CN101848757B - 用于改进的生物测定法的使用电场的方法和设备 - Google Patents
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- B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2400/00—Moving or stopping fluids
- B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
- B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
- B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
Abstract
本发明公开了应用电场来改善生物测定的方法和设备。将电场施加在带有孔(well)的装置上，所述孔接受携带电荷的反应物。由此该装置使用在第一和第二电极之间的可控电压源，其可以被控制以向给定的电极提供正电荷和负电荷。通过电场的受控使用，通过电极之间的电场引导流体通道内流体中的带电物质进入或退出所述孔。本方法包括依据各种测定流程，如DNA测序、合成等，输送流体，如在微流装置中的输送，并通过电场诱导移动反应物质。
Description
发明人
Mostafa Ronaghi，Tarun Khuarana，Juan G.Santiago
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年7月13日提交的美国临时专利申请第60/959,398号的优先权，将所述临时申请通过引用整体并入本文。
关于政府支持的声明
无。
涉及序列表、计算机程序或致密盘
无。
发明背景
发明领域
本发明涉及的领域是生物测定法和用于进行这些测定法的设备，如微流装置(microfluidic device)，向所述装置施加电场以控制带电分子的移动。所述测定法涉及带电的分子物质(charged molecular species)，诸如核苷酸(由于磷酸根离子)、或因其离子性质而含有电荷的其它分子，如某些蛋白质或小分子。
相关领域
硅的微加工(silicon microfabrication)方面取得的进展已被应用于生产多种芯片上实验室平台所用的微通道和微阵列。优势包括低试剂消耗、小型化和快反应速率。然而，挑战是有效地将生物样品分离并存放到单独的孔(well)中用于高通量分析。近来，已经实现了随机阵列，其中使用固相支持体来单独地捕获独特的生物学分子并将这些固相支持体存放到具有相同尺寸范围的几何形状的反应孔(reaction wells with a geometry of the same size range)中。这些平台所面临的另一项挑战是当在孔内分离的相同的珠子上进行重复测定时。常见这些挑战的一个好例子是DNA测序。
在某些DNA测序方法中，将DNA固定在固相支持体上，并将核苷酸和酶递送至DNA用于连续掺入核苷酸。这通常称作使用通过合成进行的测序的DNA测序。通过清洗将核苷酸去除以允许核苷酸的重复添加。在通过合成进行的测序中的主要挑战之一是将核苷酸递送到DNA附近从而能够快速并入以及有效去除核苷酸以提高阅读长度。
具体专利和出版物
Dressman等，“Transforming single DNA molecules into fluorescentmagnetic particles for detection and enumeration of genetic variations，”Proc NatAcad Sci July 22，2003，vol.100，no.15，8817-8822页，公开了一种技术，其中将DNA分子集合中的每个DNA分子转化成单一的磁性颗粒，数千个拷贝的与原始DNA序列相同的DNA与所述磁性颗粒结合。然后通过经由流式细胞仪对荧光标记的颗粒进行计数能够简单地评定原始DNA分子群体内的变异。基于这种方法的四种主要要素(珠子、乳剂、扩增和磁性)将其称作BEAM。在进行PCR循环之后，用洗涤剂破坏微乳剂，再通过离心并将试管置于Dynal的MPC-S磁体上而将珠子从油相分离。
Margulies等，“Genome sequencing in microfabricated high-density picolitrereactors，”Nature 437，376-380(2005)公开了一种用于通过合成进行测序的方法和装置，其使用光导纤维切片(fiber optic slide)的开孔。该方法使用设计成利用小规模孔的优势的改良型热测序方案(modified pyrosequencingprotocol)。光导纤维切片通过对光导纤维块进行切片来制造，光导纤维块通过重复拉伸和融合光纤获得。切片含有大约160万个孔，将所述切片装载有珠子并装配到设计在孔开口之上产生300-mm高的通道的流式腔中，测序试剂流经所述通道。未经蚀刻的切片基底与另一光导纤维成像束在光学上接触，所述光导纤维成像束与电荷耦合器件(CCD)传感器结合，允许捕获从每个单独的孔底部发射出的光子。在标准2-ml试管中制备含有150万颗珠子的800ml乳剂。将每种乳剂等分至8个PCR管用于扩增。PCR之后，破坏乳剂以释放珠子，包括带有经扩增、固定的DNA模板的珠子和空珠子。
通过离心使富集的携带模板的珠子沉积在开孔中。将用链霉抗生物素蛋白包覆的SeraMag珠与退火至DNA捕获珠上所固定的模板的生物素化富集引物结合。要点在于不要涡旋振荡珠子，因为涡旋振荡可能破坏SeraMag和DNA捕获珠之间的连接。
Erickson等，“Electrokinetically Based Approach for Single-NucleotidePolymorphism Discrimination Using a Microfluidic Device，”Anal.Chem.，77(13)，4000-4007，(2005)公开了一种用于单核苷酸多态性(SNP)鉴别的动电方法，其使用PDMS/基于玻璃的微流控芯片。该技术利用了施加外部电势所提供的在探针阵列中存在的耦合热能(焦耳加热(Joule heating))、剪切力(电渗)和电能(电泳)的精确控制。其中描述了一种四端口装置(four-port device)，对不同端口施加有不同的电压。
Chen等，“Nanopore sequencing of polynucleotides assisted by a rotatingelectric field，”Applied Physics Letters volume 82，number 8，2003年2月24日1308-1310公开了一种通过旋转电场辅助的、控制多核苷酸经过毫微孔(nanopore)的易位过程的方法。尽管所述工作基于模拟，但表明所述方法能够通过在薄膜上加入两对平行电极而轻易地在毫微孔测序实验中实现。
Erickson，D.，Liu，X.，Krull，D.，Li，D.“An electrokinetically controlledDNA hybridization microfluidic chip enabling rapid target analysis，”AnalyticalChemistry，2004，76，7269-7277公开了一种装置，其中对“H”型流动通道的不同末端施以不同的电压。论文还进一步描述了芯片加工技术。
