JP6963288B2 - 新規温度感受性納豆菌、及び胞子低含有納豆 - Google Patents
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Description
[1] 以下の(A)〜(C)の性質を有する納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)変異株。
(A) ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養して生育した前記納豆菌変異株のシングルコロニーの表色が、該シングルコロニーの表面の全面積を100%としたときに、マンセル表色系の色相が黄系(Y)、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20%以下であるという性質。
(B) 胞子形成培地において、培地の液温37℃で培養した際に、前記納豆菌変異株の胞子数が1×107個/ml以上となる性質。
(C) 前記納豆菌変異株を、煮大豆又は蒸煮大豆に1gあたり納豆菌胞子数5×103個となるように植菌し、豆の品温を40〜53℃の範囲に維持した際に、糸引き、納豆特有の香りが良好で、かつ納豆1gあたり納豆菌胞子数が5×105個以下の納豆を製造できる性質。
[2] [1]に記載の納豆菌変異株を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
[3] [2]に記載の納豆であって、納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下である、納豆。
[4] [2]に記載の納豆であって、発酵後、55℃〜100℃で30分〜2時間加熱殺菌されたことを特徴とする納豆。
[5] [4]に記載の納豆であって、納豆菌総菌数が納豆1gあたり1×106個以下である納豆。
[6] [1]に記載の納豆菌変異株を用いて大豆を発酵させる工程を含む、納豆の製造方法。
[7] 発酵工程終了後の納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下である、[6]に記載の納豆の製造方法。
[8] 発酵後に55℃〜100℃で30分〜2時間加熱殺菌する工程をさらに含む、[7]に記載の納豆の製造方法。
[9] 加熱殺菌後の納豆菌総菌数が納豆1gあたり1×106個以下である、[8]に記載の納豆の製造方法。
[10] [1]に記載の納豆菌変異株を用いて大豆を発酵させた後に加熱殺菌することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
[11] 発酵後に、55℃〜100℃で30分〜2時間加熱殺菌する、[10]に記載の納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
[12] 以下の(1)及び(2)の工程を含む、納豆発酵温度帯において胞子形成能が低下した納豆菌のスクリーニング方法。
(1) 被検納豆菌を、ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養する工程
(2) 工程(1)の培養で選択固体培地上に形成された被検納豆菌のシングルコロニーの表色を解析し、該シングルコロニーの表面の全面積を100%としたときに、マンセル表色系の色相が黄系(Y)、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20%以下である要件を満たす被検納豆菌を選抜する工程
1.納豆菌変異株
本発明の新規納豆菌変異株(以下、「本発明の納豆菌変異株」という)は、植菌用の納豆菌スターター(種菌)取得のための液体培養に通常用いられる温度帯では、通常の胞子形成能を有するが、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能の低下した温度感受性の納豆菌変異株である。本発明において、「納豆菌スターター取得のための液体培養に通常用いられる温度帯」とは、28℃〜37℃、好ましくは30℃〜37℃である。「納豆発酵に通常用いられる温度帯」とは、大豆の品温を実質的に40〜53℃、好ましくは43〜50℃に維持できる温度帯を意味し、通常の製造方法では、室温を35〜51℃、好ましくは38〜47℃の温度帯に維持することによって、発酵中の大豆の品温を上記温度帯に維持することが可能となる。大豆品温と室温が異なるのは、発酵熱によって豆の品温が上昇し、上記温度帯に維持されるためである。
本発明の納豆菌変異株は、胞子形成能以外の点においては、以下に示す通り、親株である納豆菌と同等の菌学的性質を有している。したがって、通常の納豆菌と同様に、糸引き及び外観が良好な納豆を製造できる性質を有している。
