明において、納豆の製造方法としては、納豆菌として上記納豆菌変異株を用いることを除いては、常法に従って納豆を製造することができる。
(1)原料大豆の浸漬及び液中加熱
　本発明の納豆の製造方法では、通常の納豆の製造に用いることができる如何なる原料をも用いることができる。例えば、丸大豆、半割大豆、割砕大豆（挽き割り納豆の原料）、脱脂大豆などを使用できる。特に高品質の納豆製造時に使用される中粒や大粒のものが好適である。これらの大豆は、生のまま用いることもできるが、乾燥処理を行ったもの（乾燥品）を用いることが一般的である。
　本発明では、原料の大豆を常法により蒸煮大豆又は煮大豆とするため液中加熱を行う。成分の流亡を防ぐ意味では、蒸煮大豆が好適である。なお、蒸煮や煮る操作を行う前には、原料大豆を水に浸漬し、膨潤させて用いることが望ましい。
　ここで、蒸煮大豆の具体的な調製手順としては、大豆を常温の水中に6～24時間程度浸漬した後、水切りして、100～135℃の蒸気で10～30分の蒸煮処理する方法を採用することができる。また、0.12～0.22MPaの高圧条件にて、加圧蒸煮する方法を採用することもできる。また、煮大豆の具体的な調製手順としては、大豆を常温の水中に6～24時間程度浸漬した後、90～100℃の湯で20～50分間煮込む方法を採用することができる。
(2)植菌
　本発明の納豆の製造方法において、納豆菌スターターとして上記納豆菌変異株を使用する際は、胞子状態のものを用いることが好適である。胞子状態の納豆菌は、安定保存が可能で取扱いが容易であり、熱い蒸煮大豆又は煮大豆（以下、「大豆」という）への接種の際にも死滅しないため、納豆の雑菌汚染を防ぐことができる。また、胞子状態の納豆菌は、熱によるヒートショックにより、大豆への接種後速やかに発芽させることが可能となる。
　大豆への上記納豆菌変異株の植菌は、発酵を均一に行うため、大豆と納豆菌スターターが均一になるように添加（接種又は散布など）した後、混合等を行うことが望ましい。好ましくは、納豆菌スターターとして上記納豆菌変異株の胞子懸濁液を調製し、液体状態にて添加して用いることが好適である。
　ここで胞子懸濁液としては、前述した一般的な胞子形成用の液体培地にて上記納豆菌変異株を培養した培養液を用いることができる。
　植菌する納豆菌の数は、常法に準じた菌濃度で特に限定はないが、大豆1gあたり1×103～1×106個、好ましくは1×103～1×105個、より好ましくは1×103～1×104個である。
　植菌する際の大豆の品温は、55～95℃、好ましくは60～95℃、より好ましくは65～95℃、さらに好ましくは70～90℃、特に好ましくは75～90℃とすることができる。上記範囲より大豆の品温が低い場合は雑菌汚染が生じる恐れがあり、また上記範囲より大豆の品温が高い場合は納豆菌胞子が死滅してしまい発酵不良となる恐れがある。
　上記納豆菌変異株を植菌した大豆は、1～数食分用の個別容器に充填した後、個別容器内にて後述する発酵を行うことが好適である。また、伝統的な方法として、煮沸した藁苞（warazuto;straw wrapper)に充填して行うことも可能である。また、数リットル体積容の容器等にて発酵を行うことも可能であるが、表面積に対する体積の値が大きくなると、中央部の豆に温度変化が伝わりにくくなることを考慮すると、大きめの容器を用いることは望ましくない。
　ここで個別容器としては、大豆の充填が可能であれば、どんな容器を用いることもできる。また、後述する加熱殺菌を行う場合は、その加熱処理に耐えうる容器を用いる。具体的には納豆で一般に用いられるようなスチレン改質ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン、ハイインパクトポリスチレン、スチレン－エチレン共重合体等のポリスチレン系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体等のポリオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系樹脂等の各種の合成樹脂製の発泡シートで成形した容器や、カップ状の紙製の容器を用いることができる。また、容器の形状として、当該容器を用いて直接、喫食のための掻き混ぜ（攪拌）ができるような形状のものが好適である。また、発酵後は、蓋やシーリングによる封を行うことができる態様のものが好適である。
(3)発酵
　本発明の納豆の製造方法において、納豆の発酵は、大豆の品温を実質的に40～53℃、好ましくは43～50℃である通常の納豆発酵温度帯に維持することで行うことが可能である。また、本発明においては、室温を35～51℃、好ましくは38～47℃の温度帯に維持することによって、発酵中の大豆の品温を上記温度帯に維持することが可能となる。発酵熱によって豆の品温が上昇し、上記温度帯に維持されるためである。