Edman等，“Electric field directed nucleic acid hybridization onmicrochips，”Nucleic Acids Research，Vol 25，Issue 244907-4914公开了一种基于微芯片的核酸阵列，其中通过向所选测试位点下单独的微电极选择性施加直流正偏压(DC positive bias)来进行电寻址和/或杂交。这引起带负电的核酸分子在微电子阵列上所选位置上的快速转运和浓缩。然后可以将核酸(DNA、RNA、多核苷酸、寡核苷酸等)通过直接附接到微电极上覆盖的渗透层或通过与之前寻址并附接的核酸杂交来固定。这篇论文描述了在实践此处教导的方法时适用的缓冲条件等。Sosnowski，R.G.，Tu，E.，Butler，W.F.，O′Connell，J.P.and Heller，M.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，1119-1123(在这篇论文中引用)证明受控电场可以用于调节单链和双链寡核苷酸的转运、浓缩、杂交和变性。具有大范围变化的结合强度的寡核苷酸杂合体之间的辨别可以通过简单调节电场强度来获得。
Horejsh等，“A molecular beacon，bead-based assay for the detection ofnucleic acids by flow cytometry，”Nucleic Acids Res.，2005，33(2)：e13公开了另外一种使用珠子的测定形式。在这种情况下，使用微球缀合型分子信标(molecular beacon)的流体阵列系统使用流式细胞仪对溶液中未标记核酸的进行特异性、多路检测。对于这种测定系统，使用生物素-链霉抗生物素蛋白连接将分子信标与微球缀合。
Nikiforov在2001年9月11日授权的题目为“Assay methods and system，”的US 6,287,774公开了一种测定系统，其包含排列在主体结构中的第一通道。所述第一通道与包含具有荧光标记的第一试剂的第一试剂混合物来源、与第一试剂反应以产生与第一试剂具有实质上不同的电荷的荧光标记产物的第二试剂来源、和聚离子的来源以流体方式连接(fluidly connected)。该系统还包括用于将第一试剂、第二试剂和聚离子引入第一通道的材料转运系统，和与第一通道以传感通信的方式布置的(deposited in sensory communication)检测器。将检测器配置成检测在检测区域中的试剂的荧光极化水平。
如上述专利中所引用的，受控动电转运系统在Ramsey的美国专利No.5,858,195中有详细描述。这类动电材料转运和定向系统包括依赖于在施加于所述结构的电场内带电物质(charged species)的电泳迁移率的那些系统。这些系统更具体地被称作电泳材料转运系统。其它动电材料定向和转运系统依赖通道或腔结构内流体和材料的电渗流，其产生自跨越这些结构施加的电场。简言之，在将流体置于通道中时，所述通道具有承载带电官能团(例如在蚀刻玻璃通道或玻璃微毛细管中的羟基)的表面，那些基团能够电离。在羟基官能团的情况下，这种电离，例如，在中性pH下，导致质子从所述表面释放并进入流体，在接近流体/表面界面处产生某种质子浓度，或在通道中的大量流体(bulk fluid)周围产生正电层(positively charged sheath)。沿通道长度施加电压梯度将导致质子层沿着电压下降的方向移动，即，朝负极移动。
2004年5月11日授权的Fritsch等人的题目为“Microfluidics and smallvolume mixing based on redox magnetohydrodynamics methods，”的US6,733,244公开了一种装置，其中将利用磁流体动力学的微流通道用于泵送(pump)非常小体积的溶液。所述通道沿通道壁具有电极，且溶液内携带电流的物质带着电流通过溶液。通过使用携带电流的物质生成的电场与施加于通道的磁场垂直。将这两个场垂直于期望的流动方向施加。电场和磁场的组合致使溶液垂直于两个场流过通道。
应该注意，本装置提供一个电场，其能够使带电粒子(分子)移动经过溶液。所述场不移动溶液本身。另外，所述场不需要是电磁场，也不依赖铁磁原理引起移动。即，此处的场不是简单地用磁铁吸引珠子。这不会引起此处所述的离子移动。
发明概述
以下概述不意在包括本发明的全部特性和方面，也不暗指本发明必需包括此概述中讨论的全部特性和方面。
本发明涉及电场(“e场”)用于有效地将带电物质，如珠子、分子(ATP、酶)、DNA等，沉积到固定的反应物之上或附近的用途。已经发现电场能够将底物和酶浓缩到DNA分子附近并有效地去除核苷酸。在一个设计用于进行热测序的微流装置的实施方案中实施了这种技术。所述装置被设计为可提高从光发生反应中获得的信号的整体质量并改进阅读长度。具体而言，我们证明，可以将核苷酸集中于单链DNA的珠子的附近或将它们从含单链DNA的珠子移开，来提高核苷酸的掺入或清洗。该技术可一般地应用于任何为了高通量分析而需要集中于靶位点或从靶位点移去的带电物质。这种技术使用一种带有直流偏压的交流电场以吸引/排斥核苷酸(带电分子)。改变直流偏压的极性导致核苷酸浓缩到含DNA珠的孔中或从含DNA珠的孔中去除核苷酸。所述偏压通常在约1V以上，但可以高至由介电击穿强度限定的最大电压，其可以是～15-20V或更高。
在某些实施方案中，本发明包含一种装置，其具有至少一个流体通道和被界定为与所述流体通道相通的反应区。所述反应区可以是孔、腔、管或其它物理区域。反应区包含到流体通道的朝向或开口，还包含偏离(offset from)流体通道的底部，所述装置被构建成使流体沿着横穿(transverse to)反应区开口的方向流动，其包含：(a)与底部相邻的第一电极；(b)与开口相邻的第二电极；和(c)在第一和第二电极之间的可控电压源，其可以被控制以向给定的电极提供交变的正电荷和负电荷、和直流偏压，由此通过电极之间的电场引导流体通道中流体中的带电物质进入或退出反应区。
由于所述装置可以在测序或其它注重反应检测的反应中使用，所以所述装置可以进一步包含与反应区耦合的反应传感器用于检测反应区中的反应。这可以是光电倍增管、CCD或其它装置。可以使用光纤进行改进的检测。在反应传感器包含光导纤维面板的情况下，可以自与面板单独耦合的每个反应孔获得改进的灵敏度和特异性。反应传感器包含CMOS光敏元件用于检测低水平的光，并进一步用于定量这种水平。
所述装置可以进一步描述为包含含有珠子的工作流体的微流装置，其中反应区是大小仅可容纳一颗珠子(sized to contain only one bead)的孔。在微流装置中，反应区可以在选自光致抗蚀剂和PDMS的惰性固体聚合物中界定。如果珠子是带负电的，则此处的移动(the present movements)被易化。这些珠子可以是例如聚苯乙烯。珠子也可以是磁性的。
在某些实施方案中，与底部相邻的电极是ITO(氧化锡铟)薄层，厚度小于约150nm。这种电极将是透光的，以便通过反应传感器对反应进行监测。
电极优选包含介电涂层(dielectric coating)。已经发现这样可防止腐蚀并增加电场。介电涂层可以是例如一种或多种
聚-对二甲苯，或氧化硅，或氮化硅。
所述装置可以配置成适合于与另外的电子装置连接并包含合适的流体通道和电极的一次性装置(disposable device)，例如，用于引导带电粒子在液体中移动的装置，其中将所述粒子引导入反应区，其包含：(a)处于反应区中液体的一侧的包覆有介电材料的第一电极；(b)处于反应区中所述液体的相对侧的包覆有介电材料的第二电极；(c)横穿(transverse to)反应区的流体流动通道；和(d)用于信号发生器的连接，所述信号发生器用于向第一电极和第二电极施加交流电压和直流电压，由此电极被构建并排列从而在它们之间产生电场。
