JP2003508783A

JP2003508783A - 吸収の検出により複数のサンプルを同時に分析する方法、及びこのような方法で使用されるシステム

Info

Publication number: JP2003508783A
Application number: JP2001522067A
Authority: JP
Inventors: エス．ユング、エドワード; ゴン、シャオイ
Original assignee: アイオワステイトユニヴァーシティリサーチファウンデーションインコーポレイテッド
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2003-03-04
Also published as: AU6382800A; DE10085034T1; WO2001018528A1; DE10085034B4

Abstract

(57)【要約】本発明は、吸収検出により複数のサンプルを同時に分析する方法を提供する。本方法は、（ｉ）複数容器の平面アレイを提供する工程を包含し、該複数容器の各々が少なくとも１つの吸収種を含有するサンプルを含み、（ｉｉ）光源で複数容器の平面アレイを照射する工程を包含し、（ｉｉｉ）検出手段を用いて光の吸収を検出する工程を包含し、該検出手段が、複数容器の平面アレイ中の容器の断面距離の少なくとも約１０倍の距離で光源と整列している。サンプルによる光の吸収は、該サンプル中の吸収種の存在を示す。本方法はさらに、（ｉｖ）（ｉｉｉ）において検出された光の吸収量を測定する工程を包含し、この光の吸収量がサンプル中の吸収種の量を示す。上記方法で使用するためのシステムもまた、本発明によって提供される。本システムは、（ｉ）光の少なくとも１つの波長を含むか、またはそれらから本質的になる光源を備え、該波長の吸収が検出され、（ｉｉ）複数容器の平面アレイを備え、（ｉｉｉ）光源と整列しており、かつ容器の断面距離の少なくとも約１０倍の距離で該複数容器の平面アレイと整列かつ並行して配置されている検出手段を備える。

Description

【発明の詳細な説明】

（政府の権利に関する陳述）本発明は、米国エネルギー省により与えられた契約番号W-7405-Eng-82の下で
の政府の援助によりなされた。従って、政府は、本発明に特定の権利を有し得る
。

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、吸収の検出により複数のサンプルを同時に分析する方法、及びこの
ような方法で使用するためのシステムに関する。

【０００２】（発明の背景）生物学的及び医学的技術の迅速な発達は、ハイスループット分析方法に対する
チャレンジを課してきた。例えば、コンビナトリアルケミストリーの現在の発達
は、１つのバッチで一日あたり数百又は数千もの化合物を合成することを可能に
した。このような非常に多くの化合物の特徴付け及び分析は、進行の妨げ(bottl
eneck)となっている。並行処理（即ち、同時のマルチサンプル分析）は、スルー
プットを向上させるもっともな方法である。しかし、カラムのサイズ、圧力の要
件、検出器及び固定相物質に関する限界に起因して、高度に多重化した高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを構築することは非常に困難である。
同じく、高度に多重化したガスクロマトグラフィー（ＧＣ）システムを構築する
ことも困難である。

【０００３】高速キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、小さな無機イオンから大きな生物学的
分子にわたる多数の化合物の分離のために重要な分析用ツールへと急速になった
。迅速な分析時間、高分離能、サンプルサイズの小ささ、及び溶媒の消費の少な
さ等の魅力的な特徴により、ＣＥは、ＨＰＬＣに代わる又は相補的な技術として
ますます使用されている。例えば、キャピラリーゲル電気泳動の使用は、従来の
スラブゲル電気泳動と比較してＤＮＡ配列決定速度を大いに改善した。しかし、
速度における改善の一部は、一回の泳動において複数のレーンを収容する能力（
スラブゲルに固有）の損失によって相殺されている。数百又は数千もの並行する
配列決定泳動を可能にすることによる、高度に多重化したキャピラリー電気泳動
は、既存のＤＮＡ配列決定機器の現在のスループット限界を克服する魅力的なア
プローチを提示する。このようなシステムは、米国特許第5,582,705号（Yeungら
）、同第5,695,626号（Yeungら）、及び同第5,741,411号（Yeungら）において開
示されている。このシステムでは、光により誘起される蛍光が、検出方法として
専ら用いられる。

【０００４】蛍光検出は、その高い感度及び特殊な標識プロトコルのために、ＤＮＡ配列決
定適用に適切であるが、ＵＶ吸収検出は、その実行の容易さ及び広範な適用性、
特に有機化合物及び生物学的に重要な化合物の深い(deep-)ＵＶ (200〜220nm)検
出のために依然として非常に有用であった。二次元ＣＣＤ検出器（１次元はキャ
ピラリーの長さを示し、そして他方の次元は吸収スペクトルを記録する）を使用
するキャピラリー等電点システムは、Wu及びPawliszyn, Analyst (Cambridge),
120, 1567-1571 (1995)により記載されている。このシステムは、２個のキャピ
ラリーチューブに使用されているが、３以上のキャピラリーチューブには容易に
適合しない。なぜなら、このシステムは、キャピラリーチューブが空間によって
分離されることを必要とするからである。第２のＣＣＤ次元において波長の分解
能を提供する代わりに、２個のキャピラリーチューブにおける等電点が同時にモ
ニターされる。しかし、照明のための光ファイバーの使用は、光の強度の弱さ及
びＵＶ透過の低さにつながった。そのため、可視波長のみが、特定のタンパク質
の検出に用いられていた。なぜならＣＣＤは非常に小さな電子井戸容量(electro
n well capacity)（約３０万電子）を有し、このシステムの検出限界（ＬＯＤ）
は、吸収検出における高いショットノイズにより制限されるからである。ＣＣＤ
の使用は、一回の露光あたり圧倒的な量のデータを生じ、１５秒毎に１フレーム
に対するデータ速度を制限する。また、利用される画像化スキームは、光路を制
限する機械的なスリットの存在のために、密に詰められたキャピラリーアレイに
適切ではない。さらにクロストークを回避するために、四角状キャピラリーのみ
が使用され得る。

【０００５】フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）は、検体の吸収スペクトルをリアルタイム
で提供するために、多くの商業的なＣＥ及びＨＰＬＣシステムにおいて使用され
ている。フローストリーム(flow stream)において一点から透過した光が、グレ
ーティングにより分散され、そしてリニアーアレイを横切って記録される。フォ
トダイオードアレイを画像吸収検出器として使用するキャピラリーゾーン電気泳
動システムが、Culbertson及びJorgenson, Anal. Chem. 70, 2629-2638 (1998)
により記載されている。アレイ中の異なる素子が、分離の進行に従い、１個のキ
ャピラリーチューブ中の異なる軸の位置を画像化するために使用される。ＰＤＡ
は非常に大きな電子井戸容量（１０００万電子）を有するので、吸収検出に関し
てＣＣＤよりも優れている。時間相関積分が、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を
改善するために適用される。

【０００６】なお必要とされるものは、複数のシステムの同時分析のための吸収検出アプロ
ーチである。１つのこのようなシステムは、米国特許第5,900,934号（Gilbyら）
において示されている。このシステムは、連続的な出力を提供するように接続さ
れた複数の感光性素子を備える光検出器アレイを備える。この素子は、代表的に
は、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）の画素である。この素子は、光検出器ア
レイの少なくとも一部を照明するように配置された光源により照明される。この
光源は、ＡＣ若しくはＤＣ水銀ランプ、又はクロマトグラフィーに使用可能な他
の光源であってもよい。分離チャネルのアレイは、光源と光検出器アレイとの間
に配置され、各分離チャネルは、内腔、サンプル導入端及びサンプル導入端の反
対側に置かれた検出領域を有する。このアレイは、多重並行キャピラリー電気泳
動システムである。各々の付随する分離チャネルについて少なくとも１個の開口
を有するマスクエレメントが必要とされる。各々の開口は、その付随する分離チ
ャネルに対応し、それによって光源からの光がその付随分離チャネルの内腔を通
過することを選択的に可能にする。付随する分離チャネルの内腔を通過する光の
少なくとも一部は、光検出器アレイのそれぞれの感光性素子に到達し、付随分離
チャネルのサンプル導入端中に導入されたサンプルによる光の吸収の測定をもた
らす。

【０００７】 Gilbyらにより記載されたシステムは欠点を有する。なぜなら、それは分離チ
ャネル上に到達する光の量を制限し、ＰＤＡに対し所望されるよりも低い光の強
度を提供するからである。さらに、開口及びマスクエレメントを分離チャネル（
例えば、キャピラリー）と整列させることは、いくつかの理由により困難である
。例えば、等しい分離を有するキャピラリーを配置することは、困難である。な
ぜなら、キャピラリーは、一般に、同じ寸法ではないからである（例えば、直径
公差は大きく変動する）。さらに、例えば、マスクジオメトリ（mask geometry
）は、同一の光路を提供せず、非線形の応答を生じる。また、マスクは、迷光を
生じ得、これは、低い検出限界を導き、そして隣接するキャピラリーからのクロ
ストークを完全には排除しない。なぜなら、光ビームは分散し、そして検出器素
子を免れることができないからである。さらに、マスクは、均一性の必要性に起
因して、製造することが困難であり得る。また、Gilbyは、サンプル及びＰＤＡ
をあまりにも接近させて一緒に配置し、迷光、クロストーク、及び光の最長路程
の使用不能を生じさせている。

【０００８】従って、当該分野の方法及びシステムに固有の欠点を考慮すると、吸収検出に
より複数のサンプルを同時に分析する方法についての必要性が存在する。本発明
の目的は、このような方法を提供することである。本発明の別の目的は、このよ
うな方法における使用のためのシステムを提供することである。本発明のこれら
及び他の目的及び欠点、並びにさらなる本発明の特徴は、本明細書中に提供され
る詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。

【０００９】本発明はまた、当該分野における他の欠点に取り組む。例えば、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）（1985年、Kary Mullis）の発明以来、感度の最終目的は、
実行の容易さの増加と共に、分子生物学研究及び臨床診断における中心的な位置
にこの技術を位置付けた (Rolfら, PCR: Clinical Diagnostics and Research,
1992, Springer-Verlag, Berlin and Heidelberg)。過去１０年間において、Ｐ
ＣＲは、遺伝子分析において多くの調査を刺激した。そして複雑な疾患の遺伝基
礎を決定するためにさえ使用されている(Sackiら, Science 230: 1350 (1985))
。ポストＰＣＲ分析における強力な分析ツールとしてＣＥの開発を繰り返す必要
はない。多量の研究（高速の高分解能の制限フラグメント分析 (Guttmanら, Ana
l. Chem. 62: 2348 (1992); Milofskyら, Anal. Chem. 65: 153 (1993); Willia
msら, J. Chromatogr. A680: 525 (1994); Changら, J. Chromatogr. B669: 113
(1995); Barronら, Electrophoresis 16: 64 (1995);及びRighettiら, Anal. B
iochem. 244: 195 (1997))、高速のハイスループットＤＮＡ配列決定(Ruiz-Mart
inezら, Anal. Chem. 65: 2851 (1993); Luら, J. Chromatogr. A680: 497 (199
4); Luら, J. Chromatogr. A680: 503 (1994); Fungら, Anal. Chem. 67: 1913
(1995); Zhangら, Anal. Chem. 67: 4589 (1995); Carrilhoら, Anal. Chem. 68
: 3305 (1996);及びKimら, J. Chromatogr. 781: 315 (1997))、迅速かつ正確な
ＤＮＡタイピング及びサイジング（sizing）(Babaら, Electrophoresis 16: 143
7 (1995); Noble, Anal. Chem. 67: 613A (1995); Zhangら, Anal. Chem. 68: 2
927 (1996); Isenbergら, Electrophoresis 17: 1505 (1996); Zhangら, J. Chr
omatogr. A768: 135 (1997); Butlerら, Electrophoresis 16: 974 (1995);及び
Wangら, Anal. Chem. 67: 1197 (1995))、１塩基変異分析 (Marinoら, Electrop
horesis 17: 1499 (1996); Arakawaら, J. Chromatogr.: A664: 89 (1994); Heb
enbrockら, Electrophoresis 16: 1429 (1995); Kuypersら, J. Chromatogr.: B
675: 205 (1996); Chengら, J. Cap. Elec. 2: 24 (1995); 及び Renら, Anal.
Biochem. 245: 9 (1997))、並びに疾患原因遺伝子の分析 (Luら, Nature 368:
269 (1994); Felmleeら, J. Cap. Elec. 2: 125 (1995); Gelfiら, BioTechniqu
es 19: 254 (1995);及びGrossmanら, Nucleic Acids Res. 22: 4527 (1994))を
含む）が、伝統的なスラブゲル電気泳動に対するＣＥの利点を調査するためにな
された。特に、キャピラリーアレイ電気泳動は、他の微細製作デバイス (Uenoら
, Anal. Chem. 66: 1424 (1994); Takahashiら, Anal. Chem. 66: 1021 (1994);
及びAnazawaら, Anal. Chem. 68: 2699 (1996))とともに、ハイスループットＤ
ＮＡ分析を達成する目的のために有望な方法である。この点に関して、シングル
キャピラリーが、ＤＮＡ分析に利用されている (Guttmanら(1992), 前出)。

【００１０】ＤＮＡ分析についての従来のプロトコルは、スラブゲル電気泳動又はキャピラ
リーゲル電気泳動（ＣＧＥ）におけるサイズベースの分離の前、その間又はその
後に放射性核種又は蛍光タグでの標識を必要とする。この誘導体化プロセスは、
高価な試薬を必要とし、そしてこれらの標識試薬の有毒な性質のためにオペレー
ター及び廃棄物処理に関して安全面での懸念を生じる。

【００１１】本発明は、ＵＶ吸収検出に単純に基づき遺伝子タイピング及び診断に適用され
得る。総吸収シグナルに対する各塩基対の相加的寄与は、ほとんどのＰＣＲ産物
を分析するために十分な検出感度を提供する。特殊な潜在的に有毒な蛍光標識の
使用が排除されるのみではなく、機器の複雑性及び費用もまた大いに軽減される
。従って、ＤＮＡ分析プロトコルは、ＤＮＡ塩基に固有なスペクトル特性に基づ
いて、ハイスループットキャピラリーアレイゲル電気泳動及び単純なＵＶ吸収検
出を利用するように設計され得る。ＤＮＡ産物のＵＶ吸収検出は、分析の費用を
低減する。なぜなら、それは標識を必要としないからである。

【００１２】同様に、ペプチドマッピングは、タンパク質の特徴付けに利用可能な最も強力
かつ首尾のよいツールのうちの１つを提示する (Garnickら, Anal.Chem. 60: 25
46-2557 (1988); Borman, Anal. Chem. 59: 969A-973A (1987))。タンパク質の
配列決定よりも情報が少ないが、これは、単純な機器での迅速な分析を可能にす
る。ペプチドマッピングにおいて、サンプルタンパク質が、酵素又は化学的な消
化によって選択的に切断される (Tarrら, Anal. Biochem. 131: 99-107 (1983);
Dong, Advances in Chromatography 32: 22-51, Marcel Dekker, Inc.: New Yo
rk (1992); Geisowら, Biochem. J. 161: 619-625 (1977); 及び Wardら, J. Ch
romatogr. 519: 199-216 (1990))。次いで、ペプチドマップは、そのタンパク質
に独特なフィンガープリントとして働き、そして個々のバリアント(variant)間
の非常に僅かな差異を正確に明らかにし得る。トリプシンは、ペプチドマッピン
グにおいて非常に最も広範に使用されているタンパク質分解酵素である。その望
ましい特性は、リジンのＣ末端側で切断すること、及びアルギニンが適切な条件
下で一般に定量的であること、並びにトリプシンが４Ｍ程度の濃度の尿素に耐性
であるということである (Dong(1992),前出)。欠点は、形成されるフラグメント
があまりにも小さく（平均して、７〜１２アミノ酸残基）、非常に複雑なトリプ
シンマップを生じるということである。トリプシン消化後に、この消化は、代表
的には、ペプチドマップを生じるために、スラブゲル電気泳動 (Clevelandら, J
. Biol. Chem. 252: 1102-1106 (1977))、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）(S
tephens, Anal. Biochem. 84: 116-126 (1978)), ＨＰＬＣ (Hancockら, Anal.
Biochem. 89: 203-212 (1978); Coxら, Anal. Biochem. 154: 345-352 (1986);
Fullmerら, J. Biol. Chem. 254: 7208-7212 (1979); Venselら, J. Chromatog
r. 266: 491-500 (1983); Leadbeaterら, J. Chromatogr. 397: 435-443 (1987)
; Dongら, J. Chromatogr. 499: 125-139 (1990); 及び Hartmanら, J. Chromat
ogr. 360: 385-395 (1986)、並びにキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）(Jor
gensonら, J. High Resolut. Chromatogr. Commun. 4: 230-231 (1981); Cobbら
, Anal. Chem. 61: 2226-2231 (1989); Changら, Anal. Chem. 65: 2947-2951 (
1993); Nashabehら, J. Chromatogr. 536: 31-42 (1991); Wardら, J. Chromato
gr. 519: 199-216 (1990); Janiniら, J. Chromatogr. 848: 417-433 (1999); F
renzら, J. Chromatogr. 480: 379-391 (1989);及びGrossmanら, Anal. Chem. 6
1: 1186-1194 (1989)) 等の種々の方法によって分析される。勾配逆相ＨＰＬＣ
は、今日使用されているペプチドマッピングのうちの最も一般的な形態である (
Leadbeaterら(1987), 前出; Dongら(1990), 前出;及びHartmanら(1986), 前出)
。

【００１３】特に、ＣＺＥは、ペプチドマッピングの試みにおいて、逆相液体クロマトグラ
フィーに対する相補的な方法としてかなりの注目を受けている(Jorgensonら(198
1前出; Cobbら(1989), 前出; Changら(1993), 前出; Nashabehら(1991), 前出;
Wardら(1990), 前出; Janiniら(1999), 前出; Frenzら(1989), 前出; 及びGross
manら(1989), 前出)。種々のペプチドの分離は、ｐＨ調整を通じて最適化され得
る。泳動用緩衝液へのミセル形成性界面活性剤の添加を通して、ペプチド分離の
力学的な分配機構（即ち、疎水度）もまた、中性フラグメントに対して確立され
得る。ＣＥは、ペプチドフラグメントを分析するために非常に効率的かつ迅速で
あるが、高分子量タンパク質の消化におけるペプチドの完全な分離は、例えば、
単一の緩衝液条件を使用することによっては可能ではない。ＨＰＬＣとは異なり
、ＣＥにおける勾配分離の実行は、ありふれたことではない (Whangら, Anal. C
hem. 64: 502-506 (1992);及びChangら, J. Chromatogr. B 608: 65-72 (1992))
。

【００１４】これらの方法は、タンパク質を特徴付けるために有用であるが、比較的多量の
サンプルが必要とされること、分析時間が長いこと、及び誘導体化反応の効率等
の他の問題がなお存在する。また、代表的なマップは、２０〜１５０のピークを
含み、これらの全ては、理想的には全て解析されるべきである (Dongら(1992),
前出)。従って、高度のカラム分解能及びシステムの正確性が、好ましくはサブ
ナノモル濃度の量で開始して、マップを正確に再現するために必要とされる。

【００１５】本発明は、タンパク質の独特なフィンガープリントとして役立ち得るペプチド
マップが得られることを可能とする。信頼できるハイスループット分析が、例え
ば、多次元ＣＥ及び単一の規定された実験プロトコルに基づいて実行され得る。