　大豆の品温を、当該発酵温度帯に維持する所定時間（発酵時間）としては、特に制限はないが、10～24時間、好ましくは12～22時間、特に好ましくは15～20時間を挙げることができる。当該温度帯で発酵が進行することによって、納豆特有の香り・風味の付与、柔らかい納豆らしい食感の付与、糸引き性の付与（ネバネバ性の付与）などが促進される。
　なお、「実質的に納豆発酵温度帯に維持する」とは、完全に当該温度帯を外れないことを意味するものではなく、例えば、若干の温度範囲（例えば、2℃以内、好ましくは1℃以内）で、若干の時間（例えば、10分以内、好ましくは5分以内）であれば、当該温度帯を外れた品温となった場合も、当該発酵条件を満たすことを意味する。
(4)加熱殺菌
　上述の納豆菌変異株は、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能が低下することから、上記発酵後に納豆に含まれる納豆菌の大半は耐熱性の低い栄養細胞となる。したがって、納豆菌の栄養細胞を死滅させうる(大幅に低減させうる）条件で加熱処理することにより、効果的に納豆を殺菌することが可能であるため、本発明の納豆の製造方法においては、上記発酵後に加熱殺菌処理を行うことが好ましい。
　なお、本発明において「発酵後」とは、「発酵の経過後」、及び、「発酵の終期から連続して」の両者を含む意であって、必ずしも発酵が完全に終了した後でなくとも良い。本発明において、発酵後の納豆に対して行うことが可能な「加熱殺菌」とは、一般的に納豆に含まれている納豆菌総菌数（1×108個/納豆ｇ程度）が加熱により1×106個/納豆ｇ個以下になる処理を意味する。
　本発明の加熱殺菌における処理条件は、通常の納豆菌（親株）の栄養細胞を死滅させうる(大幅に低減させうる）条件とすることができる。具体的な処理条件としては55～100℃、好ましくは60～90℃、より好ましくは60～75℃で、30～200分間、好ましくは60～180分間、より好ましくは90～150分間、特に好ましくは110～130分間である。このとき、湿度は相対湿度で0～60％とすることができる。当該加熱殺菌は、処理条件を変えて複数段階で行ってもよい。
(5)熟成
　上記の加熱殺菌処理終了後、二次発酵による弊害（発酵工程終了後に納豆上で納豆菌が活動することに起因するアンモニアの増加、チロシンの析出、糸の分解等）を抑制するために、通常、3℃以上10℃未満、好ましくは3℃以上8℃未満、より好ましくは3℃以上6℃未満の低温になるようにして6時間～3日間、好ましくは8時間～2日間、より好ましくは24時間程度、熟成を行い、製造は完了する。
３．納豆
　上記の方法にて製造された本発明の納豆は、以下の性質を有する。
(a) 胞子含有量
　本発明の納豆は、通常の納豆と比べて納豆菌胞子含有量が少ない。なぜなら、当該納豆菌変異株は、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能が低下することから、発酵工程中の胞子形成能が著しく低いためである。通常の納豆中の納豆菌胞子数は納豆1g当たり1×107個から1×109個程度であるが、本発明の納豆中の納豆菌胞子数は、発酵工程終了直後の納豆1g当たり5×105個以下、好ましくは3×105個以下、より好ましくは1×105個以下である。
　従って、本発明の納豆は、加工食品の原料として利用した場合でも、工場の製造ラインを胞子で汚染するおそれが少ないため、幅広い加工食品に適用可能である。
　なお、納豆中の胞子数の測定は、例えば納豆懸濁液を加熱処理した後、寒天培地を用いて耐熱性菌数を求めることにより行うことができる。具体的には、納豆をパドル式のブレンダー「ストマッカー（StomacherTM）」に添付のフィルターの付いた袋に入れてリン酸緩衝液を注入し、上記ストマッカーにて懸濁した納豆懸濁液をさらにリン酸緩衝液にて希釈し、それを75℃で15分間加熱処理した後、LB寒天培地（後述の表３）に塗抹培養して、そこに出現したコロニー数から算出することができる。
(b) 納豆菌総菌数
　上記の製造方法において発酵後に加熱殺菌工程を行った場合に製造される本発明の納豆は、発酵後に加熱殺菌を行わない通常の納豆と比べて、納豆菌総菌数が少ない。具体的には、加熱殺菌処理条件によって異なるが、納豆製造直後の納豆菌総菌数として、納豆1g当たり1×106個以下、好ましくは5×105個以下、より好ましくは3×105個以下、さらに好ましくは1×105個以下、特に好ましくは8×104個以下とすることができる。