本发明还包括用于在微流装置中如上所述移动带电分子物质的方法，其中所述分子物质从与反应区相通的流体通道移动进入反应区，所述方法包括步骤：(a)使带电分子物质在流体通道中沿流动方向流动；(b)提供具有跨越反应区的阳极端和阴极端的电场(an electric field having a positive end and anegative end across the reaction area)；和(c)通过向反应区中的电场施加与分子物质上的电荷相反的电荷(applying a charge to the electric field in the reactionarea opposite to the charge on the molecular species)来引导带电分子物质进入反应区。在这种实施方案的一个方面中，使超过一种分子物质移入反应区，由此引起分子物质之间的反应。在另一方面，一种或多种分子物质已在反应区中，导致带电分子物质和反应区中所述一种或多种分子物质之间的反应。所述电场含有频率为至少100kHz的交流部分(component)，还优选包含直流偏压，其至少可以是1伏特，但通常不是高压。所述方法可以进一步包括反相(reverse)直流偏压的极性的步骤，以引导带电分子物质退出反应区。
附图简述
图1是根据本发明的装置的示意图，其显示了一个带有微加工的孔和ITO电极的光导纤维面板。通过施加跨越这些电极的电势差能够引导带负电的核苷酸朝向DNA珠；
图2A和2B是用于在DNA珠(或其它靶位点)附近集中或自其移开核苷酸(或其它带电分子)的设置的示意图，其中图2B中显示的是一种备选的电极排列；
图3A和3B是显示在50μm孔内电场辅助诱捕(electric assisted trapping)1μm珠子的照片。在图片中显示的4个电极中，关闭电压(3A)，然后在2个电极处施加电压(3B)，而在这些位点观察到粒子的堆叠(stacking)。
图4A和4B是用于显示电场中的荧光染料浓度的实验装置的示意图(4A为透视图，4B为侧视图)；
图5A和5B是显示未被集中的荧光染料(5A)和通过电场被集中的荧光染料(5B)的照片；和
图6是显示因电场导致的增加的化学发光的图片，其使反应区中产生光的酶(light generating enzyme)附近的焦磷酸增加。
优选实施方案详述
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域内那些普通技术人员所通常理解的具有相同含义。尽管与本文所述那些相似或等效的任何方法和材料能够用于实践或测试本发明，但将对优选的方法和材料进行描述。概括而言，如本文使用的、在与生物化学和生物物理学相关的情况下应用的命名法是本领域公知且常用的那些。某些未具体限定的实验技术大体上依据本领域公知的常规方法并如本说明书通篇所引用和讨论的概括的和更具体的参考文献中所述来进行。出于清楚的目的，下文对以下术语进行定义。
术语“微流装置”按常规含义使用，将其理解为所述装置优选用于并有利于小反应体积和液体流速。概括而言，反应孔应不大于100nL，并且可以小达1pL。在下文描述的一个优选实施方案中，它们的直径是35μm。所述装置将包括液体流动通道使缓冲液和反应物流入反应孔。反应孔可具有可容纳单颗带电珠子的大小。反应孔通常是任何如下所述的界定的空间，反应物被聚拢在其中，并且其位于流体通道的直接流动之外(located out of the directflow of the fluid channel)，除非装置被配置成借助下述方式引导反应物进入反应区或者退出反应区：对电极充电而提供场，该场吸引带电物质进入孔中或将带电物质排斥到孔外。
术语“横穿”(transverse)按照常规含义用于表示交叉的(crosswise)，优选为但不必需为正交(perpendicular)。
术语“电场”用于意指因空间体积中或围绕空间体积的介质中电荷(如电子、离子或质子)的存在而产生的作用。基于叠加，每个电荷分布在一个点处对整个场起贡献。置于空间体积中或在周围介质中的电荷具有施加于其上的力。电场通过电压的差产生：电压越高，产生的场将越强。相反，磁场在电流流动时产生：电流越大，磁场越强。电场即使在没有电流流动时也存在。电场以伏特每米度量(V/m)。为了在方便的时限内，在本方法和装置中引起带电离子的移动，电场强度应为大约5V/cm或更高，高至焦耳加热的可实行限值和介电击穿限值，最大上限值为大约1000V/cm。
作为高强度电场的实例，注意到作为偶极的水可以通过电场进行部分排列，并且这可以通过用静电源使水流移动来容易地显示。非常高的场强(5x109V m-1)使冰中的水重新定向，从而抑制结冰。
通用方法和设备
下文描述的是用于由电场引导的带电分子的集中(concentration)和清洗(washing)的设备和方法。
先前的电泳集中技术依赖于法拉第电流将带电物质集中在电极部位。这通常导致在电极处发生的电解反应和电解产物(如氧和氢)的生成。本方法使用通过电极的电容耦合的位移场而非通过电极的法拉第电流。
本文使用的电场基于公认的电容原理。在将不同电荷的两个平板置于彼此附近时，如在平行的平板电容器中，平板之间的两个E场加成而平板之外的E场抵消。当平板彼此靠近形成电容器时，在整个电容器内部平板之间的E场是恒定的，只要E场不是靠近平板边缘。由于电场是电势梯度的负数，且E场在电容器内部是恒定的，所以电场的强度E与平板之间的电压V和它们的间隔d的关系非常简单。
式1
通过将薄绝缘材料(电介质)置于平板之间，可以使间隔d减小，由此增加电容器的电容并防止平板接触。
位移电流是与变化的电场相关的量。其发生在介电材料中，也发生在自由空间中。
位移电流在数学上定义为电位移场D(已知物理术语，也称为电场/通量密度)的变化率：
式2
其中D＝εE，其中介电常数ε＝ε0εr，并且其中
·εr是电介质的相对介电常数，而
·ε0是自由空间的介电常数(8.854E-12Fm-1)。
在本装置中，响应于所施加的跨越电极的直流电压，在电极处产生双电层，其屏蔽施加在电极处的电压。因此，由于双电层的屏蔽，跨越电极的直流电压在通道主体中不产生电场，并且需要法拉第电流以实现集中。然而，如果以比离子形成双层所用时间更快的时程切换跨越电极的电压，那么屏蔽作用变得可以忽略，电场在跨越整个通道的宽度上都存在。对于一种典型情况：10mM离子强度电解质、10nm的厚电双层，且电极之间间隙为～100μm，需要的交流频率是～100kHz。本方法使用交变场，其以～500kHz或更高的频率变化，并带有净直流偏压以实现跨越电极没有任何法拉第电流的净电场。
如果单独施加横跨流体流动通道的直流电压，则通道的一个表面附近的电压将被距离通道壁约10nm内的双电层所屏蔽。因此在通道的全部剩余宽度上(距离该壁超过～10nm)，电场大部分将为零。如果只施加交流电压——它的切换比离子响应时间(～0.1ms)更快——则该电场的作用将同等地施加在整个通道中。然而，平均电场仍将为零。在既有直流又有交流电压(both DAand AC voltage)的情况下，在整个通道上存在时均直流场(time averaged DCfield)，从而产生一个力E，其在通道一侧较高，而随着与该侧的距离增加而下降。
作为进一步的阐释，可以说(不希望受到任何理论的限制)本方法和装置采用了一种特定类型的动电作用(electrokinesis)。动电作用是指由电场作用于电解质溶液中带电物体周围的可移动离子所引起的一类现象。当具有给定的表面电荷的物体浸入含离子的溶液中时，形成一种弥散的离子云而遮蔽物体的表面电荷。这种由与浸入的物体伴随的由(固定)电荷构成的遮蔽云以及溶液中的一层(移动的)反荷离子构成的排列，称作“双层”。在这个小而厚度有限的区域中，流体不是电中性的。因此，作用于该区域的电场将激发弥散层的离子的运动，而这些离子将继而带走(entrain)周围的流体。产生的流场反映了流体中离子电流的空间分布。电渗是动电现象最简单的例子。其发生在平行于呈现固定表面电荷的样品容器或电极表面施加电场时，如在氧化硅电极的情况下(在中性pH范围内)。当电极双层中的反荷离子被电场加速时，它们拖动溶剂分子并引发(set up)主体流体流动。这种作用在窄毛细管中非常显著，可以有利地用于设计流体泵送系统。