【００１６】コンビナトリアルスクリーニングもまた、化学又は生化学上の問題に対する最
良の解決策に効率的かつ確実に照準を合わせかつ同定するその能力のために、最
近非常に興味を引き付けている (Borman, C&E News, １９９９年３月８日,３３
〜６０頁)。化学合成において、反応収率の最適化は、全ての可能な反応条件、
触媒及び試薬を同時に調査することによって達成され得る。創薬において、所定
の候補のうち全ての関連する構造バリアントが、その標的に対して試験され得る
。しかし、スクリーニングは、最良の組み合わせを逸失する機会がないように包
括的でなければならない。これは、多くのパラメータをカバーし、かつこれらの
パラメータの各々の範囲を拡大する多数の実験を有することを必要とする。ハイ
スループットは、適時の結果を生じるために必要である。これは、主に、コンビ
ナトリアルスクリーニングが実用的になったハイスループット技術及び自動化に
の進歩のためである。任意の所定の時間で実行され得る多数の反応を維持し得る
一般的かつ荒削りな分析方法論が、なお必要とされる。別の観点は、操作全体の
微小化である。これは、試薬の費用、溶媒の適切な処分、操作のための空間及び
貯蔵などに影響する。

【００１７】現在、均一触媒をスクリーニングするためのいくつかの対応するアッセイが存
在する。触媒反応により誘導されるＵＶ吸収 (Wagnerら, Sicence 270: 1797-18
00 (1995); Mengerら, J. Org. Chem. 63: 7578-7579 (1998))、蛍光 (Cooperら
, J. Am. Chem. Soc. 120: 9971-9972 (1998); Shaughnessyら, J. Am. Chem. S
oc. 121: 2123-2132 (1999)), 色 (Lavastreら, Chem. Int. Ed. 38: 3163-3165
(1999)) 又は温度 (Taylorら, Science 280: 267-270 (1998); Reetzら, Angew
. Chem. Int. Ed. 37: 2647-2650 (1999))の改変は、触媒活性の指標である。こ
れらのアプローチにおいて、触媒の相対活性が、速やかに決定されるが、このプ
ロセスの全体的な収率又は位置選択性及び立体選択性についての定量的な情報は
得られ得ない。この産物が、溶媒又は試薬と比較して非常に異なる測定可能な特
性を示すこともまた必要とされる。ほとんどの場合、二次的なスクリーニングが
必要である。触媒をスクリーニングするために広範に使用されてもいる質量分析
（ＭＳ）(Orschelら, Angew. Chem. Int. Ed. 38: 2791-2794 (1999))は、選択
的な検出を提供し得る。しかし、立体選択性に着目すると、これらの手順はなお
労働集約的な傾向がある (Reetzら, Angew. Chem. Int. Ed. 38: 1758-1761 (19
99))。従って、分析時間は合理的に短いが、ＭＳはなお、並行的ではなく連続的
なアプローチである。

【００１８】分離ベースの技術は、上記問題を解決し得る。ＨＰＬＣ及びＣＥを含む連続的
な方法が、不斉触媒 (Porteら, J. Am. Chem. Soc. 120: 9180-9187(1998); Din
gら, Angew. Chem. Int. Ed. 38: 497-501 (1999)) 及びアルキル化反応(Gausら
, Biotech. & Bioeng. 1998/1999 61: 169-177)を分析するために使用されてい
る。連続的な分離スキームで達成され得るスループットは、連続的なサンプル注
入(Rocheら, Anal. Chem. 69: 99-104 (1997))及びサンプル多重化(Woodburyら,
Anal. Chem. 67: 885-890 (1995))等の特別な技術を用いても少ない。多重化Ｈ
ＰＬＣは別の興味深いアプローチであるが(Gongら, Anal. Chem. 71: 4989-4996
(1999))、高度の多重化（例えば、キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）にお
ける９６キャピラリー）の達成は、ありがちなことではない。一方、薄層クロマ
トグラフィー及びゲル電気泳動は、完全に自動化することが困難である。

【００１９】コンビナトリアルスクリーニングに関して非常に首尾のよい形式は、ＤＮＡチ
ップの形式である (Southern, Electrophoresis 16: 1539-1542 (1995); Cheeら
, Science 274: 610-614 (1996);及びWinzelerら, Science 281: 1194-1197 (19
98))。小さな領域内に固定化されたオリゴヌクレオチドの包括的なセットが、ハ
イブリダイゼーションによって特定の標的配列を同定するために使用される。オ
リゴヌクレオチドチップはまた、特異的なタンパク質−ヌクレオチド結合を示す
アプタマーを開発するために使用されている (Weissら, J. Virol. 71: 8790-87
97 (1997))。このような異種スクリーニングアッセイは、選択的な標識又は選択
的な消光のいずれかによる、レーザ誘起蛍光（ＬＩＦ）に基づく感度のよい検出
から恩恵を受けていた。同種アッセイに関しては、９６ウェルマイクロタイター
プレートが一般的な形式である。標準的な分析機器に連結している流体操作、プ
レートリーダー及びオートサンプラーが、この形式のために開発されている。色
（吸収）の変化又は蛍光変化がある場合、検出及び定量が直接行なわれる。しか
し、多くの状況において、この反応混合物は複雑であり、そしてある程度の分離
又は精製が測定前に必要とされる。いくつかのカラムを備える多重液体クロマト
グラフ又はシングル機器が、原則的に、反応混合物の分析に使用され得る。なお
、非常により少量の試薬を意味する、非常により高度なスループット及び非常に
より小さなサンプルサイズが、所望される。本発明は、このようなより高度なス
ループット及びより小さなサンプルサイズを可能にし、そして目的の種が蛍光を
発することを必要としない。

【００２０】（発明の要旨）本発明は、吸収検出によって複数のサンプルを同時に分析する方法を提供する
。本方法は、：（ｉ）複数容器の平面アレイを提供する工程を包含し、該複数容器の各々が少
なくとも１つの吸収種を含有するサンプルを含み、（ｉｉ）１以上の吸収種によって吸収される光の少なくとも１つの波長を含む
か、またはそれらから本質的になる光源で、複数容器の平面アレイを照射する工
程を包含し、該波長の吸収が測定され、（ｉｉｉ）検出手段を用いて１以上の吸収種による光の吸収を検出する工程を
包含し、該検出手段が、光源と整列しており、かつ複数容器の平面アレイ中の容
器の断面距離の少なくとも約１０倍の距離で該複数容器の平面アレイと整列かつ
並行して配置されており、該断面距離が、複数容器の平面アレイの平面に対して
直交方向で測定されたものである。複数容器の平面アレイ中のサンプルによる光
の吸収検出は、該サンプル中の吸収種の存在を示す。本方法は、（ｉｖ）サンプ
ル中の吸収種について（ｉｉｉ）において検出される光の吸収量を測定する工程
をさらに包含し得る。（ｉｉｉ）で検出される光の吸収量の測定は、該サンプル
中の吸収種の量を示す。

【００２１】また、上記方法で使用するためのシステムが、本発明によって提供される。本
システムは、：（ｉ）１以上の吸収種により吸収される光の少なくとも１つの波長を含むか、
またはそれらから本質的になる光源を備え、該波長の吸収が検出され、（ｉｉ）複数容器の平面アレイを備え、該複数容器の各々に少なくとも１つの
吸収種を含有するサンプルが配置され得、（ｉｉｉ）光源と整列しており、かつ複数容器の平面アレイ中の容器の断面距
離の少なくとも約１０倍の距離で該複数容器の平面アレイと整列かつ並行して配
置されている検出手段を備え、該断面距離が、複数容器の平面アレイの平面に対
して直交方向で測定されたものである。

【００２２】（発明の詳細な説明）本発明は、吸収検出により複数のサンプルを同時に分析する方法を提供する。
本発明は、例えば、多重化電気泳動の状況において、自動化、高速、高精度及び
低費用の達成に関する一体化アプローチを利用する。本方法は、例えば、マルチ
キャピラリーアレイゾーン電気泳動、ミセラー動電学(micellar electrokinetic
)クロマトグラフィー、キャピラリー電気クロマトグラフィー、及びキャピラリ
ーゲル電気泳動において使用され得る。マルチキャピラリーアレイが使用される
場合、従来のシングルキャピラリー電気泳動と比較した場合に、およそ１００倍
、又は１，０００倍以上もの、より高度な分析スループットが達成され得る。こ
のシステムは、Wu及びPawliszynのシステムよりも少なくとも約１００倍感度が
よい。

【００２３】本方法は、以下：（ｉ）複数容器の平面アレイを提供する工程であって、該複数容器の各々が少
なくとも１つの吸収種を含有するサンプルを含む、工程：（ｉｉ）１以上の吸収種によって吸収される光の少なくとも１つの波長を含む
か、またはそれらから本質的になる光源で、複数容器の平面アレイを照射する工
程であって、該波長の吸収が検出される工程、並びに（ｉｉｉ）光源と整列しており、かつ複数容器の平面アレイを出る迷光が検出
手段に到達する前に分散するような距離で該複数容器の平面アレイと整列かつ並
行して配置されている検出手段を用いて、１以上の吸収種による光の吸収を検出
する工程、を包含する。迷光の量は、平面アレイと検出器との間の距離の２乗が増加するに
つれて逆比例して減少する。従って、検出手段に到達する光は、実質的に、複数
容器を通じて送達される光のみである。この様式において、複数容器の平面アレ
イからの出力強度が最も強く、従って、検出手段からの出力強度もまた最も強く
、それによって、複数容器の平面アレイ中の各容器についての検出手段からの強
度出力の決定は容易になる。複数容器の平面アレイ中のサンプルによる光の吸収
検出は、該サンプル中の吸収種の存在を示す。

【００２４】本方法はさらに、（ｉｖ）サンプル中の吸収種について、（ｉｉｉ）で検出さ
れた光の吸収量を測定する工程を包含する。（ｉｉｉ）において検出された光の
吸収量の測定は、サンプル中の吸収種の量を示す。光の吸収量を測定する方法は
、当該分野で公知である。基本的に、サンプルの非存在下及び存在下で光の強度
を測定する。この比率の対数は、吸光度である（Beer-Lambertの法則）。好まし
くは、複数容器の平面アレイと検出手段との間の距離は、複数容器の平面アレイ
中の容器の断面距離の少なくとも約１０倍であり（この距離で、迷光は約１％未
満である）、より好ましくは少なくとも約１００倍であり、この断面距離は、複
数容器の平面アレイの平面に直交して測定されたものである。

【００２５】光源と複数容器の平面アレイとの間の距離は、本発明の実施に重要ではない。
しかし、光源と複数容器の平面アレイとの間の距離が短くなると、より多くの光
が、複数容器の平面アレイによって受容されるであろう。光源と複数容器の平面
アレイとの間の距離が大きくなると、複数容器の平面アレイによって受容される
光がより均一になるであろう。複数容器の平面アレイが受容する光がより多くな
ると、検出がより高感度になるであろう。

【００２６】複数容器の平面アレイに対する光源の位置もまた、光源が複数容器の平面アレ
イを照射する限り本発明の実施に重要ではない。他の考慮すべき事項は、前述の
段落で述べた通りである。

【００２７】好ましくは、複数容器の平面アレイと検出手段との間の距離は、複数容器の平
面アレイ中の容器の断面距離の少なくとも約１０倍、より好ましくは、少なくと
も約１００倍であり、この断面距離は、複数容器の平面アレイの平面に対して直交方向で測定されたものである。従って、複数容器の平面アレイと検出手段と
の間の距離は、好ましくは、約１ｃｍ〜約３０ｃｍ、より好ましくは約３ｃｍ〜
約３０ｃｍ、及び最も好ましくは約１０ｃｍ〜約３０ｃｍである。円柱状キャピ
ラリーチューブが複数容器として使用される場合、好ましくは、この距離は、約
１ｃｍ〜約３０ｃｍ、より好ましくは約３ｃｍ〜約３０ｃｍ、及び最も好ましく
は、約１０ｃｍ〜約３０ｃｍである。

【００２８】「複数容器」とは、少なくとも３個以上、好ましくは少なくとも約１０個、よ
り好ましくは少なくとも約９０個を意味し、そして望ましくは可能な限り多くが
、本明細書中に記載されるシステムによって収容され得る。複数容器は任意の適
切な容器を含み得るが、望ましくは、この複数容器は、光源からの光が、光源に
面する容器の壁を通過し、この容器中のサンプルを通過し、そして検出手段に面
する容器の壁を通過することを可能にする。従って、容器の壁は、望ましくは透
明であるが、いくつかの場合には、容器の壁は半透明であり得る。この点におい
て、容器中のサンプルが照射され、そしてこのサンプル中の吸収種によって吸収
されない光が検出手段によって検出可能であるように、容器の壁の少なくとも一
部が光源からの光の通過を可能にする限り、必ずしも容器の壁全体が上記のよう
に光源からの光の通過を可能にする必要はない。好ましくは、複数容器は、円柱
状キャピラリーチューブを含む。好ましくは、複数容器の平面アレイは、少なく
とも約１０個のキャピラリーチューブ、より好ましくは少なくとも約９０個のキ
ャピラリーチューブ（例えば、９６個のキャピラリーチューブ）を備え、そして
望ましくは、可能な限り多くが、本明細書中に記載のシステムによって収容され
得る。

【００２９】平面アレイは、望ましくは、少なくとも１つのコントロール容器をさらに備え
る。しかし、光源が安定である場合、コントロール容器は必ずしも必要ではない
。

【００３０】一般に、平面アレイに使用される容器は、滑らかな表面及び均一な厚みの壁を
有するべきであり、そしてサンプル中の吸収種によって吸収される光の波長の範
囲にわたって透明である物質から構成されるべきであり、この吸光度が検出又は
測定される。容器について好ましい物質としては、プラスチック、石英、溶融シ
リカ（特に、キャピラリーチューブに対して）及びガラスが挙げられるがこれら
に限定されない。容器の断面は、本発明の方法に重要ではない。しかし、容器の
断面が小さくなると、高度に多重化した適用においてこの容器がより有用である
。なぜなら、より多数の容器が、より小さな空間容積で使用され得るからである
。同様に、容器の壁の厚さは、本発明の方法に重要ではない。この壁は、容器の
構造の完全性を維持するために十分な厚さであるべきだが、光が容器を通過する
のを不利に妨げるような厚さではない。容器の形状もまた、本発明の方法に重要
ではない。容器は、任意の適切な形状を有し得る。望ましくは、容器の形状は、
密に詰められるように資され、かつこの容器による迷光の発生を最小限にする。

【００３１】円柱状キャピラリーチューブは、本発明の状況における使用に好ましい容器で
ある。キャピラリーチューブは、多数の供給元（Polymicro Technologies, Inc.
, Phoenix, A.Z.を含む）から市販されている。キャピラリーチューブは、好ま
しくは、ポリマー（例えば、ポリイミド）でコーティングされ、それにより機械
的に安定である。コーティングは、光源により照射される領域では除去されなけ
ればならない。エキシマーレーザーは、ポリマーコーティングを除去するために
使用され得る。

【００３２】好ましくは、平面アレイ中の複数容器は、互いに実質的に並行に配置される。
また好ましくは、平面アレイ中の複数容器もまた、互いに実質的に隣接して配置
される。例えば、複数容器がキャピラリーチューブである場合には、キャピラリ
ーチューブは、それらの並行する長さに沿って実質的に連続するように密に詰め
られ、隣接するキャピラリー間に実質的に空間を残さない。アレイのキャピラリ
ー壁直径又は他の特性におけるわずかな不一致が、それらの長さ全体に沿って接
触することを妨げ得るが、実質的に隣接するキャピラリーチューブは、それらの
長さの全て又は一部に沿って互いに物理的に接触し得る。この平面アレイは、望
ましくは、フリッカーノイズを低減するように固定して搭載される。

【００３３】本方法の間に、多量の熱が特に複数容器の平面アレイの近辺に発生する場合、
熱を放散するために冷却が用いられるべきである。過剰の熱は、複数容器の平面
アレイ中の隣接する容器の間に機械的な振動を引き起こし得（例えば、密に詰め
られたキャピラリーチューブの場合等）、これは次いで、過剰なノイズを引き起
こし得る。例えば、検出を受ける容器の部分に並行である窒素ガスの層流が、冷
却のために使用され得る。

【００３４】検出手段は、吸収を検出する任意の適切な手段を含み得る。２次元画像アレイ
検出器が使用され得るが、好ましくは、検出手段は、望ましくは、リニアーアレ
イ中に配置される、複数の吸収検出素子（例えば、複数の感光性素子）を備える
。望ましくは、検出手段は、複数容器のリニアーアレイと並行かつ整列している
。検出手段は、望ましくは、フリッカーノイズを低減するように固定してマウン
トされる。この点において、本システムに使用されるセルコンポーネントの相対
位置は、固定されなければならない。

【００３５】好ましくは、リニアーフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）が使用される。望ま
しくは、ＰＤＡは、線形画像センサーチップ、ドライバー／増幅器回路及び温度
制御器を組み込んでいる。この温度制御器は、望ましくは、約０℃〜約−４０℃
の温度に、センサーチップを熱電気的に冷却する。温度の低下は、ダークカウン
ト(dark count)を低下させ、そして温度ドリフトを最小限にし、それにより広範
なダイナミックレンジにわたって信頼できる測定がなされることを可能にする。
ドライバー／増幅器回路が、望ましくは、Ｉ／Ｏボードを通じてコンピュータに
接続され、これはまた、好ましくは、線形画像センサーにより必要とされる、マ
スタークロックパルス及びマスタースタートパルスを提供するパルス発生器とし
て働く。ＰＤＡは、画像を線形で（二次元的ではなく）記録する。好ましくは、
獲得されたデータは、ハードディスクにリアルタイムで直接書き込まれる。また
、好ましくは、ＰＤＡの少なくとも約１０個までの素子からのシグナルが、リア
ルタイムで表示される。

【００３６】あるいは、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）又は電荷注入デバイス（ＣＩＤ）が使
用され得る。しかし、ＣＣＤは、二次元で記録し、これは、あまり効率的ではな
く、よりコンピュータメモリを必要とし、より遅く、全ての位置が読み込まれる
ことを必要とする（ＰＤＡのような単一ラインではない）。さらに、ＣＣＤは、
各位置に１００，０００個のみの電子を有するが、ＰＤＡにおける各素子は、位
置あたり画素あたり５９００万電子を保存し得；従って、検出感度が検出され得
る電子数の平方根に関連することを考慮すると、ＰＤＡは、数オーダーの規模で
ＣＣＤよりも感度がよい。

【００３７】好ましくは、ＰＤＡは、線形に整列した画素を備え、この場合において、複数
容器の平面アレイ中の各容器は、望ましくは、キャピラリーチューブであり、そ
して各キャピラリーチューブは、好ましくは、約１０個未満の画素、より好まし
くは約７〜９個の画素に光学的に結合されており、これらのうちいくつかは、キ
ャピラリーの壁に結合され、そしてこれらのうちいくつかは、隣接するキャピラ
リーの壁の間の任意の空間に結合され、そしてこれらのうち少なくとも１つが、
キャピラリーの内腔に結合されている。従って、キャピラリーの壁により生じた
迷光は、画素に衝突する前に分散され、そして／または側壁に結合した画素に閉
込められ、そして一般的に、キャピラリーの内腔に結合した画素によって生じる
シグナルに影響しない。キャピラリー：光学的にカップリングした画素の比率は
、好ましくは、約１：１０未満であり、より好ましくは、約１：７〜約１：９で
あるが、光学的にカップリングした画素に対するキャピラリーの比率は、整数の
比率である必要はない。

【００３８】検出手段が線形に整列した画素を備えるＰＤＡの場合には、本方法の工程（ｉ
ｉｉ）は、画素の中央群から１つの画素（即ち、最も強い光強度を検出する画素
）を選択する工程、及びこの画素を使用して標的種による吸光度を検出する工程
を包含し得る。１より多い画素が、容器の内部に光学的に結合している場合、た
だ１つの画素を選択して分析し、かつ他を無視することが望ましい。あるいは、
１個の画素のみが、各容器に光学的に結合され得、画素を選択する必要性を排除
する。しかし、これは、重要な光学アライメントに対する必要性のために、あま
り好ましくはない。多くの容器（望ましくは、キャピラリーチューブ）を備える
大きなアレイにおいて、容器の詰め込み、及び容器の壁の幅等における不一致及
び変動を調整するために、画素対容器のより高い比率を使用することが現実的で
あり得る。画素対キャピラリーのより高い比率が使用される場合、１個よりも多
い画素が、容器の内腔に光学的に結合され得る。容器の内腔に結合している各画
素は、検出される光の強度に正比例する強度を有するシグナルを生じる。最高の
強度を有するシグナルを生じる画素（即ち、「最も輝く（brightest）」画素）
が、有利に選択される。

