WO2018135271A1 - 酵素反応の測定方法、スクリーニング方法及び測定装置 - Google Patents

酵素反応の測定方法、スクリーニング方法及び測定装置 Download PDF

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WO2018135271A1
WO2018135271A1 PCT/JP2017/046922 JP2017046922W WO2018135271A1 WO 2018135271 A1 WO2018135271 A1 WO 2018135271A1 JP 2017046922 W JP2017046922 W JP 2017046922W WO 2018135271 A1 WO2018135271 A1 WO 2018135271A1
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enzyme
reaction
measurement
irradiation
measuring
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PCT/JP2017/046922
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English (en)
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一木　隆範
真吾 上野
Original Assignee
公益財団法人川崎市産業振興財団
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/40—Apparatus specially designed for the use of free, immobilised, or carrier-bound enzymes, e.g. apparatus containing a fluidised bed of immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme reaction measurement method, a screening method, and a measurement apparatus.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2017-009589 filed in Japan on January 23, 2017, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • New functional proteins are expected to contribute to various application fields such as pharmaceuticals, detergents, food processing, R & D reagents, clinical analysis, bioenergy, and biosensors.
  • Patent Document 1 describes a method for producing a protein array, which can produce an enormous number of mutant protein arrays.
  • Non-Patent Document 1 describes a method for screening mutant enzymes with high throughput by using droplets enclosing yeast cells.
  • a protein array in which tens of millions of mutant enzymes are loaded on a well array having a size of several cm ⁇ several cm can be manufactured.
  • Such a protein array has a volume per well of the order of femtoliters.
  • the inventors distributed the reaction solution to all the wells constituting the well array at the same time, or simultaneously observed all the wells constituting the well array to measure the enzyme activity. Found that it can be difficult to do.
  • Non-Patent Document 1 prepares a large number of droplets containing yeast cells expressing an enzyme on the cell surface and a substrate, and sorts the droplets containing a fluorescent substance generated by the enzyme reaction. To collect.
  • Non-Patent Document 1 describes that 10 8 mutant enzymes were screened in 10 hours.
  • the method described in Non-Patent Document 1 requires a certain amount of time for preparation and sorting of droplets, it may be difficult to measure enzyme activity under the same reaction conditions for all mutant enzymes. is there.
  • the present invention aims to provide a technique for controlling the time from the start of the enzyme reaction to the measurement of the enzyme reaction in the case where the enzyme reaction is measured for each of a large number of enzymes. To do.
  • a method for measuring an enzyme reaction wherein a reaction space containing the enzyme and a substrate or cofactor of the enzyme, which is a caged compound, is irradiated with an active energy ray to thereby convert the substrate or the cofactor.
  • a method comprising: a step of converting to an activated form and starting an enzyme reaction by the enzyme; a step b of measuring the enzyme reaction; and a step c of controlling a time difference between the step a and the step b.
  • the method according to [1], wherein the reaction space is a well.
  • the method according to [1], wherein the reaction space is a droplet.
  • the method according to [1], wherein the reaction space is a cell.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the enzyme reaction in 10,000 or more reaction spaces at a time is measured.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the substrate or the cofactor is a mixture of a plurality of caged compounds having different deprotection wavelengths.
  • the active energy ray is an electromagnetic wave having a peak wavelength at a wavelength of 200 to 1500 nm.
  • the active energy ray is an ultrasonic ray having a frequency of 200 to 2000 kHz.
  • a screening method for an enzyme, an enzyme-inhibiting molecule or an enzyme-activating molecule comprising a step of measuring an enzymatic reaction by the method according to any one of [1] to [8].
  • a measuring device for measuring enzyme reactions respectively occurring in a plurality of reaction spaces wherein the reaction spaces containing the enzyme and a substrate or cofactor of the enzyme that is a caged compound are irradiated with active energy rays and Control for controlling the time difference between the irradiation unit for starting the enzyme reaction, the measurement unit for measuring the enzyme reaction, the irradiation of the active energy ray from the irradiation unit, and the measurement of the enzyme reaction in the measurement unit A measuring device.
  • the measurement apparatus includes a photodetector that detects an optical signal associated with the enzyme reaction.
  • the measurement unit includes a plurality of electrodes respectively connected to the plurality of reaction spaces, and a circuit unit that measures current, voltage, or impedance generated in association with the enzyme reaction at the electrodes. ] Measuring apparatus. [13] The measurement apparatus according to any one of [10] to [12], wherein the reaction space is a well. [14] The measurement apparatus according to any one of [10] to [12], wherein the reaction space is a droplet. [15] The measurement apparatus according to any one of [10] to [12], wherein the reaction space is a cell. [16] The measuring apparatus according to any one of [10] to [15], which is used for measuring enzyme reactions occurring in each of the 10,000 or more reaction spaces.
  • the present invention it is possible to provide a technique for controlling the time from the start of the enzyme reaction to the measurement of the enzyme reaction when the enzyme reaction is measured for each of a large number of enzymes.
  • (A)-(e) is a figure explaining an example of the process of acquiring a useful enzyme, an enzyme inhibition molecule, or an enzyme activation molecule
  • FIG. 1 (a) is a diagram showing a mutant DNA library (DNA-binding beads) immobilized on beads.
  • a DNA encoding one type of mutant enzyme, enzyme inhibitor molecule candidate or enzyme activation molecule candidate is immobilized on one bead.
  • Such beads can be produced, for example, by the method described in Patent Document 1.
  • FIG. 1B the DNA-binding beads of FIG. 1A are distributed on the well array.
  • the well array of FIG. 1B one bead is distributed per well.
  • the distribution of the beads on the well array can be performed, for example, by using magnetic beads as beads and accommodating the magnetic beads in the well array using a magnet (see, for example, Patent Document 1).
  • FIG. 2 is a photograph showing a specific example of the well array of FIG. In the well array shown in FIG. 2, for example, 10 7 to 10 8 mutant proteins are loaded on one chip.
  • the well surface of the well array is transcribed by transcribing and translating the mutant enzyme, enzyme inhibitor molecule candidate, or enzyme activation molecule candidate DNA immobilized on the beads by cell-free synthesis.
  • the mutant enzyme, enzyme inhibitor molecule candidate, or enzyme activation molecule candidate is bound to.
  • the mutant enzyme, enzyme inhibitor molecule candidate or enzyme activation molecule candidate is bound to the well surface by, for example, introducing a histidine tag at the N-terminus or C-terminus of the mutant enzyme, enzyme inhibitor molecule candidate or enzyme-activating molecule candidate.
  • the surface of the well of the well array can be modified with Ni-NTA (nickel-nitrotropic acid).
  • FIG. 1 (d) the enzyme reaction of the entire well array is measured to identify a highly active mutant enzyme, enzyme inhibiting molecule or enzyme activating molecule.
  • FIG. 2 (e) DNA binding beads corresponding to the specified mutant enzyme, enzyme inhibiting molecule or enzyme activating molecule are recovered, the recovered DNA is amplified and a mutation is introduced, Re-fix to.
  • an enzyme, an enzyme inhibition molecule or an enzyme activation molecule having a desired activity can be obtained.
  • Examples of the method for introducing a mutation into DNA include a method using error-prone PCR.
  • Error-prone PCR is a method for artificially generating random errors during a PCR reaction.
  • Taq DNA polymerase having no proofreading function is preferably used.
  • Mn 2+ to the reaction solution or to make the dNTP concentration unbalanced.
  • the well array as shown in FIG. 2 takes a long time to measure the enzyme reaction of the entire well array, and thus the enzyme reaction is completed during preparation for or during the measurement of the enzyme activity. It is difficult to measure the time from the start of the reaction to the measurement at the same time for all wells on the well array.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating an example of a technique for encapsulating one type of protein in one droplet.
  • a liquid device 300 having channels 310 and 320 that are orthogonal to each other can be used to produce droplets. More specifically, the aqueous liquid 330 is introduced into one flow path 310 of the fluidic device shown in FIG. 3 and fed in the direction of the arrow, and the oil 340 is introduced into the other flow path 320 and moved in the direction of the arrow. By feeding the liquid, a droplet D (in this example, a water-in-oil emulsion) can be produced.
  • a droplet D in this example, a water-in-oil emulsion
  • the DNA 331 may encode, for example, a mutant enzyme, an enzyme inhibitor molecule candidate, or an enzyme activation molecule candidate.
  • one kind of protein 332 can be encapsulated in one droplet D by subjecting the encapsulated DNA 331 to cell-free translation.
  • Cell-free translation can be realized, for example, by using a cell-free translation reaction solution as the aqueous liquid 330.
  • the enzyme reaction can be performed inside each droplet D. By measuring this enzyme reaction, it is possible to identify droplets containing highly active enzymes, enzyme-inhibiting molecules or enzyme-activating molecules.
  • the droplet D exhibiting the desired activity is recovered by sorting or the like, and the DNA 331 present inside the droplet D is recovered. Subsequently, the recovered DNA 331 is amplified and a mutation is introduced.
  • a method for introducing a mutation into DNA the same method as described above can be used. By repeating the above steps, an enzyme, an enzyme-inhibiting molecule or an enzyme-activating molecule having a desired activity can be obtained.
  • a liquid droplet water-in-oil emulsion in this example
  • a reaction tube stirring and emulsifying with a vortex or the like.
  • the present invention is a method for measuring an enzyme reaction, wherein the reaction space containing the enzyme and a substrate or cofactor of the enzyme that is a caged compound is irradiated with active energy rays to irradiate the substrate or complement.
  • a method comprising: converting a factor into an activated form and starting an enzyme reaction by the enzyme; a process b for measuring the enzyme reaction; and a process c for controlling a time difference between the process a and the process b. To do.
  • a reaction space containing the enzyme and a substrate or cofactor of the enzyme that is a caged compound is irradiated with active energy rays to activate the substrate or the cofactor. It is said that the method comprises converting to a mold and starting an enzyme reaction by the enzyme, measuring the enzyme reaction, and controlling a time difference between the start of the enzyme reaction and the measurement of the enzyme reaction be able to.
  • the enzyme reaction is started at a desired timing, and the enzyme reaction is started from the start of the enzyme reaction.
  • the time until measurement can be controlled.
  • reaction space containing the enzyme and the substrate or cofactor of the enzyme which is a caged compound, is irradiated with active energy rays to convert the substrate or cofactor into an active form, and the enzyme reaction by the enzyme is started. To do.
  • the enzyme is not particularly limited, and an industrially useful enzyme reaction can be measured.
  • the enzyme include an enzyme comprising a protein, an enzyme comprising a nucleic acid such as a ribozyme, deoxyribozyme, and the like.
  • Specific enzymes include, for example, dehydrogenase, oxidase, oxygenase, reductase, kinase, aminotransferase, DNA polymerase, RNA polymerase, lipase, nuclease, glucosidase, protease, decarboxylase, dehydratase, racemase, epimerase, glutamine synthetase, DNA Examples include ligase and RNA ligase.
  • the reaction space is not particularly limited as long as it is a reaction space in which an enzyme is accommodated.
  • the reaction space include wells, droplets, cells, and the like.
  • -Well Well means a recess formed on a solid phase.
  • examples of the well include wells constituting a well array.
  • the well array may be, for example, a well array that takes time to measure the enzyme reaction of the entire well array.
  • An example of such a well array is a well array in which 10 7 to 10 8 mutant proteins are loaded on a well array having a size of several centimeters ⁇ several centimeters as shown in FIG. .
  • the well density of the well array may be, for example, 10,000 to 10,000,000 wells / cm 2 , and may be, for example, 100,000 to 1,000,000 wells / cm 2 .
  • the area of the well array is not particularly limited, and may be several cm ⁇ several cm to several m ⁇ several m.
  • an array of several m ⁇ several m can be manufactured by using a recent liquid crystal panel manufacturing technique or the like.
  • volume per well may be, for example, 1 fL / well to 1000 pL / well, for example, 50 fL / well to 100 pL / well.
  • Each well of the well array may contain a different mutant enzyme, enzyme inhibitor molecule candidate, or enzyme activation molecule candidate. Thereby, it becomes possible to evaluate the activity of many mutant enzymes, enzyme inhibitor molecule candidates, or enzyme activation molecule candidates simultaneously in parallel.
  • the same enzyme may be accommodated in each well of the well array. Then, the enzyme reaction may be measured by changing conditions such as the irradiation amount of the active energy ray for each region. Thereby, for example, enzyme reactions under various conditions can be measured by a single measurement. For example, the Michaelis-Menten equation for enzyme reactions can be plotted.
  • examples of the droplet include a droplet such as an aqueous liquid, an emulsion such as a water-in-oil emulsion, an oil-in-water emulsion, a liposome, and a gel.
  • examples of the aqueous liquid include water, buffer solution, and isotonic solution.
  • examples of the gel include hydrogels such as alginic acid gel and agarose gel.
  • the oil-in-water emulsion can be used, for example, when measuring an enzyme reaction of an enzyme that functions in a hydrophobic environment.
  • droplets can be arranged regularly.
  • 4A to 4D are diagrams illustrating the arrangement state of the droplets.
  • FIG. 4A is a diagram illustrating a state in which the droplet D in which the protein 332 is enclosed is packed tightly on a plane.
  • FIG. 4B is a diagram illustrating a state in which the droplets D are regularly arranged in two dimensions.
  • the droplets D can be regularly arranged two-dimensionally by accommodating the droplets in wells regularly formed two-dimensionally on the substrate.
  • the well may have a depth that can accommodate a part of the droplet D, or a depth that can accommodate the entire droplet D.
  • a suction port may be provided inside the well, and the droplet may be fixed by sucking the droplet from the suction port.
  • FIG. 4C is a diagram showing a state in which the droplets D are arranged one-dimensionally.
  • the droplet D can be arranged one-dimensionally by enclosing the droplet in a linear channel.
  • FIG. 4D is a diagram showing a state where the droplets D are two-dimensionally arranged by enclosing the droplets D in the meandering flow path 400.
  • the droplets When measuring the enzyme reaction in regularly arranged droplets, the droplets can be handled in the same manner as the well array described above.
  • the reaction space can be a cell itself.
  • the cell is not particularly limited, and examples thereof include Escherichia coli, yeast, animal cells and the like.
  • a cell into which a library consisting of an expression vector of a gene encoding a mutant enzyme, an enzyme inhibitor molecule candidate or an enzyme activation molecule candidate is introduced can be used as the reaction space.
  • One cell preferably contains only one type of mutant enzyme, enzyme inhibition molecule or enzyme activation molecule to be measured.
  • the cells may be in any state as long as the enzyme reaction performed in the cells can be individually measured for each cell.
  • the cells may be arranged on a substrate, may be enclosed in a droplet, or may be suspended in a fluid.
  • enzyme reactions in a large number of reaction spaces can be measured by controlling the time from the start of the enzyme reaction to the time of measurement of the enzyme reaction. That is, one of the features of the method of the present embodiment is that the enzyme reaction in a large number of reaction spaces can be measured while controlling the time from the start of the enzyme reaction to the time of measurement of the enzyme reaction. is there.
  • the method of this embodiment can measure, for example, enzyme reactions in 10,000 or more reaction spaces at a time.
  • “at a time” means that an enzyme reaction in 10,000 or more reaction spaces can be measured at a time.
  • the enzyme reaction in 10,000 or more reaction spaces can be measured by operating the measuring apparatus once.
  • the enzyme reaction in 10,000 or more reaction spaces can be measured continuously.
  • the upper limit of the number of reaction spaces that can be measured at one time is not particularly limited, but may be, for example, about 10 billion.