电泳是一种相近的现象，其是指的浸入电解液的带电粒子在场诱导下的迁移。与电渗一样，电场加速粒子双层中的运动离子(mobile ions)。如果与之前的情况相反，粒子本身是运动的，那么其将会通过反方向移动来抵消这种场诱导的离子运动(和产生的离子电流)。电泳通常在凝胶或具有牢固网孔(solid mesh)的介质中进行，所述凝胶或介质将基于某种因素(例如，大小)来阻碍离子粒子。如下文所述，本文预期粒子将处于液态流体中而没有阻碍性的凝胶或固相存在。
现在参考图1，其中示出了具有孔100的微流装置，孔100限至在SU-8光致抗蚀剂层110内，该装置还包括电极112，其间隔地位于层110上方(spaced above layer 110)并在各孔间延伸，从而在电极112和光致抗蚀剂层110之间界定出流体流动通道(如116所示)，电极112与各孔相通。流体通道的深度优选为100μm的量级，这是由于本装置特别适合于10μL的体积。层110为成孔(well-forming)层(即，一种图样化以界定反应区的至少一部分以及流体流动通道的层)。该层由光致抗蚀剂界定以方便在亚微米尺度进行制造。优选的是在孔中实现高的长宽比(例如，d/w＞5∶1)。换句话说，反应区或孔(因蚀刻)偏移(offset from)通道一定深度，并且是具有一定(相对窄的)宽度或直径的空腔。珠子可以流经流体流动通道并流入各孔中。第二电极114位于成孔层110下方，其界定了孔的底部。在孔已经(以蚀刻或模制方式)形成于层中的情况下，电极暴露于孔中的流体和物质，其中流体与物质是在所示箭头116处进入装置的。电极112和114优选由ITO(氧化铟锡)形成约100nm厚。如图1进一步所示，这些电极形成了基本上平行的片层(sheets)，其间夹有所述流体通道和孔。
值得注意的是，由氧化硅或Parylene或氮化硅构成的～100nm厚的介电层被涂施于电极，例如涂施于ITO层之上，如图2(204和206)所示。进一步如图1和图2A和B所示，电源118(图1)连接各电极并充电，使得，就如下文中详述的那样，顶部电极112为负极，底部电极114(在孔的底部)为正极，以便驱使粒子(原子、分子、珠子，等)进入各孔中。在这里使用术语“顶部”和“底部”是为了方便起见，装置可以根据重力或使用时的取向以各种方位配置。
再次参考图1，顶部电极112被涂施于基底120上，基底120由例如硼硅酸盐玻璃或石英制成，顶部电极112借助任何蚀刻或切削加工结构(如光致抗蚀剂层中的台阶(step))，间隔地位于成孔层110上方。
在一个示例性方法中，含有连接在表面并向外延伸的DNA分子的珠子122，如图所示，装在孔100中(每孔一个珠子)。寡核苷酸是以本领域已知的方式连接于珠子的(参见相关专利和出版物)。这些珠子已经藉由流体流动116被传送至孔区域，并在电场(经孔上方和下方的电极112和114实现)或磁体的帮助下进入各孔中。施加电场来驱使带负电荷的分子(如124处所示)移向珠子并进入各孔中。这些分子可以是核苷酸、酶或其他带电的种类。这些分子在合适的缓冲液中传送，并引起与珠子上的DNA链的可探测到的反应。优选用低浓度(～10mM)的Tris-乙酸盐(Tris-Acetate)或Tris HCl作为缓冲液。
在一个实施方式中，带电的分子是核苷酸，它们被掺入多核苷酸，并在反应区生成无机含磷物质(inorganic phosphorous)，后者被用来生成可探测到的光信号(如焦磷酸测序(pyrosequencing))。相应地，光导纤维面板126贴附到薄的透明电极114上，该电极，带有任何介电涂层，形成了反应区的底部。电极对于要收集的光而言是透明的。光导纤维面板126可以来自市购来源，如来自Schott North America，Inc。光导纤维面板由一束平行排列并垂直于孔100底部表面的融合纤维构成。以这种方式，光高效地从每个单独的孔100传播至光传感器，如耦合至光导纤维面板、在每个孔下面带有传感区的CMOS传感器128。众所周知，CMOS(表示互补金属氧化物半导体)成像器包括光敏二极管的阵列，每个像素内一个二极管。但是与CCD不同的是，CMOS成像器中的每个像素具有自己单独的集成在内部的放大器。由于每个像素具有其自己的放大器，所以这种像素称为“有源像素(active pixel)”。CMOS探测器128中的阴影区对准各单个孔，并从该孔接收最多的光，也只从该孔接收光。每个孔都与一个单独的CMOS探测器元件耦合。
构建装置，使各孔100与CMOS传感器像素几乎完美对准，是为了利用CMOS像素的全部容量(capacity)和实现最佳可能的覆盖(coverage)，这对改进系统的通量来说是必要的。然而，这不能用使面板中的纤维与像素对准来实现，这是因为在可获得的纤维面板中的图样中存在不规则处(irregularities)。避免直接对齐的最便利的方法是使用光导纤维，其尺寸远远小于各孔和CMOS像素。使用这种面板防止面板与像素和各孔的对齐问题的发生。但是像素和孔确实必须是对准的。这可以通过固定图像传感器的位置和在X和Y方向上使用两个微米调节器得到含孔的微流平台的完美对齐而容易实现。这种方法可以通过手动或通过更复杂的步进电机机制来实现。每次运行前，在存在ATP或PPi测定的校准量时，用来探测完美对准的校准度量可以设为穿过整个图像传感器区的总共的光载流子量(amount ofcollective photocharge)。如果没有良好对齐的话，光信号就会在各个CMOS像素之间的区域上有损失，但是随着对齐越来越好，损失的光子通量也会减少。最大光强度指示完美的对齐。微流板和CMOS传感器板的自动调节可以通过应用压电调节来实现。在这种技术中，微流板保持器将配备有单个或多个压电致动器。一旦将板插入保持器中，来自CMOS输出的反馈就能激活压电致动器以每次将板移动至单个位置上。发明人的计算表明2N的力应足够移动板使其对准。能产生该力的压电调节器可以市购得到。这还已经表明为μm级内的对齐可以使用这种技术来实现。就光效率而言，孔的最好位置会是离面板尽可能近的位置。因此，经由沉积和将一层SU-8图样化在面板顶部，本文的孔正好构造在面板的顶部。基于发明人的模拟，通过这种直接耦合可以将光效率从1.6％显著提高到大于90％。
图2A为进一步显示本发明装置和技术的示意图。在这个实施方式中，将氧化铟锡(ITO)电极材料(～150nm厚)涂施(112和114，如图1所示)在标准玻璃片200、202上，以便在通道中施加横穿流动方向的电场。透明的ITO电极进一步涂覆有介电薄层204、206(～20nm)，如Parylene或氧化硅或氮化硅(如图2中的图样所示)，以防止由于电解造成的电极腐蚀的发生和促进(facilitate)电位移场。这样，流体通道具有一个涂覆有介电层的表面(其与流体接触)和带有电极部分的相对表面，其中所述电极部分也涂覆有介电层。Parylene一个统称，适用于未取代的和取代的种类。Parylene N和SCSParylene HT具有特别高的介电强度和不依赖于频率的介电常数，可能是优选的。关于介电材料的进一步描述参见US 4163828，Mahoney，1979年8月7日授权，标题为“Parylene stabilization”。