【００３９】容器の内部部分に光学的に結合している画素からの適切な画素の選択は、較正
工程によって都合よくなされ得る。従って、本発明の方法はさらに、容器中にサ
ンプルを導入する工程の前に行なわれる、較正工程をさらに包含し得る。あるい
は、ｎ番目毎のキャピラリー（例えば、１０番目毎のキャピラリー）は、コント
ロール又はブランクサンプル（即ち、上記のコントロール容器）を含む。

【００４０】本方法は、室温等の周囲温度（例えば、約２０℃〜約３０℃）、又は０℃程度
若しくは８０℃程度で実行され得る。しかし、本方法が好ましい検出手段として
ＰＤＡを用いる場合に、望ましくは、ＰＤＡは、０℃以下の温度（例えば、約０
℃〜約−４０℃）での作動のためにそれ自身の冷却器を有する。

【００４１】光源は、好ましくは、約１８０ｎｍ〜約１５００ｎｍの範囲にある波長を含む
か、またはそれらから本質的になる。適切な光源の例としては、水銀（紫外（Ｕ
Ｖ）光の吸収に対する）、タングステン（可視光の吸収に対する）、ヨウ素（Ｕ
Ｖ光の吸収に対する）、亜鉛（ＵＶ光の吸収に対する）、カドミウム（ＵＶ光の
吸収に対する）、キセノン（ＵＶ光の吸収に対する）、重水素（可視光の吸収に
対する）等が挙げられる。望ましくは、光源は、吸収種によって吸収される光の
波長を含むか、又はそれらから本質的になり、該波長の吸収が検出される。光の
どの波長が目的の吸収種（即ち、その吸収が本発明に従って検出又は測定される
吸収種）によって吸収されるかは、標準的な吸収分光計を使用して決定され得る
。あるいは、このような情報を提供する分光学的表が、例えば、National Insti
tute of Science and Technology (NIST)を通じて当該分野において利用可能で
ある。望ましくは、より少量の吸収種が検出され得るように、最大吸収される光
の波長は、所定の吸収種が検出又は測定され得るように選択される。一般的に、
光源は、複数容器の平面アレイがある平面に直交して、複数容器の平面アレイに
到達する光を提供する。光源は、点源であり得る。また好ましくは、光源は、約
０．５ｍＶ〜約５０ｍＶの電力出力を有する。光源は、ＡＣ又はＤＣであり得る
が、ＤＣが好ましい。光源に由来する任意のフリッカーノイズは、光の二重ビー
ムを使用することによって排除され得る。

【００４２】光の路程（pathlength）は、本発明の方法の感度にとって重要である。容器中
のサンプルによって吸収される光の路程が長くなると、サンプルに対するシグナ
ルが大きくなる。これは、吸光度＝定数（容器中のサンプル中の吸収種のスペク
トル特性であり、この吸収種の吸光度が検出又は測定される）×光の路程×容器
中のサンプル中の吸収種の濃度、を説明するBeerの法則に従う。高い定数及び長
い路程が所望される。

【００４３】光学フィルターは、望ましくは、複数容器の平面アレイと検出手段との間に配
置される。光学フィルターは、吸収種（この吸収種の吸収が検出される）によっ
て吸収される光源からの光の少なくとも１つの波長を選択する。光学フィルター
は、複数容器の平面アレイと検出手段との間に配置された光学フィルターに加え
て、またはこの代わりに、光源と複数容器の平面アレイとの間に配置され得るが
、光源と複数容器の平面アレイとの間へのシングル光学フィルターの配置は、サ
ンプルによるその後の蛍光が検出手段に到達することをブロックしないので不利
である。対照的に、複数容器の平面アレイと検出手段との間への光学フィルター
の配置は、サンプルの蛍光が検出手段に到達することをブロックする。

【００４４】フラットフィールドレンズ(flat-field lens)もまた、望ましくは、複数容器
の平面アレイと検出手段との間に配置される。フラットフィールドレンズは、複
数容器の平面アレイ中の各サンプル中の１以上の吸収種によって吸収されない光
を検出手段と結合させる。フラットフィールドレンズ以外のレンズが、本発明の
状況において使用され得るが、視野全体を均一に画像化しないので不利である。
結果的に、視野の縁はゆがめられ、そしてレンズの視野の縁に配置された複数容
器の平面アレイ中の容器の吸収は、検出も測定もされ得ない。レンズは、複数容
器の平面アレイの画像を検出手段（好ましくは、ＰＤＡである）の面上に反転さ
せる。

【００４５】望ましくは、フラットフィールドレンズによる光の結合は、光源から遮蔽され
る。この様式では、レンズからの光のみが検出手段上に収束する。

【００４６】複数キャピラリーの平面アレイ中の各キャピラリーに対するローダミン６Ｇの
検出限界は、約１．８×１０^-8Ｍである。複数キャピラリーの平面アレイ中の隣
接するキャピラリー間のクロストークは、約０．２％未満である。

【００４７】サンプルは、複数キャピラリーの平面アレイ中の各キャピラリーチューブに任
意の適切な方法によって導入され得るが、好ましくは、サンプルは、圧力、重力
、真空、キャピラリー又は電気泳動の作用によってキャピラリーチューブ中に導
入される。

【００４８】ビームエキスパンダーは、光源と複数容器の平面アレイとの間に配置され得る
。ビームエキスパンダーは、複数容器をより効率的に照射するように、光源の収
束した線を変化し得る。ビームは、必要に応じて、アレイに接触する前に、例え
ば、鏡、フィルター又はレンズにより変化又は再指向され得る。

【００４９】コリメート焦点調節レンズ(collimating focusing lens)は、光源と複数容器
の平面アレイとの間に配置され得る。

【００５０】上記構成部分は、迷光を実質的に、そして望ましくは完全に排除するように配
置される。２種類の迷光が存在する。迷光の一種類は、側壁及び内腔を有する容
器から生じるグレアである。迷光の他の種類は、複数容器の平面アレイ中の他の
容器の存在に起因するものである。この種の迷光は、「クロストーク」と呼ばれ
る。クロストークは、本質的に、他の容器からのグレアである。従って、この２
種類のグレアを実質的に、そして望ましくは完全に排除するために、サンプルと
フラットフィールドレンズとの間に十分な距離が必要とされる。少なくとも約１
／ｒ²（即ち、距離ｒの増加につれての迷光の減少率）又は１/ｄ（ｒ＝半径及び
ｄ＝直径）の距離は、容器からのほとんどのグレアを排除する。グレアは、容器
中の完全に吸収する物質を測定することによって評価され得；検出される任意の
光が存在する場合、その光はグレアに起因する。

【００５１】好ましくは、生のデータセットが、単一ダイオードエレクトロフェログラムへ
と抽出され、そしてＰＤＡにて収集された透過光の強度を吸光値に変換すること
によって分析される。エレクトロフェログラムにおける二乗平均平方根 (root-m
ean-squared) ノイズは、検体ピークのうちの１つの付近のベースライン区画を
使用して得られる。本発明に従い得られたデータを収集かつ分析する好ましい様
式は、実施例１に示される。

【００５２】数学的平滑化が、シグナルをゆがめることなくノイズを有意に低減させるため
に使用され得る。例えば、実施例１を参照のこと。この点において、可能な限り
速いデータ獲得速度が、平滑化のためのより多くのデータポイントを提供するた
めに用いられるべきである。ボックスカー平滑化（例えば、２５ポイントボック
スカー平滑化）が、数学的平滑化の好ましい方法である。

【００５３】上記を考慮すると、本発明はさらに、上記方法で使用するためのシステムを提
供する。この本システムの好ましい実施態様は、本明細書中に示される実施例及
び図１に例示されている。本システムは、以下：（ｉ）１以上の吸収種により吸収される光の少なくとも１つの波長を含むか、
またはそれらから本質的になる光源であって、該波長の吸収が検出される、光源
、（ｉｉ）複数容器の平面アレイであって、該複数容器の各々に少なくとも１つ
の吸収種を含有するサンプルが配置され得る、複数容器の平面アレイ、並びに（ｉｉｉ）光源と整列しており、かつ複数容器の平面アレイを出る迷光が検出
手段に到達する前に分散するような距離で該複数容器の平面アレイと整列かつ並
行して配置されている検出手段、を備える。従って、検出手段に到達する光は、実質的に、複数容器を通じて透過
した光のみである。この様式において、複数容器の平面アレイからの出力の強度
が最も強く、それ故、検出手段からの出力強度もまた最も強く、それによって、
複数容器の平面アレイ中の各容器に対する検出手段からの強度出力の決定を容易
にする。好ましくは、この距離は、複数容器の平面アレイ中の容器の断面距離の
、少なくとも約１０倍、より好ましくは、少なくとも約１００倍であり、この断
面距離は、複数容器の平面アレイの平面に対して直交方向で測定されたものであ
る。複数容器の平面アレイ中のサンプルによる光の吸収検出は、該サンプル中の
吸収種の存在を示す。

【００５４】上記のように、光源と複数容器の平面アレイとの間の距離は、本発明の実施に
重要ではない。しかし、光源と複数容器の平面アレイとの間の距離が短くなると
、より多くの光が、複数容器の平面アレイによって受容されるであろう。光源と
複数容器の平面アレイとの間の距離が大きくなると、複数容器の平面アレイによ
って受容される光がより均一になるであろう。複数容器の平面アレイが受容する
光がより多くなると、検出がより高感度になるであろう。

【００５５】複数容器の平面アレイに対する光源の位置もまた、光源が複数容器の平面アレ
イを照射する限り本発明の実施に重要ではない。他の考慮すべき事項は、前述の
段落で述べた通りである。

【００５６】好ましくは、複数容器の平面アレイと検出手段との間の距離は、複数容器の平
面アレイ中の容器の断面距離の少なくとも約１０倍、より好ましくは、少なくと
も約１００倍であり、この断面距離は、複数容器の平面アレイの平面に対して直
交方向で測定されたものである。従って、複数容器の平面アレイと検出手段との
間の距離は、好ましくは、約１ｃｍ〜約３０ｃｍ、より好ましくは約３ｃｍ〜約
３０ｃｍ、及び最も好ましくは約１０ｃｍ〜約３０ｃｍである。キャピラリーチ
ューブが複数容器として使用される場合、好ましくは、この距離は、約１ｃｍ〜
約３０ｃｍ、より好ましくは約３ｃｍ〜約３０ｃｍ、及び最も好ましくは、約１
０ｃｍ〜約３０ｃｍである。

【００５７】「複数容器」とは、少なくとも３個以上、好ましくは少なくとも約１０個、よ
り好ましくは少なくとも約９０個を意味し、及び望ましくは可能な限り多くが、
本明細書中に記載されるシステムによって収容され得る。複数容器は任意の適切
な容器を含み得るが、望ましくは、この複数容器は、光源からの光が、光源に面
する容器の壁を通過し、この容器中のサンプルを通過し、そして検出手段に面す
る容器の壁を通過することを可能にする。従って、容器の壁は、望ましくは透明
であるが、いくつかの場合には、容器の壁は半透明であり得る。この点において
、容器中のサンプルが照射され、そしてこのサンプル中の吸収種によって吸収さ
れない光が検出手段によって検出可能であるように、容器の壁の少なくとも一部
が光源からの光の通過を可能にする限り、必ずしも容器の壁全体が上記のように
光源からの光の通過を可能にする必要はない。好ましくは、複数容器は、円柱状
キャピラリーチューブを含む。円柱状キャピラリーチューブが使用される場合、
好ましくは、検出手段と複数容器の平面アレイとの間の距離は、キャピラリーチ
ューブの直径の少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍であ
る。好ましくは、複数容器の平面アレイは、少なくとも約１０個の円柱状キャピ
ラリーチューブ、より好ましくは少なくとも約９０個の円柱状キャピラリーチュ
ーブ（例えば、９６個の円柱状キャピラリーチューブ）を備え、そして望ましく
は、可能な限り多くが、本明細書中に記載のシステムによって収容され得る。

【００５８】平面アレイは、望ましくは、少なくとも１つのコントロール容器をさらに備え
る。しかし、光源が安定である場合、コントロール容器は必ずしも必要ではない
。

【００５９】一般に、平面アレイに使用される容器は、滑らかな表面、均一な厚みの壁を有
するべきであり、そしてサンプル中の吸収種によって吸収される光の波長の範囲
にわたって透明である物質から構成されるべきであり、この吸光度が検出又は測
定される。容器について好ましい物質としては、石英、溶融シリカ（特に、キャ
ピラリーチューブに対して）及びガラスが挙げられるがこれらに限定されない。
容器の断面は、本発明の方法に重要ではない。しかし、容器の断面が小さくなる
と、高度に多重化した適用においてこの容器がより有用である。なぜなら、より
多数の容器が、より小さな空間容積で使用され得るからである。同様に、容器の
壁の厚さは、本発明の方法に重要ではない。この壁は、容器の構造完全性を維持
するために十分な厚さであるべきだが、光が容器を通過するのを不利に妨げるよ
うな厚さではない。容器の形状もまた、本発明の方法に重要ではない。容器は、
任意の適切な形状を有し得る。望ましくは、容器の形状は、密に詰められるよう
に資され、かつこの容器による迷光の発生を最小限にする。

【００６０】円柱状キャピラリーチューブは、本発明の状況における使用に好ましい容器で
ある。キャピラリーチューブは、多数の供給元（Polymicro Technologies, Inc.
を含む）から市販されている。キャピラリーチューブは、好ましくは、ポリマー
（例えば、ポリイミド）でコーティングされ、それにより機械的に安定である。
コーティングは、光源により照射される領域では除去されなければならない。エ
キシマーレーザーは、ポリマーコーティングを除去するために使用され得る。

【００６１】好ましくは、平面アレイ中の複数容器は、互いに実質的に並行に配置される。
また好ましくは、平面アレイ中の複数容器もまた、互いに実質的に隣接して配置
される。例えば、複数容器がキャピラリーチューブである場合には、キャピラリ
ーチューブは、それらの並行する長さに沿って実質的に連続するように密に詰め
られ、隣接するキャピラリー間に実質的に空間を残さない。アレイのキャピラリ
ー壁直径又は他の特性におけるわずかな不一致が、それらの長さ全体に沿って接
触することを妨げ得るが、実質的に隣接するキャピラリーチューブは、それらの
長さの全て又は一部に沿って互いに物理的に接触し得る。この平面アレイは、望
ましくは、フリッカーノイズを低減するように固定して搭載される。

【００６２】本システムの使用中に、多量の熱が特に複数容器の平面アレイの近辺に発生す
る場合、システムは、望ましくは、冷却手段をさらに備える。過剰の熱は、複数
容器の平面アレイ中の隣接する容器の間に機械的な振動を引き起こし得（例えば
、密に詰められたキャピラリーチューブの場合等）、これは次いで、過剰なノイ
ズを引き起こし得る。例えば、検出を受ける容器の部分に並行である窒素ガスの
層流が、使用され得る。

【００６３】検出手段は、吸収を検出する任意の適切な手段を含み得る。２次元画像アレイ
検出器が使用され得るが、好ましくは、検出手段は、望ましくは、リニアーアレ
イ中に配置される、複数の吸収検出素子（例えば、複数の感光性素子）を備える
。望ましくは、検出手段は、複数容器のリニアーアレイと並行かつ整列している
。検出手段は、望ましくは、フリッカーノイズを低減するように固定して搭載さ
れる。

【００６４】好ましくは、リニアーフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）が使用される。望ま
しくは、ＰＤＡは、線形画像センサーチップ、ドライバー／増幅器回路及び温度
制御器を組み込んでいる。この温度制御器は、望ましくは、約０℃〜約−４０℃
の温度に、センサーチップを熱電気的に冷却する。温度の低下は、ダークカウン
トを低下させ、そして温度ドリフトを最小限にし、それにより広範なダイナミッ
クレンジにわたって信頼できる測定がなされることを可能にする。ドライバー／
増幅器回路が、望ましくは、Ｉ／Ｏボードを通じてコンピュータに接続され、こ
れはまた、好ましくは、線形画像センサーにより必要とされる、マスタークロッ
クパルス及びマスタースタートパルスを提供するパルス発生器として働く。ＰＤ
Ａは、画像を線形で（二次元的ではなく）記録する。好ましくは、獲得されたデ
ータは、ハードディスクにリアルタイムで直接書き込まれる。また、好ましくは
、ＰＤＡの少なくとも約１０個までの素子からのグナルが、リアルタイムで表示
される。

【００６５】あるいは、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）又は電荷注入デバイス（ＣＩＤ）が使
用され得る。しかし、ＣＣＤは、二次元で記録し、これは、あまり効率的ではな
く、よりコンピュータメモリを必要とし、より遅く、全ての位置が読み込まれる
ことを必要とし（ＰＤＡのような単一ラインではない）、そして低減した電子容
量を有する。さらに、ＣＣＤは、各位置に１００，０００個のみの電子を有する
が、ＰＤＡにおける各素子は、位置あたり画素あたり５９００万電子を保存し得
；従って、検出感度が、検出され得る電子数の平方根に関連することを考慮する
と、ＰＤＡは、数オーダーの規模でＣＣＤよりも感度がよい。

【００６６】好ましくは、ＰＤＡは、線形に整列した画素を備え、この場合において、複数
容器の平面アレイ中の各容器は、望ましくは、キャピラリーチューブであり、そ
して各キャピラリーチューブは、好ましくは、約１０個未満の画素、より好まし
くは約７〜９個の画素に光学的に結合されており、これらのうちいくつかは、キ
ャピラリーの壁に結合され、そしてこれらのうちいくつかは、隣接するキャピラ
リーの壁の間の任意の空間に結合され、そしてこれらのうち少なくとも１つが、
キャピラリーの内腔に結合されている。従って、キャピラリーの壁により生じた
迷光は、画素をステーク(stake)する前に分散され、そして／または側壁に結合
した画素に閉込められ、そして一般的に、キャピラリーの内腔に結合した画素に
よって生じるシグナルに影響しない。キャピラリー：光学的に結合した画素の比
率は、好ましくは、約１：１０未満であり、より好ましくは、約１：７〜約１：
９であり、一方、光学的に結合した画素に対するキャピラリーの比率は、整数の
比率である必要はない。この様式におけるキャピラリーと画素との間の光学的な
結合は、本システムを極度に安定化する。

【００６７】ノイズが、実施例１に例示されるように、最小のベースライン変動レベル（そ
れ故、本システムの検出限界（ＬＯＤ））を最終的に決定する場合、可能な限り
高い光子カウントを有することが所望される。好ましくは、少なくとも約３００
，０００個、より好ましくは、少なくとも約３００万個、及び最も好ましくは、
少なくとも約３０００万個の光子が使用される。さらに、制御不能な変数に起因
するベースラインドリフトをデータ獲得の期間にわたって許容するために、ダイ
オードは、好ましくは、８５〜９５％のみ飽和する。