  • a caged compound is a compound that is temporarily inactivated by protection with a protecting group that can be deprotected by irradiation with active energy rays. By irradiating the caged compound with active energy rays, it can be instantaneously converted into an active compound.
  • the caged compound includes not only a substrate or cofactor of an enzyme protected with a protecting group, but also a cofactor forming a complex with a molecule protected with a protecting group.
  • a cofactor is a chemical substance necessary for the catalytic activity of an enzyme, and examples thereof include a coenzyme, a prosthetic group, and a metal ion.
  • a molecule that forms a complex with a cofactor for example, caged-ethylenediaminetetraacetic acid, caged-glycoletherdiaminetetraacetic acid, etc., chelate the cofactor before irradiation with active energy rays, and then irradiate with active energy rays. May be molecules that release the cofactor.
  • the enzyme reaction can be stopped before irradiation with active energy rays, and the enzyme reaction can be started by irradiation with active energy rays.
  • Examples of the protecting group of the caged compound include an ⁇ -carboxy-2-nitrobenzyl (CNB) group represented by the following formula (1) and 1- (2-nitrophenyl) ethyl (NPE) represented by the following formula (2).
  • Ph represents a phenyl group.
  • the caged compound may be a salt or a free form. More specific caged compounds include, for example, adenosine 5′-triphosphate, P3- (1- (2-nitrophenyl) ethyl) ester, disodium salt (NPE-caged ATP), adenosine 5′-triphos Fate, P3- (1- (4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl) ethyl) ester, disodium salt (MNPE-caged ATP), adenosine 5′-diphosphate, P2- (1- (2-nitro Phenyl) ethyl) ester, potassium salt (NPE-caged ADP), 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyladenosine 3 ′, 5′-cyclic monophosphate (DMNB-caged cAMP), D-myoinositol 1, 4,5-triphosphate, P4 (5)-(1- (2-nitrophenyl) ethyl) Steal, tri
  • the caged compound a plurality of types of compounds having different active energy rays for deprotecting the protecting group can be used. This makes it possible to measure enzyme reactions using a plurality of substrates and multistage enzyme reactions.
  • the protecting group of the caged compound can be appropriately selected in relation to the effect in the next step.
  • the active energy ray is not particularly limited as long as it can deprotect the above-described protecting group and convert the above-mentioned caged compound into an active form.
  • ultraviolet rays visible rays, infrared rays and other electromagnetic waves
  • ⁇ rays ⁇ Examples thereof include radiation such as rays, ⁇ rays, electron rays, neutron rays, and X-rays, and focused ultrasonic rays.
  • an electromagnetic wave having a peak wavelength at a wavelength of 200 to 1500 nm, for example, a wavelength of 250 to 850 nm, for example, a wavelength of 340 to 380 nm can be used.
  • the dose of the electromagnetic waves is not particularly limited as long as it is an amount capable of deprotecting the caged compound to be used, for example, may be 1 ⁇ 10000mJ / cm 2, for example may be 1 ⁇ 1000mJ / cm 2, for example, It may be 1 to 100 mJ / cm 2 , for example, 1 to 10 mJ / cm 2 .
  • the wavelength of the electromagnetic wave is in the range of 340 to 380 nm, the nucleic acid is hardly damaged.
  • the wavelength of the electromagnetic wave is in the range of 1000 to 1500 nm, it is possible to manufacture a device for irradiating the electromagnetic wave at low cost by using consumer parts.
  • an ultrasonic beam having a frequency of 200 to 2000 kHz can be used as a suitable active energy beam.
  • Dose of ultrasound line is not particularly limited as long as it is an amount capable of deprotecting the caged compound to be used, for example, may be 1 ⁇ 10000mJ / cm 2, for example it may be 1 ⁇ 1000mJ / cm 2 For example, it may be 1 to 100 mJ / cm 2 , for example, 1 to 10 mJ / cm 2 .
  • the irradiation of the active energy ray and the measurement of the enzyme reaction may be repeated a plurality of times while changing the conditions such as the irradiation amount of the active energy ray.
  • enzyme reactions under various conditions can be measured in the same well.
  • the Michaelis-Menten equation for one mutant enzyme contained in one well can be plotted.
  • step a the enzyme reaction is measured in this step.
  • the enzyme reaction can be measured as an optical signal, an electric signal, or the like. Examples of the optical signal include color development, light emission, and fluorescence.
  • an electrical signal can be obtained, for example, by measuring an oxidation-reduction reaction by an enzyme by electrochemical measurement.
  • a reaction system represented by the following formula (F1) can be used.
  • the substrate of the kinase is ADP
  • a caged compound such as NPE-caged ADP may be used as ADP.
  • step a when active energy rays are irradiated in step a, the caged compound is deprotected and ADP is generated.
  • the produced ADP can react as a substrate for the kinase.
  • the kinase converts ADP to ATP.
  • luminescence corresponding to the activity of the kinase is observed by combining the produced ATP with a luminescence reaction by luciferase. By measuring this luminescence, the reaction of the kinase can be measured.
  • caged-ethylenediaminetetraacetic acid formed as a complex with magnesium ion (Mg 2+ ) as a cofactor can also be used as a caged compound.
  • Mg 2+ magnesium ion
  • the caged compound is deprotected and free Mg 2+ is generated.
  • the produced Mg 2+ can act as a cofactor for kinases and luciferases.
  • the kinase converts ADP to ATP, and luminescence corresponding to the activity of the kinase is observed by combining the purified ATP with the luminescence reaction by luciferase. By measuring this luminescence, the reaction of the kinase can be measured.
  • Step c the time difference between step a and step b described above is controlled.
  • Controlling the time difference means that the time when the step a is performed, that is, the time when the target reaction space is irradiated with the active energy ray, and the time when the step b is performed, that is, the time when the enzyme reaction in the reaction space is measured. It means to control the time difference (interval).
  • the time difference between step a and step b may be constant, or the time difference between step a and step b may be changed intentionally.
  • the time from the start of the enzyme reaction to the time of measurement of the enzyme reaction can be controlled. Since the time difference control method is closely related to the structure of the measuring apparatus, the details will be described later.
  • the present invention provides a screening method for an enzyme, an enzyme-inhibiting molecule or an enzyme-activating molecule, comprising the step of measuring an enzymatic reaction by the method described above.
  • the enzyme reaction can be accurately measured for a large number of enzymes by controlling the time from the start of the enzyme reaction to the time of measuring the enzyme reaction, as described above.
  • the enzyme, enzyme inhibitor molecule or enzyme activation molecule may be encoded by a library prepared by an evolutionary molecular engineering technique.
  • the present invention provides a measuring device that measures enzyme reactions respectively occurring in a plurality of reaction spaces.
  • the measurement apparatus of this embodiment includes an irradiation unit, a measurement unit, and a control unit.
  • the irradiation unit starts the enzyme reaction by irradiating the reaction space containing the enzyme and a substrate or cofactor of the enzyme that is a caged compound with active energy rays.
  • the measurement unit measures an enzyme reaction.
  • the control unit controls the time difference between the irradiation of the active energy ray from the irradiation unit and the measurement of the enzyme reaction in the measurement unit.
  • the measuring apparatus according to the present embodiment may be used for measuring enzyme reactions respectively occurring in 10,000 or more reaction spaces.
  • the measurement method of the enzyme reaction described above can be carried out by controlling the time from the start of the enzyme reaction to the time of measurement of the enzyme reaction by the measuring apparatus of the present embodiment.
  • the measurement apparatus of the first embodiment is an apparatus for measuring an enzyme reaction in a well array.
  • the measurement apparatus is a measurement apparatus for measuring an enzyme reaction in a well array, and is an irradiation region having a smaller area than the region where the well array is formed on the substrate on which the well array is formed.
  • An irradiation unit that irradiates active energy rays to start the enzyme reaction in the well array, a measurement unit that detects an optical signal associated with the enzyme reaction in the irradiation region, and the irradiation unit and the substrate relative to the measurement unit A drive unit that moves a relative position in a direction along the surface of the substrate; and a control unit that controls a time difference between irradiation of active energy rays from the irradiation unit and measurement of the enzyme reaction in the measurement unit.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a main part of the measuring apparatus 1 of the first embodiment.
  • the measurement apparatus 1 includes a support unit 30, a drive unit 35, an irradiation unit 40, a measurement unit 50, and a control unit 36.
  • the measuring device 1 measures an optical signal accompanying an enzyme reaction.
  • the measurement unit 50 may be a photodetector that detects the intensity of light, or may be an imaging unit that acquires an image.
  • the optical signal may be colored, luminescent, or fluorescent. When the optical signal is fluorescence, the measurement unit 50 preferably further includes an excitation light irradiation unit that emits excitation light for exciting the fluorescent material.
  • the support part 30 fixes and supports the board
  • the substrate 20 is made of an elastomer material such as glass or polydimethylsiloxane.
  • the substrate 20 has a first surface 20a and a second surface 20b.
  • FIG. 6 is a plan view of the substrate 20.
  • FIG. 7 is an enlarged view of region III in FIG.
  • a plurality of wells 21 are formed on the first surface 20 a of the substrate 20.
  • the plurality of wells 21 are arranged along the X-axis direction and the Y-axis direction within the surface of the first surface 20a.
  • the diameter and depth of each well 21 are both several ⁇ m, for example.
  • the plurality of wells 21 constitute a well array 25. That is, a well array 25 configured by arranging a plurality of wells 21 is formed on the substrate 20.
  • Each well 21 of the well array 25 accommodates an enzyme, a substrate of the enzyme, and, if necessary, an enzyme inhibition molecule, an enzyme activation molecule, or a cofactor.
  • the measuring apparatus 1 of the present embodiment measures an enzyme reaction in the well array 25.
  • the support unit 30 supports the substrate 20 with the first surface 20a of the substrate 20 facing upward.
  • the support unit 30 is a so-called XY table that is moved along the horizontal direction (X-axis direction and Y-axis direction) by the drive unit 35.
  • the drive unit 35 moves the support unit 30 in a direction along the surface of the substrate 20 (horizontal direction).
  • the drive unit 35 includes a servo motor that moves the support unit 30 along the X-axis direction and the Y-axis direction, respectively.
  • the driving unit 35 may be any unit that moves the relative position of the substrate 20 in the direction along the surface of the substrate 20 with respect to the irradiation unit 40 and the imaging unit 50. Therefore, the drive part 35 does not necessarily drive the support part 30, for example, may drive the irradiation part 40 and the measurement part 50 integrally.
  • the control unit 36 is connected to the drive unit 35.
  • the control unit 36 controls the moving speed of the driving unit 35.
  • the control unit 36 can control the time difference between the irradiation of the active energy ray in the irradiation unit 40 and the detection of the enzyme reaction in the measurement unit 50. That is, the above-described process c for controlling the time difference between the process a and the process b may be performed by controlling the moving speed of the drive unit 35.
  • the irradiation unit 40 is disposed so as to face the first surface 20a of the substrate 20.
  • the irradiation unit 40 forms an irradiation region A in the well array 25 and irradiates the irradiation region A with active energy rays.
  • the optical axis L40 of the irradiation unit 40 is orthogonal to the first surface 20a of the substrate 20.
  • the substrate or cofactor which is a caged compound accommodated in the well array 25 is converted into an active form by irradiation with active energy rays. Thereby, an enzyme reaction is started in the well array 25.
  • the irradiation unit 40 shields a part of the light emitted from the light source 41, the optical system (exit lens) 42 that emits the light emitted from the light source 41 toward the well array 25, and the light emitted from the optical system 42.
  • the light source 41 for example, an LED light source can be adopted.
  • the exit lens 42 condenses and emits the light emitted from the light source 41 toward the well array 25.
  • the mask 43 has a light shielding plate 43b provided with a rectangular hole 43a in the center.
  • the light shielding plate 43 b shields part of the light emitted from the emission lens 42.
  • the light shielding plate 43b allows the light emitted from the emission lens 42 to pass along the shape of the hole 43a.
  • the light emitted from the emission lens 42 is projected onto the well array 25 with a rectangular outer shape corresponding to the shape of the hole 43a. That is, the irradiation area A of the irradiation unit 40 has a rectangular shape corresponding to the mask 43.
  • the irradiation area A has a smaller area than the area where the well array 25 is formed.
  • the irradiation area A may be formed to have the same shape and the same size as the measurement area B measured by the measurement unit 50.
  • the measuring unit 50 is disposed so as to face the first surface 20a of the substrate 20.
  • the measurement unit 50 measures the enzyme reaction in the well array 25 by imaging a light signal accompanying the enzyme reaction in a predetermined region (measurement region B) in the well array 25. That is, the measurement unit 50 functions as a detection unit that detects an enzyme reaction.
  • the optical axis L50 of the measurement unit 50 is orthogonal to the first surface 20a of the substrate 20.
  • the irradiation unit 40 and the measurement unit 50 may be arranged side by side in a direction along the surface of the substrate 20.
  • the optical axis L50 of the measurement unit 50 and the optical axis L40 of the irradiation unit 40 are parallel to each other.
  • the optical axis L50 of the measurement unit 50 and the optical axis L40 of the irradiation unit 40 are arranged apart from each other by a distance W along the X-axis direction.
  • the distance W may be variable.
  • the distance W By controlling the distance W, the time difference between the start of the enzyme reaction and the measurement of the enzyme reaction can also be controlled. That is, the above-described process c for controlling the time difference between the process a and the process b may be performed by controlling the distance W.
  • the measuring unit 50 may include an image sensor 51 and an objective lens (objective optical system) 52.
  • the image sensor 51 for example, a CCD image sensor or a CMOS image sensor is employed.
  • the measurement unit 50 forms a measurement region B having a shape and a size depending on the performance (number of pixels and resolution) of the image sensor 51.
  • the step a described above applies the active energy ray to an irradiation region set on the well array and having a smaller area than the region where the well array is formed. Irradiation is performed to convert the substrate or cofactor into an active form and start an enzyme reaction with the enzyme, and the above-described process b is a process b1 for measuring the enzyme reaction in the irradiation region. Good. Further, the above-described step c may be performed by controlling the speed at which the irradiation unit 40 and the measurement unit 50 are moved on the well array.
  • FIG. 8 is a diagram showing a procedure of a process of irradiating the well array 25 with active energy rays in the measurement method of the present embodiment.
  • a rectangular irradiation region A irradiated with active energy rays by the irradiation unit 40 is formed.
  • the irradiation area A moves at a constant speed in one direction (X-axis direction in the example of FIG. 8) in the well array 25.
  • the movement of the irradiation area A can be easily realized by driving the support portion 30 in the X-axis direction and the Y-direction by the drive portion 35 (see FIG. 5).
  • the substrate or cofactor contained in the well 21 irradiated with active energy rays in the irradiation region A is converted into an active form. Thereby, an enzyme reaction starts.
  • the amount of the substrate or cofactor that is converted to the active form depends on the irradiation energy amount of the active energy ray.
  • the irradiation energy amount of the active energy ray can be adjusted by the intensity of the active energy ray irradiated from the light source 41, the moving time of the irradiation region A, and the like.
  • the irradiation area A first moves in the well array 25 along the X-axis direction from the one end side in the X-axis direction to the other end side. Subsequently, the irradiation of active energy rays by the irradiation unit 40 is stopped. Subsequently, the irradiation area A moves to a position offset on the one end side along the X-axis direction of the well array 25 by the spot size of the irradiation area A in the Y-axis direction.
  • the irradiation region A is moved along the X-axis direction in the well array 25 from the one end side in the X-axis direction to the other end side in the same manner as described above. By repeating the above steps, the irradiation region A can scan all the wells included in the well array 25.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating a procedure of a process of detecting an optical signal accompanying an enzyme reaction in the well array 25 in the measurement method of the present embodiment.