在图2B中示出了电极排列的一个变化方案。在这个实施方式中，如图2A中所示的位于202处的玻璃层适于CMOS制造工艺，在该工艺中CMOS传感器正好置于孔的下面和透明层117的下方。孔电极优选涂覆有介电层(未示出)，但是由一组布线115、115a中的一个或两个形成，或者由成孔层下方的、沿着孔一侧的、位于底部部分的电极条119形成。在俯视图中，布线和电极会是栅格的形式，在每个孔的底部部分的周围靠近传感器处形成正方形。这使得在CMOS传感器像素尺寸的量级上制造各孔成为可能。例如，如果每个孔(像素)为一个20μM的正方形，可以用布线直径约为1μm的单根或双根布线来形成栅格，并产生脉冲以提供AC和DC电荷(charge)。布线邻接孔的底部排布。电极也置于孔的侧壁内，部分地延伸到孔的底部，如图115和115a处所示。同样地，如果认为“像素”是孔底部的一部分，其中孔与传感器光学接触，则像素的四条边被电极所界定，在此处电极为一组金属条，每个金属条大部分在孔的侧壁内，但是稍许延伸至孔的底部。这些金属布线115和金属条119连接至电源，并以如上所述的方式工作。
含有流动通道及用于DNA珠子的各孔的流动结构形成在SU-8(～200μm厚)中。PDMS/硅橡胶垫片(gasket)也可用来产生流动通道。ITO-介电层涂覆的玻璃片形成流动通道的顶部和底部。如图1中所述，珠子122位于含有带电粒子124的流体介质中的孔中，电源连接电极从而引起了粒子朝向或背离孔和孔中的珠子122移动，珠子具有贴附其上的反应物，如与核苷酸124反应的寡聚核苷酸。
常规的光刻技术可以用于SU-8图样化。这种制造SU-8的方法已经经过测试并在Stanford纳米器件加工装置上得到验证。SU-8加工能用来制造长宽比(aspect ratio)大的孔，这对减少相邻珠子之间的化学串扰而言是很关键的。即，反应区应当完全容纳珠子。
在给出上述描述本发明装置优选实施方式的条件下，很明显各种备选构造都是可能的。尽管没有示出，但是可以想到在一个实施方式中，每个孔都可耦合到单独受控的电极对上，在同一时间，不同的孔可处于带电物质受到吸引或排斥的不同状态。
电极可以由各种透明的导电层制成，例如金属氧化物如氧化铟锡(ITO)、锑掺杂的氧化锡和锡酸镉(氧化镉锡)，其中每种都常用作光电装置(如液晶显示器)中的透明电极。出于光学探测的目的，电极是透明的。在以热或电方式测量反应的装置中，电极无需为透明的。例如，装置可用于电探测结合反应。参见US 5,284,748，Mroczkowski等人，1994年2月8日，标题为“Method for electrical detection of a binding reaction”。伏安免疫测定法可以通过用电活性物质标记一种免疫反应物来进行。Pace，美国专利号4,233,144，1980年11月11日授权，解释了一种这样的技术。另一种方法涉及将抗原-抗体层夹在两个导电层之间并测量所得叠层的电容。Giaever，美国专利号4,054,646，1977年10月18日授权，记载了这样一种方法。电容测量系统的另一种类型包括一对电极，这对电极涂覆有基底并浸入含有特别与基底结合的物质的介质中，正如Arwin，美国专利号4,072,576中所描述的。
成孔层可以由任何惰性材料形成。光刻技术可以用来将层图样化入一系列流体通道和反应区中，例如US 6,960,437，Enzelberger等人，2005年11月1日授权，标题为“Nucleic acid amplification utilizing microfluidicdevices”中所记载的。如此文中所述，微流装置至少部分由弹性材料构成，并且通过单层和多层软刻蚀(MLSL))技术和/或牺牲层包封方法构成(参见，例如，Unger等人，(2000)，Science 288：113-116和PCT公开WO01/01025)。利用这些方法，微流装置可以如此设计：其中流经装置的流动通道的溶液至少部分地利用一个或多个控制通道控制，该控制通道通过弹性膜或片段与流体通道分隔开。更具体地来说，一些制造方法涉及通过用光致抗蚀剂的光刻技术初期制造硅晶片上的用于顶部层(具有控制通道的弹性层)和底部层(具有流体通道的弹性层)的母模(Shipley SJR 5740)。通道高度可以受到旋涂速率的精确控制。光致抗蚀剂通道通过将光致抗蚀剂暴光于UV光并接着显影而形成。热回流工艺和保护处理如先前所述的那样进行(M.A.Unger，H.-P.Chou，T.Throsen，A.Scherer和S.R.Quake，Science 288，113(2000))。
光致抗蚀剂物质可以旋涂或喷涂至基底如硅晶片上，或者作为膜或丝网应用至晶片上。市购的干燥膜状光致抗蚀剂物质包括：丙烯酸基物质，例如从Mitsui(日本)以商品名Ordyl PR132购得的物质；环氧基物质，例如从E.I.DuPont de Nemours and Company Corporation(Wilmington，Del.)以商品名RISTON购得的物质，或者从MicroChem Corporation(Newton，Mass.)以商品名SU-8购得的物质，(或者例如Lexmark International，Inc.(Lexington，Ky.)内部使用的专利物质，内部称为GSP920)；以及聚酰亚胺基光致抗蚀剂物质，例如从HD Microsystems(Parlin，NJ.)以商品名HD4000购得的物质。
在将光致抗蚀剂物质应用至晶片基底的流体侧上之后，通过掩膜使光致抗蚀剂物质曝光于光化辐射如紫外(UV)光以使光致抗蚀剂物质图样化，以便在显影光致抗蚀剂物质时提供流体通道在光致抗蚀剂物质中的位置。然后，通过用显影化学试剂将未固化的物质从晶片的流体通道/孔区域溶解，显影得到图样化的光致抗蚀剂物质。显影化学试剂可以选自四甲基氢氧化铵、二甲苯、脂肪烃、碳酸钠和乙酸2-丁基乙氧乙酯(BCA)。进一步细节参见US7,043,838，Smoot等人，2006年5月16日授权，标题为“Process formanufacturing a micro-fluid ejection device”。
一种用于核苷酸预浓集(preconcentration)/清洗的通用测定规程如下所述：
1.首先以DNA珠子填充流动通道。
2.用ITO介电玻璃片从顶部密封流动通道。
3.接着用含核苷酸的溶液填充流动通道。
4.将ITO电极连接到高频AC源，并且跨越通道施加高频方波脉冲(V峰～5-7V，＞100kHz)。即，电源118向电极112、114提供AC场，电极114仅在孔底部是有效的。AC场在2至20伏、优选5至7伏范围内，并且频率在约10kHz至约10MHz的范围内，优选为大于100kHz。
高频AC场消除了在电极-液体界面处形成的双电层的作用。如果没有AC场，双电层会屏蔽施加在电极间的DC电压，这样在通道内部就不会有DC电场。
5.将小DC电压(～1.5V)叠加在存在的AC电压上，该DC电压也来自电源118。根据DC场的极性，核苷酸或者浓集在DNA珠子附近或者被各孔中的DNA珠子排开。
本装置可以用于广泛多样的测定法。优选的测定法包括涉及核苷酸转运的那些。这些测定法包括：
引物延伸/降解测定法
在这种测定法中，通过将dATP结合到ssDNA中来检测蛋白质制备物中的末端转移酶活性。典型的流程包括：将130nM TdTS或130nM TdTL在200nM二甲胂酸钾、25mM Tris-HCl，pH 6.6、0.25mg/ml BSA、4mMMgCl2、4μM ZnSO4、5％甘油、1mM dATP和20nM 5′-32P-标记的(dA)10引物中在35℃温育。使用同一测定法在缺乏dATP的条件下查找蛋白质制备物中的3′5′核酸外切酶活性。在第0、5、15、30和60分钟取等分试样，补充以甲酰胺染料混合物，并在16％丙烯酰胺变性凝胶上进行电泳。在将湿胶在Kodak胶片(Biomax MR)下于-70℃曝光之后使产物显像。参见See TheJournal of Immunology，2004，172：6764-6767.“Evidence That the Long MurineTerminal Deoxynucleotidyltransferase Isoform Plays No Role in the Control ofV(D)J Junctional Diversity.”。