【００６８】光源は、好ましくは、約１８０ｎｍ〜約１５００ｎｍの範囲にある波長を含む
か、またはそれらから本質的になる。適切な光源の例としては、水銀、タングス
テン、ヨウ素、亜鉛、カドミウム、キセノン、重水素等が挙げられる。望ましく
は、光源は、吸収種によって吸収される光の波長を含むか、又はそれらから本質
的になり、該波長の吸収が検出される。光のどの波長が目的の吸収種（即ち、そ
の吸収が本発明に従って検出又は測定される吸収種）によって吸収されるかは、
標準的な吸収分光計を使用して決定され得る。あるいは、このような情報を提供
する分光学的表が、例えば、NISTを通じて当該分野において利用可能である。望
ましくは、より少量の吸収種が検出され得るように、最大吸収される光の波長は
所定の吸収種が検出又は測定されるように選択される。一般的に、光源は、複数
容器の平面アレイがある平面に直交して、複数容器の平面アレイに到達する光を
提供する。光源は、点源であり得る。また好ましくは、光源は、約０．５ｍＶ〜
約５０ｍＶの電力出力を有する。光源は、ＡＣ又はＤＣであり得るが、ＤＣが好
ましい。光源に由来する任意のフリッカーノイズは、光の二重ビームを使用する
ことによって排除され得る。

【００６９】望ましくは、光学フィルターは、複数容器の平面アレイと検出手段との間に配
置される。光学フィルターは、吸収種によって吸収される光源からの光の少なく
とも１つの波長を選択し、この波長の吸収が検出されるべきものである。。光学
フィルターは、複数容器の平面アレイと検出手段との間に配置された光学フィル
ターに加えて、またはこの代わりに、光源と複数容器の平面アレイとの間に配置
され得るが、光源と複数容器の平面アレイとの間へのシングル光学フィルターの
配置は、サンプルによるその後の蛍光が検出手段に到達することをブロックしな
いので不利である。対照的に、複数容器の平面アレイと検出手段との間への光学
フィルターの配置は、サンプルの蛍光が検出手段に到達することをブロックする
。

【００７０】また望ましくは、フラットフィールドレンズが、複数容器の平面アレイと検出
手段との間に配置される。フラットフィールドレンズは、複数容器の平面アレイ
中の各サンプル中の１以上の吸収種によって吸収されない光を検出手段と結合さ
せる。フラットフィールドレンズ以外のレンズが本発明の状況において使用され
得るが、視野全体を均一に画像化しないので不利である。結果的に、視野の縁は
ゆがめられ、そしてレンズの視野の縁に配置された複数容器の平面アレイ中の容
器の吸収は、検出も測定もされ得ない。レンズは、複数容器の平面アレイの画像
を検出手段（好ましくは、ＰＤＡである）の面上に反転させる。

【００７１】好ましくは、本システムは、フラットフィールドレンズによる光の結合を光源
から遮蔽するシールドをさらに備える。この様式では、レンズからの光のみが検
出手段上に収束する。

【００７２】本システムにおけるキャピラリーチューブの平面アレイ中の各キャピラリーに
対するローダミン６Ｇについての検出限界は、約１．８×１０^-8Ｍである。隣接
するキャピラリー間のクロストークは、約０．２％未満である。

【００７３】本システムが、キャピラリーチューブなどを利用する場合、本システムは、キ
ャピラリーチューブにサンプルを導入するための手段をさらに備える。好ましく
は、サンプルは、圧力、重力、真空、キャピラリー又は電気泳動の作用によって
キャピラリーチューブ中に導入される。

【００７４】本システムは、光源と複数容器の平面アレイとの間にビームエキスパンダーを
さらに備え得る。ビームエキスパンダーは、複数容器をより効率的に照射するよ
うに、光源の収束した線を変化させ得る。ビームは、必要に応じて、アレイに接
触する前に、例えば、鏡、フィルター又はレンズにより変化又は再指向され得る
。

【００７５】本システムは、光源と複数容器の平面アレイとの間にコリメート焦点調節レン
ズをさらに備え得る。

【００７６】上記コンポーネントは、上記のように、迷光を実質的に、そして望ましくは完
全に排除するように配置される。従って、２種類のグレアを実質的に、そして望
ましくは完全に排除するために、サンプルとフラットフィールドレンズとの間に
十分な距離が必要とされる。少なくとも約１／ｒ²又は１/ｄの距離（ｒ＝半径及
びｄ＝直径）は、容器からのほとんどのグレアを排除する。望ましくは、上記コンポーネントは、耐光性構成物（例えば、光学テーブル(o
ptical table)に取り付けられた金属箱）中に集合的に配置される。また、望ま
しくは、このコンポーネントは、光学テーブル上の中心に置かれる。

【００７７】（実施例）本発明は、以下の実施例によってさらに実証される。以下の実施例は、本発明
を例示するために提供されるが、その範囲をいかなる様式にも限定することを意
図しない。

【００７８】フルオレセイン(F)、ローダミン6G、5(6)-カルボキシフルオレセイン(5CF、6C
F)、β-ラクトグロブリンA及びB(BLGA及びBLGB)、L-1-トシルアミド-2-フェニル
エチルクロロメチルケトン(TPCK)処理トリプシン、CHES(2-[N-シクロヘキシルア
ミノ]エタン−スルホン酸)、トリシン(tricine)(N-トリス[ヒドロキシメチル]メ
チルグリシン)、Trizma(登録商標)-Base(トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタ
ン)、酢酸アンモニウム、CaCl₂、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ピルビン酸ナ
トリウム(99+%)、β-ニコチンアミンアデニンジヌクレオチド(還元形態)(β-NAD
H)、L-乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH-5（M₄）98+%イソ酵素懸濁液(2.1M (NH₄)₂SO₄
中))、及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を、Sigma Chemical Co.(St. Louis, M
O)から購入した。実験前に、β-NAD⁺及びβ-NADHの溶液の両方を新しく調製し、
そして冷蔵庫中で維持した。NADH溶液を黒いテープで覆い、光に曝されることを
防いだ。Tween 20を、Aldrich Chemical Co.(Milwaukee, WI)から購入した。2,7
-ジアセテート，ジクロロ−フルオレセイン（DADCF）を、Acros (Fair Lawn, NJ
)から入手した。エチジウムブロミド(EtBr)を、Molecular Probes, Inc.(Eugene
, OR)から入手した。50bp及び100bp DNAラダーを、Life Technologies(Gaithers
burg, MD)から購入した。0.2%(w/w)PVPを含有する1×TBE（0.089M Tris，0.089M
ボレート、及び0.002Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA）水）緩衝液に適切な量
のこれらのフルオレセインを溶解することによって、CZEのサンプル溶液を調製
した。MEKC実験については、検体及び緩衝液添加物を、Aldrich (Milwaukee, WI
), J.T. Baker (Phillipsburg, NJ)及びSigma Chemical Co.から購入した。1.0M
HCl、250mM Brij-Sストック溶液、アセトニトリル及び2-プロパノールの適切な
アリコートを水に添加することによって、泳動用緩衝液を調製した。0.1M HCl又
は0.1M NaOHストック溶液を使用してpHを2.4に調整し、そしてpHメーターにより
確認した。脱イオン水にプレミックスTBE緩衝液粉末(Amresco, Solon, OH)を溶
解することによって1×TBE緩衝液を調製した。2%(w/v)の1,3000,000MW PVPをこ
の緩衝液に溶解し；2分間振盪し、そして1時間静置して、泡を取り除くことによ
り、実施例２で使用したコーティングマトリクスを作製した。ポリ（エチレンオ
キシド）（PEO）を、Aldrich Chemical (Milwaukee, WI)から入手した。2%(w/v)
600,000MW PEOをこの緩衝液に溶解することによって、実施例２で使用したふる
い分け（シービング）(sieving)マトリクスを作製した。全ての物質が溶解し、
そして泡が全く確認され得なくなるまでこの溶液を一晩激しく攪拌した。実施例
３での全ての緩衝液をCorning (登録商標) Filter System, 0.22μmセルロース
アセテートフィルター(Corning, NY)又はμStar LB^TM、0.22μmセルロースアセ
テート非発熱性フィルター(Coaster, Cambridge)に通してろ過し、そして使用前
に脱気した。実施例３で溶液を調製するために使用した水を、Mili-Q水精製シス
テム(Millipore, Worcester, MA)で脱イオン化した。無菌0.2ml 96ウェルプレロ
ード(preloaded)プレートを、Marsh Biomedical Products, Inc. (Rochester, N
Y)から入手した。リン酸ナトリウム（一塩基性）（NaH₂PO₄・H₂O）をFisher(Fair
Lawn, NJ)から購入した。実施例４で使用された全ての水をMillipore水精製シ
ステムにより精製して、酵素が混入していないことを確認した。

【００７９】（実施例１）本実施例は、シングルリニアーフォトダイオードアレイ検出器を用いる多重化
キャピラリー電気泳動システムを実証する。

【００８０】有効長35cm及び全長55cmの96個の溶融シリカキャピラリー (内径75μm;外径15
0μm;Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) を並べて詰めた。エキシマーレー
ザービームを使用して、各キャピラリーの同じ領域中のポリイミドコーティング
を焼いて、各キャピラリーに導入されるべきでありかつその中に含まれるべきで
あるサンプルを、光源からの光が通過するための「ウインドウ」を提供した。キ
ャピラリーアレイの底（即ち、出口）端にて、キャピラリーを一緒に束ねて、同
時に緩衝液で満たしリンスすることを可能にした。注入端にて、キャピラリーア
レイを広げ、そして銅プレート上にマウントして、サンプル導入のために、96ウ
ェルマイクロタイタープレートに適した寸法の8×12形式を形成した。さらに、9
6の金コートピン(Mill-Max Mfg. Corp., Oyster Bay, NY)をキャピラリーチップ
の隣に配置し、個々の電極として使用した。サンプル及び緩衝液トレイを移動し
、そしてキャピラリー入口の下に整列させた。この様式で、キャピラリーアレイ
は決して物理的に移動しなかった。Spellman (Plainview, NY) の高電圧DC電源
は、電気泳動のための動力を提供した。96個全ての電極を同じ電源に接続した。

【００８１】光源、光学（即ち、干渉）フィルター，キャピラリーアレイホルダー、カメラ
レンズ及びPDA検出器を、光学テーブルに取り付けられた耐光性金属箱内に配置
した。全ての光学コンポーネントを光学テーブルの中心12.6cmに置いた。光源と
して、12Vタングステンランプ又は254nm携帯水銀ランプ(model E-09816-02; Col
e-Parmer, Vernon Hills, IL)を、それぞれ、可視吸収検出又は紫外吸収検出に
対して使用した。本発明の方法で使用するためのシステムの一覧図を図1に示す
。タングステンランプ（1.1cmのフィラメント長を有する）の場合には、円柱レ
ンズを通して光を最初に拡大させ、キャピラリーチューブのアレイ全体の「ウイ
ンドウ」（これは、1.5cmの結合幅を有する）を均一に覆った。この携帯水銀ラ
ンプは、充分に長い放射長（7cm）を有することが証明され、従って、アレイ全
体を照明するためにビームエキスパンダーを必要としない。キャピラリーアレイ
から透過した光は、干渉フィルター(Oriel, Stamford, CT)及び石英レンズ(Niko
n, Melville, NY; f.1.=105mm; F♯=4.5)を通過した。この干渉フィルターは、
吸収波長を規定するために用いられた。名目変位倍率1.5で、キャピラリーアレ
イの倒立像を、石英レンズによってPDA面上に作成した。PDA(model S5964, Hama
matsu, Bridgewater, NJ)は、線形画像センサーチップ、ドライバー／増幅器回
路及び温度制御器を組み込んでいた。線形画像センサーチップは、1,024ドーデ
ス(dodes)を有し、その各々は、幅25μm及び高さ2,500μmであった。温度制御器
は、熱電気的にセンサーチップを0℃に冷却し、ダークカウントを低減し、かつ
温度ドリフトを最小限にし、それにより広範なダイナミックレンジにわたって信
頼できる測定がなされることを可能にする。National Instrument PCI E シリー
ズ多機能 16-ビット I/Oボードを介して、内蔵型ドライバー／増幅器回路をIBM
互換性コンピュータ(233MHz Pentium, Packard Bell)に接続した。このI/Oボー
ドはまた、パルス発生器として働き、線形画像センサーによって必要とされるマ
スタークロックパルス及びマスタースタートパルスを提供した。PDAを作動させ
かつデータを獲得するために使用される全てのコードを、National Instruments
Labview 4.1ソフトウェア(Austin, TX)を使用して構内(in-house)に書込んだ。
キャピラリーアレイにより規定される平面とPDA検出器素子により規定される平
面との間の距離は３０ｃｍであった。

【００８２】 1,024素子PDA検出器を使用して、各CEの泳動に対して非常に多量のデータを生
成した。10Hzのデータ獲得速度での１時間の泳動は、70Mbのデータを生じた。従
って、全てのデータをリアルタイムでハードディスクに直接記録した。PDAの10
個までの素子からのシグナルを、Labviewプログラムにおいてリアルタイムで表
示し得た。より多くの画素のリアルタイムモニタリングを、本発明者らのコンピ
ュータのビデオ速度によって制限した。生のデータセットを抽出して、別の構内
Labviewプログラムによってシングルダイオードエレクトロフェログラムデータ
に抽出した。Microsoft Excel 97(Microsoft, Seattle, WA)及びGRAMS/32 5.05
(Galactic Industries, Salem, NH)を使用して、データの処理および分析を行な
った。連続的なブランク参照（即ち、コントロール）として10番目のキャピラリ
ー（緩衝溶液のみ）を使用して、PDAにて収集された透過光の強度を吸光度の値
に変換した。検体ピークのうちの１つに近いベースライン区画を使用して、全て
のエレクトロフェログラムにおける二乗平均平方根（rms）ノイズを得た。この
ベースライン区画は、目的のピークとおおよそ同じ幅であった。

【００８３】キャピラリーゾーン電気泳動実験については、洗浄のために、キャピラリーア
レイを最初にメタノールで、次いで水で洗い流した。緩衝液（pH8.0，0.2% (w/w
)ポリビニルピロリドン（PVP）を含有する1×TBE）をキャピラリーアレイ中に満
たし、一方、注入端を緩衝液トレイに浸した。緩衝液で満たした後に、満たした
端部を第2の緩衝液トレイに浸した。検体を96ウェルマイクロタイターサンプル
プレート（1μl/ウェル）中に入れて、そして11kV（100V/cm）にて6秒間カソー
ドにて注入した。泳動用電圧もまた11kVであった。CE実験については、泳動の間
に緩衝液を用いてキャピラリーを1分間洗浄した。MEKC実験については、キャピ
ラリーアレイを最初に0.1M HClで、次いで水で洗い流した。使用した緩衝液添加
物は、クロロスルホン酸によるBrij-30のスルホン酸化により作製されたBrij-S
であった (Dingら, Anal. Chem. 70: 1859-1865 (1998))。10kVにて3秒間カソー
ドにて検体を注入し、そして同じ電圧で泳動した。

【００８４】タングステンランプ及びPDAを使用して得られた代表的な96-キャピラリーアレ
イ画像を図２Ａに示す。この図２は、カウント対画素番号のグラフであり、そし
て96-キャピラリーアレイ全体の画像をＰＤＡ上に表示している。カウント対画
素番号のグラフであり、そして96-キャピラリーアレイの1つの領域の画像をPDA
上に表示している図２Ｂにおいて理解され得るように、各キャピラリーの中心は
、画像中の「ピーク」（（ａ）により示される中心ピーク）に対応する。２つの
隣接するキャピラリー間に、通常、透過「ピーク」（（ｂ）により示される間隔
ピーク）をまた作製する間隔が存在する。これらの「間隔ピーク」は、通常、図
２Ｂにおいて示されるように、この画像化システム中の「中心ピーク」よりもわ
ずかに広く、かつより大きな強度（この場合は飽和している）を有する。アレイ
の詰め込みが一様でない場合、2つの隣接するキャピラリーは、互いに重複し得
、その結果、それらの間の「間隔ピーク」は観察されない。間隔を含んで、各キ
ャピラリーをPDA中の9〜11ダイオード上に画像化した。96-キャピラリーアレイ
は、全体として912画素をカバーした。図２Ｂにおいて理解され得るように、「
中心ピーク」と「間隔ピーク」との間に、キャピラリーの壁に対応する「谷」（
（ｃ）により示される）が存在する。キャピラリーアレイ画像をPDA上に十分に
焦点調節した場合、これらの谷の強度は最小になった。この特性を使用して、最
良の焦点調節を生じさせた。中心ピークに対応するダイオードを、対応するキャ
ピラリーに対する吸収検出器として使用した。それらの強度は、このダイオード
の飽和値のおおよそ40%〜90%である。キャピラリーアレイに対して比較的均一な
強度分布を維持するために、本発明者らは、光源の放射長がキャピラリーアレイ
の幅（1.5cm）よりも少なくとも2倍長いべきであるということを見出した。UV光
源として使用された携帯水銀ランプ（7cm放射長）は、アレイ全体の均一な照明
のために十分な長さであった。しかし、可視光源として使用されたタングステン
ランプは、たった1cmの放射長しか有しておらず、従って、光源を拡大して照明
条件を満たすために円柱レンズを追加する必要があった。図２Ａは、アレイの中
心から縁までの光学スループットにおける2倍変動を示す。これは、検出限界が
アレイにわたり

【００８５】

【化１】

【００８６】倍変動することを意味する。しかし、強度がブランク（緩衝液）に最初に比例し
ない限り、かつlogスケールが使用（Beerの法則）されない限り、感度（シグナ
ル）は、2倍変動する。水銀ランプがアレイから非常に離れて配置されたとする
と、強度分布は、図２Ａで示される強度分布よりも非常により均一であった。

【００８７】機械的スリットは画像を規定するために使用されなかった。円柱状キャピラリ
ーはアレイ中の他のダイオード上に実際に光を屈折させるが、アレイからカメラ
レンズまでの距離を、曲率半径よりも大きい距離に維持した。各ダイオードは、
全てのキャピラリーに対して平均化された低レベルの迷光を受ける。これは、図
２における「谷」に限界を設定するが、クロストークにごくわずかに寄与する。
キャピラリーの直径を横切る光線は、直線的に進み、そしてPDAにて適切に画像
化される。従って、感度（吸収路の長さ）もまた、最適化される。機械的なスリ
ットが存在せず、かつ各キャピラリーが9画素に広がると、このシステムは非常
に安定である。アライメント及び焦点調節の定期的なチェック（例えば、一週間
毎のチェック）が実行されるべきであるが、再アライメントも再焦点調節も必要
ない。

【００８８】アレイ検出器についてのノイズ源の明確な理解が重要である。なぜなら、ノイ
ズは、最小のベースライン変動レベル（従ってこのシステムのLOD）を最終的に
決定するからである。PDAのダークノイズは、暗電流ショットノイズ、ダイオー
ドリセットノイズ及び回路ノイズに寄与し得、これらは、ダイオード中に発生す
る光電子の数（即ち、入力光強度）に依存しない。製造業者により提供されたデ
ータに従うと、PDAのダークノイズ（s_d）は、0℃で約3,200電子である。ショッ
トノイズは、一般的に、励起源からの光子のランダムな発生及びダイオード接合
部中の光電子のランダムな発生と関連する組み合せノイズとして規定され、そし
て各ダイオードで計測された光電子の数の平方根（n_e）^1/2に等しい。フリッカ
ーノイズ（以下を参照のこと）の非存在下でのPDAの総rmsノイズレベルは、以下
の方程式を使用して表現され得る：ｓ＝ｓ_d＋（ｎ_e）^1/2 （１）従って、可能な限り高い光子カウントを有することが所望される。ダイオードの
電子井戸容量は、一般的に、感知接合部の面積に正比例する。長いが狭いダイオ
ードは、ダイナミックレンジ及び空間分解能（1次元において）を同時に最大限
にする。これには、冷却が強制的となるような暗電流の増加が付随する。