  • the measurement unit 50 forms a measurement region B on the well array 25 as a range in which an optical signal accompanying the enzyme reaction can be detected.
  • the measurement region B moves at a constant speed in one direction (X-axis direction in the example of FIG. 9) in the well array 25. Similar to the movement of the irradiation area A, the movement of the measurement area B can be easily realized by driving the support section 30 in the X-axis direction and the Y-direction by the driving section 35 (see FIG. 5).
  • the moving speed of the measurement area B may be controlled to be the same as the moving speed of the irradiation area A.
  • the movement path of the measurement area B may be controlled to be the same as the movement path of the irradiation area A. Thereby, the time difference between the process a1 and the process b1 can be controlled to be constant.
  • the process a1 and the process b1 are performed simultaneously, and in the process c, the irradiation area A is moved at a constant speed, and the movement of the measurement area B is made to follow the movement of the irradiation area A. Also good.
  • the measurement region B moves in the well array 25 along the X-axis direction from one end side in the X-axis direction to the other end side. Subsequently, measurement by the measurement unit 50 is stopped. Subsequently, the end of the well array 25 along the X axis direction is moved to a position offset by the spot size of the measurement region B in the Y axis direction.
  • the measurement region B is moved along the X-axis direction from the one end side in the X-axis direction to the other end side in the well array 25 in the same manner as described above. By repeating the above steps, the measurement region B can scan all the wells included in the well array 25.
  • the time from when the active energy ray is irradiated and the enzyme reaction is started until the measurement is performed can be reduced.
  • the movement paths of the irradiation area A and the measurement area B are not limited to those shown in FIGS.
  • a path moving spirally from the outer periphery of the well array 25 toward the center may be employed, or a path moving spirally from the center toward the outer periphery may be employed.
  • after moving along the X-axis direction from one end side in the X-axis direction to the other end side it moves to the position offset by the spot size of the measurement region B in the Y-axis direction on the other end side in the X-axis direction.
  • the irradiation area A and the measurement area B have a smaller area on the first surface 20a of the substrate 20 than the area where the well array 25 is formed.
  • the size of the measurement region B measured by the measurement unit 50 depends on, for example, the number of pixels of the image sensor 51 and the resolution. Therefore, when the entire well array 25 is to be imaged simultaneously, it is necessary to prepare an expensive image sensor 51.
  • the irradiation and measurement of active energy rays are sequentially performed by the irradiation region A and the measurement region B smaller than the well array 25, so that the time from the irradiation of the active energy rays to the measurement can be kept large.
  • the measurement of the well array of the area can be performed by the inexpensive measuring apparatus 1.
  • the irradiation unit 40 and the measurement unit 50 are arranged side by side in a direction along the surface of the substrate 20. Therefore, by moving the support unit 30 using the drive unit 35 and moving the substrate 20 in the direction in which the irradiation unit 40 and the measurement unit 50 are arranged, the process a1 and the process b1 can be performed in parallel. As a result, the time from when the active energy ray is irradiated to when the enzyme reaction starts to be measured can be made constant in a plurality of wells.
  • the time from irradiation to measurement of the active energy ray depends on the moving speed of the support unit 30 and the optical axis L40 of the irradiation unit 40. It can be controlled by adjusting the distance W of the optical axis L50 of the imaging unit 50.
  • the measuring apparatus 1 of the present embodiment may include a plurality of measuring units 50. Moreover, the some measurement part 50 may be located in a line along the surface of a board
  • the irradiation unit 40 and the measurement unit 50 are arranged so that the optical axes L40 and L50 are aligned in a direction along the surface of the substrate 20.
  • the irradiation unit 40 and the measurement unit 50 may be configured to be switched on the same axis during active energy ray irradiation and measurement. In this case, a procedure of starting the step b1 after the step a1 is completed over the entire well array 25 may be adopted.
  • the irradiation unit 40 and the measurement unit 50 are arranged on the upper surface (first surface 20a) side of the substrate 20.
  • the irradiation unit 40 and the measurement unit 50 may be arranged on the lower surface (second surface 20b) side of the substrate 20, and are separately arranged on the upper and lower surface sides with respect to the substrate 20, respectively. May be.
  • FIG. 10 is a diagram showing a procedure of a step of irradiating active energy rays to the well array and a step of imaging a light signal accompanying an enzyme reaction in the well array.
  • the steps a1 and b1 may be alternately performed in the same region on the well array.
  • step a1 the well array 25 is irradiated with active energy rays.
  • step a1 a rectangular irradiation region A irradiated with the active energy rays by the irradiation unit 40 is formed in the region a on the well array 25.
  • step b1 an optical signal accompanying the enzyme reaction in the well array 25 is measured.
  • a measurement region B as a range in which an optical signal associated with an enzyme reaction can be measured is formed in the region a on the well array 25 shown in FIG. 10, and the enzyme reaction is measured. That is, the process b1 is performed after performing the process a1 in the same region a.
  • the step c for controlling the time difference between the step a1 and the step b1 can be performed by controlling the time until the step b1 is performed after the step a1 is performed.
  • the irradiation unit 40 is moved to a region b which is a position offset by the spot size of the irradiation region A, and the above steps a1 and b1 are repeated. Subsequently, the irradiation unit 40 is moved to a region c which is a position offset by the spot size of the irradiation region A, and the above steps a1 and b1 are further repeated.
  • the irradiation region A and the measurement region B can scan all the wells included in the well array 25.
  • the time from irradiation of active energy rays to measurement can be made the same for each well 21 also by the measurement method of the present embodiment. Thereby, the measurement conditions in each well 21 can be aligned, and the accuracy of comparison of measurement results in each well 21 can be improved.
  • the irradiation unit 40 may be configured to be able to irradiate the entire well array 25 with active energy rays simultaneously.
  • the objective lens 52 and the image sensor 51 of the measurement unit 50 may be configured to be able to simultaneously image the optical signal in the entire well array 25.
  • the time from the start of the enzyme reaction to the measurement of the enzyme reaction can be controlled. For example, even when it is difficult to simultaneously distribute reaction solutions to all wells constituting a well array, the enzyme reaction is started at an arbitrary timing after the reaction solution is distributed to all wells constituting the well array. In all wells, the enzyme reaction can be measured by aligning the time from the start of the enzyme reaction to the measurement of the enzyme reaction.
  • cells arranged on the substrate 20 can be used instead of the well array 25.
  • a droplet disposed on the substrate 20 can be used instead of the well array 25.
  • the measuring apparatus is an apparatus that measures an enzyme reaction in a well array.
  • the measuring apparatus irradiates active energy rays to the well array of a substrate on which a well array composed of a plurality of wells having electrodes formed on at least a part of the inner surface is formed, and the enzyme in the well array.
  • An irradiation unit for starting a reaction; a measurement unit connected to a plurality of the electrodes to measure a current, voltage or impedance generated by an enzyme reaction; irradiation of active energy rays from the irradiation unit; and the measurement unit A control unit for controlling a time difference from the measurement of the enzyme reaction.
  • the measurement unit calculates the current, voltage, or impedance generated by the enzyme reaction and the electrode of the well array composed of a plurality of wells having electrodes formed on at least a part of the inner surface. And a circuit portion for measuring at the electrode.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of a main part of the measuring apparatus 101 of the second embodiment.
  • the measuring apparatus 101 of the present embodiment is mainly different from the measuring apparatus of the first embodiment in the method for detecting an enzyme reaction.
  • symbol same or corresponding is attached
  • the measurement apparatus 101 includes an irradiation unit 140, a measurement unit (circuit unit) 160, and a control unit 136.
  • the measuring device 101 measures the current, voltage, or impedance generated with the enzyme reaction.
  • the substrate 120 has a first surface 120a and a second surface 120b.
  • a plurality of wells 121 are formed on the first surface 120 a of the substrate 120.
  • the plurality of wells 121 are arranged along the X-axis direction and the Y-axis direction in the plane of the first surface 120a.
  • Each well 121 of the well array 125 accommodates an enzyme, a substrate of the enzyme, and an enzyme inhibition molecule, an enzyme activation molecule, or a cofactor as necessary.
  • An electrode 129 is provided on the bottom surface of each well 121.
  • the electrode 129 may be formed on at least a part of the inner surface of the well 121.
  • the irradiation unit 140 is disposed to face the first surface 120a of the substrate 120.
  • the irradiation unit 140 can simultaneously irradiate the entire well array 125 with active energy rays.
  • the substrate or cofactor accommodated in each well 121 is converted into an active form by irradiation with active energy rays. Thereby, an enzyme reaction is started in each well 121. Further, the current, voltage or impedance flowing through the electrode 129 changes with the enzyme reaction.
  • the measurement unit 160 is disposed on the second surface 120b side of the substrate 120.
  • the measurement unit 160 measures the current, voltage, or impedance that flows through the electrode 129 in accordance with the enzyme reaction. That is, the measurement unit 160 functions as a detection unit that detects an enzyme reaction.
  • the control unit 136 is connected to the irradiation unit 140 and the measurement unit 160.
  • the control unit 136 controls irradiation of active energy rays in the irradiation unit 140 and measurement of current, voltage, or impedance in the measurement unit 160.
  • the control unit 136 can control the time difference between the irradiation of the active energy ray in the irradiation unit 140 and the detection of the enzyme reaction in the measurement unit 160. That is, the process c for controlling the time difference between the process a and the process b described above may be performed by the control unit 136.
  • the measuring apparatus 101 may include a memory that records changes over time in the detection result of the enzyme reaction in the measuring unit 160. This makes it possible to record the enzyme reaction in the well 121 over time.
  • an integrated circuit (IC, Integrated Circuit) can be employed as the measurement unit 160.
  • the measurement unit 160 can simultaneously process the current, voltage, or impedance flowing through the multiple electrodes 129.
  • step a described above all the wells of the well array are simultaneously irradiated with the active energy rays to convert the substrate or cofactor into an active form, and the enzyme
  • the step a2 for starting the enzyme reaction according to the above step may be the step b2 for simultaneously measuring the enzyme reaction in all wells of the well array by electrochemical measurement.
  • the measurement apparatus and the measurement method of the present embodiment by adopting a configuration in which detection of enzyme reaction is measured by electrochemical measurement, on a well array having a size of several cm ⁇ several cm, for example, 10 7 to Even when a well array on which 10 8 mutant enzymes, enzyme inhibitor molecule candidates or enzyme activation molecule candidates are loaded is used, the enzyme reaction in all wells can be measured simultaneously.
  • Step a2 First, in this step, all the wells 121 of the well array 125 are simultaneously irradiated with active energy rays to convert the substrate S or cofactor into an active form, and an enzyme reaction by the enzyme is started. More specifically, as shown in FIG. 11, each of the wells 121 accommodates different mutant enzymes (for example, e1 and e2 in FIG. 11), enzyme inhibitor molecule candidates, or enzyme activation molecule candidates. As a result of the conversion of the substrate S or cofactor to the active form, an enzymatic reaction with the enzymes e1, e2, etc. proceeds and a product P is produced. In the process of generating the product P, the electron e ⁇ is exchanged between the oxidant Ox and the reductant Red.
  • FIG. 12 is a schematic diagram of a main part of a measuring apparatus 201 which is a modification of the measuring apparatus according to the second embodiment.
  • the irradiation unit 240 of the measurement apparatus 201 is mainly different in that the active energy beam is irradiated to an irradiation area having a smaller area than the area where the well array is formed.
  • symbol same or corresponding is attached
  • the irradiation unit 240 even if the total amount of light of the light source is the same as that of the irradiation unit 140, the light is condensed to a small area through the lens, and the light irradiation region is limited to a small area.
  • the irradiation amount of the active energy ray per area can be increased. Thereby, it is possible to shorten the irradiation time of the active energy ray.
  • the measurement apparatus 201 includes an irradiation unit 240, a measurement unit (circuit unit) 160, and a control unit 136.
  • the measuring device 201 measures the current, voltage, or impedance generated with the enzyme reaction.
  • the irradiation unit 240 is disposed to face the first surface 120a of the substrate 120.
  • the irradiation unit 240 forms an irradiation region A in the well array 125 and irradiates the irradiation region A with active energy rays.
  • the irradiation region A of the irradiation unit 240 has a smaller area than the region where the well array 125 is formed.
  • the above-described step a includes applying the active energy ray to an irradiation region set on the well array and having a smaller area than the region where the well array is formed. Irradiation is performed to convert the substrate or cofactor into an active form and start an enzyme reaction with the enzyme, and the above-described process b is a process b1 for measuring the enzyme reaction in the irradiation region. Good.
  • control unit 136 can control the time difference between the irradiation of the active energy ray in the irradiation unit 240 and the detection of the enzyme reaction in the measurement unit 160. That is, the process c for controlling the time difference between the process a and the process b described above may be performed by the control unit 136.
  • each well 121 The substrate or cofactor accommodated in each well 121 is converted to an active form by irradiation with active energy rays. Thereby, an enzyme reaction is started in each well 121. Further, the current, voltage or impedance flowing through the electrode 129 changes with the enzyme reaction.
  • the measurement unit 160 is disposed on the second surface 120b side of the substrate 120.
  • the measurement unit 160 measures the current, voltage, or impedance that flows through the electrode 129 in accordance with the enzyme reaction. That is, the measurement unit 160 functions as a detection unit that detects an enzyme reaction.
  • the control unit 136 is connected to the irradiation unit 240 and the measurement unit 160.
  • the control unit 136 controls the irradiation of active energy rays in the irradiation unit 240 and the measurement of current, voltage, or impedance in the measurement unit 160.
  • the control unit 136 can control the time difference between the irradiation of the active energy ray in the irradiation unit 240 and the detection of the enzyme reaction in the measurement unit 160. That is, the process c for controlling the time difference between the process a and the process b described above may be performed by the control unit 136.
  • the measurement unit 160 measures the current, voltage, or impedance flowing through the electrode 129 provided in each well 121 of the irradiation region A at the time controlled by the control unit 136 after the irradiation of the active energy ray to the irradiation region A. .
  • the measurement unit 160 may simultaneously measure the current, voltage, or impedance flowing through the electrodes 129 provided in all the wells 121 of the well array 125. In this case, since the enzyme reaction does not occur in the wells 121 other than the irradiation region A, the data measured in the wells 121 other than the irradiation region A may be discarded as unnecessary data.
  • the measurement unit 160 is configured to measure current, voltage, or impedance only in a limited region (measurement region B) including the well 121 located in the irradiation region A among all the wells 121 of the well array 125. It is good.
  • time delay may be a problem. In such a case, it is possible to limit the time delay to a level that can be ignored by limiting the measurement region B to a configuration in which current, voltage, or impedance is measured.
  • the measuring apparatus 201 may include a memory that records a change with time of the detection result of the enzyme reaction in the measuring unit 160. This makes it possible to record the enzyme reaction in the well 121 over time.
  • the irradiation region A and the measurement region B can be moved in the same manner as described above with reference to FIGS. That is, in the measurement using the measuring apparatus 201, the steps a1 and b1 are simultaneously performed in the same manner as described above with reference to FIGS. 8 and 9, and the irradiation area A is moved at a constant speed in the step c.
  • the movement of the measurement area B may be made to follow the movement of the irradiation area A.
  • the irradiation area A and the measurement area B are the same area as described above with reference to FIG. 10, and the process a1 and the process b1 are repeated in this order. It may be a thing.
  • the step c for controlling the time difference between the step a1 and the step b1 can be performed by controlling the time until the step b1 is performed after the step a1 is performed.