　ここで、納豆菌総菌数（胞子と栄養細胞の総和）の測定は、納豆懸濁液の菌数を、寒天培地を用いて求めることにより行うことができる。具体的には、納豆をストマッカー袋に入れてリン酸緩衝液を注入し、上記ストマッカーにて懸濁した納豆懸濁液をさらにリン酸緩衝液にて希釈した後、LB寒天培地に塗抹培養して、そこに出現したコロニー数から算出することができる。
(c) 納豆の品質
　上記の方法により製造された本発明の納豆は、十分な糸引き性（ネバネバ性）を有し、納豆特有の香りを有する納豆となる。
４．納豆菌胞子及び栄養細胞の低減方法
　本発明においては、上記の方法に従い納豆を製造することによって、納豆菌の胞子及び栄養細胞の含有量が低減された納豆を製造することができる。従って、本発明は、上記納豆菌変異株を用いて納豆を製造することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法を提供するものである。
　本発明においては、納豆発酵後に上記の加熱殺菌工程を行うことで、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞、特に栄養細胞の含有量を顕著に低減することができる。当該加熱殺菌における処理条件は上述の通りであるが、例えば55～100℃、好ましくは60～90℃、より好ましくは60～75℃で、30～200分間、好ましくは60～180分間、より好ましくは90～150分間、特に好ましくは110～130分間とすることができる。このとき、湿度は相対湿度で0～60％とすることができる。また、上述したように、当該加熱殺菌は処理条件を変えて複数段階で行うこともできる。
５．納豆菌のスクリーニング方法
　本発明によればまた、上記のシングルコロニーの表色を指標として納豆発酵温度帯において胞子形成能が低下した納豆菌をスクリーニングする方法が提供される。本発明のスクリーニング方法は、被検納豆菌を、ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養する工程と、該培養で選択固体培地上に形成された被検納豆菌のシングルコロニーの表色を解析する工程を含み、選抜は「シングルコロニーの表面の全面積を100％としたときに、マンセル表色系の色相が黄系（Y）、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20％以下である」という要件を満たすか否かによって行う。被検納豆菌は、自然界から単離した菌株、各種発酵食品から分離した菌株、これらを化学変異剤処理などの化学的手法、紫外線やX線照射などの物理的手法、遺伝子工学的手法などを用いて変異させた変異株のいずれであってもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
（実施例１）納豆菌変異株の育種、ならびにその胞子形成能及び納豆製造適性の評価
１．胞子液の調製
　納豆菌変異株の育種親株としては、Bacillus subtilis No.7株（NITE BP-01805）を用いた。No.7株を下記表１の胞子形成培地（YE）10ml/試験管に植菌し、37℃、150rpm、24時間振盪培養することで胞子液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．胞子液の化学的変異処理
　納豆菌胞子液の化学的変異処理には、変異剤として変異カクテルMBS001（ちとせ研究所）を用いて、以下の操作を行った。
　まず、上述のNo.7株の胞子液5μlを、下記表２のLB培地5mlを充填した試験管に植菌し37℃、150rpm、15時間振盪培養した。次に、変異カクテルを4μg/ml、8μg/ml添加したLB培地を5mlずつ試験管に充填し、上記操作で得られた胞子培養液を波長660nmにおける吸光度が約0.01となるように植菌し、37℃、150rpmで吸光度を経時的に測定し、吸光度が約1.0となるまで振盪培養することで変異処理液を得た。なお、上記吸光度測定には、紫外可視分光光度計UV-1800（島津製作所）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　変異処理液に含まれる納豆菌変異株の総菌数については、50mMリン酸Na緩衝液（pH7）で適切な濃度に希釈した変異処理液を、下記表３のLB寒天培地に塗抹培養し気相温度37℃に設定したインキュベータ内で、約18時間培養後、出現したコロニー数から算出した。その結果、変異カクテル 4μg/ml、8μg/ml含有変異処理液の納豆菌変異株の総菌数はそれぞれ5.2×108個/ml、3.3×107個/mlであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
３．シングルコロニーの表色を指標とした納豆発酵温度帯における胞子形成能低下株のスクリーニング