【００８９】本研究で使用されたPDAについては、各ダイオードについての飽和電荷は、約2
5pC又は1.56億電子である。これは、以前の研究で使用されたPDAのほぼ3倍であ
る (Culbertsonら, Anal. Chem. 70: 2629-2638 (1998))。しかし、実際の吸収
検出において、ダイオードは、データ獲得期間にわたっての制御不能な変数に起
因するベースラインドリフトに余地を残すために85〜90％のみ飽和しているべき
である。ｓ_dが3,200電子に等しいことを考慮して、85％飽和ダイオードについて
の総rmsノイズを、方程式(1)に従い14,700電子であると算定した。吸光度単位へ
のこの値の変換は、4.7×10^-5の吸光度ノイズ限界を提供した。

【００９０】実際のノイズを、シングルダイオードエレクトロフェログラムから測定した。
タングステンランプを光源として使用し、そして入力光強度（それ故、ダイオー
ド接合部に発生した光電子数）を制御するためにキャピラリーアレイの後方で前
後に移動させた。1つのダイオードの測定されたrmsノイズレベルは、ダイオード
接合部で発生した光電子数の平方根に直線的に比例する。曲線の線形回帰のイン
ターセプト(intercept)は、方程式（1）に従うrmsダークノイズに関連し得る。
この測定されたインターセプト値は、3,266電子であった。この値は、製造業者
によって与えられた値（即ち、3,200電子）に近かった。また、測定された傾き0
.92は、理論値1に近かった。ダイオードが、タングステンランプを光源として用
いて25％よりも飽和した場合、主要なノイズ源はショットノイズであった。これ
は、熱電気的に冷却されたPDAの比較的低いダークノイズ、及びバッテリー駆動D
Cタングステンランプの優れた安定性（従って、無視可能なフリッカーノイズ）
に寄与し得た。PDAを室温で使用した場合、rmsノイズレベルは少なくとも5倍高
かった。85％飽和レベルで測定されたダイオードのrmsノイズは、4.8×10^-5の吸
光度単位に変換され得る。この吸光度単位は、予期されたノイズ限界4.7×10^-5
に近い。携帯水銀ランプを使用した場合、1つのダイオードについて測定された
平均rmsノイズは、85％飽和レベルで9.0×10^-5であった。これは、予期された値
よりもおよそ2倍高かった。これは、水銀ランプと関連するさらなる強度フリッ
カーノイズに起因すると考えられる。

【００９１】数学的平滑化は、適切に使用される場合には、シグナルをゆがめることなく有
意にノイズを低減し得る。時間応答を犠牲にすることなくより多くのデータポイ
ントが平滑化のために使用され得ることを保証するために、より高速のデータ獲
得速度が用いられる必要がある。PDA検出器については、データ獲得速度は、デ
ジタル化速度及び露光時間によって制限される。本発明者らのシステムにおける
A/D変換器は、25kHzで機能し得る。従って、40ミリ秒は、1024アレイにおける各
データポイントに対する最小の露光時間である。本実験においてタングステン又
は水銀ランプを光源として用いると、全てのダイオードについておよそ85％の飽
和レベルを達成するためには40ミリ秒の露光時間で十分であった。通常、検体ピ
ークは、幅において10秒よりも大きく、そして９つのデータポイントは、代表的
なクロマトグラフィー又は電気泳動ピークを表すに十分である。従って、25まで
のデータポイント（時間では1秒）が、検体ピークの幅をほとんど犠牲にせずに
平滑化のために使用され得る。異なる種類の平滑化アプローチを比較し、そして
ボックスカー平滑化が、ここでのノイズを抑制する最も効率的な方法であること
が証明された。25ポイントボックスカー平滑化の後に、平均rmsノイズは、タン
グステンランプを光源として用いて、85％飽和レベルで1.33×10^-5AUに低下した
。この事実後、平滑化をダイオードのダイナミックレンジ（電子井戸の深さ(dep
th)）の増加と考えることができる。観察された増強係数は、方程式（1）によっ
て推定された係数5に近い。

【００９２】このキャピラリーアレイ吸収検出システムを使用して達成可能な実際の検出限
界を証明するために、泳動用緩衝液として1×TBEを使用して、１×TBE緩衝溶液
中でローダミン6Gの電気泳動を4×10^-7Mの濃度で実行した。このサンプルを、8c
mの高さの差異で流体力学的に6秒間注入した。サンプルのスタッキング(stackin
g)は、これらの条件下で予期されなかった。キャピラリー電気泳動を250V/cmで
行なった。10nm帯域幅の干渉フィルターによって規定される、552nmの波長で検
出を実行した。アレイ中の1つのキャピラリーからのエレクトロフェログラムを
図３に示す。この図３は、吸光度対フレーム番号のグラフであり、この図におい
ては、上のトレースは生のデータを表し、そして下のトレースは、25ポイントボ
ックスカー平滑化したデータを表す。ローダミン6GピークについてのS/Nは、約8
であり（ピーク高0.0002及びフレーム1950とフレーム2250との間のrmsノイズ2.6
×10^-5に基づく）、これは、方程式（1）によって推定される検出限界に近かっ
た。25ポイントボックスカー平滑化の後に、図３に示されるように、S/N比は、
約45に改善された。注入されたローダミン6Gに対して得られた1.8×10^-8M LOD（
S/N=2）は、大部分の商業的なシングルキャピラリー機械が達成し得たものに匹
敵する。

【００９３】本実験において使用された携帯水銀ランプは、タングステンランプが有する変
動よりも多くの変動を有したが、以前の研究で使用されたペンライト水銀ランプ
よりも小さな変動を有した(Culbertsonら(1998), 前出)。これは、タングステン
源におけるジュール熱と比較して水銀源の放電性に固有である。バッテリー作動
タングステンランプは、本システムにおいて無視可能なフリッカーノイズを提供
したが、二重ビームスキームが、水銀ランプに起因するフリッカーノイズを打ち
消すために用いられた。この96-キャピラリーアレイ中の特定のキャピラリーに
ブランクサンプル（緩衝溶液）を注入し、そしてそれらからのシグナルを参照シ
グナルとして使用した。他のキャピラリーからのシグナルを、最も近い参照キャ
ピラリーからの参照シグナルのレベルに正規化し、次いで参照シグナルを正規化
されたシグナルから差し引いた。図４は、光強度（カウント）対フレーム番号対
差し引いた後の値（カウント）のグラフであり、この図において、（Ａ）は、ノ
イズを打ち消す前のエレクトロフェログラムであり、（Ｂ）はブランクキャピラ
リーからの参照シグナルであり、そして（Ｃ）はノイズを打ち消した後のエレク
トロフェログラムである。この図４は、約85％の飽和レベルでのシグナルに対す
るノイズ打消しスキームの効果を示す。ベースラインドリフト及び中間期ノイズ
（すなわち、シグナルピークの時間スケール上のもの）は、低減した。参照シグ
ナルに対する正規化の後に、シグナルのrmsノイズは、9.1×10^-5から6.0×10^-5A
Uに低下した。短期（高周波数）ノイズは、実際には、わずかに高かった。しか
し、これらを、上記のボックスカーアルゴリズムによって適切に平滑化した。こ
の96-キャピラリーアレイにおいて、1つのキャピラリーからのブランクシグナル
は、各々の側の10個のキャピラリーからのシグナルに対する参照として十分良好
に作用し得ることが見出された。従って、5個の参照キャピラリーのみが、96個
全てのキャピラリーのアレイにおいて必要とされた。各ダイオードにおけるデー
タがデジタイザーによって連続的に得られたので、フリッカーノイズの真の時間
的相関がなお、参照チャネルと測定チャネルとの間に存在しないことに本発明者
らは留意している。これは、短期ノイズに寄与する。本システムのこの局面は、
潜在的に、柔軟なクロック機能を備えるより洗練されたダイオードアレイによっ
て将来的に改善され得る。

【００９４】図５は、強度対フレーム番号のグラフであり、5つの中性（多環式芳香族炭化
水素）化合物のMEKC分離の結果を示す（順番に、9,10-ジフェニル−アントラセ
ン(9×10^-5M)、ベンゾ[ghi]ペリレン（1×10^-4M）、ベンゾ[a]-ピレン（6×10^-5 M）、ベンズ[a]アントラセン（4×10^-5M）、フルオランテン（1×10^-4M）及びア
ントラセン（5×10^-5M））。LOD（S/N=2）は、平滑化前では1.9×10^-6Mであり、
そして平滑化後では9.2×10^-7Mであった。最終的なノイズレベルは、上記で議論
されるように、携帯水銀ランプのより高い強度変動に起因して、CZE分離実験と
比較して約2倍高かった。

【００９５】 MEKC分離はまた、非常に高い電流を発生した（キャピラリーあたり30μA及び
アレイ全体で約3mA）。従って、多量の熱が、分離中に生じた。熱の放散を補助
するために、いくつかの冷却アプローチを用いる必要があった。この構成におい
て、分離中に最も熱い部分は検出ウインドウであったことが見出された。これは
、全てのキャピラリーがこの領域中に密に一緒に詰め込まれたためであった。キ
ャピラリーアレイにおける機械的な振動（これは、過剰な量のノイズをもたらす
）を回避するために、窒素ガスの層流をキャピラリーアレイの検出ウインドウと
並行して生じさせ、この領域中に発生した熱を分散させた。窒素冷却アプローチ
を用いた後には、この構成においては、熱の放散は問題ではなかった。

【００９６】隣接するキャピラリー間のクロストークを最小限にするために、PDA面上のキ
ャピラリーの画像は、キャピラリーの中心に対応するダイオードが隣接するキャ
ピラリーから最小の迷光を受容することを保証するのに十分に大きいことが必要
とされる。1つのキャピラリーの画像がＰＤＡ中の8個よりも多くのダイオードを
覆う場合には、クロストークは0.2％未満（これは、多重化分析では無視可能で
ある）であったことが見出された。クロストークはまた、キャピラリーアレイの
空間アライメントに関連することが見出された。本発明者らは、アレイ中の各キ
ャピラリーの画像がPDA中のダイオードに並行であることが必要とされることを
見出した。そうでなければ、1個よりも多くのキャピラリーからのシグナルが、
各ダイオード（これは、狭いが長い）を越え、そしてより多くのクロストークを
引き起こし得る。このアレイはまた、平面に限定される必要があり、でなければ
画像化は、各キャピラリーに対して均一ではないであろう。最終的に、キャピラ
リーにおける振動は、特に、高電圧が印加される場合又は冷却ファンが不適切に
配置される場合に、本システムにおいてさらなるフリッカーノイズを引き起こす
。従って、アレイ及び光学の固定支持が重要である。

【００９７】図６は96-キャピラリーアレイにおける4つの可視色素のCZE分離の結果であり
、この図において、色素の順番は、5CF (4×10^-5M)、6CF (4×10^-5M)、F (8×10 ^-5 M)及びDADCF (1.2×10^-4M)であり、水平方向は、キャピラリーの位置を表し、
垂直方向は5.3〜7.0分の移動時間を表し、上のプロットはアレイを横切る強度を
表し、そして左のプロットはキャピラリーの１つに沿った強度を表している。相
対的に均一な分離分解能およびS/N分布が、再構成された画像ファイルから観察
され得る。隣接するキャピラリー間のクロストークは、この検体濃度範囲に関し
て予期されるように観察可能ではなかった。

【００９８】多重化CEの結果は、移動時間がキャピラリー間で非常に不均一であることを示
す。これは、カラム表面に温度調節及び変動が存在しないことから予期されるは
ずである。本発明者らは、内部標準化スキームがキャピラリー間の結果を正規化
するために用いられ得、その結果、移動時間及びピーク面積がハイスループット
適用に対して十分に信頼できることを実証した。図７は、移動時間対キャピラリ
ー番号のグラフであり、この図において、白記号は生のデータを表し、そして黒
記号は、2つのフルオレセインについて2つの内部標準によって正規化されたデー
タを表す。これにより、2つの内部標準として最初及び最後のピークを使用する
ことによって、移動時間及びピーク面積の両方がアレイにわたって均一になるこ
とが確認される。第2及び第3のピークに関して、移動時間の相対標準偏差（RSD
）は、それぞれ、17％及び22％から1.9％及び2.0％に低減し、ピーク面積のRSD
は、それぞれ、65％及び87％から3.8％及び8.8％に低減した。ピーク面積の場合
には、2つのキャピラリー（番号23及び番号45。図８を参照のこと。この図は、
ピーク面積対キャピラリー番号のグラフであり、この図においては、白記号は生
のデータを表し、そして黒記号は、2つのフルオレセインについて2つの内部標準
によって正規化されたデータを表す）は、RSDに対する寄与をしのいだ。これら
の2つのキャピラリーが統計学的分析から省略された場合、RSDは、それぞれ、2.
9％及び5.3％に低下した。この正規化スキーム(Xueら, Anal. Chem. 71: 2642-2
649(1999))がここでの吸収検出器により同様にうまく働くという事実は、図７Ｂ
のデータが全て、この検出器の線形範囲内にあるということを示す。これは驚く
べきことではない。なぜなら、強度が15％を越えて減少した時間はなかったから
である（図６）。より大きな吸収に関しては、線形応答を維持するために対数補
正を適用する必要がある。

【００９９】本実施例は、吸収検出を使用して複数のサンプルを同時に分析するためのハイ
スループットシステムを初めて実証する。均一な分離効率及び良好なＳ／Ｎを得
た。このようなシステム（例えば、上記の96-キャピラリーアレイ電気泳動シス
テム）で達成可能なLODは、吸収検出を使用する商業的なシングルキャピラリー
電気泳動機械に対するLODに匹敵する。ゾーン電気泳動及びMEKCによって、それ
ぞれ、イオン性検体及び中性検体の分離を実証した。結果的に、キャピラリーア
レイ電気泳動システムは、単に非常により高いスループットを有していれば、シ
ングルキャピラリー電気泳動吸収機器が可能とする全てを可能にする。潜在的に
、本発明のシステムはまた、多くの適用においてHPLCに対する代替として働き得
る。本システムでは、可動部分を使用しなかった。一旦、全ての構成部分の位置
が固定されると、キャピラリーアレイの最も焦点の合った画像を入手するために
調整される必要がある唯一のものは、（ちょうど写真を撮るように）カメラレン
ズの焦点である。一旦、焦点が合わせられると、本システムにおいて顕著な変化
は、多くの日数にわたって観察されなかった。また、レーザーは使用されず、従
って、本システムは、多重化レーザー誘起蛍光CEシステムよりも小さく、より経
済的であり、かつ使用及び維持が容易であるはずである。加えて、検体は検出さ
れるべき蛍光を有する必要はない。吸収波長は、フィルターを単に交換すること
によって選択され得る。サンプル注入プロセスは、注入ブロックの下に異なるマ
イクロタイタープレートを移動することのみを含み、かつ完全に自動化できるの
で、従来の単一CE吸収決定が達成し得るスループットよりも100倍高度な真のス
ループットを達成することが可能なはずである。

【０１００】（実施例２）本実施例は、遺伝子タイピング及び診断への本発明の適用を実証する。

【０１０１】実施例1の96-キャピラリーアレイ電気泳動システムに基づき、キャピラリーア
レイゲル電気泳動、並びにDNA塩基に固有なスペクトル特性、及び100bp DNAが感
度のよい検出のための優れた正味の吸収性を提供し得る100吸収単位を含むとい
う事実に基づく吸収検出を利用してDNA分析プロトコルを設計した。代表的な濃
度の出発物質を使用して、広範に使用されている2つのPCRプロトコルでこの方法
を試験した。サンプルを以下の通りに調製した：

【０１０２】（ポリメラーゼ連鎖反応）（１．可変数のタンデムリピート(tandem repeat)（VNTR）遺伝子座に対す
る多重化PCR） AmpliFLP D1S80 PCR増幅キットをPerkin-Elmer (Foster City, CA) から購入
した。このキットは、D1S80 PCR反応ミックス（2つのD1S80プライマー、AmpliTa
q DNAポリメラーゼ及びdNTPを緩衝液中に含む）、MgCl₂溶液及びコントロールDN
A3（D1S80タイプ18のヒトゲノムDNA（緩衝液中））を含んだ。使用したPCR混合
物は、以下の通りであった：陽性コントロール：20μlのD1S80 PCR反応ミックス、10μlのMgCl₂溶液及び20μlのコントロールDNA3。陰性コントロール：20μlのD1S80 PCR反応ミックス、10μlのMgCl₂溶液及び20μlのオートクレーブされたDI H₂O。ポリメラーゼ連鎖反応を以下のパラメータで実行した（95℃で15秒間の変性、
66℃で15秒間のアニーリング、及び72℃で40秒間の伸長を30サイクル）。使用し
たサーマルサイクラーは、Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 2400であった。

【０１０３】（２．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に対するPCR） HIV試験キット(Perkin-Elmer)は、HIV-1ゲノムの全ての部分を含む陽性コント
ロールDNA、陰性コントロールDNA、HIVプライマー、AmpliTaq DNAポリメラーゼ
、dNTP、PCR反応緩衝液及びMgCl₂溶液を含んだ。使用したPCR混合物を表１に列
挙する。Perkin-Elmer GeneAmpサーマルサイクラーについてのプロトコルは、95
℃で30秒間の変性、62℃で1分間のアニーリング及び伸長を40サイクルである。
アニーリング及び伸長時間は、この増幅と同じであった。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】（ＤＮＡ精製） Microcon YM-30 遠心ろ過装置(Millipore, Bedford, MA)を用いて、全てのPCR
産物を精製した。精製後に、塩、dNTP及びほとんどのHIV-1プライマーをDNAサン
プルから除去した。

【０１０６】実施例１に記載されるようなフォトダイオードアレイ吸収検出を備える96キャ
ピラリーアレイ電気泳動システムを使用した。DC電源水銀ランプ(UVP Inc. Upla
nd, CA)を光源として使用した。このランプは、以前の研究に使用されたＡＣ電
源水銀ランプよりも低いノイズレベルを生じた。吸収波長を干渉フィルター(Ori
el)によって254nmに設定した。キャピラリーの全長は、55cmであり、有効長35cm
であった。キャピラリーアレイを、最初に脱イオン水で、次いで1mlの2% PVPで
、100psiの圧力にて洗い流した。この注入端を緩衝液リザーバ中に浸しつつ、0.
5mlの2% PEO（600,000MW）シービングマトリクスを100psiにてキャピラリーバン
ドルに押し出した。この手順にはだいたい20分要した。ゲルで満たした後に、エ
チジウムブロマイドを1μg/mlの濃度で緩衝液リザーバに添加した。次いで、こ
のシステムを150V/cmの電場強度にて10分間予め泳動した。予備的泳動の後に、
エチジウムブロマイドは、電気的な移動によりシービングマトリクス中に均一に
広がった。エチジウムブロマイドは、DNAフラグメントをより堅くし、それによ
ってCGEにおいてよりシャープなバンドをもたらすことが知られている。本研究
において、DNAフラグメントの吸収強度を有意に変化させることは予測されなか
った。このサンプルを150V/cmで15秒間、動電学的に注入した。150V/cmの電場強
度を分離に用いた。分離プロセスの間の総電流はおよそ620μAであった。12の異
なるサンプルを96-キャピラリーアレイ電気泳動実験において使用した。これに
ついては表２に詳述する。各タイプのサンプルを96-キャピラリーアレイ中の8つ
の異なるキャピラリーに注入し、そして泳動した。

【０１０７】

【表２】

【０１０８】図９は、キャピラリーアレイ電気泳動に対し再構成された2次元エレクトロフ
ェログラムであり、この図において、12個のキャピラリー（表２に記載される12
個のサンプルに対応している）が垂直に整列されており、そして移動方向は左か
ら右である。この図は、再構成された「ゲル」画像としてＤＮＡ分析に関するキ
ャピラリーアレイゲル電気泳動の結果を示す。垂直方向は、キャピラリーアレイ
配置を示し、一方、水平方向は移動時間を示す。全ての分離を25分以内に終了し
た。キャピラリー番号84（サンプルタイプ11、表２を参照のこと）は、350塩基
対以降に粗悪な分離分解能を示した。他の95のキャピラリーは、合理的な分離及
び良好なシグナル対ノイズ比を与えた。移動時間およびピーク強度は、キャピラ
リー間で非常に不均一であった。これは、カラム表面の温度調節及び変動の非存
在から生じていると予期された。内部標準化スキームを用いて、キャピラリー間
の結果を正規化し得る。従って、移動時間及びピーク面積は、ハイスループット
適用に対して十分に信頼できる。