  • the measurement device of the third embodiment is a device that measures an enzyme reaction in a droplet.
  • the measuring apparatus of the third embodiment can also control the time from the start of the enzyme reaction to the measurement of the enzyme reaction.
  • FIG. 13 is a schematic diagram of a main part of the measuring apparatus 501 of the third embodiment.
  • the measuring device 501 measures an optical signal accompanying the enzyme reaction.
  • the measurement apparatus 501 of the third embodiment is mainly different from the measurement apparatus of the first embodiment in that the reaction space is a droplet.
  • symbol same or corresponding is attached
  • subjected and the description is abbreviate
  • the measurement apparatus 501 of the third embodiment is a measurement apparatus that measures an enzyme reaction in a droplet D, and includes an enzyme 332 and a substrate or cofactor of the enzyme that is a caged compound.
  • the control unit 536 controls the time difference between the irradiation of the active energy ray from the irradiation unit 540 and the measurement of the enzyme reaction in the measurement unit 550.
  • the control unit 536 may control the time difference between the irradiation with the active energy ray and the measurement of the enzyme reaction by controlling the distance W between the irradiation unit 540 and the measurement unit 550. Alternatively, the control unit 536 may control the time difference between the irradiation with the active energy ray and the measurement of the enzyme reaction by controlling the liquid feeding speed of the droplet D in the measuring device 501.
  • the control unit 536 may be a member that holds the irradiation unit 540 and the measurement unit 550 fixedly, for example. Or the control part 536 may control the liquid feeding speed of the droplet D in the measuring apparatus 501, for example.
  • the above-described step c can be performed by controlling the distance W between the irradiation unit 540 and the measurement unit 550.
  • the distance W may be kept constant, for example.
  • the process c mentioned above can be implemented by controlling the liquid feeding speed of the droplet D in the measuring apparatus 501.
  • the measuring apparatus 501 may include a droplet forming unit 515 that forms droplets.
  • the droplet forming unit 515 may have a structure similar to that of the fluidic device 300 shown in FIG.
  • the droplets formed by the droplet forming unit 515 are fed at a constant speed in the direction of the arrow in FIG. Then, the enzyme reaction is started when the irradiation unit 540 passes through the irradiation region A irradiated with the active energy rays.
  • the droplet D flows through the flow path 510 by a predetermined distance W, and the enzyme reaction in the droplet D is measured by the measurement unit 550 in the measurement region B.
  • the measuring device 501 may have a plurality of measuring units.
  • the measurement apparatus 501 may include a second measurement unit 550A and a third measurement unit 550B.
  • the measurement which made reaction time different with respect to the enzyme reaction with the same droplet D can be performed in one liquid sending.
  • a collection unit for sorting and collecting desired droplets may exist downstream of the measuring apparatus 501.
  • the droplet D contains DNA encoding the enzyme 332
  • DNA encoding the enzyme having the desired activity can be obtained by collecting the DNA. That is, enzyme screening can be performed.
  • the ultraviolet irradiation an erecting fluorescent microscope equipped with a DAPI fluorescent filter (Ex: 340-380, DM: 400, BA435-485) using a mercury lamp as a light source was used.
  • the ultraviolet irradiation time was set to nine types of 0 second, 1 second, 5 seconds, 10 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 60 seconds, 120 seconds, and 300 seconds.
  • reaction solution was transferred to a 96-well plate at 27 ⁇ L / well, and mineral oil was layered at 30 ⁇ L / well. Subsequently, 3 ⁇ L / well of polyphosphate kinase (16.8 Unit / L) was added, and the amount of luminescence was measured using a luminometer.
  • 14A and 14B are graphs showing the measurement results of the light emission amount.
  • an irradiation amount of about 30 to 60 seconds 450 to 900 mJ / cm 2 . It became clear that there was.
  • reaction solution was transferred to a 96-well plate by 27 ⁇ L / well, and mineral oil was layered at 30 ⁇ L / well.
  • mineral oil was layered at 30 ⁇ L / well.
  • 3 ⁇ L / well of polyphosphate kinase (16.8 Unit / L) was added, and the amount of luminescence was measured using a luminometer.
  • the 96-well plate was taken out of the luminometer, and the reaction solution in the well was irradiated with ultraviolet rays (about 15 mW / cm 2 ) having a wavelength of 340 to 380 nm.
  • ultraviolet rays about 15 mW / cm 2
  • an upright fluorescent microscope equipped with a DAPI fluorescent filter (Ex: 340-380, DM: 400, BA435-485) using a mercury lamp as a light source was used.
  • the ultraviolet irradiation time was set to seven types of 0 second, 1 second, 5 seconds, 10 seconds, 20 seconds, 30 seconds, and 60 seconds. Subsequently, the amount of luminescence was measured again using a luminometer.
  • FIG. 15 (a) and 15 (b) are graphs showing the measurement results of the light emission amount.
  • FIG. 15A is a graph showing the measurement result of the light emission amount before ultraviolet irradiation
  • FIG. 15B is a graph showing the measurement result of the light emission amount after ultraviolet irradiation.
  • reaction solution was transferred to a 96-well plate by 27 ⁇ L / well, and mineral oil was layered at 30 ⁇ L / well.
  • reaction solution in the well was irradiated with ultraviolet rays (about 15 mW / cm 2 ) having a wavelength of 340 to 380 nm.
  • the ultraviolet irradiation time was set to nine types of 0 second, 1 second, 5 seconds, 10 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 60 seconds, 120 seconds, and 300 seconds.
  • a mercury lamp is used as a light source, an upright fluorescent microscope equipped with a DAPI fluorescent filter (Ex: 340-380, DM: 400, BA435-485), or a UV lamp having a wavelength of 365 nm (model “B-100AP”). ”, UVP).
  • FIG. 16 is a graph showing the measurement results of the light emission amount.
  • the light emission amount is shown as a percentage (%) where the maximum light emission amount of the sample with an ultraviolet irradiation time of 0 seconds is taken as 100%.
  • DMNP-EDTA Biotium irradiated with ultraviolet rays having a wavelength of 340 to 380 nm (about 15 mW / cm 2 ) and those not irradiated were prepared.
  • ultraviolet irradiation an upright fluorescent microscope equipped with a DAPI fluorescent filter (Ex: 340-380, DM: 400, BA435-485) using a mercury lamp as a light source was used. The ultraviolet irradiation time was 30 seconds.
  • reaction solutions shown in Table 4 below were prepared. In Table 4 below, MgSO 4 .7H 2 O supplies Mg 2+ ions chelated to DMNP-EDTA.
  • reaction solution was transferred to a 96-well plate by 27 ⁇ L / well, and mineral oil was layered at 30 ⁇ L / well.
  • mineral oil was layered at 30 ⁇ L / well.
  • 3 ⁇ L / well of polyphosphate kinase (16.8 Unit / L) was added, and the amount of luminescence was measured using a luminometer.
  • FIG. 17 is a graph showing the measurement results of the light emission amount. As a result, it was revealed that the enzyme reaction was suppressed before ultraviolet irradiation. Moreover, it was confirmed that an enzyme reaction can be started by ultraviolet irradiation.
  • the present invention it is possible to provide a technique for controlling the time from the start of the enzyme reaction to the measurement of the enzyme reaction when the enzyme reaction is measured for each of a large number of enzymes.
  • Objective lens objective optical system
  • 129 Electrode
  • 160 260
  • Measurement unit Circuit part
  • 300 Fluidic device
  • 310 320, 400, 510 ... Flow path
  • 330 Aqueous liquid
  • 331 ... DNA
  • 332 Protein (enzyme)
  • 515 Droplet forming part
  • a ... Irradiation area, B ... Constant region, III, a, b, c ... area, L40, L50 ... optical axis, W ... distance, e1, e2 ... enzymes, S ... substrate, P ... product, Ox ... oxidant, Red ... reductant, e - ... electronic, D ... droplets.

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Abstract

酵素反応の測定方法であって、前記酵素と、ケージド化合物である、前記酵素の基質又は補因子と、を含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は前記補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始することと、前記酵素反応を測定することと、酵素反応の開始と酵素反応の測定との時間差を制御することと、を備える、方法。

Description

酵素反応の測定方法、スクリーニング方法及び測定装置
　本発明は、酵素反応の測定方法、スクリーニング方法及び測定装置に関する。本願は、２０１７年１月２３日に、日本に出願された特願２０１７－００９５８９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、バイオエネルギー、バイオセンサー等の様々な応用分野への貢献が期待されている。