本発明の納豆菌変異株の栄養細胞は、大きさ2〜3μm程度の桿菌であり、運動性を有する。また、グラム染色性を有する。胞子の形状は楕円形であり、大きさは1.12〜1.28μm程度である。
本発明の納豆菌変異株のLB寒天培地上(後述の実施例1の表3)でのコロニーの形状は環状である。当該コロニーは、表面に皺があり、光沢が無く、色調が不透明〜乳白色であり、中央部の隆起がない特徴を有する。なお、グルタミン酸に富む培地上でのコロニーは粘調性を有する。
当該納豆菌変異株を液体培地で培養すると、培養後の培地表面に菌膜が形成される。また、培養液は混濁する。
本発明の納豆菌変異株は、グルコース、シュクロースに対する資化性を有する。一方、ラクトース、アラビノースに対する資化性を有さない。
本発明の納豆菌変異株は、好気性細菌であり、ビオチン要求性を示し、最少培地での生育が可能である。また、プロテアーゼ活性を有する。また、クエン酸塩を利用して生育が可能である。
本発明の納豆菌変異株は、通常の納豆菌の生育温度帯である37℃〜40℃付近で好適な生育能を有し、通常の納豆菌と同等の増殖速度により増殖する。
本発明の納豆菌変異株の胞子形成能は、温度感受性を有する。胞子形成能は、培養液中の胞子数の測定結果を指標として判定することができる。胞子数の測定は、培養液を加熱処理した後、寒天培地を用いて耐熱性菌数を求めることにより行うことができる。
本発明の温度感受性の納豆菌変異株は、自然界からのスクリーニングも可能であるが、人為的な変異導入法を用いると効率的に変異株が取得できるため好ましい。人為的に変異を導入する方法としては、化学変異剤処理のような化学的手法、紫外線やX線照射などの物理的手法、又は、遺伝子工学的手法などが挙げられる。上記の化学変異剤としては、特に限定はされないが、メタンスルホン酸エチル(EMS)、メタンスルホン酸メチル(MMS)、N-エチル-N-ニトロソウレア(ENU)、N-メチル-N-ニトロソウレア(NNU)、N-メチル-N'-ニトロソグアニジン(NTG)、N-メチル-N'-ニトロ−N-ニトログアニジン(MNNG)、臭素化デオキシウリジン(BrdU)、マイトマイシン、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、ヌクレオチド類似体等が挙げられ、これらの変異剤は1種を用いてもよく、2種以上の混合物を用いてもよい。
本発明では、上記納豆菌変異株を用いて納豆を製造することによって、加熱殺菌が可能な納豆を製造することが可能となる。
本発明の納豆の製造方法では、通常の納豆の製造に用いることができる如何なる原料をも用いることができる。例えば、丸大豆、半割大豆、割砕大豆(挽き割り納豆の原料)、脱脂大豆などを使用できる。特に高品質の納豆製造時に使用される中粒や大粒のものが好適である。これらの大豆は、生のまま用いることもできるが、乾燥処理を行ったもの(乾燥品)を用いることが一般的である。
本発明の納豆の製造方法において、納豆菌スターターとして上記納豆菌変異株を使用する際は、胞子状態のものを用いることが好適である。胞子状態の納豆菌は、安定保存が可能で取扱いが容易であり、熱い蒸煮大豆又は煮大豆(以下、「大豆」という)への接種の際にも死滅しないため、納豆の雑菌汚染を防ぐことができる。また、胞子状態の納豆菌は、熱によるヒートショックにより、大豆への接種後速やかに発芽させることが可能となる。
本発明の納豆の製造方法において、納豆の発酵は、大豆の品温を実質的に40〜53℃、好ましくは43〜50℃である通常の納豆発酵温度帯に維持することで行うことが可能である。また、本発明においては、室温を35〜51℃、好ましくは38〜47℃の温度帯に維持することによって、発酵中の大豆の品温を上記温度帯に維持することが可能となる。発酵熱によって豆の品温が上昇し、上記温度帯に維持されるためである。
上述の納豆菌変異株は、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能が低下することから、上記発酵後に納豆に含まれる納豆菌の大半は耐熱性の低い栄養細胞となる。したがって、納豆菌の栄養細胞を死滅させうる(大幅に低減させうる)条件で加熱処理することにより、効果的に納豆を殺菌することが可能であるため、本発明の納豆の製造方法においては、上記発酵後に加熱殺菌処理を行うことが好ましい。
上記の加熱殺菌処理終了後、二次発酵による弊害(発酵工程終了後に納豆上で納豆菌が活動することに起因するアンモニアの増加、チロシンの析出、糸の分解等)を抑制するために、通常、3℃以上10℃未満、好ましくは3℃以上8℃未満、より好ましくは3℃以上6℃未満の低温になるようにして6時間〜3日間、好ましくは8時間〜2日間、より好ましくは24時間程度、熟成を行い、製造は完了する。
上記の方法にて製造された本発明の納豆は、以下の性質を有する。
(a) 胞子含有量