　変異処理株からの高温培養下での胞子形成能低下株の選抜は以下の手順で行った。
　まず、変異処理液（変異カクテル 4μg/ml, 8μg/ml含有）を50mMリン酸Na緩衝液（pH7）で適切に希釈し、下記表４の胞子形成寒天培地（B入り）を20ml充填したプレート各150枚に塗抹培養し、気相温度49℃のインキュベータ内で48時間培養した。なお、変異処理液の希釈においては、予備実験により培養後の各プレート上のコロニーが約150個となる希釈率を事前に算出した。培養の結果、約45000コロニーのシングルコロニーが得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次に、上記シングルコロニーのうち、直径5mm以上のシングルコロニーの表色を評価した。なお、評価は、実験台から離れた窓からの自然光及びプレート直上から照射した蛍光灯を光源とした約1500ルクスの照度下で実施し、プレートは黒色の実験台に載置した状態で行い、色見本との比較評価時はプレートを斜め45度方向から観察した状態で評価を行った。シングルコロニーの表色は、「マンセルシステムによる　色彩の定規・拡充版」（日本色研事業株式会社　2014）に添付の色見本と比較して肉眼で評価した。評価は、シングルコロニーの表面の色調（表色）が、「該シングルコロニーの表面の全面積を100％としたときに、マンセル表色系の色相が黄系（Y）、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20％以下である」という基準を満たすかどうかによって行い、当該基準を満たした納豆菌変異株の270株を選抜した。図１に上記評価の模式図を示す。マンセル表色系の色相が黄系（Y）であり、明度が9以上、彩度2が以下の領域は、図１（ｂ）に示すように、複数に分かれていてもよい。
　上記評価で選抜した納豆菌変異株のうち、S092株、S103株のコロニー、親株のNo.7株のコロニーを撮影した写真を図２に示す。写真は蛍光灯下でデジタルカメラ（finepix f31fd (富士フィルム）)を用いて撮影した。撮影画像は、コロニーを直接目視した際と同等の表色であった。図２において、点線で囲んだ領域は、マンセル表色系の色相が黄系（Y）であり、明度が9以上、彩度が2以下となった領域を示す。図２に示されるように、No.7株はコロニーの中央に同心円状に、マンセル表色系の色相が黄系（Y）であり、明度が9以上、彩度が2以下である略白色の領域を大きく有し、その領域の面積はコロニー表面の全面積の20％を超えていた。一方、S092株、S103株においては、マンセル表色系の色相が黄系（Y）であり、明度が9以上、彩度が2以下である領域が僅かに点在するものの、当該領域を合計してもコロニー表面の全面積の10％に満たなかった。
　次に、上記270株の候補菌株から偽陽性を排除するため、再現試験を行った。具体的には、コロニーをLB寒天培地にストリークし、気相温度37℃で約18時間培養した後、再度、胞子形成寒天培地（B入り）にストリークし、気相温度49℃で48時間培養した後、形成されたコロニーについて再度上記の評価を行って、同基準を満たした納豆菌変異株のみを選抜した。
　合わせて、候補菌株のポリグルタミン酸生産能の確認のため、LB寒天培地上に培養した候補菌株を、下記表５に記載のGSP寒天培地に白金耳を用いてストリークし、気相温度37℃に設定したインキュベータ内で、約18時間培養し、培養後のコロニー上に、育種親株のNo.7株と同等以上の粘物質が形成されたものを合格とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記の２回の胞子形成寒天培地（B入り）上でのコロニー表色確認試験、GSP寒天培地での粘物質の産生試験によって、候補菌株を112株に絞りこんだ。
４．候補菌株の納豆製造適性の評価
（a)胞子液調製
　次に、候補菌株のコロニーを白金耳で採取し、酵母エキス培地5mlに植菌し、37℃、150rpm、24時間振盪培養することで納豆製造用の胞子液(納豆菌胞子スターター)を調製した。また、得られた胞子液(納豆菌胞子スターター)中に含まれる胞子数は、50mMリン酸Na緩衝液（pH7）で適切な濃度に希釈した胞子液を75℃、15分加熱した後、LB寒天培地に塗抹培養し気相温度37℃に設定したインキュベータ内で、約18時間培養後、出現したコロニー数から算出した。
（b)納豆製造試験
　納豆製造試験は以下の方法で実施した。まず、常法により蒸煮した直後の大豆（圧力0.16MPaにて24分蒸煮）に対し、選抜した納豆菌変異株の胞子液を適切に希釈し、納豆菌胞子数が約5000個/蒸煮大豆1gとなるように添加してよく混合した後、ポリスチレン製の個別容器に45gずつ充填した。