【０１０９】表２に記載した各タイプのサンプルを示すために、実際のエレクトロフェログ
ラムをキャピラリー番号3、9、17、25、33、41、49、57、65、73、85及び89から
抽出した。これらを図１０に示す（図１０においては、12個のキャピラリー（表
２に記載される12個のサンプルに対応している）は、図９の順番に従い垂直に積
み重ねられ、そして移動時間は、左から右にプロットされている）。キャピラリ
ー番号9〜16及び番号17〜24において、陰性及び陽性のHIV-1 PCR産物をそれぞれ
注入した。陽性及び陰性の結果は、キャピラリー番号17〜24からのエレクトロフ
ェログラムのみに現れた、HIV-1 gagフラグメントピーク（三角）によって容易
に区別され得る。陽性及び陰性の両方のHIV-1 PCRサンプルもまた、過剰のプラ
イマー（丸）及びプライマーダイマー（十字）を含んだ。同定に関してより高い
レベルの信頼性を提供するために、キャピラリー間の移動時間の変動にもかかわ
らず、HIV-1 gagフラグメント、プライマー及びプライマーダイマーは、PCR産物
と100bp DNAラダー（キャピラリー番号25〜32）とを混合し、かつそれらをキャ
ピラリー番号33〜40及び番号41〜48に注入することによってサイズ分けされ得る
。キャピラリーの後者の２つの群からのエレクトロフェログラムは、HIV-1 gag
フラグメントがおよそ115bpであり、そしてプライマーダイマーが約60bpである
ことを示した。

【０１１０】キャピラリー番号1〜8からのエレクトロフェログラムにおいて、HIV-1プライ
マーは、広いピークを与えた。これは、サンプルを過剰にロードしたためである
と本発明者らは考えている。キャピラリー番号89〜96に、脱イオン化H₂Oを注入
し、これらはブランクエレクトロフェログラムを与えた。これらのエレクトロフ
ェログラムは、ブランク参照として役立ち、そして以前に報告されたように、水
銀ランプからのフリッカーノイズを打ち消すために、他のキャピラリーにおける
シグナルから差し引かれた。キャピラリー番号49〜56からのエレクトロフェログ
ラムは、陰性のD1S80 PCR結果を示し、このときプライマーピークのみが観察さ
れ得る。キャピラリー番号57〜64からのエレクトロフェログラムは、陽性のD1S8
0ゲノタイピングPCR結果を示した。非常に広範なプライマーピークに加えて、2
つの成分のピーク（D1S80タイプ18及び31）が、ヘテロ接合性サンプルから予期
される通りに観察され得る。また、同定に関する信頼レベルを向上させるために
、各PCR産物と50bpラダー（キャピラリー番号65〜72）とを混合し、そしてそれ
らをキャピラリー番号73〜80（陰性）及び番号81〜88（陽性）に注入することに
よって、2つのD1S80成分並びにプライマーをおおまかにサイズ分けした。これら
の結果は、2つのD1S80成分がおよそ400bp及び600bpであることを示した。

【０１１１】 PCR産物の分析に対する現在のハイスループットアプローチは、主に、電気泳
動分離及びレーザー誘起蛍光検出に基づく。本実施例は、本発明がUV吸収検出に
単純に基づいて遺伝子タイピング及び診断に適用され得ることを実証する。総吸
収シグナルに対する各塩基対の相加的寄与は、ほとんどのPCR産物を分析するた
めに適当な検出感度を提供する。特殊な潜在的に有毒である蛍光標識の使用が排
除されるのみではなく、機器の複雑性及び費用もまた大いに軽減される。例えば
、レーザーは使用されない。DNA産物のUV吸収検出は、分析費用を軽減する。な
ぜなら、それは標識を必要としないからである。キャピラリーアレイを、泳動間
に水で洗い流し、そして1ヶ月の期間において、数十回の泳動に対しいかなる分
解をも示さなかった。サンプル注入は完全に自動化され得るので、本実施例は、
商業的なシングルキャピラリーゲル電気泳動システムが達成し得るよりも100倍
（1000倍に匹敵する）高い真のDNA分析スループットを得ることが比較的に低費
用で可能になることを実証する。

【０１１２】（実施例３）本実施例は、タンパク質の包括的なハイスループットペプチドマッピングへの
本発明の適用を実証する。

【０１１３】実施例１の電気泳動と同様である多次元96-キャピラリーアレイ電気泳動に関
する実験的CE構成を使用した。簡潔には、50cmの有効長及び70cmの全長を有する
、全部で96個の溶融シリカキャピラリー (Polymicro Technologies, Inc., Phoe
nix, AZ)（内径50μm及び外径360μm）を、検出ウインドウに並列に詰め込み、
そしてプラスチック台の2つの平らな表面間にクランプで固定した。詰め込みの
後に、エキシマーレーザービームを使用してポリイミドコーティングを焼くこと
により、ウインドウを作製した。底端（出力）にて、12個のキャピラリーごとに
一緒に束ねて、6次元のペプチドマッピングのために6個の異なる緩衝液を同時に
満たすことを可能にした。注入端にて、キャピラリーアレイを広げ、そして銅プ
レート上にマウントして、サンプル導入のために、96ウェルマイクロタイタープ
レートに適した寸法の8×12形式を形成させた。さらに、個々の電極として作用
するように、金コートピン(96)(MillMax Mfg. Corp.)をキャピラリー先端の近く
の銅プレート上にマウントした。ここでキャピラリー先端は、小容量のサンプル
との接触を保証するように、この電極を越えてわずかに伸長していた（〜0.5mm
）。高電圧電源（Glassman High Voltage, Inc., Whitehorse Station, NJ）を
使用して、電気泳動を駆動した。

【０１１４】上記のように、光源、フィルター，キャピラリーアレイホルダー、及びPDA検
出器を全て、光学テーブルに取り付けられた耐光性金属箱内に備えた。光源とし
て、UV吸収検出のために、213.9nm亜鉛ランプ(model ZN-2138, Cole-Parmer)を
使用した。キャピラリーアレイから透過した光は、干渉フィルター(Oriel)及び
石英レンズ(Nikon; f.1.=105mm; F=4.5)を通過した。名目変位倍率1.2での、キ
ャピラリーアレイの倒立像を、石英レンズによってPDA面上に作成した。PDA(Ham
amatsu, model S5964, Hamamatsu, Japan)は線形画像センサーチップ (1024ダイ
オード, 幅25μm、高さ2500μm)、ドライバー／増幅器回路及び温度制御器を組
み込んでいた。内蔵型ドライバー／増幅器回路をNational Instrument PCI Eシ
リーズ多機能16ビット I/Oボードを介してIBM互換性コンピュータ(233MHz Penti
um, Packard Bell)に接続した。PDAを作動させかつデータを入手するために使用
される全てのコードを、Labview 5.0ソフトウェア(National Instruments, Aust
in, TX)を使用して構内に書込んだ。

【０１１５】別の構内Labviewプログラムによって、生のデータセットをシングルダイオー
ドエレクトロフェログラムへと変換した。Microsoft Excel 97及びGRAMS/32 5.0
5(Galactic Industries)を使用して、データの処理及び分析を実行した。

【０１１６】多次元CE実験において、洗浄のために、キャピラリーアレイを最初にメタノー
ルで、次いで水で洗い流した。6つの泳動緩衝液を4次元CZE分離に使用し、そし
て二次元MEKC分離は、以下の通りであった：（１）50mM Trizam(登録商標)リン
酸緩衝液(pH2.5(H₃PO₄含有))、（２）50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0(酢酸含
有))、（３）0.1M Trizma(登録商標)Base/0.1M トリシン緩衝液(pH8.1)、（４）
0.1M CHES/0.1M NaOH(pH9.3)、（５）0.1% Tween 20の50mM酢酸ナトリウム緩衝
液(pH5.0(酢酸含有))、並びに（６）7% Tween 20及び10mM SDSの0.1M Trizma(登
録商標)Base/0.1M トリシン緩衝液(pH8.1)。96-ウェルマイクロタイターサンプ
ルプレートにサンプルを入れ（1μl/ウェル）、そして8cmの高さにて60秒間アノ
ードにて重力によって注入した。印加された電場は+157V/cmであり、そして電気
泳動を周囲温度で行なった。各々の泳動後に、キャピラリーを0.1M NaOH、水及
び泳動用緩衝液でそれぞれ5分間リンスした。

【０１１７】 CZE及びMEKC分析に関する全てのCE分離を、多次元多重化CE泳動前に、ISCO (L
incoln, NE) Model 3140 Electropherograph Systemに対して最適化した。有効
長50cm及び全長75cm(内径50μm及び外径361μm)の裸溶融シリカキャピラリー(Po
lymicro Technologies, Inc., Phoenix, AZ)を使用した。4つの異なる緩衝液シ
ステムをCZE分離について調査し、そして2つの異なる緩衝液システムもまた、ME
KC分離について調査した。最適な組成は上記されている。キャピラリーの入り口
をサンプルバイアル中に配置し、そしてサンプルバイアルを出口バイアルよりも
30cm上に持ち上げ、そして10秒間、キャピラリー中にサンプルを吸い込ませるこ
とによって、サンプルを流体力学流により導入した。印加された電場は+227V/cm
であり、そして電気泳動を周囲温度で行なった。ペプチドフラグメントをモニタ
ーするために検出波長を214nmに設定した。各々の泳動の後に、順番に0.1M NaOH
、水及び泳動用緩衝液で、キャピラリーをそれぞれ5分間リンスした。

【０１１８】透析及び凍結乾燥の工程を設けることなく、Cobbら((1989)), 前出)の手順に
従い、BLGA及びBLGBのトリプシン消化を行なった。0.1mM塩化カルシウムを含有
する10mM Trizma(登録商標)Base及び50mM酢酸アンモニウム緩衝液 (pH8.2)を用
いて、2mg/ml BLG及びトリプシンの混合物を調製した。トリプシンをトリプシン
−タンパク質比1:50 (w/w)で添加し、そして消化混合物を37℃で5時間インキュ
ベートした。この消化物をろ過することなく、分離CEシステムに直接注入した。

【０１１９】ウシβ-ラクトグロブリン(BLG)はウシミルクの主要な乳清タンパク質である。
ウシ成体のBLGは、BLGの3つのバリアントのペプチドマップを表す図１１に示さ
れるように162残基を有する（配列番号1）。BLGの3つのバリアント（A,B及びCと
表記する）はウシのミルク中に一般的に存在する。バリアントA及びBは、2つの
部位で異なる。BLGAのアスパラギン酸（D）64が、BLGBではグリシン(G)に変化し
ており、そしてBLGA中のバリン(V)118が、BLGBではアラニン(A)に変化している
。バリアントB及びCは、1つの部位で異なる。BLGBのグルタミン(Q)59は、BLGCで
はヒスチジン(H)に変化している(Binら, Protein Science 8: 75-83 (1999))。
トリプシン消化は、定量的かつ非常に特異的である。なぜなら、トリプシンは、
リジン及びアルギニン残基のC末端側でのみ切断するからである。理論的なフラ
グメントを表３に列挙する。BLGの場合、17個の異なるペプチドが、トリプシン
消化後に存在する。

【０１２０】

【表３】

【０１２１】多重化キャピラリーアレイシステムは、酵素消化後に、一定に印加された電場
での6次元キャピラリー電気泳動を使用して、タンパク質のハイスループットな
特徴付け及びペプチドマップの作製を可能にした。亜鉛ランプ及びＰＤＡを使用
して得られた96-キャピラリーアレイ画像において、各キャピラリーの中心は、
画像中の「ピーク」に対応する。2個の中心「ピーク」全ての間に、キャピラリ
ーの壁に対応する「谷」が存在する。キャピラリーアレイ画像がPDA上に良好に
焦点調節される場合、これらの谷の強度は最小となる。この特性を使用して、最
良の焦点調節を生じる。「間隔ピーク」（上を参照のこと）を本研究から排除し
た。これは、キャピラリーアレイのウインドウに対する特定の処理から生じ、そ
のためにエポキシ系接着剤を検出ウインドウ上のキャピラリー間に適用した。エ
ポキシ系接着剤は、キャピラリーアレイのウインドウ領域を大いに強化し、そし
て電場中でのキャピラリーの移動を最小限にした。エポキシ系接着剤はＵＶ透過
性ではないので、これは、キャピラリーの間隔を通過した全ての光を吸収し、そ
して「間隔ピーク」を排除した。これはさらに、吸収検出に対する迷光を低減し
た。亜鉛ランプは、ペプチドの吸収検出に十分に適する213.9nmの光を提供した
。亜鉛ランプの放射長は、およそ2cmであり、これは、キャピラリーアレイ全体
（1.5cm）の均一な照明のために十分長い。アレイの中心から縁までの光学スル
ープットにおいて2倍未満の変動が存在した。このことは、検出限界がアレイに
わたって

【０１２２】

【化２】

【０１２３】未満変動したことを意味する。亜鉛ランプは非常に安定であり、そして無視可能
なフリッカーノイズを生じた。従って、二重ビームの差し引きは、本実験に必要
ではなかった。

【０１２４】現在まで、タンパク質のペプチドマッピングは、酵素又は化学薬剤によるタン
パク質の切断、引き続く得られたペプチドフラグメントの1次元又は2次元分離に
主に基づいていた。1次元分離によって達成されるペプチドフラグメントの分解
能は、しばしば、ペプチドの複雑な混合物を分析するには不十分であるが、従来
の2次元技術は、第1のディメンジョンから非不純ペプチドを効率的に回収して第
2のディメンジョンに移すことの困難性を被っている。また、2次元分離条件は、
サンプルタンパク質に従って変化されなければならない。これらの問題を克服す
るために、6次元システムが使用された。異なるpHの4つの異なるCZE条件と2つの
異なるMEKC条件とを組み合わせることによって、任意のタンパク質のペプチドに
関する包括的かつ補足的な情報を入手した。シングルキャピラリーによる泳動の
結果（図１５及び１６）において示されるように、異なる分離条件のペプチドフ
ラグメントは、異なるが関連したペプチドマップを示した。図１２は、96-キャ
ピラリーアレイにおけるBLGA及びBLGBのトリプシン消化物の6次元分離の結果を
示す。この図１２において、（Ａ）は50mM Trizam(登録商標)リン酸緩衝液 (pH2
.5 (H₃PO₄含有))、（Ｂ）は50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0 (酢酸含有)）、
（Ｃ）は0.1% Tween 20の50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0（酢酸含有））、（
Ｄ）は0.1M Trizma(登録商標)Base/0.1M トリシン緩衝液（pH8.1）、（Ｅ）は7%
Tween 20及び10mM SDSの0.1M Trizma(登録商標)Base/0.1M トリシン緩衝液 (pH
8.1)、並びに（Ｆ）は0.1M CHES/0.1M NaOH (pH9.3)である。垂直方向はキャピ
ラリーアレイの配置を示し、一方、水平方向は移動時間を示す。印加された電場
は+157V/cmであった。有効長／全長 50/70cm及び内径50μmである裸溶融シリカ
キャピラリーのカラムを使用した。流体力学的な注入を8cmの高さにて60秒間行
なった。

【０１２５】シングルキャピラリーCEシステムにおいて、+227V/cmの電場が内径50μmのキ
ャピラリーに適用された場合、電流は周囲温度では20μA未満であった。しかし
、キャピラリーを、96-ウェルキャピラリーアレイシステム中に並列に詰め込み
、そして密な詰め込みは、同じ分離条件においてより高い温度を発生した。結果
的に、いくつかのキャピラリーは、泡の形成のために、分離中に電流を損失し得
る。従って、+157V/cmのより低い電場を、分析時間が増加するにもかかわらず適
用した。全ての分離はなお45分以内に終了した。キャピラリー87及び88は異常な
長い分離時間及び非常に低いシグナルレベルを示したが、他の94個のキャピラリ
ーは全て、同等の分離時間及び良好なシグナル対ノイズ比を与えた。再構成され
た画像に示されるように、同じ分離条件でさえも、移動時間及びピーク強度がキ
ャピラリー間で均一ではなかった。この現象は、実験において温度を制御しなか
ったことに由来すると予測される(Xueら(1999), 前出;及びGongら(1999), 前出)
。しかし、補正された移動時間及びピーク面積がハイスループット適用に対して
十分に信頼できるものであるように、内部標準化スキームがキャピラリー間の結
果を正規化するために適用され得ることを本発明者らは実証した(Xueら(1999),
前出;及びGongら(1999), 前出)。

【０１２６】図１３及び１４は、それぞれ、図１２の6次元データに由来する、BLGA及びBLG
Bの抽出されたエレクトロフェログラムを示す。個々のマップは、シングルキャ
ピラリー結果に実質的に同一である。BLGA及びBLGBのペプチドパターンは、6次
元分離条件の各々において容易に区別され得る。シングルキャピラリーでの泳動
と比較して、0.1% Tween 20の50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)は、96-キャピ
ラリーアレイにおいてより遅い移動時間を与えた。部分的に、これは、より低い
電場（+157対+227V/cm）が印加されたことに起因した。MEKC条件でTween 20(0.2
%)の代わりにTween 20(0.1%)をこのアレイに使用した。なぜならTween 20 (0.2%
)は、いっそう長い分析時間を生じたからである。

【０１２７】ペプチドはアミノ酸のポリマーであるので、それらは代表的には、イオン化可
能な側鎖を有するアミノ酸部分の存在に依存して、それらの構造中に限定された
数の荷電状態を有する(Landersら, Handbook of Capillary Electrophoresis, C
RC Press(1997), 219〜221頁)。これは、CE分離に関するpH範囲を決定し、この
範囲を越えて理論的な最適化は行なわれ得ない。2未満のpHでは、ペプチドのイ
オン化可能な全ての基がプロトン化される。ペプチド鎖中の塩基性残基の数は、
分子の全体的な電荷状態を決定する。pH10よりも大きなpHでは、イオン化可能な
全ての基は脱プロトン化され、負に荷電したペプチドを生じる。これらの極端な
pH条件では、ペプチドの分離は調整され得ない。中間のpHでは、部分的にイオン
化した末端及び側鎖残基は、ペプチド分離の最適化を可能にする。従って、4つ
の異なるpH条件（即ち、pH2.5、5.0、8.1及び9.3）を、ペプチドフラグメントの
分離のために選択した。ペプチドのイオン化は、一般的に、2.5〜3.0のpH範囲に
わたって生じるので、これらのpHは、独立したエレクトロフェログラムを与える
のに十分に離れているが、条件の連続的な（コンビナトリアル）セットを形成す
るのに十分に接近している。

【０１２８】図１５は、トリプシン消化後にシングルキャピラリーを使用するCZEについて
、4つのpH条件でのBLGA及びBLGBの代表的なペプチドマップを示す。この図にお
いて、（Ａ）は0.1M CHES/0.1M NaOH(pH9.3)であり、（Ｂ）は、0.1M Trizma(登
録商標)・Base/0.1Mトリシン緩衝液(pH8.1)であり、（Ｃ）は、50mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液(pH5.0(酢酸含有))であり、そして（Ｄ）は、50mM Trizma(登録商標)
リン酸緩衝液(pH2.5 (H₃PO₄含有))である。印加された電場は、+227V/cmであっ
た。分離は周囲温度であった。有効長／全長 50/75cm及び内径50μmの裸溶融シ
リカキャピラリーのカラムを使用した。流体力学的な注入を、30cmの高さで10秒
間実施した。4つの異なる分離条件における全てのペプチドピークを、約30分以
内に十分に解析した。各条件は、異なるペプチドマップを示した。pH5.0を超え
るペプチドの分離を、15分以内に迅速かつ効率的に終了した（図１５Ａ、Ｂ及び
Ｃ）。pH2.5でのエレクトロフェログラムは、比較的に長い分析時間にもかかわ
らず良好な分解能を示した（図１５Ｄ）。CEにおけるキャピラリー壁へのタンパ
ク質の吸着は、深刻な問題であり得る。これは、変動する移動時間、バンドの広
がり、及びピークのテーリング(tailing)を生じ得る。pH2.5では、負の電荷のほ
とんどが、キャピラリーのシリカ壁を不活化（titrate off）し、その結果、ペ
プチドと壁との間のクーロン相互作用がほとんど存在しなかった。これは、他の
pH条件では当てはまらない。従って、ペプチドフラグメントとキャピラリー壁と
の間の相互作用の低減のために、泳動用緩衝液において高いイオン強度を使用し
て、効率的な分離を提供した。