　従来、新規機能性タンパク質の取得は、タンパク質の構造をデザインするタンパク質工学的手法により行うことが主流であった。しかしながら、近年、より有用なタンパク質を取得するためには、多数のタンパク質を効率的にスクリーニングすることが重要であると考えられている。そこで、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。
　進化分子工学的手法においては、スクリーニングの回数を増やすほど有用なタンパク質を得ることができる。このため、膨大な数の変異タンパク質を同時並列的に評価する必要がある。
　例えば、特許文献１には、膨大な数の変異タンパク質のアレイを製造することができる、タンパク質アレイの製造方法が記載されている。また、例えば非特許文献１には、酵母細胞を封入した液滴を用いることにより、変異酵素をハイスループットにスクリーニングする方法が記載されている。
国際公開第２０１５／０２９７１４号
Agresti, J. J., et al., Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution, PNAS, 107 (9), 4004-4009, 2010.
　特許文献１に記載の方法によれば、例えば、数ｃｍ×数ｃｍの大きさのウェルアレイ上に数千万種類の変異酵素を積載したタンパク質アレイを製造することができる。このようなタンパク質アレイは、１ウェルあたりの容積がフェムトリットルオーダーである。
　しかしながら、発明者らは、このようなタンパク質アレイを用いた場合、ウェルアレイを構成する全ウェルに同時に反応液を分配することや、ウェルアレイを構成する全ウェルを同時に観測し、酵素活性を測定することが困難な場合があることを見出した。
　具体的には、まず、酵素反応の測定に必要な基質を含む反応液を上記のウェルアレイ上の各ウェルに添加するために、少なくとも数分間必要である。また、数ｃｍ×数ｃｍの大きさのチップ全体をスキャンし、酵素反応を測定するためにも少なくとも数分間必要である。一方、１ウェルあたりの容積がフェムトリットルオーダーであるウェル内では、数分程度で基質を消費してしまい、酵素反応が終了してしまう。このため、上記のタンパク質アレイでは、酵素活性の測定準備中又は測定中に酵素反応が終了してしまう場合がある。また、全ての変異酵素の酵素活性を測定することができたとしても、全てのウェルを同時に測定できないために、反応開始からの時間のずれが生じ、ウェル毎の反応条件を揃えて酵素活性を測定することが困難な場合がある。
　また、非特許文献１に記載の方法は、酵素を細胞表面に発現した酵母細胞と、基質とを含む多数の液滴を調製し、酵素反応により生成された蛍光物質を含む液滴をソーティングして回収するものである。非特許文献１には、１０時間で１０８個の変異酵素をスクリーニングしたことが記載されている。しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、液滴の作製やソーティングにある程度の時間を必要とするため、全ての変異酵素について、反応条件を揃えて酵素活性を測定することが困難な場合がある。
　このような背景のもと、本発明は、多数の酵素について酵素反応をそれぞれ測定する場合において、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］酵素反応の測定方法であって、前記酵素と、ケージド化合物である、前記酵素の基質又は補因子と、を含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は前記補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａと、前記酵素反応を測定する工程ｂと、工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃと、を備える、方法。
［２］前記反応空間がウェルである、［１］に記載の方法。
［３］前記反応空間が液滴である、［１］に記載の方法。
［４］前記反応空間が細胞である、［１］に記載の方法。
［５］一度に１０，０００個以上の前記反応空間における前記酵素反応を測定する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記基質又は前記補因子が、脱保護波長が異なる複数のケージド化合物の混合物である、［１］～［５］のいずれか記載の方法。
［７］前記活性エネルギー線が波長２００～１５００ｎｍにピーク波長を有する電磁波である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記活性エネルギー線が周波数２００～２０００ｋＨｚの超音波線である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の方法により酵素反応を測定する工程を備える、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子のスクリーニング方法。
［１０］複数の反応空間でそれぞれ生じる酵素反応を測定する測定装置であって、前記酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む前記反応空間に活性エネルギー線を照射して前記酵素反応を開始させる照射部と、前記酵素反応を測定する測定部と、前記照射部からの前記活性エネルギー線の照射と、前記測定部での前記酵素反応の測定と、の時間差を制御する制御部と、を備える、測定装置。
［１１］前記測定部が、前記酵素反応に伴う光信号を検出する光検出器を有する、［１０］に記載の測定装置。
［１２］前記測定部が、複数の前記反応空間にそれぞれ接続された複数の電極と、前記酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを前記電極において測定する回路部と、を有する、［１０］に記載の測定装置。
［１３］前記反応空間がウェルである、［１０］～［１２］のいずれかに記載の測定装置。
［１４］前記反応空間が液滴である、［１０］～［１２］のいずれかに記載の測定装置。
［１５］前記反応空間が細胞である、［１０］～［１２］のいずれかに記載の測定装置。
［１６］１０，０００個以上の前記反応空間でそれぞれ生じる酵素反応の測定用である、［１０］～［１５］のいずれかに記載の測定装置。
　本発明によれば、多数の酵素について酵素反応をそれぞれ測定する場合において、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御する技術を提供することができる。
（ａ）～（ｅ）は、進化分子工学的手法により、有用な酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得する工程の一例を説明する図である。 ウェルアレイの具体例を示す写真である。 １つの液滴に１種類のタンパク質を封入する技術の一例を説明する模式図である。 （ａ）～（ｄ）は、液滴の配置状態を例示した図である。 第１実施形態の測定装置の模式図である。 基板の平面図である。 図６の領域ＩＩＩの拡大図である。 ウェルアレイに活性エネルギー線を照射する工程の手順を示す図である。 ウェルアレイにおける酵素反応に伴う光信号を撮像する工程の手順を示す図である。 ウェルアレイに活性エネルギー線を照射する工程及びウェルアレイにおける酵素反応に伴う光信号を撮像する工程の手順を示す図である。 第２実施形態の測定装置の模式図である。 第２実施形態の測定装置の変形例を示す模式図である。 第３実施形態の測定装置の模式図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１の結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例２の結果を示すグラフである。 実験例３の結果を示すグラフである。 実験例４の結果を示すグラフである。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。また、図には、場合によりＸ－Ｙ－Ｚ座標系を示した。以下の説明において、Ｘ－Ｙ平面に沿う方向を水平方向とし、＋Ｚ方向を上方向とする。以下、必要に応じて各座標系に基づいて各方向の説明を行う。
（従来のスクリーニング方法１）
　まず、図１（ａ）～（ｅ）を参照しながら、進化分子工学的手法により、有用な酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得する工程の一例を説明する。図１（ａ）は、ビーズ上に固定化された変異ＤＮＡライブラリー（ＤＮＡ結合ビーズ）を示す図である。１個のビーズ上に１種類の変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補をコードするＤＮＡが固定化されている。このようなビーズは、例えば特許文献１に記載された方法により作製することができる。
　続いて、図１（ｂ）に示すように、図１（ａ）のＤＮＡ結合ビーズをウェルアレイ上に分配する。図１（ｂ）のウェルアレイでは、１ウェルあたり１個のビーズが分配されている。ビーズのウェルアレイ上への分配は、例えばビーズとして磁気ビーズを使用し、磁石を用いて磁気ビーズをウェルアレイに収容させることにより行うことができる（例えば、特許文献１を参照。）。図２は、図１（ｂ）のウェルアレイの具体例を示す写真である。図２に示すウェルアレイでは、例えば１０７～１０８個の変異タンパク質が１枚のチップ上に積載されている。
　続いて、図１（ｃ）に示すように、無細胞合成によりビーズに固定された変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補のＤＮＡを転写及び翻訳することで、ウェルアレイのウェル表面に変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補を結合させる。ウェル表面への変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補の結合は、例えば、変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグを導入しておき、ウェルアレイのウェルの表面をＮｉ－ＮＴＡ（ｎｉｃｋｅｌ－ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）で修飾しておくこと等により行うことができる。
　続いて、図１（ｄ）に示すように、ウェルアレイ全体の酵素反応を測定し、活性の高い変異酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を特定する。続いて、図２（ｅ）に示すように、特定した変異酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子に対応するＤＮＡ結合ビーズを回収し、回収したＤＮＡを増幅するとともに変異を導入し、ビーズ上に再固定する。
　以上の工程を繰り返すことにより、所望の活性を有する酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得することができる。
　ＤＮＡへの変異の導入方法としては、例えば、エラープローンＰＣＲを利用する方法等が挙げられる。エラープローンＰＣＲとは、ＰＣＲ反応中に人為的にランダムなエラーを発生させる方法である。エラープローンＰＣＲにおいては、プルーフリーディング（校正）機能のないＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。更に、突然変異を有用な頻度で起こすために、反応液中にＭｎ２＋を添加することや、ｄＮＴＰ濃度を不均衡にすることも有効である。これらの処理により、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのエラー発生率が増加し、ＤＮＡに変異を導入することができる。
　しかしながら、上述したように、図２に示すようなウェルアレイは、ウェルアレイ全体の酵素反応の測定に時間がかかるため、酵素活性の測定準備中又は測定中に酵素反応が終了してしまい、酵素反応の開始時から測定時までの時間を、ウェルアレイ上の全てのウェルで揃えて測定することが困難である。
（従来のスクリーニング方法２）
　続いて、進化分子工学的手法により、有用な酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得する工程の別の例を説明する。以下に説明するスクリーニング方法は、上述したウェルアレイの代わりに液滴を用いる点が主に異なっている。
　図３は、１つの液滴に１種類のタンパク質を封入する技術の一例を説明する模式図である。図３に示すように、例えば、互いに直交する流路３１０及び３２０を有する流体デバイス３００を用いて液滴を作製することができる。より具体的には、図３に示す流体デバイスの一方の流路３１０に水系液体３３０を導入して矢印の方向に送液し、他方の流路３２０にオイル３４０を導入して矢印の方向に送液することにより、液滴Ｄ（本例ではｗａｔｅｒ－ｉｎ－ｏｉｌエマルション）を作製することができる。
　ここで、例えば、水系液体３３０に変異ＤＮＡライブラリーを添加して液滴Ｄを形成することにより、１つの液滴Ｄに１分子のＤＮＡ３３１を封入することができる。ＤＮＡ３３１は、例えば、変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補をコードしていてもよい。
　続いて、封入されたＤＮＡ３３１を無細胞翻訳させることにより、１つの液滴Ｄに１種類のタンパク質３３２を封入することができる。無細胞翻訳は、例えば、水系液体３３０として無細胞翻訳の反応液を使用することにより実現することができる。
　ここで、水系液体３３０中に予め酵素の基質を添加しておけば、各液滴Ｄの内部で酵素反応を行うことができる。この酵素反応を測定することにより、活性の高い酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を含む液滴を特定することができる。
　続いて、所望の活性を示した液滴Ｄをソーティング等により回収し、液滴Ｄの内部に存在するＤＮＡ３３１を回収する。続いて、回収したＤＮＡ３３１を増幅するとともに変異を導入する。ＤＮＡへの変異の導入方法としては、上述したものと同様の方法を用いることができる。以上の工程を繰り返すことにより、所望の活性を有する酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を取得することができる。
　液滴を用いたスクリーニング方法において、液滴の作製方法は、上述したものに限られない。例えば、反応チューブ内に、水系液体とオイルを入れ、ボルテックス等により撹拌して乳化させることによっても、液滴（本例ではｗａｔｅｒ－ｉｎ－ｏｉｌエマルション）を作製することができる。
　しかしながら、上述したような方法により、液滴中で酵素反応を行い、酵素反応を測定する場合、液滴の作製やソーティングにある程度の時間を必要とするため、全ての液滴について、反応条件を揃えて酵素活性を測定することが困難である。
［酵素反応の測定方法］
　１実施形態において、本発明は、酵素反応の測定方法であって、前記酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａと、前記酵素反応を測定する工程ｂと、工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃと、を備える方法を提供する。
　本実施形態の酵素反応の測定方法は、前記酵素と、ケージド化合物である、前記酵素の基質又は補因子と、を含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は前記補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始することと、前記酵素反応を測定することと、前記酵素反応の開始と前記酵素反応の測定との時間差を制御することとを備える方法であるということができる。
　本実施形態の方法によれば、酵素の基質又は補因子に、不活性型であるケージド化合物を利用することにより、所望のタイミングで酵素反応を開始して、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御することができる。以下、各工程について説明する。
（工程ａ）
　本工程において、酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する。
《酵素》
　本実施形態の方法において、酵素としては、特に制限されず、産業上有用な酵素の反応を測定することができる。酵素としては、タンパク質からなる酵素、リボザイム、デオキシリボザイム等の核酸からなる酵素等が挙げられる。具体的な酵素としては、例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ、キナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、グルコシダーゼ、プロテアーゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドラクターゼ、ラセマーゼ、エピメラーゼ、グルタミンシンテターゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ等が挙げられる。
《反応空間》
　本実施形態の方法において、反応空間は、酵素が収容された反応空間であれば特に制限されない。反応空間としては、例えば、ウェル、液滴、細胞等が挙げられる。
・ウェル
　ウェルとは、固相上に形成された凹部を意味する。反応空間がウェルである場合、ウェルとしては、ウェルアレイを構成しているウェルが挙げられる。ウェルアレイは、例えば、ウェルアレイ全体の酵素反応の測定に時間がかかるウェルアレイであってもよい。このようなウェルアレイとしては、例えば、図２に示すような、数ｃｍ×数ｃｍの大きさのウェルアレイ上に、例えば１０７～１０８個の変異タンパク質が積載されたウェルアレイが挙げられる。
　ウェルアレイのウェル密度は、例えば１０，０００～１０，０００，０００ウェル／ｃｍ２であってもよく、例えば１００，０００～１，０００，０００ウェル／ｃｍ２であってもよい。
　また、ウェルアレイの面積は特に限定されず、数ｃｍ×数ｃｍ～数ｍ×数ｍであってもよい。例えば、近年の液晶パネル製造技術等を用いることにより、数ｍ×数ｍのアレイを作製することが可能である。
　また、ウェル１つあたりの容積は、例えば１ｆＬ／ウェル～１０００ｐＬ／ウェルであってもよく、例えば５０ｆＬ／ウェル～１００ｐＬ／ウェルであってもよい。
　ウェルアレイの各ウェルには、それぞれ異なる変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補を収容してもよい。これにより、多数の変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補の活性を同時並列的に評価することが可能となる。
　あるいは、ウェルアレイの各ウェルには同一の酵素を収容してもよい。そして、活性エネルギー線の照射量等の条件を領域ごとに変化させて酵素反応を測定してもよい。これにより、例えば、一度の測定で、様々な条件下における酵素反応を測定することができる。例えば、酵素反応のミカエリスメンテン式をプロットすることができる。
・液滴
　反応空間が液滴である場合、液滴としては、水系液体等の液滴、ｗａｔｅｒ－ｉｎ－ｏｉｌエマルション、ｏｉｌ－ｉｎ－ｗａｔｅｒエマルション等のエマルション、リポソーム、ゲル等が挙げられる。
　ここで、水系液体としては、水、緩衝液、等張液等が挙げられる。また、ゲルとしては、例えば、アルギン酸ゲル、アガロースゲル等のハイドロゲル等が挙げられる。また、ｏｉｌ－ｉｎ－ｗａｔｅｒエマルションは、例えば、疎水性環境下で機能する酵素の酵素反応を測定する場合等に用いることができる。