　充填した個別容器を気相温度40℃1時間、50.5℃5時間、47.5℃6時間の条件で発酵させ、納豆を製造した。比較例として育種親株のNo.7株も同様の方法で納豆を製造した。発酵した納豆は4℃、24時間冷蔵庫で熟成した後、下記の評価基準にて納豆品質（糸引き性、納豆特有の香り）を評価した。糸引き性、納豆特有の香りの評価は熟練した検査員のべ６名の評点の平均値で算出した。
［糸引き性の評価基準］
　糸引き性は、図３に示すように、納豆を箸で30回／10秒撹拌を行った後、納豆粒の塊を持ち上げた時の箸からの納豆粒の落ちにくさの程度により評価した。
　５点：非常に強い（混ぜた納豆粒の塊を箸で持ち上げた際に、空中で保持され５秒以上落下しない）
　４点：強い（混ぜた納豆粒の塊を箸で持ち上げた際に、空中で保持され落下するまで３秒かかる）
　３点：普通（混ぜた納豆粒の塊を箸で持ち上げた際に空中で保持できずに納豆粒が落ちる）
　２点：弱い（糸は引くが納豆粒の塊が形成されない）
　１点：非常に弱い（糸をひかない）
［納豆特有の香りの評価基準］
　納豆特有の香りを以下の尺度で官能評価により評価した。
　３点：適度な納豆臭があり、異臭もなく好ましい
　２点：納豆臭があるが、異臭がやや感じられる
　１点：異臭が強く感じられる
　また、品質評価を行った、納豆中の胞子数は以下の方法で測定した。納豆約45gに50mMリン酸緩衝液(pH7)を加えストマッカー（オルガノ製　エクスナイザー400）にて230rpm、1分間懸濁し、同緩衝液で適切な濃度に希釈した。希釈した抽出液は75℃15分加熱処理したのちLB寒天培地に塗抹培養（37℃16時間）し、出現したコロニー数から胞子数を求めた。
　上記各評価項目について、糸引き性の評点が３点以上、納豆特有の香りの評点が３点、納豆に含まれる納豆菌胞子が5×105個/納豆g以下、胞子液（納豆菌スターター）に含まれる納豆菌が1×107個/ml以上の全ての要件を満たす納豆変異株を合格とした。
　その結果、上記の全ての要件を満たす、すなわち納豆品質が良好で、胞子数が少ない納豆を製造可能な納豆菌変異株として6菌株（S092、S103、S125、S215、S219、S238)を選抜した。これらの選抜菌株を用いて調製した納豆製造用の胞子液（スターター）、製造された納豆の胞子数、糸引き性、納豆特有の香りの評価結果を下記表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　さらに、これらの菌株のうち、後述の加熱試験も踏まえて総合的に評価の高かったS103株を、受託番号NITE BP-02423として寄託した。
　また、S092株、S103株を用いて納豆の品温がやや低い温度帯においても、上記試験と同様の結果が得られるか確認した。具体的には、納豆菌変異株の胞子液を適切に希釈し、上記と同様にして納豆菌胞子数が約5000個/蒸煮大豆1gとなるように添加した蒸煮大豆を45ｇずつ充填した個別容器を気相温度40℃1時間、45℃11時間の条件で発酵させ、納豆を製造した。得られた納豆について、上記と同様にして納豆品質（糸引き性、納豆特有の香り）を評価した。結果を下記表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　その結果、いずれの変異株も1回目の試験より低い気相温度の条件でも上記の選抜基準を満たすことが確認できた。
（実施例２）納豆発酵後の加熱試験
　実施例１で選抜した納豆菌変異株のうち、S092株、S103株、S125株、S219株の4株に関して、発酵に続いて栄養細胞が殺菌可能な温度で加熱を行うことで総菌数の低減が可能かどうか確認した。
　まず、一夜、常温の水中で浸漬後、常法により蒸煮した直後の大豆（圧力0.16MPaにて24分蒸煮）に対し、上記納豆菌変異株の胞子液を滅菌水で希釈し、胞子数5000個/蒸煮大豆1gとなるように添加してよく混合した後、ポリスチレン製の個別容器に45gずつ充填した。
　充填した個別容器を気相温度40℃1時間、50.5℃5時間、47.5℃6時間での発酵に続き70℃2時間の条件で加熱した。加熱後の納豆は速やかに4℃の冷蔵庫に移して熟成した後、納豆品質、納豆菌総菌数、胞子数の確認を行った。
　比較例として育種親株のNo.7株も同様の方法で加熱試験を行った。一部の検体については、70℃加熱前に4℃で熟成して発酵終了時点での納豆品質（糸引き性、納豆特有の香り）、納豆菌総菌数、胞子数を前述の方法で測定した。結果を表８及び表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　その結果、いずれの納豆菌変異株も、発酵終了時点での納豆菌総菌数は1×108個オーダーであったものの、70℃加熱後の納豆菌総菌数が1×106個/納豆g以下となっており、納豆菌胞子以外の栄養細胞がほぼ殺菌できただけでなく、糸引き性、納豆特有の香りの評点も基準を満たしており、製造された納豆の品質としても良好であった。