DNA的克隆分析，或复用分析
这种测定法使用具有多个反应区的装置，其中每个反应区被设计成可容纳一颗且仅可容纳一颗珠子的孔。使用本领域已知的方法使DNA分子附着在电中性的珠子上，每颗珠子一种DNA。可以用于珠子的中性材料的实例包括玻璃、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、
珠(交联的多糖琼脂糖，GEHealthcare的商标权)、琼脂糖的其它形式、胶乳等。此外，可以使用磁珠，如实施例3中所示例的。由于附着DNA或其它分子的过程是不完全的，所以这将导致两组珠子，一组带有DNA，而一组没有DNA。将两组都放入流动通道，并向孔施加带有直流偏压的交流场。由于DNA带负电，这将导致含DNA的珠子被捕获在孔中，而裸珠则流过，由此将它们洗去。这样在装置中产生DNA包覆珠子的富集群体。然后可以使用本领域已知的技术扩增珠子上的DNA。DNA包覆的珠子可以是多种已知的珠子材料并且直接与DNA(或RNA)的寡核苷酸或多核苷酸相连，然后这些DNA(或RNA)寡核苷酸或多核苷酸通过充当测序模板或通过充当用于附接其它多核苷酸的探针等进行进一步加工。可以将珠子用链霉抗生物素蛋白包覆并与生物素化的DNA/RNA连接，或将珠子以本领域技术人员已知的多种的方式进行配置。
在此实施方案的一个方面中，用条形码为珠子编码。条形码是用于唯一性地检测一个分子的一种特殊标记。条形码可以是本领域已知的任何类型的条形码，包括但不限于光学标记、荧光标记、电响应标记和一组质量不同的标记。使用取决于条形码类型的方法来解码条形码，所述方法包括但不限于质量、电、视觉、荧光和核酸检测。这样能够鉴定每个反应区中的DNA。
如此，这种方法允许将一组珠子引入流动通道中，这组珠子中仅有一些含有要分析的分子(例如，DNA)，其中含有分子的珠子含有不同的分子种类(例如，不同的DNA序列、不同的蛋白质等)。将珠子随机放入孔中，并通过条形码编码来鉴定。分子仅需要响应存在的E场。如图5中所示，甚至某些染料也响应，以及蛋白质和核酸(DNA、RNA)也是。
复用分析在多个孔中进行，其可以是大约数百或数千个不同的孔。可以利用不同的流体通道寻址每个孔(或孔的子组)。一旦将靶分子引导进入单独的孔中，就将反应物特异性地寻址到那些分子进行化学分析。如上所述读取结果，并且分析可以进一步包括去卷积(deconvolute)条形码以识别靶分子。本文灵活地(loosely)使用术语“条形码”来指代与靶分子直接地或通过固相支持体如珠子相关联的独特分子(如寡核苷酸或磁性颗粒)。更多细节可以在例如2001年7月17日授权的、题为“Fixed address analysis of sequence tags.”的Lizardi等人的US 6,261,782中找到。其它能够依据本方法使用的标签包括分子或金属条形码、质量标签，和可通过核磁共振、电子顺磁共振、表面增强型拉曼散射、表面细胞质基因组反响(surface plasmon resonance)、荧光、磷光、化学发光、拉曼共振、微波或其组合检测的标签。质量标签是在质谱中具有区别性质量特征(distinctive mass signature)、或为标记的组分提供在质谱中的区别性质量特征的化合物或成分(moiety)。治疗标签在使用质谱进行检测时有用。优选的治疗标签是肽、核酸和糖。也可以使用标签的组合。例如，具有例如265种独特标签组合的颜色编码微珠可用于区别多种组分。例如，可以独特地标记和检测256种不同的连接物-检测物(ligator-detector)，使得所公开的方法能够复用和自动操作。
聚合酶链式反应
这种标准测定法检测DNA分子中界定序列的存在，所述序列与一对寡核苷酸引物互补。通过加入加热元件，PCR反应可以在例如图1中所示例的装置中进行。PCR在例如基本专利中有述，所述专利如美国专利No.4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188。1996年4月30日授权的、题为“Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of longDNA sequences，”的Cheng的US 5,512,462描述了通过聚合酶链式反应(PCR)扩增长于10kb的DNA序列的方法和试剂。所述方法使用由来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的主要热稳定DNA聚合酶与较少量的来自海岸热球菌(Thermococcus litoralis)、火球菌属菌种GB-D(Pyrococcus species GB-D)或海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的、拥有3′到5′的核酸外切酶活性的次要热稳定DNA聚合酶组成的组合物。
本方法也可以应用于多种通过合成进行DNA测序的方法。
热测序
本文描述的焦磷酸方法是一种通过合成进行的测序。参见Ronaghi等，″ASequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate，″Science，281：363 365(1998)和Hyman，″A New Method of Sequencing DNA，″Anal.Biochem.，174：423 436(1988)。
如Ronaghi，“Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing，”GenomeResearch Vol.11，Issue 1，3-11，January 2001中所述，热测序是一种以检测DNA合成过程中释放的焦磷酸(PPi)为基础的DNA测序技术。在一连串酶促反应中，产生与结合的核苷酸数成比例的可见光。这一连串反应始于核酸聚合反应，其中因通过聚合酶进行的核苷酸结合而导致无机PPi的释放。释放的PPi继而由ATP硫酸化酶转化成ATP，ATP为萤光素酶氧化萤光素并生成光提供能量。由于加入的核苷酸是已知的，所以能够测定模板的序列。所述核酸分子可以是RNA或DNA。然而，由于对于有限的核苷酸延伸DNA聚合酶与RNA聚合酶相比显示出更高的催化活性，所以集中针对引物DNA模板(primed DNA template)用于热测序的用途作出努力。标准热测序使用大肠杆菌DNA Pol I的Klenow片段，其是相对缓慢的聚合酶。热测序中使用的ATP硫酸化酶是来自酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的重组形式，而萤光素酶来自美洲萤火虫Photinus pyralis。从聚合到光检测的全部反应在室温下发生于3-4秒之内。热测序反应中的1pmol DNA产生6×1011ATP分子，其继而在560纳米的波长生成超过6×109个光子。这种量的光可简单地通过光电二极管、光电倍增管或电荷耦合器件(CCD)相机检测。有两种不同的热测序策略：固相热测序(Ronaghi等1996)和液相热测序。固相热测序利用先前描述的三酶系统中的固定的DNA。在此系统中，在每次核苷酸添加之后进行清洗步骤以去除过量的底物。在液相热测序中，引入腺苷三磷酸双磷酸酶，一种来自马铃薯的核苷酸降解酶，从而成为四酶系统。这种酶的加入消除了对固相支持体和中间清洗的需要，由此使得热测序反应能够在一个试管中进行。