【０１２９】図１５（図１５Ａ（pH9.3）；図１５Ｂ（pH8.1）；図１５Ｃ（pH5.0）；及び
図１５Ｄ（pH2.5））は、4つの異なるCZE条件での、BLGA及びBLGBのペプチドマ
ップの差異を示す。ウシBLGA及びBLGBのアミノ酸配列は、162個のアミノ酸のう
ち2つの部位（64及び118、図１１、配列番号11）のみで異なるが、BLGA及びBLGB
のペプチドフラグメントにおける差異は、明確に同定され得た。CEによるペプチ
ドマッピングは、HPLCの既に確立された技術に対する相補物（使用可能な代替物
ではない場合）としてますます利用されている。CEは、HPLCに対していくつかの
利点（より効率がよいこと、及び必要とされるサンプルがより少ないことを含む
）を有する。さらに、CEはまた、物理化学特性との移動時間の直接の相関を提供
する。pHへの依存に従って、各ペプチドフラグメントの正味の電荷が確認され得
る。4つの異なる条件にて組み合わされたペプチドマップ（図１５Ａ〜Ｄ）の解
釈は、たった1つの分離条件を使用しては得られ得ない、ペプチドに対して重複
する冗長性(redundancy)を有する包括的なデータを示した。

【０１３０】泳動用緩衝液への界面活性剤の添加は、分離機構に対していくつかの新規な局
面を付与し得る。界面活性剤はそれらの臨界ミセル濃度を超えてミセルを形成し
、泳動用緩衝液に擬固定相を導入する。図１６は、非イオン性界面活性剤（Twee
n 20（即ち、0.2% Tween 20の50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0（酢酸含有））
（Ａ及びＢ）、並びに／あるいは非イオン性及び陰イオン性界面活性剤の組み合
わせ（Tween 20＋SDS（即ち、7% Tween及び10mM SDSの0.1M Trizma(登録商標) B
ase/0.1Mトリシン緩衝液（pH8.1）（Ｃ及びＤ）を使用して、2つの異なるMEKC条
件にて得られた、BLGA及びBLGBのMEKCペプチドマップを示す。中間のｐＨ範囲に
おける界面活性剤の使用は適切であった。なぜなら極端なpH（例えば、pH2又は1
0）でよりもその中間ｐＨ範囲により多くの中性のペプチドが存在するからであ
る。

【０１３１】非イオン性界面活性剤を使用するMEKC条件（MEKC Ｉ条件）において（図１６
Ａ及びＢ）、エレクトロフェログラムは、CZE条件（図１５Ｃ）を使用して得ら
れたエレクトロフェログラムと比較してより高度な分解能を示した。相対的なピ
ーク位置において、ほとんどは初期の溶出成分に関して、いくつかのマイナーな
シフトが存在する。pH5.0では、非イオン性界面活性剤Tween 20の濃度が増加す
ると、電流の増加を伴うことなくペプチドフラグメントの分解能が増加する。全
てのペプチドフラグメントが0.3% Tween 20以上でベースライン分離を示したが
、この分析時間は、およそ１時間であった。+227V/cmの印加された電場の下では
、0.2% Tween 20は、CZEと比較して分解能を改善するに十分であった。この緩衝
液は、分析時間が20分未満に維持され得るように選択された。

【０１３２】非イオン性及び陰イオン性界面活性剤の組み合わせを使用するMEKC条件（MEKC
II条件）では（図１６、Ｃ及びＤ）、より高濃度のTween 20及び陰イオン性界
面活性剤SDSが、分解能を向上するために必要とされた。より高いpHが溶液中の
ペプチドフラグメントについてより大きな移動度を引き起こしたので、より低頻
度のミセルへの力学的分配が生じた。しかし、泳動用緩衝液中の界面活性剤の濃
度が増加して分配を促進すると、分析時間もまた増加し、そして感度が低下した
。従って、7% Tween 20及び10mM SDSが、MEKC IIに対する最適な界面活性剤濃度
として選択された。Tween 20とSDSとの組み合わせの独特な利点は、全てのペプ
チドフラグメントの完全な分解能へと導き、中性ペプチド及び電荷が同じペプチ
ドの両方に対するより高い分解能を可能にする。図１７は、移動時間（分）に関
する、BLGBのMEKCペプチドマップに対するpH8.1でのTween 20濃度の効果を示す
。分解能及び選択性の両方が界面活性剤により影響されることは明らかである。
上記の6つの異なるCE条件で得られたペプチドマップパターン（図１５及び１６
）は、各々の場合において5回繰り返された注入の結果を比較することによって
判定される通り、再現性があった。

【０１３３】本実施例は、例えば、多重化したキャピラリー電気泳動を使用することによっ
て、本発明に従うタンパク質のハイスループット多次元ペプチドマッピングを実
証する。6つの異なる分離条件による96-キャピラリーアレイ上での、密接に関連
したサンプルタンパク質であるBLGA及びBLGBの独特なフィンガープリントが、45
分以内に得られた。ペプチド結合の214nmモニタリングは、一般的であるが、ま
た非常に複雑である。なぜなら、代表的なマップは、一般的に、20〜150個のピ
ークを含み（Dongら(1992),前出）、そして全てのフラグメントが、理想的には
、完全に解析されるはずだからである。未知タンパク質のマップは、1次元又は2
次元分離のみを使用することによっては明瞭ではない。6つの補完性分離条件を
用いると、各々の新しいサンプルについてプロトコルを再び最適化する必要はな
い。機器の設定が単純化され、そして方法の自動化が可能になる。最も重要なこ
とには、この多次元及び多重化ペプチドマッピング技術は、本質的に、小容量及
びハイスループットのアプローチである。例えば、2つのタンパク質のみがここ
では研究されているが、16個の異なるタンパク質が、μlのサンプルから開始し
て同時にマップされ得る。あるいは、異なる酵素又は化学薬剤が、さらなる確認
のために、ペプチドマップの相補セットを提供するために用いられ得る。複雑な
未知サンプルについては、内部標準が、移動時間及びピーク面積を正規化するた
めに使用され得る(Xueら(1999), 前出;及びGongら(1999),前出)。次いで、6つの
分離条件が、等電点（pIs）（高分解能勾配溶出に非常にかなり似ている）に関
してペプチドフラグメントを階級付けするために使用され得る。アレイ中の各キ
ャピラリーにおける緩衝液システムの異なるセットの使用は、実際に、検体の所
定の群に対する最良の分離条件を開発するためのコンビナトリアルアプローチで
ある。この最後の特性は、一般的に、CEの全ての適用において有用であるはずで
ある。最終的には、キャピラリーアレイは、複数チャネルにおける完全な自動化
(Changら(1992), 前出; Zhangら(1999), 前出; 及びZhangら, Anal. Chem. 71:
1138-1145 (1999))がμl未満の容量のサンプル及び試薬を用いて可能であるよう
に、タンパク質のカラム上での消化と適合している(Changら, Anal. Chem. 65:
294-2951 1993)。

【０１３４】（実施例４）本実施例は、酵素活性のコンビナトリアルスクリーニングにおける本発明の使
用を実証する。

【０１３５】上記の多重化キャピラリーシステムを使用した。反応物、産物及び酵素を分離
するために、50cmの有効長及び70cmの全長を有する並列に詰められた合計で96個
の溶融シリカキャピラリー（内径50μm，外径150μm；Polymicro Technologies,
Phoenix, AZ）を使用した。プレロード（0.2ml）した96-ウェルプレートを、酵
素反応を行なうためのリアクターとして使用した。254nm水銀ランプを、ＵＶ吸
収検出のために使用した。+11kV（〜157V/cm）の電圧を、分離用のキャピラリー
を横切るように印加した。

【０１３６】インキュベーション時間の間、プレートをプラスチックフィルムによって覆い
、反応溶液の蒸発を最小限にした。これは、酵素及び基質の濃度が可能な限り安
定性を持続することを可能にした。

【０１３７】 LDHの触媒作用に対するピルベートの阻害のために、ピルベートの最適な濃度
が重要である。pH7.2及び25℃において、2mMのピルベートが、通常は、M₄イソ酵
素に対して適切である。従って、反応緩衝液（20mMリン酸、pH5.8〜8.0の範囲）
において、2.0mM NADH及び約2.0mMピルベートを、酵素反応に対する基質として
添加した。反応の方向は、以下のように選択された。

【０１３８】

【化３】

【０１３９】この反応を、キャピラリーへの反応物、産物及び酵素の流体力学的注入の前に、
一定の時間で進行させた。pH8.0の10mMリン酸溶液を分離用緩衝液として使用し
た。電圧を適用した後に、全ての成分を異なる移動度に起因して容易に分離した
。低濃度の酵素（5×10^-10〜1×10^-8M）（擬一次反応）を使用したので、一定の
温度で所定の時間の間に形成されたNAD⁺の量は、LDH活性に直線的に比例する。
従って、LDH活性は、一定のインキュベーション時間の間に形成されたNAD⁺のピ
ーク面積を測定することによって定量化され得る。NAD⁺ピーク及びNADHピークの
面積を積分した。NAD⁺及びNADHの両方は254nmで吸収し、一方、酵素は、この波
長にてバックグランドにあまり寄与しないので、254nm水銀ランプを使用した。
従来の分光光度計において254nmでのNAD⁺及びNADHの吸収係数を測定することに
よって、このピーク面積を量に変換した。形成されたNAD⁺量と元のNADH量との間
の比率を算定した。小さなバックグランド反応が存在するので、ブランク反応を
モニターし、そして差し引いた。

【０１４０】 pH値5.8、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.6及び8.0の別々の20mMリン酸緩衝液を
調製した。緩衝溶液（175μl）、酵素溶液10μl、40mM NADH 10μl及び90mMピル
ベート5μlを、反応用の96ウェルに添加した。反応は室温で進行した。これらの
溶液中の酵素の種々の最終濃度は、5×10^-10M、2×10^-9M、3×10^-9M、4×10^-9M
、5×10^-9M、6×10^-9M、7×10^-9M、8×10^-9M及び1×10^-8Mであった。従って、酵
素の各濃度について、8つの異なる緩衝溶液が存在した。同時に、異なるpH値の
全ての緩衝溶液について、9個の異なる酵素濃度が存在した。反応混合物を、30
分間、78分間、128分間、180分間、308分間、420分間、480分間及び1,477分間イ
ンキュベートした。各インキュベーション時間の後に、流体力学的注入を使用し
て、CE分析を開始した。反応バイアルから各時点で引き抜かれた容量は、出発容
量と比較して無視できるものであった。従って、実質的に非侵入的モニタリング
を達成した。

【０１４１】流体力学的注入を使用する理由は、動電学的注入が深刻な誤差を生じたという
ことである。これは、キャピラリーごとに異なる表面条件、緩衝溶液の異なる組
成、異なるキャピラリー温度、並びにNADH及びNAD⁺の異なる移動速度のためであ
る(Leeら, Anal. Chem. 64: 1226-1231 (1992))。この効果は、図１８Ａ（この
図は、NAD量（注入）に対するNADH量（注入）の比率対9回の動電学的注入からの
結果のグラフである）及び図１８Ｂ（この図は、NAD量（注入）に対するNADH量
（注入）の比率対9回の流体力学的注入からの結果のグラフである）の比較から
自明である。従って、1mM NADH及び1mM NAD⁺を有する溶液を調製し、そして流体
力学的注入及び動電学的注入によって9個の異なるキャピラリーに別々に注入し
た。高さにおける5cmの差異を前者に対して60秒間維持し、そして+11kVを後者に
対して30秒間適用した。キャピラリーに+11kVを印加することによって、NADH及
びNAD⁺サンプルゾーンを分離し、そして検出ウインドウを横切るように駆動した
。全ての溶液が同じNADH及びNAD⁺濃度を有したので、同一のピーク面積が、NADH
ピーク及びNAD⁺ピークに対して予期された。図１８に従うと、流体力学的注入は
、非常に小さな標準偏差（SD）約0.027（平均0.817）を生じたのみであるが、動
電学的注入は、深刻な誤差（SD 0.483及び平均3.66）を生じた。このような注入
問題は、表面の不均一性のために、シングルキャピラリーでの反復注入と比較し
てキャピラリーアレイにおいてより深刻である。

【０１４２】この移動時間はキャピラリーごとに変動する。なぜならキャピラリーの条件は
異なったからである。異なる移動時間にもかかわらず、NADHおよびNAD⁺ピークを
、この単純な混合物において容易に同定した。これらのピーク面積を定量のため
に使用した。各インキュベーション時間の後に、以下の方程式を使用して、NAD⁺ に変換されたNADHの画分を算定した：

【０１４３】

【化４】

【０１４４】前で述べたように、次いで、NADHの画分（反応済）を使用して、この反応が擬一
次反応である場合には必ず酵素の活性を示した。比率の使用は、キャピラリー間
の検出感度及び注入量における変動に関する問題を回避する。検出器を通過する
検体の異なる速度についてさらなる補正がなされた。なぜなら流体力学的注入が
用いられたからである(Leeら(1992), 前出)。

【０１４５】 8つのPH条件及び9つの酵素濃度をスクリーニングしたので、産物が検出された
チャネル（キャピラリー）が、合計して72個存在した。さらに、バックグランド
反応の16個のチャネル（基質を含有するが、酵素を含有しない8つのpH条件）を
モニターした。このアレイ中の他の8個のチャネルを、吸収参照として緩衝液（
基質なし及び酵素なし）で満たした。96-キャピラリーアレイに関する全データ
セットを、図１９において再構成された画像として示す。この図は、96個のキャ
ピラリーアレイにおける、酵素活性のコンビナトリアルスクリーニングの再構成
された吸収画像であり、この図において、キャピラリー（1〜96）は、上から下
に配置されており、そして移動時間（0〜33分）が、左から右へとプロットされ
ている。1つのキャピラリーから次のキャピラリーへの電気浸透流の変化、及び
温度の変動が、チャネル間の移動時間における実質的な変動の主な理由である。
さらにより大きな変動が予期される。なぜならサンプルのpH及びサンプルのイオ
ン強度が全て異なるからである。このキャピラリー壁は、注入の結果として劇的
に変化する。内部標準が移動時間を正規化するために用いられ得るが、本研究に
おける簡単なエレクトロフェログラムについては必要とされなかった。図１９に
おける強度の変動は、部分的には不均一な照明に起因するが、大部分は各チャネ
ルにおける反応の程度における予期された変動に起因する。

【０１４６】活性スクリーニングについて抽出されたエレクトロフェログラムを図２０及び
２１に示す。一定のpH（図２０）では、反応の程度がLDH濃度とともに増加する
ことは容易に理解される（左ピークはNAD⁺（産物）；右ピークはNADH（反応物）
；上から下に、濃度は、0、0.5nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM及び10n
Mである；酵素は、この濃度で検出されない）。固定されたLDH濃度（即ち、5×1
0^-9M）にて（図２１）、LDH活性が最高である最適なpHが存在することが理解さ
れ得る（左ピークはNAD⁺（産物）；右ピークはNADH（反応物）；上から下に、pH
は、5.8、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.6及び8.0であり；酵素はこの濃度で検出
されない）。

【０１４７】図２２（これは、シリーズ1〜9に関する180分のインキュベーションでのNADH
変換百分率対pHのグラフである）に示された定量的な最適化結果は、十分に規定
された時間間隔で反応混合物を反復的にサンプリングすることによって、より注
意深く試験されることが必要である。短い反応時間（図２３、この図は、シリー
ズ1〜9に関する30分間のLDH触媒作用についての反応百分率対pHのグラフである
）に関して、全てのpH条件について、反応の程度において、LDH濃度の関数とし
ての直線的な増加が存在する。これは理想的な挙動である。長い反応時間（図２
４、この図は、シリーズ1〜9に関する24時間のLDH触媒作用についての反応百分
率対pH値のグラフである）に関して、特に画分が0.6を超えて反応した場合に非
直線性が観察される。これは反応が飽和したためである。有意な割合の試薬（NA
DH）が消費される場合には、擬一次反応での説明は成立しない。これを改善する
には、より高い試薬濃度を使用するか、又は短い反応時間に留めることである。
この特性は、一点のモニタリングとは反対に、反応の完全な反応速度論をモニタ
ーする重要性を示す。図２４はそれ自体、広範なpH範囲にわたって酵素活性の差
異があまり存在しないという不正確な結論を導いた。

【０１４８】（実施例５）本実施例は、均一な触媒作用のコンビナトリアルスクリーニング、及び均一に
触媒された合成有機反応の最適化における本発明の使用を実証する。

【０１４９】本発明の方法を使用して、γ-カルボリンの生物学的活性に着目して、容易に
γ-カルボリンを与える新規パラジウム触媒環化反応を分析した(Zhangら, J. Or
ganometal. Chem. 576: 111-124 (1999))。このタイプの環化に関する最適な反
応条件及び位置化学は、一般的に、用いられるパラジウム触媒及び塩基の性質に
非常に依存する。このプロセスを最適化するための以前の試みは、5% Pd(OAc)₂
、10% PPh₃及び塩基としてNa₂CO₃を用いており、そして1:1の比率の異性体A/Bを
実質的に定量的な収率で与えた。

【０１５０】

【化５】

【０１５１】この触媒反応及び他の触媒反応の性質は、多くのパラメータが収率に影響し得
、そして「最適」条件が試行錯誤によってしばしば見出されるということである
。上記反応を、5mlのジメチルホルムアミド(DMF)中で0.25mmol使用することによ
って行なった。一端を密封し、かつ96-ウェル形式に配置された6mm O.D.ガラス
チューブを使用することによって、容量を120μlに低減した。個々の成分をDMF
溶液としてか、又はピペッティングによりスラリーとして添加した。セプタムを
使用して、反応チューブに蓋をして蒸発を防いだ。従って、全ての反応を5μmol
スケールで行なった。110℃に維持したドライ加熱浴によって熱を与えた。内部
標準として、1μmolのノルハルマンを反応混合物に添加した。コントロール実験
では、ノルハルマンの添加に由来するこのシステムに対する触媒効果は観察され
なかった。図２５は、2つの異なる緩衝液（40mM NH₄OAc及び0.75%ギ酸（メタノ
ール中）（1a）；40mM NH₄OAc及び0.75%ギ酸）（80% DMf/20% H₂O（1b）を使用
した、試薬及び内部標準からの生成物の２つの異性体形態（Ａ及びＢ）の分離を
示す（印加した電場140V/cm、有効長／全長50/75cm及び内径50μmの裸溶融シリ
カキャピラリーを使用。8cmの高さでの15秒間の流体力学的注入）。エタノール
及び純粋なDMFもまた試験したが、分離され得なかった。低沸点溶媒（例えば、
メタノール）を使用した場合であっても、CAEには泡は見出されなかった。