　本発明によれば、植菌用の納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯では通常の胞子形成能を有するが、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能の低下した新規納豆菌が提供される。本発明の納豆菌株によれば、従来と同様の方法で納豆菌胞子を高濃度で含有する納豆菌スターターを製造可能で、従来の納豆製造工程によって、胞子数は少ないが、その他の点においては従来の一般的な納豆と同等の品質を備えた納豆を製造することができる。また、本発明の納豆は、納豆の品質を損なわない程度の加熱条件による殺菌が可能であるため、高品質の納豆を利用した各種加工食品の開発を促進可能である。従って、本発明は、納豆及びそれを利用した加工食品の製造において利用可能である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。

Claims (12)

  1. 　以下の(A)～(C)の性質を有する納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)変異株。
     (A)ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養して生育した前記納豆菌変異株のシングルコロニーの表色が、該シングルコロニーの表面の全面積を100％としたときに、マンセル表色系の色相が黄系（Y）、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20％以下であるという性質。
     (B) 胞子形成培地において、培地の液温37℃で培養した際に、前記納豆菌変異株の胞子数が1×107個/ml以上となる性質。
     (C) 前記納豆菌変異株を、煮大豆又は蒸煮大豆に1gあたり納豆菌胞子数5×103個となるように植菌し、豆の品温を40～53℃の範囲に維持した際に、糸引き、納豆特有の香りが良好で、かつ納豆1gあたり納豆菌胞子数が5×105個以下の納豆を製造できる性質。
  2. 　請求項１に記載の納豆菌変異株を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
  3. 　納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下である、請求項２に記載の納豆。
  4. 　発酵後、55℃～100℃で30分～2時間加熱殺菌されたことを特徴とする、請求項２に記載の納豆。
  5. 　納豆菌総菌数が納豆1gあたり1×106個以下である、請求項４に記載の納豆。
  6. 　請求項１に記載の納豆菌変異株を用いて大豆を発酵させる工程を含む、納豆の製造方法。
  7. 　発酵工程終了後の納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下である、請求項６に記載の納豆の製造方法。
  8. 　発酵後に55℃～100℃で30分～2時間加熱殺菌する工程をさらに含む、請求項７に記載の納豆の製造方法。
  9. 　加熱殺菌後の納豆菌総菌数が納豆1gあたり1×106個以下である、請求項８に記載の納豆の製造方法。
  10. 　請求項１に記載の納豆菌変異株を用いて大豆を発酵させた後に加熱殺菌することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
  11. 　発酵後に、55℃～100℃で30分～2時間加熱殺菌する、請求項１０に記載の納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
  12. 　以下の(1)及び(2)の工程を含む、納豆発酵温度帯において胞子形成能が低下した納豆菌のスクリーニング方法。
     (1) 被検納豆菌を、ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養する工程
     (2) 工程（1)の培養で選択固体培地上に形成された被検納豆菌のシングルコロニーの表色を解析し、該シングルコロニーの表面の全面積を100％としたときに、マンセル表色系の色相が黄系（Y）、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20％以下である要件を満たす被検納豆菌を選抜する工程
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