　また、液滴を規則的に配置することもできる。図４（ａ）～（ｄ）は、液滴の配置状態を例示した図である。図４（ａ）は、タンパク質３３２が封入された液滴Ｄを平面上に最密充填した状態を示す図である。図４（ｂ）は、液滴Ｄを規則的に２次元に配置した状態を示す図である。例えば、基板上に規則的に２次元に形成されたウェルに、それぞれ液滴を収容すること等により液滴Ｄを規則的に２次元に配置することができる。この場合、ウェルは、液滴Ｄの一部を収容可能な深さを有していてもよいし、液滴Ｄの全体を収容可能な深さを有していてもよい。また、ウェルの内部に吸引口を設け、吸引口から液滴を吸引することにより液滴を固定してもよい。
　図４（ｃ）は、液滴Ｄを１次元に配置した状態を示す図である。例えば、直線状の流路内に液滴を封入すること等により液滴Ｄを１次元に配置することができる。図４（ｄ）は、蛇行した流路４００の内部に液滴Ｄを封入することにより、液滴Ｄを２次元に配置した状態を示す図である。
　規則的に配置した液滴中の酵素反応を測定する場合、液滴を上述したウェルアレイと同様に取り扱うことが可能となる。
・細胞
　反応空間としては、細胞そのものを用いることもできる。細胞としては、特に限定されず、例えば、大腸菌、酵母、動物細胞等が挙げられる。例えば、変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補をコードする遺伝子の発現ベクターからなるライブラリーを導入した細胞を反応空間として利用することができる。１つの細胞は、測定対象となる変異酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子を１種類のみ含んでいることが好ましい。
　細胞は、細胞内で行われた酵素反応を細胞１つずつについて個別に測定することができる限りどのような状態であってもよい。具体的には、細胞は、基板上に配置されていてもよいし、液滴に封入されていてもよいし、流体中に懸濁されていてもよい。
・反応空間の数
　本実施形態の方法により、多数の反応空間における酵素反応を、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御して測定することができる。すなわち、本実施形態の方法の特徴の一つは、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御しながら、大規模な数の反応空間における酵素反応を測定することができることである。
　本実施形態の方法により、例えば、一度に１０，０００個以上の反応空間における酵素反応を測定することができる。ここで、「一度に」とは、一度の測定で１０，０００個以上の反応空間における酵素反応を測定することができることを意味する。あるいは、測定装置を一度操作することにより、１０，０００個以上の反応空間における酵素反応を測定することができるといいかえることもできる。あるいは、連続的に１０，０００個以上の反応空間における酵素反応を測定することができるといいかえることもできる。
　一度に測定することができる反応空間の数の上限は特に限定されないが、例えば１００億個程度を目安としてもよい。
《ケージド化合物》
　ケージド化合物とは、活性エネルギー線の照射により脱保護することができる保護基で保護することにより、一時的に不活性化させた化合物である。ケージド化合物に活性エネルギー線を照射することにより、瞬時に活性型の化合物に変換することができる。ケージド化合物には、保護基で保護された酵素の基質又は補因子のほか、保護基で保護された分子と複合体を形成している補因子等も含まれる。
　補因子とは、酵素の触媒活性に必要な化学物質であり、例えば補酵素、補欠分子族、金属イオン等が挙げられる。補因子と複合体を形成する分子としては、例えば、ケージド－エチレンジアミン四酢酸、ケージド－グリコールエーテルジアミン四酢酸等のように、活性エネルギー線の照射前は補因子をキレートし、活性エネルギー線の照射によって補因子を開放する分子が挙げられる。
　ケージド化合物である基質又は補因子を使用することにより、活性エネルギー線の照射前は酵素反応を停止させておき、活性エネルギー線の照射により酵素反応を開始することができる。
　ケージド化合物の保護基としては、例えば下記式（１）で表わされるα－カルボキシ－２－ニトロベンジル（ＣＮＢ）基、下記式（２）で表わされる１－（２－ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）基、下記式（３）で表わされる４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）基、下記式（４）で表わされる１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル（ＤＭＮＰＥ）基、下記式（５）で表わされる（４，５－ジメトキシ－２－ニトロ）フェニル（ＤＭＮＰ）基、下記式（６）で表わされる５－カルボキシメチルオキシ－２－ニトロベンジル（ＣＭＮＢ）基、下記式（７）で表わされる２－ニトロフェニル（ＮＰ）基、下記式（８）で表わされる１－（２－ニトロフェニル）エトキシカルボニル（ＮＰＥＣ）基、下記式（９）で表わされる３－ニトロベンゾフラン－２－イル（ＮＤＢＦ）基、下記式（１０）で表わされる４－メトキシ－７－ニトロインドリニル（ＭＮＩ）基、下記式（１１）で表わされる［１，３－ビス（ジヒドロキシホスホリルオキシ）プロパン－２－イルオキシ］－７－ニトロインドリン（ＤＰＮＩ）基、下記式（１２）で表わされるルテニウム－ビピリジン（ＲｕＢｉ）基、下記式（１３）で表わされる１－（ヒドロキシアセチル）ピレン基等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ［式（１２）中、Ｐｈはフェニル基を表す。］
　ケージド化合物は塩であってもよく、フリー体であってもよい。より具体的なケージド化合物としては、例えば、アデノシン５’－トリフォスフェート，Ｐ３－（１－（２－ニトロフェニル）エチル）エステル，二ナトリウム塩（ＮＰＥ－ケージドＡＴＰ）、アデノシン５’－トリフォスフェート，Ｐ３－（１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル）エステル，二ナトリウム塩（ＭＮＰＥ－ケージドＡＴＰ）、アデノシン５’－ジフォスフェート，Ｐ２－（１－（２－ニトロフェニル）エチル）エステル，カリウム塩（ＮＰＥ－ケージドＡＤＰ）、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジルアデノシン３’，５’－サイクリックモノフォスフェート（ＤＭＮＢ－ケージドｃＡＭＰ）、Ｄ－ミオイノシトール１，４，５－トリフォスフェート，Ｐ４（５）－（１－（２－ニトロフェニル）エチル）エステル，トリス（トリエチルアンモニウム）塩（ＮＰＥ－ケージドイノシトール１，４，５－トリフォスフェート）、サイクリックアデノシン５’－ジフォスフェートリボース，１－（１－（２－ニトロフェニル）エチル）エステル（ＮＰＥ－ケージドｃＡＤＰ－リボース）、γ－アミノ酪酸，α－カルボキシ－２－ニトロベンジルエステル，トリフルオロ酢酸塩（Ｏ－（ＣＮＢケージド）ＧＡＢＡ）、Ｄ－ルシフェリン，１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチルエステル（ＤＭＮＰＥ－ケージドルシフェリン）、下記式（１４）で表される、Ｃａ２＋イオンと錯体を形成したＮＰ－ＥＧＴＡ、下記式（１５）で表される、Ｃａ２＋イオンと錯体を形成したＤＭＮＰ－ＥＧＴＡ、下記式（１６）で表される、ジアゾ－２，四カリウム塩、下記式（１７）で表される、ＣＮＢケージドＬ－グルタミン酸、下記式（１８）で表される、Ｎ－（ＣＮＢケージド）カルバコール（Ｎ－（α－カルボキシ－２－ニトロベンジル）カルバミルコリン，トリフルオロ酢酸塩等が挙げられるがこれに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　また、ケージド化合物として、保護基を脱保護させる活性エネルギー線が異なる複数種類の化合物を用いることもできる。これにより、複数の基質を用いた酵素反応や、多段階の酵素反応を測定することが可能になる。ケージド化合物の保護基は次の工程での効果との関連で適宜選択することができる。
《活性エネルギー線》
　活性エネルギー線としては、上述した保護基を脱保護し、上述したケージド化合物を活性型に変換できるものであれば特に限定されず、例えば、紫外線、可視光線、赤外線等の電磁波、α線、β線、γ線、電子線、中性子線、Ｘ線等の放射線、集束された超音波線等が挙げられる。
　好適な活性エネルギー線として、例えば波長２００～１５００ｎｍ、例えば波長２５０～８５０ｎｍ、例えば波長３４０～３８０ｎｍにピーク波長を有する電磁波を用いることができる。電磁波の照射量は、使用するケージド化合物を脱保護できる量であれば特に制限されず、例えば１～１００００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１～１０００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１～１００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１～１０ｍＪ／ｃｍ２であってもよい。
　また、例えば電磁波の波長が３４０～３８０ｎｍの範囲であれば、核酸に損傷を与えにくい。また、例えば電磁波の波長が１０００～１５００ｎｍの範囲であれば、民生用の部品を流用して、電磁波を照射する装置を安価に製造することができる。
　あるいは、好適な活性エネルギー線として、周波数２００～２０００ｋＨｚの超音波線を用いることができる。超音波線の照射量は、使用するケージド化合物を脱保護できる量であれば特に制限されず、例えば１～１００００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１～１０００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１～１００ｍＪ／ｃｍ２であってもよく、例えば１～１０ｍＪ／ｃｍ２であってもよい。
　また、実施例において後述するように、活性エネルギー線の照射量を変化させることにより、活性型に変化させるケージド化合物の量を制御することも可能である。
　あるいは、活性エネルギー線の照射量等の条件を変化させながら、活性エネルギー線の照射及び酵素反応の測定を複数回繰り返してもよい。これにより、例えば、同一のウェルにおいて、様々な条件下における酵素反応を測定することができる。例えば、１つのウェルに収容されている１種の変異酵素のミカエリスメンテン式をプロットすることができる。
（工程ｂ）
　工程ａの後、本工程において、酵素反応を測定する。酵素反応は、光信号、電気信号等として測定することができる。光信号としては、発色、発光、蛍光等が挙げられる。また、電気信号は、例えば酵素による酸化還元反応を電気化学計測により計測することにより得ることができる。
　例えば、キナーゼの酵素反応を発光の検出により測定する場合、下記式（Ｆ１）に示すような反応系を利用することができる。この場合、キナーゼの基質はＡＤＰであり、ＡＤＰとして、ＮＰＥ－ケージドＡＤＰ等のケージド化合物を使用するとよい。
　下記式（Ｆ１）における反応では、工程ａにおいて活性エネルギー線を照射するとケージド化合物が脱保護され、ＡＤＰが生成される。生成されたＡＤＰはキナーゼの基質として反応することができる。続いて、キナーゼがＡＤＰをＡＴＰに変換する。続いて、生成されたＡＴＰを、ルシフェラーゼによる発光反応と組み合わせることにより、キナーゼの活性に対応した発光が観察される。この発光を測定することによりキナーゼの反応を測定することができる。
　下記式（Ｆ１）における反応において、補因子であるマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）と複合体を形成したケージド－エチレンジアミン四酢酸をケージド化合物として使用することもできる。この場合、活性エネルギー線を照射するとケージド化合物が脱保護され、遊離Ｍｇ２＋が生成される。生成されたＭｇ２＋はキナーゼ及びルシフェラーゼの補因子として作用することができる。その結果、キナーゼがＡＤＰをＡＴＰに変換し、精製されたＡＴＰをルシフェラーゼによる発光反応と組み合わせることにより、キナーゼの活性に対応した発光が観察される。この発光を測定することによりキナーゼの反応を測定することができる。
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（工程ｃ）
　本工程において、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する。時間差を制御するとは、工程ａを実施した時間、すなわち、対象の反応空間に活性エネルギー線を照射した時間と、工程ｂを実施した時間、すなわち、当該反応空間における酵素反応を測定した時間との時間差（間隔）を制御することを意味する。
　例えば、複数の反応空間において、工程ａと工程ｂとの時間差を一定にしてもよいし、工程ａと工程ｂとの時間差を意図的に変化させてもよい。
　上述した従来のスクリーニング方法においては、酵素反応の開始時を制御することが困難である。このため、反応空間中の酵素反応が無制御に開始してしまい、酵素反応の開始時と測定時との時間差を一定にすること、あるいは時間差を意図的に変化させることが困難であった。このため、酵素の活性を正確に測定することが困難であった。
　これに対し、本実施形態の測定方法によれば、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御することができる。時間差の制御方法は、測定装置の構造と密接に関連するため、詳細については後述する。
［スクリーニング方法］
　１実施形態において、本発明は、上述した方法により酵素反応を測定する工程を備える、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子のスクリーニング方法を提供する。
　上述したように、上述した酵素反応の測定方法により、多数の酵素について、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御して、酵素反応を正確に測定することができる。本実施形態のスクリーニング方法において、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子は、進化分子工学的手法により作製されたライブラリーにコードされるものであってもよい。
　したがって、本実施形態のスクリーニング方法で酵素反応を測定することにより、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子の大規模なスクリーニングをハイスループットに行うことができる。
［測定装置］
　１実施形態において、本発明は、複数の反応空間でそれぞれ生じる酵素反応を測定する測定装置を提供する。本実施形態の測定装置は、照射部と、測定部と、制御部とを備える。照射部は、前記酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む前記反応空間に活性エネルギー線を照射して前記酵素反応を開始させる。測定部は、酵素反応を測定する。また、制御部は、照射部からの活性エネルギー線の照射と、測定部での酵素反応の測定との時間差を制御する。本実施形態の測定装置は、１０，０００個以上の反応空間でそれぞれ生じる酵素反応の測定用であってもよい。
　本実施形態の測定装置により、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御しながら、上述した酵素反応の測定方法を実施することができる。
（第１実施形態）
　ここで、測定装置の第１実施形態について説明する。第１実施形態の測定装置は、ウェルアレイ内での酵素反応を測定する装置である。
　第１実施形態の測定装置は、ウェルアレイ内での酵素反応を測定する測定装置であって、前記ウェルアレイが形成された基板の前記ウェルアレイが形成された領域よりも面積が小さい照射領域に活性エネルギー線を照射してウェルアレイ内で前記酵素反応を開始させる照射部と、前記照射領域において前記酵素反応に伴う光信号を検出する測定部と、前記照射部及び前記測定部に対する前記基板の相対的な位置を前記基板の面に沿う方向に移動させる駆動部と、前記照射部からの活性エネルギー線の照射と前記測定部での前記酵素反応の測定との時間差を制御する制御部とを備える。
　図５は、第１実施形態の測定装置１の要部の模式図である。測定装置１は、支持部３０と、駆動部３５と、照射部４０と、測定部５０と、制御部３６と、を有する。測定装置１は、酵素反応に伴う光信号を測定する。測定部５０は、光の強度を検出する光検出器であってもよいし、画像を取得する撮像部であってもよい。光信号は、着色であってもよいし、発光であってもよいし、蛍光であってもよい。光信号が蛍光である場合、測定部５０は、蛍光物質を励起するための励起光を照射する励起光照射部を更に備えることが好ましい。
　支持部３０は、基板２０を着脱可能に固定して支持する。基板２０は、ガラス又はポリジメチルシロキサン等のエラストマー材料からなる。基板２０は、第１の面２０ａ及び第２の面２０ｂを有する。
　図６は、基板２０の平面図である。図７は、図６の領域ＩＩＩの拡大図である。基板２０の第１の面２０ａには、複数のウェル２１が形成されている。複数のウェル２１は、第１の面２０ａの面内でＸ軸方向及びＹ軸方向に沿って配列されている。それぞれのウェル２１の直径及び深さは、例えば、共に数μｍである。複数のウェル２１は、ウェルアレイ２５を構成する。すなわち、基板２０には、複数のウェル２１が配列されて構成されたウェルアレイ２５が形成されている。ウェルアレイ２５の各ウェル２１には、酵素と、当該酵素の基質と、必要に応じて、酵素阻害分子、酵素活性化分子又は補因子とが収容される。本実施形態の測定装置１は、ウェルアレイ２５内での酵素反応を測定する。
　支持部３０は、基板２０の第１の面２０ａを上側に向けた状態で、基板２０を支持する。支持部３０は、駆動部３５により水平方向（Ｘ軸方向及びＹ軸方向）に沿って移動させられる、いわゆるＸＹテーブルである。
　駆動部３５は、支持部３０を基板２０の面に沿う方向（水平方向）に移動させる。駆動部３５は、支持部３０をＸ軸方向及びＹ軸方向に沿ってそれぞれ移動させるサーボモータを有する。なお、駆動部３５は、照射部４０及び撮像部５０に対して基板２０の相対的な位置を基板２０の面に沿う方向に移動させるものであればよい。したがって、駆動部３５は、必ずしも支持部３０を駆動するものでなくてもよく、例えば照射部４０及び測定部５０を一体的に駆動するものであってもよい。
　制御部３６は、駆動部３５に接続されている。制御部３６は、駆動部３５の移動速度を制御する。結果として、制御部３６は、照射部４０における活性エネルギー線の照射と、測定部５０における酵素反応の検出と、の時間差を制御することができる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、駆動部３５の移動速度を制御することにより実施されてもよい。
　照射部４０は、基板２０の第１の面２０ａに対向して配置されている。照射部４０は、ウェルアレイ２５内に照射領域Ａを形成し、照射領域Ａに活性エネルギー線を照射する。照射部４０の光軸Ｌ４０は、基板２０の第１の面２０ａと直交する。上述したように、ウェルアレイ２５内に収容されたケージド化合物である基質又は補因子は、活性エネルギー線が照射されることで、活性型に変換される。これにより、ウェルアレイ２５内で酵素反応を開始させる。
　照射部４０は、光源４１と、光源４１から出射された光をウェルアレイ２５に向けて出射する光学系（出射レンズ）４２と、光学系４２から出射された光の一部を遮光し照射領域Ａを測定領域Ｂと同一の形状及び同一の大きさとするマスク４３と、を有していてもよい。