尽管在使用天然核苷酸方面是有利的，但是焦磷酸方法需要将聚合酶同步化在DNA链上，已知这会限制序列阅读长度。同样，预期所述检测方法无法接近单一分子敏感性，原因是在所述流程中由萤光素酶产生的光的有限的量子效率。此外，整体测序速度受到必要的清洗步骤、后续的目的为鉴定焦磷酸存在的化学步骤的限制，也受到用全部四种碱基相继测试要测序的每个碱基对所需的固有时间的限制。在精确测定序列中同型核苷酸序列段(stretch)中的困难也是公认的。
使用上文所列的DNA、核苷酸、PPi和酶的动电现象的本方法为热测序提供了显著的改进。反应物更好地流入孔中，解决上文列出的关于同步、阅读长度和速度的潜在问题领域。
引物延伸
如2003年9月2日授权的、题为“Sequencing by incorporation”的Parce等的US 6,613,513中所述，通过合成或结合进行的测序通常都涉及将核苷酸或核苷酸类似物加入包含核酸模板和引物的反应混合物，例如，DNA或RNA。将核苷酸掺入引物，产生延伸的引物。随着每个附加的互补核苷酸并入引物而使序列得到测定，并重复这些步骤直到整个模板序列或其部分得到测定。
在本方法的一个实施方案中，核苷酸或核苷酸类似物，或其部分，包含3′-封闭基团和可检测的标签模块，所述模块通常包含磷酸或氨基甲酸基团。3′-封闭基团提供可逆的链终止。当添加至生长中的核酸链时，这些核苷酸类似物导致不能延伸的引物。通常将3′-封闭基团去除，例如通过还原剂和/或磷酸酶，以产生可延伸引物，向该可延伸引物添加更多的核苷酸，由此允许对核酸模板的持续测序。3′-封闭基团的去除任选在检测添加的核苷酸之前或之后进行。
在本方法的另一实施方案中，核苷酸或核苷酸类似物包含荧光标签。使用荧光核苷酸通过合成进行的测序通常包括在检测添加的核苷酸之后光漂白荧光标签。光漂白包括施加光脉冲，光脉冲破坏核苷酸(例如，已经添加至引物的荧光核苷酸)的荧光或将其降低至可以接受的水平，例如，背景水平或降低至足以防止信号经过几个测序循环而积累的低水平。
已经开发了与末端核苷酸相关的使用染料或荧光标签的相关方法，其中序列测定也通过凝胶电泳和自动荧光检测器来进行。例如，最近已将Sanger延伸法修改用于自动微型测序系统中，其仅需要亚微升体积的试剂和染料标记的三磷酸双脱氧核糖核苷酸。在Soper等的美国专利No.5,846,727中，荧光检测在芯片上进行，所述芯片具有一个将激发光传送至毛细管通道的单模光纤，和另一个收集荧光光子的单模光纤。估计序列读取在400至500个碱基范围内，这相对于用传统Sanger或Maxam-Gilbert方法获得的序列信息量没有显著改进。另外，Soper方法在开始分离反应之前需要PCR扩增模板DNA，并对寡核苷酸测序“梯子”进行纯化和凝胶电泳。这些系统都需要大量目标DNA。即使是Cheeseman的美国专利5,302,509中描述的方法，其不使用凝胶电泳进行序列测定，也需要至少一百万个DNA分子。
另外，可以使目前的电场设备适合用于涉及蛋白质和其它蛋白质之间或蛋白质和小分子之间的接触的测定法。例如，可以将固定的酶与底物(含或不含抑制剂)接触，由此使底物和任何抑制剂作为带电粒子存在于溶液中。施加的E场使反应物朝着酶移动以缩短过程时间。类似地，可以按照公开的方法设计使用固定在微量滴定板上的捕获抗体的免疫测定形式，从而改进带电试剂(抗原、标记的抗体)朝向或离开捕获抗体的流速。
实施例
实施例1：将珠子集中到电极孔中
在本实施例中，示例了在50μm孔内由电场辅助诱捕1μm荧光聚苯乙烯珠。如图3中所示，制备了四个电极孔。孔使用一侧带有粘合剂的150μm厚Mylar片层(sheet)制成。将电极加工在印刷电路板上，且每个电极能够通过施加跨越该电极和主体溶液的电压来单独地激活。80μm厚的电流传导性Nafion膜形成了孔的底部，并且使电极与含有珠子的溶液绝缘。
将一个多输出式计算机控制的电源(multi-output computer controlledpower supply)(Labsmith，HVS 3000D)用于单独激活电极。使用立式Nikon落射荧光显微镜进行成像。通过将母液在10mM Tris-HEPES缓冲液中稀释10,000x制备珠的溶液。然后将珠的溶液注入电极之上3cm长、5mm宽的流动腔中。跨越电极和主体溶液施加～75V/cm的额定直流电场，珠子继而在不到10秒之内被诱捕到孔中。电压仅施加在四个电极中的两个上，并在这些激活的电极部位处的Nafion膜上观察到颗粒堆叠。在此实施方案中，存在将珠子引导至孔内的膜的直流电流。在下文描述的实施方案中，在电极上存在介电层，其阻止这些直流电流。因此，那些实验需要来自交流和直流电压的组合的位移电流。
实施例2：电场引导的荧光物质的预浓集
现参考图4，其示例了用于说明电场引导的带电分子移动的原型装置。该装置包含一层250μM厚的硅垫片材料410，在该层中具有1mm直径的孔。将其置于20nm聚对二甲苯介电层408上，聚对二甲苯介电层408已经放置在1 in.x 3 in玻璃片404上的150nm ITO层406上，形成“底部”。为了形成“顶部”，将另一玻璃片414类似地用ITO层415包覆以形成电极，且聚对二甲苯层417位于顶部电极的“底部”一侧与流体接触，流体可以容纳在孔412中，孔412在两个片包夹到一起时形成。
将Coolsnap fx-16 CCD照相机，Olympus IX70落射荧光显微镜成像装置416布置在流体孔之下。使用导电铜带将电极与信号发生器连接。
将含有500nM Alexa-Fluor 488荧光染料(Molecular Probes)的10mMTris-HCl溶液按照以下流程置于孔中：将导电铜带与玻璃片上曝露的ITO层连接。将硅垫片置于底部玻璃片上并且对玻璃片按压以形成密封。用荧光染料溶液填满垫片中的1mm孔。将第二片玻璃片置于垫片顶部以密封含荧光染料的孔的顶部。控制信号发生器402操作，以跨越玻璃片上的顶部和底部ITO电极(即，孔上和孔下)提供5V交流峰峰值、500kHz频率。跨越底部和顶部玻璃片施加偏压VDC＝1.5V以实现将荧光Alexa-Fluor分子预浓集在孔底部附近。
结果示于图5中。在图5B的照片中可见，当在玻璃片之间施加+1.5V直流电压和交流电压时，荧光染料集中在孔底部附近。在仅施加交流电压或仅施加直流电压时，未观察到预浓集(5A)。如上所述，本装置在此使用位移电流(或交流场，参见上文的式2)来防止在液体-电介质界面形成双电层，双电层将使一个表面附近的场集中(concentrate the field near one surface)。双电层通常会屏蔽施加的整个直流电压，在主体液体中将不存在电场。因此，主体溶液中的离子不会经受任何电场。通过施加高频交流场，双电层的影响消失。因此，当施加带有直流偏压的高频交流电时，有可能在主体液体中具有净电场。交流场使因双电层产生的电压屏蔽作用瓦解，而直流偏压在溶液中产生净电场。这个系统的一个优势是系统中不需要法拉第电流(引起电解)来实现预浓集。
实施例3：电场引导的焦磷酸的预浓集
基本上如图4中所示构建了一个装置，有以下不同：代替照相机和显微镜，将磁体和Hamamatsu光电倍增管布置在孔412之下，如图4中416处所示。
流程如下：将导电铜带与玻璃片上曝露的ITO层连接。将硅垫片置于底部玻璃片上并且对玻璃片按压以形成密封。用含酶的磁珠装填垫片中的1mm孔。将磁体置于玻璃片下以使磁珠保持静止。用焦磷酸盐溶液注满垫片中1mm的孔。将第二片玻璃片置于垫片顶部来密封含化学品的孔的顶部。化学品如下：焦磷酸盐溶液、装载有ATP硫酸化酶的磁珠和萤光素酶(获得自454 Life Scineces)。
在顶部和底部ITO片之间施加峰峰值5V、500kHz频率的交流电压。在底部和顶部片之间施加偏压VDC＝1.5V以实现将焦磷酸分子预浓集在孔的底部附近。