本発明の納豆は、通常の納豆と比べて納豆菌胞子含有量が少ない。なぜなら、当該納豆菌変異株は、納豆発酵に通常用いられる温度帯では胞子形成能が低下することから、発酵工程中の胞子形成能が著しく低いためである。通常の納豆中の納豆菌胞子数は納豆1g当たり1×107個から1×109個程度であるが、本発明の納豆中の納豆菌胞子数は、発酵工程終了直後の納豆1g当たり5×105個以下、好ましくは3×105個以下、より好ましくは1×105個以下である。
上記の製造方法において発酵後に加熱殺菌工程を行った場合に製造される本発明の納豆は、発酵後に加熱殺菌を行わない通常の納豆と比べて、納豆菌総菌数が少ない。具体的には、加熱殺菌処理条件によって異なるが、納豆製造直後の納豆菌総菌数として、納豆1g当たり1×106個以下、好ましくは5×105個以下、より好ましくは3×105個以下、さらに好ましくは1×105個以下、特に好ましくは8×104個以下とすることができる。
上記の方法により製造された本発明の納豆は、十分な糸引き性(ネバネバ性)を有し、納豆特有の香りを有する納豆となる。
本発明においては、上記の方法に従い納豆を製造することによって、納豆菌の胞子及び栄養細胞の含有量が低減された納豆を製造することができる。従って、本発明は、上記納豆菌変異株を用いて納豆を製造することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法を提供するものである。
本発明によればまた、上記のシングルコロニーの表色を指標として納豆発酵温度帯において胞子形成能が低下した納豆菌をスクリーニングする方法が提供される。本発明のスクリーニング方法は、被検納豆菌を、ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養する工程と、該培養で選択固体培地上に形成された被検納豆菌のシングルコロニーの表色を解析する工程を含み、選抜は「シングルコロニーの表面の全面積を100%としたときに、マンセル表色系の色相が黄系(Y)、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20%以下である」という要件を満たすか否かによって行う。被検納豆菌は、自然界から単離した菌株、各種発酵食品から分離した菌株、これらを化学変異剤処理などの化学的手法、紫外線やX線照射などの物理的手法、遺伝子工学的手法などを用いて変異させた変異株のいずれであってもよい。
1.胞子液の調製
納豆菌変異株の育種親株としては、Bacillus subtilis No.7株(NITE BP-01805)を用いた。No.7株を下記表1の胞子形成培地(YE)10ml/試験管に植菌し、37℃、150rpm、24時間振盪培養することで胞子液を調製した。
納豆菌胞子液の化学的変異処理には、変異剤として変異カクテルMBS001(ちとせ研究所)を用いて、以下の操作を行った。
変異処理株からの高温培養下での胞子形成能低下株の選抜は以下の手順で行った。
まず、変異処理液(変異カクテル 4μg/ml, 8μg/ml含有)を50mMリン酸Na緩衝液(pH7)で適切に希釈し、下記表4の胞子形成寒天培地(B入り)を20ml充填したプレート各150枚に塗抹培養し、気相温度49℃のインキュベータ内で48時間培養した。なお、変異処理液の希釈においては、予備実験により培養後の各プレート上のコロニーが約150個となる希釈率を事前に算出した。培養の結果、約45000コロニーのシングルコロニーが得られた。
(a)胞子液調製
次に、候補菌株のコロニーを白金耳で採取し、酵母エキス培地5mlに植菌し、37℃、150rpm、24時間振盪培養することで納豆製造用の胞子液(納豆菌胞子スターター)を調製した。また、得られた胞子液(納豆菌胞子スターター)中に含まれる胞子数は、50mMリン酸Na緩衝液(pH7)で適切な濃度に希釈した胞子液を75℃、15分加熱した後、LB寒天培地に塗抹培養し気相温度37℃に設定したインキュベータ内で、約18時間培養後、出現したコロニー数から算出した。
納豆製造試験は以下の方法で実施した。まず、常法により蒸煮した直後の大豆(圧力0.16MPaにて24分蒸煮)に対し、選抜した納豆菌変異株の胞子液を適切に希釈し、納豆菌胞子数が約5000個/蒸煮大豆1gとなるように添加してよく混合した後、ポリスチレン製の個別容器に45gずつ充填した。
糸引き性は、納豆を箸で30回/10秒撹拌を行った後、納豆粒の塊を持ち上げた時の箸からの納豆粒の落ちにくさの程度により評価した。
5点:非常に強い(混ぜた納豆粒の塊をスプーンで持ち上げた際に、空中で保持され5秒以上落下しない)
4点:強い(混ぜた納豆粒の塊をスプーンで持ち上げた際に、空中で保持され落下するまで3秒かかる)
3点:普通(混ぜた納豆粒の塊をスプーンで持ち上げた際に空中で保持できずに納豆粒が落ちる)
2点:弱い(糸は引くが納豆粒の塊が形成されない)
1点:非常に弱い(糸をひかない)
納豆特有の香りを以下の尺度で官能評価により評価した。