　光源４１としては、例えばＬＥＤ光源を採用することができる。また、出射レンズ４２は、光源４１から出射された光をウェルアレイ２５に向けて集光して出射する。マスク４３は、中央に矩形状の孔４３ａが設けられた遮光板４３ｂを有する。遮光板４３ｂは、出射レンズ４２から出射された光の一部を遮光する。また、遮光板４３ｂは、出射レンズ４２から出射された光を孔４３ａの形状に沿って通過させる。出射レンズ４２から出射された光は、孔４３ａの形状に対応する矩形状の外形でウェルアレイ２５上に投影される。すなわち、照射部４０の照射領域Ａは、マスク４３に対応する矩形状となる。照射領域Ａは、ウェルアレイ２５が形成された領域よりも面積が小さい。照射領域Ａは、測定部５０により測定される測定領域Ｂと同一の形状及び同一の大きさとなるように形成されていてもよい。
　測定部５０は、基板２０の第１の面２０ａに対向して配置されている。測定部５０は、ウェルアレイ２５内の所定の領域（測定領域Ｂ）において、酵素反応に伴う光信号を撮像することでウェルアレイ２５内の酵素反応を測定する。すなわち、測定部５０は、酵素反応を検出する検出部として機能する。測定部５０の光軸Ｌ５０は、基板２０の第１の面２０ａと直交する。照射部４０及び測定部５０は、基板２０の面に沿う方向に並んで配置されていてもよい。
　測定部５０の光軸Ｌ５０と照射部４０の光軸Ｌ４０は、互いに平行である。本実施形態において、測定部５０の光軸Ｌ５０と照射部４０の光軸Ｌ４０とは、Ｘ軸方向に沿って距離Ｗだけ離して配置されている。
　例えば、距離Ｗは可変であってもよい。距離Ｗを制御することにより、酵素反応の開始時と酵素反応の測定時の時間差を制御することもできる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、距離Ｗを制御することにより実施されてもよい。
　測定部５０は、撮像素子５１と、対物レンズ（対物光学系）５２と、を有していてもよい。撮像素子５１としては、例えばＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサが採用される。測定部５０は、撮像素子５１の性能（画素数及び解像度）に依存した形状及び大きさの測定領域Ｂを形成する。
　以下に、図８及び図９を参照しながら、測定装置１を用いた酵素反応の測定方法について説明する。
　測定装置１を用いた酵素反応の測定方法において、上述した工程ａは、前記ウェルアレイ上に設定された、前記ウェルアレイが形成された領域よりも面積が小さい照射領域に、前記活性エネルギー線を照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａ１であり、上述した工程ｂは、前記照射領域における前記酵素反応を測定する工程ｂ１であってもよい。また、上述した工程ｃは、照射部４０及び測定部５０を前記ウェルアレイ上で移動させる速度を制御することにより実施されてもよい。
（工程ａ１）
　図８は、本実施形態の測定方法においてウェルアレイ２５に対して活性エネルギー線を照射する工程の手順を示す図である。ウェルアレイ２５上には、照射部４０によって活性エネルギー線が照射された矩形の照射領域Ａが形成される。
　照射領域Ａは、ウェルアレイ２５において一方向（図８の例では、Ｘ軸方向）に一定速度で移動する。照射領域Ａの移動は、駆動部３５（図５参照）により支持部３０をＸ軸方向及びＹ方向に駆動させることで容易に実現できる。
　照射領域Ａで活性エネルギー線が照射されたウェル２１に含まれる基質又は補因子は活性型に変換される。これにより、酵素反応が開始する。なお、活性型へ変換される基質又は補因子の量は、活性エネルギー線の照射エネルギー量に依存する。活性エネルギー線の照射エネルギー量は、光源４１から照射される活性エネルギー線の強度、照射領域Ａの移動時間等により調整することができる。
　図８に示すように、照射領域Ａは、まず、ウェルアレイ２５内において、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動する。続いて、照射部４０による活性エネルギー線の照射を停止する。続いて、照射領域Ａは、ウェルアレイ２５のＸ軸方向に沿う一端側の、Ｙ軸方向に照射領域Ａのスポットサイズだけオフセットした位置に移動する。
　続いて、照射部４０による活性エネルギー線の照射を再開する。具体的には、照射領域Ａを、上述したものと同様に、ウェルアレイ２５内において、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動させる。以上の工程を繰り返すことで、照射領域Ａは、ウェルアレイ２５に含まれる全てのウェルを走査することができる。
（工程ｂ１）
　図９は、本実施形態の測定方法において、ウェルアレイ２５における酵素反応に伴う光信号を検出する工程の手順を示す図である。測定部５０は、ウェルアレイ２５上に、酵素反応に伴う光信号を検出できる範囲としての測定領域Ｂを形成する。
　測定領域Ｂは、ウェルアレイ２５において一方向（図９の例では、Ｘ軸方向）に一定速度で移動する。測定領域Ｂの移動は、照射領域Ａの移動と同様に、駆動部３５（図５参照）により支持部３０をＸ軸方向及びＹ方向に駆動させることで容易に実現できる。測定領域Ｂの移動速度は、照射領域Ａの移動速度と同一に制御してもよい。また、測定領域Ｂの移動経路は、照射領域Ａの移動経路と同一に制御してもよい。これにより、工程ａ１と工程ｂ１との時間差を一定に制御することができる。
　すなわち、本実施形態の測定方法では、工程ａ１及び工程ｂ１を同時に実施し、工程ｃにおいて、照射領域Ａを一定の速度で移動させ、測定領域Ｂの移動を照射領域Ａの移動に追従させてもよい。
　まず、測定領域Ｂは、ウェルアレイ２５内において、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動する。続いて、測定部５０による測定を停止する。続いて、ウェルアレイ２５のＸ軸方向に沿う一端側の、Ｙ軸方向に測定領域Ｂのスポットサイズだけオフセットした位置に移動する。
　続いて、測定部５０による測定を再開する。具体的には、測定領域Ｂを、上述したものと同様に、ウェルアレイ２５内において、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動させる。以上の工程を繰り返すことで、測定領域Ｂは、ウェルアレイ２５に含まれる全てのウェルを走査することができる。
　このようにして、測定領域Ｂの移動速度と照射領域Ａの移動速度及び移動経路を同一に制御することにより、活性エネルギー線が照射されて酵素反応が開始してから測定されるまでの時間を複数のウェルにおいて一定にすることができる。これにより、各ウェル２１における測定条件を揃えて、各ウェル２１での測定結果の比較の正確性を高めることができる。
　本実施形態の測定方法において、照射領域Ａ及び測定領域Ｂの移動経路は、図８、図９に示したものに限られない。例えば、ウェルアレイ２５の外周から中心部に向かって渦巻き状に移動する経路を採用してもよいし、中心部から外周に向かって渦巻き状に移動する経路を採用してもよい。また、Ｘ軸方向の一端側から他端側に達するまでＸ軸方向に沿って移動した後、Ｘ軸方向の他端側において、Ｙ軸方向に測定領域Ｂのスポットサイズだけオフセットした位置に移動し、Ｘ軸方向の他端側から一端側に沿って移動する経路を採用してもよい。
　本実施形態において、照射領域Ａ及び測定領域Ｂは、基板２０の第１の面２０ａにおいて、ウェルアレイ２５が形成された領域よりも面積が小さい。測定部５０により測定される測定領域Ｂの大きさは、例えば、撮像素子５１の画素数及び解像度に依存する。したがって、ウェルアレイ２５全体を同時に撮像しようとする場合、高価な撮像素子５１を用意する必要が生じる。本実施形態によれば、ウェルアレイ２５より小さい照射領域Ａ及び測定領域Ｂにより、活性エネルギー線の照射及び測定を順次行うことで、活性エネルギー線の照射から測定までの時間を一定に保ちつつ大面積のウェルアレイの測定を安価な測定装置１により行うことができる。
　本実施形態の測定装置１では、照射部４０及び測定部５０が基板２０の面に沿う方向に並んで配置されている。したがって、駆動部３５を用いて支持部３０を移動させ、基板２０を照射部４０及び測定部５０が並ぶ方向に移動させることで、工程ａ１と工程ｂ１とを同時並行的に行うことができる。これにより、活性エネルギー線が照射されて酵素反応が開始してから測定されるまでの時間を複数のウェルにおいて一定にすることができる。
　測定領域Ｂを照射領域Ａに追従させて照射と測定を同時並行的に行う場合、活性エネルギー線の照射から測定までの時間は、支持部３０の移動速度、並びに照射部４０の光軸Ｌ４０と撮像部５０の光軸Ｌ５０の距離Ｗを調整することにより制御することができる。
　本実施形態の測定装置１は、複数の測定部５０を備えていてもよい。また、複数の測定部５０は、基板の面に沿う方向に並んでいてもよい。すなわち、図５に、二点鎖線で示すように、本実施形態の測定装置１は、第２の測定部５０Ａを有していてもよい。すなわち、測定装置１は、複数の撮像部５０、５０Ａを有していてもよい。この構成によれば、駆動部３５を用いて支持部３０を移動させ、基板２０を複数の測定部５０、５０Ａが並ぶ方向に移動させることで、同一のウェル２１での酵素反応に対し反応時間を異ならせた測定を、１回の工程ａ１及び工程ｂ１において行うことができる。これにより、同一のウェル２１における酵素反応の経時的な変化を測定でき、例えば酵素反応速度を算出することが可能となる。測定部５０は３個以上存在していてもよい。
　図５の例では、照射部４０及び測定部５０は、光軸Ｌ４０、Ｌ５０が基板２０の面に沿う方向に並ぶように配置されている。しかしながら、照射部４０と測定部５０は、活性エネルギー線照射時及び測定時に同軸上で切り替えて使用する構成としてもよい。この場合、工程ａ１がウェルアレイ２５全体に亘って完了した後に、工程ｂ１を開始する手順を採用してもよい。
　また、本実施形態において、照射部４０及び測定部５０は、基板２０の上側の面（第１の面２０ａ）側に配置されている。しかしながら、照射部４０及び測定部５０は、基板２０の下側の面（第２の面２０ｂ）側に配置されていてもよく、基板２０に対してそれぞれ上下の面側に別々に配置されていてもよい。
（第１実施形態の測定装置の変形例）
　以下に、図１０を参照しながら、測定装置１を用いた酵素反応の測定方法の変形例について説明する。図１０は、ウェルアレイに活性エネルギー線を照射する工程及びウェルアレイにおける酵素反応に伴う光信号を撮像する工程の手順を示す図である。
　測定装置１を用いた酵素反応の測定方法においては、ウェルアレイ上の同一の領域において、工程ａ１と工程ｂ１とを交互に行ってもよい。
　この場合、まず、工程ａ１において、ウェルアレイ２５に対して活性エネルギー線を照射する。この結果、図１０に示すように、ウェルアレイ２５上の領域ａに、照射部４０によって活性エネルギー線が照射された矩形の照射領域Ａが形成される。
　続いて、工程ｂ１において、ウェルアレイ２５における酵素反応に伴う光信号を測定する。本実施形態の測定方法では、図１０に示すウェルアレイ２５上の領域ａに、酵素反応に伴う光信号を測定できる範囲としての測定領域Ｂを形成し、酵素反応を測定する。すなわち、同一の領域ａにおいて、工程ａ１を実施した後、工程ｂ１を実施する。この場合、工程ａ１と工程ｂ１との時間差を制御する工程ｃは、工程ａ１を実施した後、工程ｂ１を実施するまでの時間を制御することにより実施することができる。
　続いて、照射部４０を、照射領域Ａのスポットサイズだけオフセットした位置である領域ｂに移動し、以上の工程ａ１及び工程ｂ１を繰り返す。続いて、照射部４０を、照射領域Ａのスポットサイズだけオフセットした位置である領域ｃに移動し、以上の工程ａ１及び工程ｂ１を更に繰り返す。
　以上の工程を繰り返すことで、照射領域Ａ及び測定領域Ｂは、ウェルアレイ２５に含まれる全てのウェルを走査することができる。
　本実施形態の測定方法によっても、活性エネルギー線の照射から測定までの時間を各ウェル２１で同一とすることができる。これにより、各ウェル２１における測定条件を揃えて、各ウェル２１での測定結果の比較の正確性を高めることができる。
　第１実施形態の測定装置の変形例において、照射部４０は、ウェルアレイ２５の全体に同時に活性エネルギー線を照射可能に構成されていてもよい。また、測定部５０の対物レンズ５２及び撮像素子５１は、ウェルアレイ２５の全体における光信号を同時に撮像可能に構成されていてもよい。
　このような構成の測定装置によっても、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御することができる。例えば、ウェルアレイを構成する全ウェルに同時に反応液を分配することが困難な場合であっても、ウェルアレイを構成する全ウェルに反応液を分配した後に、任意のタイミングで酵素反応を開始させることができ、全てのウェルで酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を揃えて酵素反応を測定することができる。
　第１実施形態の測定装置において、ウェルアレイ２５の代わりに基板２０上に配置された細胞を用いることもできる。あるいは、ウェルアレイ２５の代わりに基板２０上に配置された液滴を用いることもできる。
（第２実施形態）
　続いて、測定装置の第２実施形態について説明する。第２実施形態の測定装置は、ウェルアレイ内での酵素反応を測定する装置である。
　第２実施形態の測定装置は、内面の少なくとも一部に電極が形成された複数のウェルからなるウェルアレイが形成された基板の前記ウェルアレイに活性エネルギー線を照射してウェルアレイ内で前記酵素反応を開始させる照射部と、複数の前記電極に接続され酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを測定する測定部と、前記照射部からの活性エネルギー線の照射と、前記測定部での前記酵素反応の測定との時間差を制御する制御部とを備える。
　すなわち、第２実施形態の測定装置において、測定部は、内面の少なくとも一部に電極が形成された複数のウェルからなるウェルアレイの前記電極と、酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを前記電極において測定する回路部と、を有する。
　図１１は、第２実施形態の測定装置１０１の要部の模式図である。本実施形態の測定装置１０１は、第１実施形態の測定装置と比較して、酵素反応の検出方法が主に異なる。なお、上述した実施形態と同一態様の構成要素については、同一又は対応する符号を付し、その説明を省略する。
　図１１に示すように、測定装置１０１は、照射部１４０と、測定部（回路部）１６０と、制御部１３６と、を有する。測定装置１０１は、酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを測定する。
　基板１２０は、第１の面１２０ａ及び第２の面１２０ｂを有する。基板１２０の第１の面１２０ａには、複数のウェル１２１が形成されている。複数のウェル１２１は、第１の面１２０ａの面内でＸ軸方向及びＹ軸方向に沿って配列されている。ウェルアレイ１２５の各ウェル１２１には、酵素と、当該酵素の基質と、必要に応じて、酵素阻害分子、酵素活性化分子又は補因子とが収容される。
　各ウェル１２１の底面には、電極１２９が設けられている。なお、電極１２９は、ウェル１２１の内面の少なくとも一部に形成されていればよい。
　照射部１４０は、基板１２０の第１の面１２０ａに対向して配置されている。照射部１４０は、ウェルアレイ１２５全体に対して、同時に活性エネルギー線を照射することができる。各ウェル１２１内に収容された基質又は補因子は、活性エネルギー線が照射されることで、活性型に変換される。これにより、各ウェル１２１内で酵素反応を開始させる。また、酵素反応に伴い、電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスが変化する。
　測定部１６０は、基板１２０の第２の面１２０ｂ側に配置されている。測定部１６０は、酵素反応に伴い電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを測定する。すなわち、測定部１６０は、酵素反応を検出する検出部として機能する。
　制御部１３６は、照射部１４０及び測定部１６０に接続されている。制御部１３６は、照射部１４０における活性エネルギー線の照射及び測定部１６０における電流、電圧又はインピーダンスの測定を制御する。制御部１３６は、照射部１４０における活性エネルギー線の照射と、測定部１６０における酵素反応の検出と、の時間差を制御できる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、制御部１３６により実施されてもよい。
　また、測定装置１０１は、測定部１６０における酵素反応の検出結果の経時的な変化を記録するメモリを備えていてもよい。これにより、ウェル１２１内の酵素反応を経時的に記録することが可能となる。
　第２実施形態の測定装置１０１において、測定部１６０としては、集積回路（ＩＣ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ）を採用することができる。測定部１６０は、多数の電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを同時に処理することができる。
　以下に、測定装置１０１を用いた酵素反応の測定方法について説明する。測定装置１０１を用いた酵素反応の測定方法において、上述した工程ａは、前記ウェルアレイの全ウェルに、前記活性エネルギー線を同時に照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａ２であり、上述した工程ｂは、前記ウェルアレイの全ウェルにおける前記酵素反応を、電気化学計測により同時に計測する工程ｂ２であってもよい。
　本実施形態の測定装置及び測定方法によれば、酵素反応の検出を電気化学計測により計測するという構成を採用することにより、数ｃｍ×数ｃｍの大きさのウェルアレイ上に、例えば１０７～１０８個の変異酵素、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補が積載されたウェルアレイを用いた場合においても、全てのウェルにおける酵素反応を同時に測定することができる。
（工程ａ２）
　まず、本工程において、ウェルアレイ１２５の全てのウェル１２１に、活性エネルギー線を同時に照射して基質Ｓ又は補因子を活性型に変換し、酵素による酵素反応を開始する。より具体的には、図１１に示すように、ウェル１２１のそれぞれには、それぞれ異なる変異酵素（例えば図１１におけるｅ１、ｅ２）、酵素阻害分子候補又は酵素活性化分子候補が収容されている。基質Ｓ又は補因子が活性型に変換された結果、酵素ｅ１、ｅ２等による酵素反応が進行し、生成物Ｐが生成される。生成物Ｐが生成される過程において、酸化体Ｏｘと還元体Ｒｅｄとの間で電子ｅ－の授受が行われる。
（工程ｂ２）
　続いて、本工程において、ウェルアレイ１２５の全てのウェル１２１における酵素反応を、電気化学計測により同時に計測する。具体的には、各ウェル１２１における酵素反応の過程で生じる電子の移動により発生する電流、電圧又はインピーダンスを、電極１２９を通じて測定部１６０で測定する。
（第２実施形態の測定装置の変形例）
　図１２は、第２実施形態の測定装置の変形例である測定装置２０１の要部の模式図である。測定装置２０１の照射部２４０は、測定装置１０１の照射部１４０と異なり、ウェルアレイが形成された領域よりも面積が小さい照射領域に活性エネルギー線を照射する構成である点が主に異なる。なお、上述の実施形態と同一態様の構成要素については、同一又は対応する符号を付し、その説明を省略する。
　照射部２４０によれば、照射部１４０と比較して、光源の総光量が同じであっても、レンズを介して小面積に集光し、光照射領域を小面積に限定することにより、単位面積当たりの活性エネルギー線の照射量を増加させることができる。これにより、活性エネルギー線の照射時間を短縮することが可能となる。