【０１５２】実験プロトコルの１つの重要な特徴は、分析前に希釈又はクエンチすることな
く反応混合物がCAEに注入されたということである。反応中の所定の時間に、反
応ブロックを加熱用土台から取り出し、急速に冷却し、そしてキャピラリーアレ
イの注入端の下に置いた。触媒系に対する有害な効果は、この操作によっては観
察されなかった。サンプルの操作を回避することによって（例えば、反応バイア
ルからピペッティングにより取り出すことによって）、移動に関する誤差及び汚
染が低減され得る。CAE泳動用緩衝液は、流体力学的注入のために反応用緩衝液
と適合すべきである。緩衝液としてメタノールを使用する場合には、注入は均一
でなかった。96個のうち約半分のキャピラリーのみが、適切なシグナルを有した
。注入時間を増加させることは可能でなかった。なぜなら、次いでいくつかのキ
ャピラリーはオーバーロードしたからである。DMFベースの緩衝液を使用した場
合、96個全てのチャネルが、3つの連続する泳動に対して均一なシグナルを有し
た。CAEに対するこの緩衝液適合性の問題点は、溶液特性（例えば、粘度及び表
面張力）の差異に寄与し得、そしてシングルキャピラリー実験において観察され
なかった。全分析時間は、代表的には、60分＋30分（キャピラリーの洗浄のため
）である。図２５における分解能から判断すると、キャピラリーは、15分の分析
時間を提供するように有効長の25％まで短かくされ得る。

【０１５３】 8個の異なるPd触媒及び11個の異なる塩基を選択することによって、88個の異
なる組み合わせを試験した。図２６は、図２５における1bに関する反応条件及び
1分の流体力学的注入についてのこのような96-キャピラリー分離を示し、この図
において、水平方向は、88個のキャピラリーにわたっており（残りの8個のキャ
ピラリーは溶媒のみを含み、そしてプロットしなかった）、そして垂直方向は時
間を示す。全収率に関する情報（図２７、この図は、110℃での17時間後の反応
についての、収率対触媒対塩基の3次元棒グラフである。この図では、dppeは、
ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンであり、TABCはテトラ-n-ブチルアンモニ
ウムクロリドであり、DABCOは1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンであり、そし
てdbaはtrans,trans-ジベンジリデン−アセトンである）、選択性に関する情報
（図２８、この図は、反応により生じた2つの異性体の選択性プロットであり、P
1/P2は、それぞれ、2つの異性体A及びBの比率である）並びに反応速度論に関す
る情報（図２９、この図は、触媒としてPd(PPh₃)₄および種々の塩基を使用する
反応についての、画分変換対時間（時間）対塩基の線図である）が、エレクトロ
フェログラムから入手され得る。触媒としてリガンドPPh₃とともにPd(OAc)₂、及
び塩基としてNa₂CO₃を使用することによって、5mlの反応におけるＮ₂の保護下で
選択性がない定量的変換（17時間後90%）と比較して、84%の全収率が実質的に位
置選択性なくマイクロリアクターにおいて達成された。全ての塩基のうち、無機
塩基がこの反応の促進においてより効果的であることが証明された。ピリジン又
は他の有機塩基を使用した場合には収率が低く、そしていくつかの副生成物が生
じた。副生成物を検出する能力は明らかにCAEの利点である。予備的な結果もま
た、この環化反応に非常に効果的であるいくつかの新規条件を明らかにする。そ
れらは、Na₂CO₃とのPd(PPh₃)₄(C9,74%)、K₂CO₃とのPd(dba)₂(E10,72%)、Na₂CO ₃ とのPdBr₂及び2PPh₃(G9,88%)並びにK₂CO₃とのPdBr₂及び2PPh₃(G10,96%)であ
る。後者の2つは、実際には、以前の最良の触媒条件よりも優れている(Zhangら(
1999), 前出)。いくつかの試験が他の系よりも優れていることが証明されたが、
完全な位置選択性は、いかなる試験条件でも観察されない（図２８）。条件G2、
H2、及びB1は、いくらかの選択性を有するが、不運なことにそれらの収率は低い
。図２９における速度及びプロットの形状の差異は、いくつかの時点でこの反応
をモニターする必要性を説明する。本研究において反応機構と反応速度論とを相
関付けるための試みはなされなかった。

【０１５４】要約すると、新規方法論である、微量反応と結びついた非水性キャピラリーア
レイ電気泳動が、均一な触媒作用及び反応の最適化に対するコンビナトリアルア
プローチのハイスループットの必要性に取り組むために開発される。種々の組み
合わせの触媒活性、選択性及び反応速度論が迅速に決定される。本方法は、不斉
触媒及び薬物並びにコンビナトリアルライブラリー合成のスクリーニングにおい
て潜在的に有用である。

【０１５５】（参照による援用）本書類若しくは任意の図面、配列表、又は本明細書とともに同時に出願された
陳述書の任意の箇所において参照又は引用された全ての情報源（例えば、本発明
者らの証明書、特許出願、特許、印刷された刊行物、貯蔵登録又は記録、実用新
案、ワールドワイドウェブページ等）は、本明細書によって、本明細書中に援用
され、かつ本明細書に対するこのような参照によって本明細書の一部を構成する
。

【０１５６】（解釈に対する指針）前述は、単に、任意の特定の要素またはその様相ではなく、本発明を全体とし
て一体化した記載である。この記載は、本発明の「好ましい実施形態」（本発明
を実施するために発明者が知っているベストモードを含む）を記載している。も
ちろん、前述の記載を読めば、それらの好ましい実施形態のバリエーションは、
当業者に明らかとなる。本発明者らは、このようなバリエーションを当業者が適
宜用いることを予期しており、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に特に
記載された以外で実施されることを意図している。従って、本発明は、適用可能
な法律によって許容されるように、本明細書に添付されている特許請求の範囲に
列挙される主題の全ての改変物及び均等物を含む。

【０１５７】前述の記載および上記の特許請求の範囲において使用されているように、単数
の指摘（例えば、「a」又は「one」）は、他に示されない限り複数を含む。不連
続値の範囲の記載は、その範囲内にある各々の別々の値を個別にいう簡略方法と
して働くことが意図され、そして各々の別々の値は、個別に列挙されているかの
ごとく本明細書中に援用される。特に特許請求の範囲に関しては、用語「から本
質的になる(consisting essentially of)」とは、特に列挙された成分又は工程
に加えて、本発明の基本的かつ新規特徴に本質的に影響しない列挙されていない
成分又は工程が用いられ得ることを示す。対照的に、用語「含む(comprising)」
、「有する(having)」又は「組み込む(incorporating)」は、列挙されている成
分又は工程に加えて、任意の成分又は工程が存在し得ることを示す。用語「から
なる(consisting of)」は、列挙された成分又は工程のみが存在することを示す
が、成分又は工程の均等物が、特に列挙された成分又は工程を代用し得る可能性
を除外しない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の方法に使用されるシステムの図である。

【図２】図２Ａは、カウント対画素番号のグラフである。図２Ｂは、カウント対画素番号のグラフである。

【図３】図３は、吸光度対フレーム番号のグラフである。

【図４】図４は、光の強度（カウント）対フレーム番号対差し引き後の値（カウント）
のグラフである。

【図５】図５は、強度対フレーム番号のグラフである

【図６】図６は96-キャピラリーアレイにおける４個の可視色素のＣＺＥ分離の結果で
ある。

【図７】図７は、移動時間対キャピラリー番号のグラフである。

【図８】図８は、ピーク面積対キャピラリー番号のグラフである。

【図９】図９は、キャピラリーアレイ電気泳動について再構成された二次元エレクトロ
フェログラムである。

【図１０】図１０は、キャピラリーアレイ電気泳動について抽出された１セットのエレク
トロフェログラムである。

【図１１】図１１は、ウシβ−ラクトグロブリン（配列番号１）の３つのバリアントのペ
プチドマップを示す。

【図１２】図１２は96-キャピラリーアレイにおけるＢＬＧＡ及びＢＬＧＢのトリプシン
消化物の６次元分離（キャピラリー対移動時間）の結果を示す。

【図１３】図１３は、図１２のデータから抽出されたＢＬＧＡの選択されたエレクトロフ
ェログラムを示す。

【図１４】図１４は、図１２のデータから抽出されたＢＬＧＢの選択されたエレクトロフ
ェログラムを示す。

【図１５】図１５Ａ〜Ｄは、トリプシン消化後にシングルキャピラリーを使用するＣＺＥ
に関する、４つのｐＨ条件でのＢＬＧＡ及びＢＬＧＢの代表的なペプチドマップ
を示す（図１５Ａ pH9.3; 図１５Ｂ pH8.1; 図１５Ｃ pH5.0; 図１５Ｄ pH2
.5）。

【図１６】図１６は、非イオン性界面活性剤（Ａ及びＢ）並びに／又は非イオン性及び陰
イオン性界面活性剤の組み合わせ（Ｃ及びＤ）を使用する２つの異なるＭＥＫＣ
条件で得られたＢＬＧＡ（Ｂ及びＤ）並びにＢＬＧＢ（Ａ及びＣ）のＭＥＫＣペ
プチドマップを示す。

【図１７】図１７は、移動時間（分）に関するＢＬＧＢについてのＭＥＫＣペプチドマッ
プに対するpH8.1でのTween 20濃度の効果を示す。

【図１８】Ａは、ＮＡＤ量（注入）に対するＮＡＤＨ量（注入）の比率対９回の動電学的
注入からの結果のグラフである。Ｂは、ＮＡＤ量（注入）に対するＮＡＤＨ量（注入）の比率対９回の流体力学
的注入からの結果のグラフである。

【図１９】図１９は96-キャピラリーアレイにおける酵素活性のコンビナトリアルスクリ
ーニングの再構成された吸収画像であり、この図において、キャピラリー（1〜9
6）は、上から下に示されており、そして移動時間（0〜33分）が、左から右へと
プロットされている。

【図２０】図２０は、異なるＬＤＨ濃度に関するpH=7での１８０分の反応後の産物のエレ
クトロフェログラムである。

【図２１】図２１は、異なるｐＨに関するＬＤＨ濃度5×10^-9Mでの１８０分の反応後の産
物のエレクトロフェログラムである。

【図２２】図２２は、シリーズ1〜9に関する１８０分のインキュベーションでのＮＡＤＨ
変換百分率対ｐＨのグラフである。

【図２３】図２３は、シリーズ1〜9に関する３０分間のＬＤＨ触媒作用についての反応百
分率対ｐＨのグラフである。

【図２４】図２４は、シリーズ1〜9に関する２４時間のＬＤＨ触媒作用についての反応百
分率対ｐＨ値のグラフである。

【図２５】図２５は、２つの異なる緩衝液（１ａ及び１ｂ）を使用する、試薬及び内部標
準からの生成物の２つの異性体形態（Ａ及びＢ）の分離を示す。

【図２６】図２６は、図２５の１ｂについての反応条件及び１分の流体力学的注入に関す
る96-キャピラリー分離を示し、この図において、水平方向は、８８個のキャピ
ラリーにわたり（残りの８個のキャピラリーは溶媒のみを含み、そしてプロット
しなかった）、そして垂直方向は時間を示す。

【図２７】図２７は、収率対触媒対塩基の３次元棒グラフである。

【図２８】図２８は、反応中に生じた２つの異性体の選択性のプロットであり、ここでP1
/P2は、それぞれ、２つの異性体Ａ及びＢの比率である。

【図２９】図２９は、触媒Pd(PPh₃)₄及び種々の塩基を使用する反応についての、画分変
換対時間（時間）対塩基の線図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１０月１５日（２００１．１０．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００６６】好ましくは、ＰＤＡは、線形に整列した画素を備え、この場合において、複数
容器の平面アレイ中の各容器は、望ましくは、キャピラリーチューブであり、そ
して各キャピラリーチューブは、好ましくは、約１０個未満の画素、より好まし
くは約７〜９個の画素に光学的に結合されており、これらのうちいくつかは、キ
ャピラリーの壁に結合され、そしてこれらのうちいくつかは、隣接するキャピラ
リーの壁の間の任意の空間に結合され、そしてこれらのうち少なくとも１つが、
キャピラリーの内腔に結合されている。従って、キャピラリーの壁により生じた
迷光は、画素に衝突する前に分散され、そして／または側壁に結合した画素に閉
込められ、そして一般的に、キャピラリーの内腔に結合した画素によって生じる
シグナルに影響しない。キャピラリー：光学的に結合した画素の比率は、好まし
くは、約１：１０未満であり、より好ましくは、約１：７〜約１：９であり、一
方、光学的に結合した画素に対するキャピラリーの比率は、整数の比率である必
要はない。この様式におけるキャピラリーと画素との間の光学的な結合は、本シ
ステムを極度に安定化する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ゴン、シャオイアメリカ合衆国、ニュージャージー州 08817、エディソン、フォレストヘイヴンブールヴァード 2713 Ｆターム(参考） 2G057 AA02 AA04 AB07 AC01 BA05 2G059 AA01 AA05 BB04 DD13 EE01 GG10 HH01 HH02 HH03 JJ02 JJ11 KK04 MM09 MM10 NN01 NN05 NN10 【要約の続き】いる検出手段を備える。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】吸収検出により複数のサンプルを同時に分析する方法であっ
て、該方法は、：（ｉ）複数容器の平面アレイを提供する工程を包含し、該複数容器の各々が少
なくとも１つの吸収種を含有するサンプルを含み、（ｉｉ）該少なくとも１つの吸収種の１以上によって吸収される光の少なくと
も１つの波長を含むか、またはそれらから本質的になる光源で、複数容器の平面
アレイを照射する工程を包含し、該波長の吸収が検出され、（ｉｉｉ）検出手段を用いて該少なくとも１つの吸収種の１以上による光の吸
収を検出する工程を包含し、該検出手段が、光源と整列しており、かつ複数容器
の平面アレイ中の容器の断面距離の少なくとも約１０倍の距離で該複数容器の平
面アレイと整列かつ並行して配置されており、該断面距離が、複数容器の平面ア
レイの平面に対して直交方向で測定されたものであり、ここで、複数容器の平面アレイ中のサンプルによる光の吸収の検出が該サンプ
ル中の吸収種の存在を示す、方法。
【請求項２】（ｉｖ）サンプル中の吸収種について（ｉｉｉ）において検
出される光の吸収量を測定する工程をさらに包含し、（ｉｉｉ）で検出される光
の吸収量の測定が該サンプル中の吸収種の量を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記距離が約１０ｃｍ〜約５０ｃｍである、請求項１に記載
の方法。
【請求項４】前記複数容器の平面アレイがキャピラリーチューブを備える
、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記距離がキャピラリーチューブの直径の少なくとも約１０
倍である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記複数容器の平面アレイが少なくとも１０個のキャピラリ
ーチューブを備える、請求項４に記載の方法。
【請求項７】前記複数容器の平面アレイが少なくとも約９０個のキャピラ
リーチューブを備える、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記平面アレイが少なくとも１個のコントロール容器をさら
に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記検出手段がフォトダイオードアレイ中に複数の感光性素
子をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記フォトダイオードアレイが線状に整列した画素を備え
る、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】該複数容器の平面アレイ中の各容器がキャピラリーチュー
ブであり、かつ各キャピラリーチューブが約１０未満の画素に光学的に連結され
ている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記光源が約１８０ｎｍ〜約１５００ｎｍの範囲にある波
長を含むか、またはそれらから本質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記光源が約０．５ｍＷ〜約５０ｍＷの電力出力を有する
、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】光学フィルターが前記複数容器の平面アレイと前記検出手
段との間に配置されており、該光学フィルターが前記光源からの光の少なくとも
１つの波長を選択する、請求項１又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】フラットフィールドレンズが前記複数容器の平面アレイと
前記検出手段との間に配置されており、該フラットフィールドレンズが、複数容
器の平面アレイ中の各サンプル中の前記少なくとも１つの吸収種の１以上によっ
て吸収されない光を、検出手段と結合させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】フラットフィールドレンズによる光の結合が光源から遮蔽
される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】複数容器の平面アレイ中の各キャピラリーについてローダ
ミン６Ｇに対する検出限界が約１．８×１０^-8Ｍである、請求項４に記載の方法
。
【請求項１８】隣接するキャピラリー間のクロストークが約０．２％未満
である、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】隣接するキャピラリー間のクロストークが約０．２％未満
である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】前記サンプルが、圧力、重力、真空、キャピラリー又は電
気泳動の作用によって前記キャピラリーチューブ中に導入される、請求項４に記
載の方法。
【請求項２１】ビームエキスパンダーが前記光源と前記複数容器の平面ア
レイとの間に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】コリメート焦点調節レンズが前記光源と前記複数の平面ア
レイとの間に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】請求項１に記載の方法に使用するためのシステムであって
、該システムは、：（ｉ）１以上の吸収種により吸収される光の少なくとも１つの波長を含むか、
またはそれらから本質的になる光源を備え、該波長の吸収が検出され、（ｉｉ）複数容器の平面アレイを備え、該複数容器の各々に少なくとも１つの
吸収種を含有するサンプルが配置され得、（ｉｉｉ）光源と整列しており、かつ複数容器の平面アレイ中の容器の断面距
離の少なくとも約１０倍の距離で該複数容器の平面アレイと整列かつ並行して配
置されている検出手段を備え、該断面距離が、複数容器の平面アレイの平面に対
して直交方向で測定されたものである、システム。
【請求項２４】前記距離が約１０ｃｍ〜約５０ｃｍである、請求項２３に
記載のシステム。
【請求項２５】前記複数容器の平面アレイがキャピラリーチューブを備え
る、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】前記距離がキャピラリーチューブの直径の少なくとも約１
０倍である、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】前記複数容器の平面アレイが少なくとも約１０個のキャピ
ラリーチューブを備える、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２８】前記複数容器の平面アレイが少なくとも約９０個のキャピ
ラリーチューブを備える、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】前記平面アレイが少なくとも１個のコントロール容器をさ
らに備える、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３０】前記検出手段がフォトダイオードアレイ中に複数の感光性
素子を備える、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３１】前記フォトダイオードアレイが線状に整列した画素を備え
る、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】該複数容器の平面アレイ中の各容器がキャピラリーチュー
ブであり、かつ各キャピラリーチューブが約１０未満の画素に光学的に連結され
ている、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】前記光源が約１８０ｎｍ〜約１５００ｎｍの範囲にある波
長を含むか、またはそれらから本質的になる、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３４】前記光源が約０．５ｍＷ〜約５０ｍＷの電力出力を有する
、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】前記複数容器の平面アレイと前記検出手段との間に光学フ
ィルターをさらに備え、該光学フィルターが前記光源からの光の少なくとも１つ
の波長を選択する、請求項２３又は請求項３２に記載のシステム。
【請求項３６】前記複数容器の平面アレイと前記検出手段との間にフラッ
トフィールドレンズをさらに備え、該フラットフィールドレンズが、複数容器の
平面アレイ中の各サンプル中の前記少なくとも１つの吸収種の１以上によって吸
収されない光を、検出手段と結合させる、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】フラットフィールドレンズによる光の結合を光源から遮蔽
するシールドをさらに備える、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】複数容器の平面アレイ中の各キャピラリーについてのロー
ダミン６Ｇに対する検出限界が約１．８×１０^-8Ｍである、請求項２５に記載の
システム。
【請求項３９】隣接するキャピラリー間のクロストークが約０．２％未満
である、請求項２５に記載のシステム。
【請求項４０】隣接するキャピラリー間のクロストークが約０．２％未満
である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４１】前記キャピラリーチューブ中に前記サンプルを導入するた
めの手段をさらに備える、請求項２５に記載のシステム。
【請求項４２】前記サンプルが、圧力、重力、真空、キャピラリー又は電
気泳動の作用によって前記キャピラリーチューブ中に導入される、請求項４１に
記載のシステム。
【請求項４３】前記光源と前記複数容器の平面アレイとの間にビームエキ
スパンダーをさらに備える、請求項２３に記載のシステム。
【請求項４４】前記光源と前記複数容器の平面アレイとの間にコリメート
焦点調節レンズをさらに備える、請求項２３に記載のシステム。