3点:適度な納豆臭があり、異臭もなく好ましい
2点:納豆臭があるが、異臭がやや感じられる
1点:異臭が強く感じられる
実施例1で選抜した納豆菌変異株のうち、S092株、S103株、S125株、S219株の4株に関して、発酵に続いて栄養細胞が殺菌可能な温度で加熱を行うことで総菌数の低減が可能かどうか確認した。
Claims (11)
- (A)ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養して生育した納豆菌のシングルコロニーの表色が、該シングルコロニーの表面の全面積を100%としたときに、マンセル表色系の色相が黄系(Y)、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20%以下であるという性質と、(B) 胞子形成培地において、培地の液温37℃で培養した際に、納豆菌の胞子数が1×10 7 個/ml以上となる性質を有する納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)変異株を、品温が55〜95℃の煮大豆又は蒸煮大豆に植菌し、発酵させて製造されたことを特徴とする納豆。
- 請求項1に記載の納豆であって、納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下である、納豆。
- 請求項1又は2に記載の納豆であって、発酵後、55℃〜100℃で30分〜2時間加熱殺菌されたことを特徴とする納豆。
- 請求項3に記載の納豆であって、納豆菌総菌数が納豆1gあたり1×106個以下である納豆。
- (A)ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養して生育した納豆菌のシングルコロニーの表色が、該シングルコロニーの表面の全面積を100%としたときに、マンセル表色系の色相が黄系(Y)、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20%以下であるという性質と、(B) 胞子形成培地において、培地の液温37℃で培養した際に、納豆菌の胞子数が1×10 7 個/ml以上となる性質を有する納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)変異株を、品温が55〜95℃の煮大豆又は蒸煮大豆に植菌する工程;及び
該大豆の品温を40〜53℃に維持することによって大豆を発酵させる工程;
を含む、納豆の製造方法。 - 発酵工程終了後の納豆菌胞子数が納豆1gあたり5×105個以下である、請求項5に記載の納豆の製造方法。
- 発酵後に55℃〜100℃で30分〜2時間加熱殺菌する工程をさらに含む、請求項6に記載の納豆の製造方法。
- 加熱殺菌後の納豆菌総菌数が納豆1gあたり1×106個以下である、請求項7に記載の納豆の製造方法。
- (A)ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養して生育した納豆菌のシングルコロニーの表色が、該シングルコロニーの表面の全面積を100%としたときに、マンセル表色系の色相が黄系(Y)、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20%以下であるという性質と、(B) 胞子形成培地において、培地の液温37℃で培養した際に、納豆菌の胞子数が1×10 7 個/ml以上となる性質を有する納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)変異株を、品温が55〜95℃の煮大豆又は蒸煮大豆に植菌し、該大豆の品温を40〜53℃に維持することによって大豆を発酵させた後に加熱殺菌することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
- 発酵後に、55℃〜100℃で30分〜2時間加熱殺菌する、請求項9に記載の納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
- 以下の(1)及び(2)の工程を含む、40〜53℃の納豆発酵温度帯において胞子形成能が低下した納豆菌(Bacillus subtilis var. natto)のスクリーニング方法。
(1) 被検納豆菌を、ビオチンを含有する選択固体培地において、気相温度49℃で48時間培養する工程
(2) 工程(1)の培養で選択固体培地上に形成された被検納豆菌のシングルコロニーの表色を解析し、該シングルコロニーの表面の全面積を100%としたときに、マンセル表色系の色相が黄系(Y)、明度が9以上、彩度が2以下である領域の面積が20%以下である要件を満たす被検納豆菌を選抜する工程
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