　図１２に示すように、測定装置２０１は、照射部２４０と、測定部（回路部）１６０と、制御部１３６と、を有する。測定装置２０１は、酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを測定する。
　照射部２４０は、基板１２０の第１の面１２０ａに対向して配置されている。照射部２４０は、ウェルアレイ１２５内に照射領域Ａを形成し、照射領域Ａに活性エネルギー線を照射する。照射部２４０の照射領域Ａは、ウェルアレイ１２５が形成された領域よりも面積が小さい。
　続いて、測定装置２０１を用いた酵素反応の測定方法を説明する。測定装置２０１を用いた酵素反応の測定方法において、上述した工程ａは、前記ウェルアレイ上に設定された、前記ウェルアレイが形成された領域よりも面積が小さい照射領域に、前記活性エネルギー線を照射して前記基質又は補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａ１であり、上述した工程ｂは、前記照射領域における前記酵素反応を測定する工程ｂ１であってもよい。
　測定装置２０１において、制御部１３６は、照射部２４０における活性エネルギー線の照射と、測定部１６０における酵素反応の検出と、の時間差を制御できる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、制御部１３６により実施されてもよい。
　各ウェル１２１内に収容された基質又は補因子は、活性エネルギー線が照射されることで、活性型に変換される。これにより、各ウェル１２１内で酵素反応を開始させる。また、酵素反応に伴い、電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスが変化する。
　測定部１６０は、基板１２０の第２の面１２０ｂ側に配置されている。測定部１６０は、酵素反応に伴い電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを測定する。すなわち、測定部１６０は、酵素反応を検出する検出部として機能する。
　制御部１３６は、照射部２４０及び測定部１６０に接続されている。制御部１３６は、照射部２４０における活性エネルギー線の照射及び測定部１６０における電流、電圧又はインピーダンスの測定を制御する。制御部１３６は、照射部２４０における活性エネルギー線の照射と、測定部１６０における酵素反応の検出と、の時間差を制御できる。すなわち、上述した工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃは、制御部１３６により実施されてもよい。
　測定部１６０は、照射領域Ａへの活性エネルギー線の照射後、制御部１３６によって制御された時間に、照射領域Ａの各ウェル１２１に設けられた電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを測定する。
　ここで、測定部１６０は、ウェルアレイ１２５の全てのウェル１２１に設けられた電極１２９に流れる電流、電圧又はインピーダンスを同時に測定してもよい。この場合、照射領域Ａ以外のウェル１２１では酵素反応が生じていないため、照射領域Ａ以外のウェル１２１で測定されたデータは不要なデータとして破棄してもよい。
　あるいは、測定部１６０は、ウェルアレイ１２５の全てのウェル１２１のうち、照射領域Ａに位置するウェル１２１を含む、限定された領域（測定領域Ｂ）のみにおいて、電流、電圧又はインピーダンスを測定する構成としてもよい。
　大規模なアレイを構成する多数の電極１２９の全てについて、電流、電圧又はインピーダンスを同時に測定することは困難な場合があり、時間的な遅延が問題となる場合がある。このような場合において、測定領域Ｂに限定して、電流、電圧又はインピーダンスを測定する構成とすることにより、時間的な遅延を無視できるレベルに抑えることが可能となる。
　また、測定装置２０１は、測定部１６０における酵素反応の検出結果の経時的な変化を記録するメモリを備えていてもよい。これにより、ウェル１２１内の酵素反応を経時的に記録することが可能となる。
　測定装置２０１を用いた酵素反応の測定においては、照射領域Ａ及び測定領域Ｂの移動は、図８、図９、図１０を参照しながら上述したものと同様に行うことができる。すなわち、測定装置２０１を用いた測定は、図８、図９を参照しながら上述したものと同様に、工程ａ１及び工程ｂ１を同時に実施し、工程ｃにおいて、照射領域Ａを一定の速度で移動させ、測定領域Ｂの移動を照射領域Ａの移動に追従させるものであってもよい。
　あるいは、測定装置２０１を用いた測定は、図１０を参照しながら上述したものと同様に、照射領域Ａ及び測定領域Ｂが同一の領域であり、工程ａ１及び工程ｂ１をこの順で繰り返し実施するものであってもよい。この場合、工程ａ１と工程ｂ１との時間差を制御する工程ｃは、工程ａ１を実施した後、工程ｂ１を実施するまでの時間を制御することにより実施することができる。
（第３実施形態）
　続いて、測定装置の第３実施形態について説明する。第３実施形態の測定装置は、液滴内での酵素反応を測定する装置である。第３実施形態の測定装置によっても、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御することができる。
　図１３は、第３実施形態の測定装置５０１の要部の模式図である。測定装置５０１は、酵素反応に伴う光信号を測定する。第３実施形態の測定装置５０１は、第１実施形態の測定装置と比較して、反応空間が液滴である点が主に異なる。なお、上述した実施形態と同一態様の構成要素については、同一又は対応する符号を付し、その説明を省略する。
　図１３に示すように、第３実施形態の測定装置５０１は、液滴Ｄ中での酵素反応を測定する測定装置であって、酵素３３２とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む液滴Ｄが流れる流路５１０と、液滴Ｄに活性エネルギー線を照射して液滴Ｄ内で酵素反応を開始させる照射部５４０と、酵素反応に伴う光信号を検出する測定部５５０と、照射部５４０からの活性エネルギー線の照射と、測定部５５０での酵素反応の測定との時間差を制御する制御部５３６とを備える。
　制御部５３６は、照射部５４０と測定部５５０との間の距離Ｗを制御することにより、活性エネルギー線の照射と、酵素反応の測定との時間差を制御してもよい。あるいは、制御部５３６は、測定装置５０１における液滴Ｄの送液速度を制御することにより、活性エネルギー線の照射と、酵素反応の測定との時間差を制御してもよい。
　制御部５３６は、例えば照射部５４０と測定部５５０とを固定して保持する部材であってもよい。あるいは、制御部５３６は、例えば測定装置５０１における液滴Ｄの送液速度を制御するものであってもよい。
　すなわち、測定装置５０１において、上述した工程ｃは、照射部５４０と測定部５５０との間の距離Ｗを制御することによって実施することができる。距離Ｗは、例えば一定に保たれていてもよい。あるいは、上述した工程ｃは、測定装置５０１における液滴Ｄの送液速度を制御することによって実施することができる。
　測定装置５０１は、液滴を形成する液滴形成部５１５を備えていてもよい。液滴形成部５１５は、例えば図３に示す流体デバイス３００と同様の構造を有していてもよい。液滴形成部５１５で形成された液滴は、図１３中の矢印の方向に一定の速度で送液される。そして、照射部５４０により活性エネルギー線が照射された照射領域Ａを通過した時点で酵素反応が開始される。
　続いて、液滴Ｄは流路５１０の内部を所定の距離Ｗ流れ、測定領域Ｂにおいて測定部５５０により液滴Ｄにおける酵素反応が測定される。
　測定装置５０１は、複数の測定部を有していてもよい。例えば、図１３に示すように、測定装置５０１は、第２の測定部５５０Ａ及び第３の測定部５５０Ｂを有していてもよい。この構成によれば、同一の液滴Ｄでの酵素反応に対し反応時間を異ならせた測定を、１回の送液において行うことができる。これにより、同一の液滴Ｄにおける酵素反応の経時的な変化を測定でき、例えば酵素反応速度を算出することが可能となる。
　測定装置５０１の下流には、所望の液滴をソーティングして回収する回収部が存在していてもよい。液滴Ｄに酵素３３２をコードするＤＮＡが含まれている場合、当該ＤＮＡを回収することにより、所望の活性を有する酵素をコードするＤＮＡを得ることができる。すなわち、酵素のスクリーニングを行うことができる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（紫外線照射量の検討）
　ケージド化合物を基質とした酵素反応を行い、ケージド化合物の活性化に必要な紫外線照射量を検討した。ケージド化合物として、ＮＰＥ－ケージドＡＤＰを使用した。また、ＡＤＰを代謝する酵素として、ポリリン酸キナーゼを使用した。
　具体的には、１ｍＭ　ＮＰＥ－ケージドＡＤＰ　３μＬに、波長３４０～３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射した後、下記表１に示す組成の反応液を調製した。
　紫外線照射には、水銀ランプを光源とし、ＤＡＰＩ蛍光フィルター（Ｅｘ：３４０－３８０、ＤＭ：４００、ＢＡ４３５－４８５）を搭載した正立蛍光顕微鏡を用いた。紫外線照射時間は、０秒、１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、６０秒、１２０秒、３００秒の９通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記反応液を９６ウェルプレートに２７μＬ／ウェルずつ移し、ミネラルオイルを３０μＬ／ウェル重層した。続いて、ポリリン酸キナーゼ（１６．８Ｕｎｉｔ／Ｌ）を３μＬ／ウェルずつ添加し、ルミノメーターを用いて発光量を測定した。
　図１４（ａ）及び（ｂ）は、発光量の測定結果を示すグラフである。その結果、ケージド化合物を活性化するためには、波長３４０～３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）の場合、照射時間３０～６０秒程度（４５０～９００ｍＪ／ｃｍ２）の照射量が必要であることが明らかとなった。
［実験例２］
（紫外線照射による酵素反応の開始１）
　ケージド化合物を基質とした酵素反応を行い、紫外線照射により酵素反応の開始を制御できることを確認した。ケージド化合物として、ＮＰＥ－ケージドＡＤＰを使用した。また、ＡＤＰを代謝する酵素として、ポリリン酸キナーゼを使用した。具体的には、まず、下記表２に示す反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　続いて、上記反応液を９６ウェルプレートに２７μＬ／ウェルずつ移し、ミネラルオイルを３０μＬ／ウェル重層した。続いて、ポリリン酸キナーゼ（１６．８Ｕｎｉｔ／Ｌ）を３μＬ／ウェルずつ添加し、ルミノメーターを用いて発光量を測定した。
　発光量を３０分間測定した後、９６ウェルプレートをルミノメーターから取り出し、ウェル中の反応液に波長３４０～３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外線照射には、水銀ランプを光源とし、ＤＡＰＩ蛍光フィルター（Ｅｘ：３４０－３８０、ＤＭ：４００、ＢＡ４３５－４８５）を搭載した正立蛍光顕微鏡を用いた。紫外線照射時間は、０秒、１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、６０秒の７通りとした。続いて、ルミノメーターを用いて再度発光量を測定した。
　図１５（ａ）及び（ｂ）は、発光量の測定結果を示すグラフである。図１５（ａ）は紫外線照射前の発光量の測定結果を示すグラフであり、図１５（ｂ）は紫外線照射後の発光量の測定結果を示すグラフである。その結果、紫外線照射前は酵素反応が抑制されていることが明らかとなった。また、紫外線照射により酵素反応を開始できることが確認された。また、酵素活性の高さは、紫外線の照射量に依存することが明らかとなった。
［実験例３］
（紫外線照射装置の検討）
　酵素に紫外線を照射した後に酵素反応を行い、紫外線照射装置の種類が酵素活性に与える影響を検討した。紫外線照射装置として、ＵＶランプ又は正立蛍光顕微鏡を使用した。具体的には、まず、下記表３に示す反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　続いて、上記反応液を９６ウェルプレートに２７μＬ／ウェルずつ移し、ミネラルオイルを３０μＬ／ウェル重層した。続いて、ウェル中の反応液に波長３４０～３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外線照射時間は、０秒、１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、６０秒、１２０秒、３００秒の９通りとした。
　紫外線照射装置としては、水銀ランプを光源とし、ＤＡＰＩ蛍光フィルター（Ｅｘ：３４０－３８０、ＤＭ：４００、ＢＡ４３５－４８５）を搭載した正立蛍光顕微鏡、又は波長３６５ｎｍのＵＶランプ（型式「Ｂ－１００ＡＰ」、ＵＶＰ社）を使用した。
　続いて、ポリリン酸キナーゼ（１６．８Ｕｎｉｔ／Ｌ）を３μＬ／ウェルずつ添加し、ルミノメーターを用いて発光量を測定した。
　図１６は、発光量の測定結果を示すグラフである。図中、発光量は、紫外線照射時間０秒のサンプルの最大発光量を１００％とした割合（％）で示した。
　その結果、ＵＶランプによる紫外線照射では、照射時間が長くなると酵素活性が低下することが明らかとなった。この結果から、ＵＶランプによる紫外線照射では、熱により酵素が失活している可能性が考えられた。一方、蛍光顕微鏡による紫外線照射では、ＵＶランプよりも長時間の紫外線照射を行っても酵素活性が維持される傾向にあった。
［実験例４］
（紫外線照射による酵素反応の開始２）
　ケージド化合物を補因子とした酵素反応を行い、紫外線照射により酵素反応の開始を制御できることを確認した。ケージド化合物として、Ｍｇ２＋をキレートしたＤＭＮＰ－ＥＤＴＡを使用した。また、ＡＤＰを代謝する酵素として、ポリリン酸キナーゼを使用した。
　まず、ＤＭＮＰ－ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）に波長３４０～３８０ｎｍの紫外線（約１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射したものと照射しなかったものを準備した。紫外線照射には、水銀ランプを光源とし、ＤＡＰＩ蛍光フィルター（Ｅｘ：３４０－３８０、ＤＭ：４００、ＢＡ４３５－４８５）を搭載した正立蛍光顕微鏡を用いた。紫外線照射時間は３０秒とした。続いて、下記表４に示す反応液を調製した。なお、下記表４中のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは、ＤＭＮＰ－ＥＤＴＡにキレートされるＭｇ２＋イオンを供給するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　続いて、上記反応液を９６ウェルプレートに２７μＬ／ウェルずつ移し、ミネラルオイルを３０μＬ／ウェル重層した。続いて、ポリリン酸キナーゼ（１６．８Ｕｎｉｔ／Ｌ）を３μＬ／ウェルずつ添加し、ルミノメーターを用いて発光量を測定した。
　図１７は、発光量の測定結果を示すグラフである。その結果、紫外線照射前は酵素反応が抑制されていることが明らかとなった。また、紫外線照射により酵素反応を開始できることが確認された。
　本発明によれば、多数の酵素について酵素反応をそれぞれ測定する場合において、酵素反応の開始時から酵素反応の測定時までの時間を制御する技術を提供することができる。
　１，１０１，２０１，５０１…測定装置、２０，１２０…基板、２０ａ，１２０ａ…第１の面、２０ｂ，１２０ｂ…第２の面、２１，１２１…ウェル、２５，１２５…ウェルアレイ、３０…支持部、３５…駆動部、３６，１３６，５３６…制御部、４０，１４０，２４０，５４０…照射部、４１…光源、４２…出射レンズ、４３…マスク、４３ａ…孔、４３ｂ…遮光版、５０，５５０…測定部、５０Ａ，５５０Ａ…第２の測定部、５５０Ｂ…第３の測定部、５１…撮像素子、５２…対物レンズ（対物光学系）、１２９…電極、１６０，２６０…測定部（回路部）、３００…流体デバイス、３１０，３２０，４００，５１０…流路、３３０…水系液体、３３１…ＤＮＡ、３３２…タンパク質（酵素）、５１５…液滴形成部、Ａ…照射領域、Ｂ…測定領域、ＩＩＩ，ａ，ｂ，ｃ…領域、Ｌ４０，Ｌ５０…光軸、Ｗ…距離、ｅ１，ｅ２…酵素、Ｓ…基質、Ｐ…生成物、Ｏｘ…酸化体、Ｒｅｄ…還元体、ｅ－…電子、Ｄ…液滴。

Claims (16)

  1. 　酵素反応の測定方法であって、
    　前記酵素と、ケージド化合物である、前記酵素の基質又は補因子と、を含む反応空間に、活性エネルギー線を照射して前記基質又は前記補因子を活性型に変換し、前記酵素による酵素反応を開始する工程ａと、
    　前記酵素反応を測定する工程ｂと、
    　工程ａと工程ｂとの時間差を制御する工程ｃと、
    　を備える、方法。
  2. 　前記反応空間がウェルである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記反応空間が液滴である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記反応空間が細胞である、請求項１に記載の方法。
  5. 　一度に１０，０００個以上の前記反応空間における前記酵素反応を測定する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記基質又は前記補因子が、脱保護波長が異なる複数のケージド化合物の混合物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記活性エネルギー線が波長２００～１５００ｎｍにピーク波長を有する電磁波である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記活性エネルギー線が周波数２００～２０００ｋＨｚの超音波線である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の方法により酵素反応を測定する工程を備える、酵素、酵素阻害分子又は酵素活性化分子のスクリーニング方法。
  10. 　複数の反応空間でそれぞれ生じる酵素反応を測定する測定装置であって、
    　前記酵素とケージド化合物である前記酵素の基質又は補因子とを含む前記反応空間に活性エネルギー線を照射して前記酵素反応を開始させる照射部と、
    　前記酵素反応を測定する測定部と、
    　前記照射部からの前記活性エネルギー線の照射と、前記測定部での前記酵素反応の測定と、の時間差を制御する制御部と、
    　を備える、測定装置。
  11. 　前記測定部が、前記酵素反応に伴う光信号を検出する光検出器を有する、請求項１０に記載の測定装置。
  12. 　前記測定部が、
    　複数の前記反応空間にそれぞれ接続された複数の電極と、
    　前記酵素反応に伴い発生する電流、電圧又はインピーダンスを前記電極において測定する回路部と、
    　を有する、請求項１０に記載の測定装置。
  13. 　前記反応空間がウェルである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の測定装置。
  14. 　前記反応空間が液滴である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の測定装置。
  15. 　前記反応空間が細胞である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の測定装置。
  16. 　１０，０００個以上の前記反応空間でそれぞれ生じる酵素反応の測定用である、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の測定装置。
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