图6显示了跨越通道施加或未施加直流偏压时的光电倍增管的输出。当施加直流偏压时，来自化学发光反应的光信号增加，原因是酶珠附近的焦磷酸盐浓度增加。当去除偏压时，背景光信号降回到原始水平。当在片之间施加+1.5VDC电压时，来自酶促反应的光信号因焦磷酸分子预浓集到孔底部酶珠附近而增加。当仅施加交流电压或仅施加直流电压时，观察不到预浓集。在本实施例中，使用磁珠固定酶，并且在下方有将珠子保持在适当位置的磁体。当施加纯交流场时，不存在预浓集，因为主体液体中的净电场为零。当仅施加直流场时，双电层屏蔽了施加的电压，因而主体液体中的离子仍然不经受净电场。
实施例4：电场引导的热测序
为了在微流芯片上进行热测序，优选在反应孔中分离各个珠子。
为了定位光信号并产生高强度发光，将检测酶(萤光素酶和ATP硫酸化酶)固定在用羧酸官能化的0.5μm聚苯乙烯珠上。首先使用N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(DEC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将珠子上的羧酸转化成胺活性的NHS酯。用于将配体与珠子耦合的多种方案在“Particulate solidsupports functionalized with EGTA ligands，”US 6,551,515中给出。然后这些NHS酯参与用酶表面上的氨基基团形成酰胺键。通过采用两步式明确界定的固定化策略来最小化酶中关键残基的损失。这些相对透明的聚苯乙烯珠远小于454使用的2.8μm不透明的磁珠(Margulies等，2005，cited under″ParticularPatents and Publications″)。因此，结合容量显著增加，并且将产生更高的每体积固定材料的酶单位量。另外，由珠子上的羧基基团提供的负电荷和酶上的净负电荷(对于萤火虫萤光素酶和ATP硫酸化酶PI分别为6.2-6.4和5.3-5.7)在7.5的热测序pH下，将为珠子提供有效的负电荷。
然后通过电场(e场)的使用将这些带高电荷的珠子沉积在孔中。为了在芯片上实现e场，将通过沉积如图1-2中所示的ITO薄层(～0.1μm)而加工的透明电极用在光导纤维面板和流体腔的顶盖上。
跨越包覆的电极施加～1V电势差以避免任何电解反应并实现～100V/cm的电场。这些电极也将有助于沉积带有DNA的30μm聚苯乙烯珠和0.5μm聚苯乙烯酶珠，它们带有净负电荷。由于珠子溶液的电荷分布和降低的电导率，面板孔覆盖率将被改进到～80％。我们已经证明了使用微加工电极对孔内1μm聚苯乙烯珠进行的选择性诱捕(如实施例1中所述)。
如上所述，为了实现将核苷酸活性预浓集至反应孔附近，我们施加了横穿流动方向的e场。这种策略提供了几个优势。在每次热测序运行过程中释放的PPi将通过使负电荷进入孔中的电场被限制在反应孔，并且将两个相邻孔之间的化学品相互干扰最小化。这对于将来为了高密度平台而降低孔和珠的大小是关键的。另外，清洗步骤能够通过简单地逆转电场方向并因此将核苷酸排斥到孔外而变得更加有效。这种方法对于提高清洗效率以实现长阅读的价值是无法衡量的。
在热测序实验开始时，进行PPi清洗以测量跨越整个芯片产生的光信号。从每个孔释放的光信号在所有的孔中应该相等。然后进行清洗，其后循环添加核苷酸。第一核苷酸序列提供关于“钥匙”的信息，“钥匙”将帮助我们启动系统。在碱基判定之后，将这个钥匙序列从实际序列去除以提供初生序列(nascent sequence)用于装配。
结论
上文的具体描述意在示例并阐明本发明，而不应被看作对本发明范围的限制，本发明的范围由随附权利要求字面上的范围和等同的范围来界定。在本说明书中提及的任何专利或出版物表明了所述专利所属领域技术人员的水平，并且旨在传达可能没有明确列出但是本领域工作人员应该理解的细节。这些专利或出版物通过引用并入本文，其程度就像为了描述并使所涉及的方法或材料能够进行的目的所需，通过具体和个别地引用将每一篇参考文献并入本文一样。
Claims (25)
1.一种用于实施生物测定的装置，其具有至少一个流体通道和反应区，所述反应区带有暴露于该流体通道的开口和偏离该流体通道的反应区底部，所述装置被构建成使流体沿着横穿反应区开口的方向流动，所述装置包含：
(a)与反应区底部相邻的第一电极；
(b)与反应区开口相邻的第二电极；和
(c)与第一和第二电极相连的可控电压源，其可被控制以在第一电极和第二电极之间提供叠加有直流偏压的交流电压，从而在第一电极和第二电极之间产生电场；
所述第一电极和第二电极电容耦合，使得通过由所述可控电压源产生的电极之间的电场引导流体通道内流体中的带电物质进入或退出反应区。
2.权利要求1的装置，进一步包含与反应区耦合的反应传感器，用于检测反应区中的反应。
3.权利要求2的装置，其中所述反应传感器包含与透明电极耦合的光导纤维面板。
4.权利要求2的装置，其中所述反应传感器包含CMOS光敏元件。
5.权利要求1的装置，进一步地，其中反应区是孔，其大小仅可容纳一颗珠子。
6.权利要求5的装置，进一步地包含带负电荷的珠子。
7.权利要求6的装置，其中所述带负电荷的珠子是聚苯乙烯。
8.权利要求6的装置，其中所述珠子是磁性的，并且所述装置进一步包含磁体。
9.权利要求1的装置，其中所述与底部相邻的电极是厚度小于约150nm的氧化锡铟薄层。
10.权利要求1的装置，其中所述反应区是在惰性固态聚合物中界定的，所述聚合物选自由光致抗蚀剂和PDMS组成的组。
11.权利要求1的装置，其中所述电极包含位于暴露于流体通道中液体的表面上的介电涂层。
12.权利要求11的装置，其中所述介电涂层是聚对二甲苯或氧化硅或氮化硅中的一种或多种。
13.权利要求1的装置，其中所述电极由线栅形成。
14.一种用于引导液体中带电粒子的移动的装置，其中所述粒子被引导进入反应区，所述装置包含：
(a)位于反应区中液体的一侧的涂有介电材料的第一电极；
(b)位于反应区中液体的相对侧的涂有介电材料的第二电极；
(c)横穿反应区的流体流动通道；和
(d)用于信号发生器的连接，所述信号发生器向第一电极和第二电极施加交流电压和直流偏压，藉此所述电极被构建并排列以在它们之间生成电场。
15.权利要求14的装置，其中所述反应区仅对于一颗珠子是足够大的。
16.一种用于在微流装置中移动带电分子物质的方法，所述物质从与反应区相通的流体通道移动进入反应区，所述方法包括步骤：
(a)使带电分子物质在流体通道中沿流动方向流动；
(b)提供具有跨越反应区的正极端和负极端且具有直流偏压的电场；和
(c)通过向反应区中的电场施加与分子物质上的电荷相反的电荷来引导带电分子物质进入反应区。
17.权利要求16的方法，其中所述反应区含有第二分子物质，并且其中所述方法导致所述带电分子物质与所述第二分子物质之间的反应。
18.权利要求16的方法，其进一步包括以至少100kHz的频率将电场反相的步骤。
19.权利要求16的方法，其中所述频率最小为10kHz且最大为10MHz。
20.权利要求16的方法，其中所述偏压为至少1伏特。
21.权利要求16的方法，其中所述电场具有至少5V/cm的强度。
22.权利要求16的方法，其中将所述偏压反相以引导分子物质退出反应区。
23.权利要求16的方法，其中所述电场是电位移场。
24.一种在微流装置中富集核酸包覆的珠子的方法，其包括步骤：
(a)使裸珠子和核酸包覆的珠子在流体通道中沿流动方向流动，其中所述流体通道与反应区相通，所述反应区包含到流体通道的开口和偏离所述流体通道的底部；
(b)提供具有跨越反应区的阳极端和阴极端的电场；
(c)通过向电场施加与核酸包覆的珠子上的电荷相反的电荷来引导核酸包覆的珠子进入反应区；和
(d)收集任何没有被引导进入反应区的珠子。
25.权利要求24的方法，其中所述微流装置含有多个反应区，并且其中每个反应区是大小仅可容纳一颗珠子的孔。
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