WO2018078276A1 - Composition de peptides de collagène de peau de poisson et son utilisation à titre de médicament - Google Patents

Composition de peptides de collagène de peau de poisson et son utilisation à titre de médicament Download PDF

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Christelle BRUNO-BONNET
Yannick AUFFRET
Pascale JOLIMAITRE-ROBERT
Patrice CORBILLE
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Gelatines Weishardt
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Definitions

  • the invention relates to a composition of fish skin (s) collagen peptides.
  • the invention relates in particular to such a peptide composition obtained by enzymatic hydrolysis of fish skin collagen (s).
  • the invention also relates to such a composition for use as a medicament.
  • the invention thus relates to the use of such a composition for the curative or preventive treatment of a pathology affecting the human or animal body.
  • the invention particularly relates to such a composition for its use as a medicament in the treatment of a gastrointestinal candidiasis in humans or animals and / or in the treatment of intestinal inflammation in humans or animals. animal.
  • the invention also relates to such a composition for use as a medicament in a microbiota stimulating treatment.
  • FR 2 720 067 discloses a peptide powder obtained by hydrolysis by papain of a collagen-rich raw material derived from the skin or skeleton of fish, molluscs or crustaceans. In the peptide powder obtained, 38% of the peptides have a molecular weight of between 10,000 Da and 50,000 Da.
  • the peptide composition of FR 2 720 067 has a wide range of molecular weights, particularly greater than 10% of peptides with a molecular weight greater than 10,000 Da.
  • the peptide composition of FR 2 720 067 is heterogeneous in peptide size and has a water-soluble peptide fraction of only 80% to 90%. Such high molecular weight peptide powders higher than 10,000 Da are not perfectly water soluble. They are also not totally absorbable by the digestive tract and therefore pose the problem of their bioavailability.
  • FR 2 720 067 also describes the use of such a peptide powder obtained from live fish in the great depths in the curative treatment of inflammation of the tendons of the joints of the lower limbs (knees, balls and hooves) of horses race. Obtaining such a composition is problematic. It requires the removal of abyssal fish. In addition, such a powder is limited in its use in the treatment of joint inflammation.
  • the invention therefore aims to overcome these disadvantages.
  • the aim of the invention is to propose a novel peptide composition resulting from an enzymatic hydrolysis of skin skin (s) collagen (s), said peptides being water-soluble, ie 100% water-soluble, and totally absorbable by the digestive tract.
  • the invention also aims to propose a novel peptide composition formed by enzymatic hydrolysis of skin collagen (x) of temperate water fish (s).
  • the invention also aims at providing such a peptide composition that can be used as a medicament.
  • the invention aims in particular to provide such a peptide composition resulting from an enzymatic hydrolysis of skin collagen (x) of temperate water fish (s) and may be used as a drug.
  • the aim of the invention is to propose such a peptide composition which at the same time has a distribution of their apparent molecular weights extending over a narrow range of between one hundred and a few thousand daltons, ie excluding peptides from high apparent molecular weights, and also exhibiting a low proportion of apparent low molecular weight peptides.
  • the object of the invention is to propose such a peptide composition that can be used as a medicament in the treatment of intestinal candidiasis.
  • the invention also aims at providing such a peptide composition that can be used as a medicament in the treatment of inflammatory digestive diseases, including inflammatory bowel disease (IBD).
  • IBD inflammatory bowel disease
  • the invention also aims to propose such a peptide composition that can be used to promote the balance and maintenance of intestinal flora (or microbiota).
  • the invention also aims to propose the use of such a peptide composition resulting from an enzymatic hydrolysis of collagen of skin (s) of fish (s) of temperate waters as a dietary supplement.
  • the invention relates to a peptide composition having an aminogram in which:
  • the glycine is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 20.0% and 24.5%;
  • the hydroxyproline is in a molar amount such that the ratio of this quantity to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 6.0% and 12.0%, in particular between 7.0% and 11, 0%;
  • the proline is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 10.6% and 14.6%, especially between 11.6% and 13.6%; %, in particular between 12.1% and 13.1%, preferably of the order of 12.6%; the peptide composition exhibiting, in an exclusion chromatography analysis, in which each peptide of the peptide composition is eluted with a retention time representative of the apparent molecular weight of that peptide, an elution curve (c ') that is, a chromatogram elution curve) peptides having a value of area under the curve (i.e., an area value representative of the mass quantity of peptides) corresponding to the peptides of apparent molecular weight less than 1400 Da such that the ratio of this area value to the total area under the curve (corresponding to all the peptides of the composition) is less than 40%, in particular less than 38%, preferably between 30% and 38%, in particular between 30% and 35%
  • a filtration column of dimensions 300 x 7.8 mm comprising a stationary phase formed of a silica gel with a porosity of 5 ⁇ ;
  • the column being maintained at a temperature of 40 ° C .;
  • aminogram means the list of free amino acids forming, by peptide linking (or binding), the sequence of a peptide or the peptide sequences of a mixture of peptides. Such an aminogram is obtained by analysis - in particular by global analysis or by sequential analysis - of the amino acids constituting a peptide or a mixture of peptides.
  • the nature and amount of the constituent amino acids of the peptides of the composition according to the invention are determined by any overall analysis method known in itself to those skilled in the art.
  • this analysis is carried out in accordance with ISO 13903: 2005 by assaying free and total amino acids by means of an amino acid analyzer or by means of high performance liquid chromatography (HPLC) equipment. Hydroxyproline is assayed by continuous flow analysis and colorimetric detection.
  • the aminogram obtained by global analysis of the composition according to the invention is representative of the amino acid composition of collagen of skins of temperate water fish.
  • the invention thus relates to such a peptide composition resulting from an enzymatic hydrolysis of collagen from skins of temperate water fish by a cysteine protease of plant origin - in particular a protease of the class EC 3.4.22.2-.
  • protease cysteine provides a composition of peptides which are water-soluble - i.e., 100% water soluble - and which are fully absorbable through the digestive tract and have an apparent molecular weight distribution that extends over a narrow range between one hundred and a few thousand daltons, ie excluding high apparent molecular weight peptides, and also having a low proportion of apparent low molecular weight peptides.
  • a separation of the peptides from the peptide composition according to the invention is carried out as a function of their apparent molecular weight by subjecting the peptide composition to an analytical separation step by liquid chromatography on a silica gel filtration column ( BioSep-SEC-S2000, Phenomenex, Peck, France) porous and high density in silanol groups.
  • a solution comprising (A) ultra-pure water supplemented with trifluoroacetic acid (0.1% by volume) and (B) acetonitrile (A / B; 75/25; / v).
  • the gel filtration column is maintained at a temperature of 40 ° C during the analysis.
  • the flow rate of the mobile phase in the stationary phase is 0.6 mL / min.
  • the volume of peptide composition to be analyzed introduced at the top of the gel filtration column is 25 ⁇ L ⁇ and the detection is carried out continuously by absorbance at the wavelength of 214 nm.
  • a chromatogram is obtained on which each peak is characterized by a value of time or retention time (expressed in minutes following the introduction of the mixture to be analyzed at the top of the column) determined at the maximum value of peak absorbance.
  • the apparent molecular weight of each peptide corresponding to this retention time value is determined at the maximum absorbance value of each peak by means of a predetermined calibration curve obtained by analysis under the same chromatographic conditions as described above. above-peptides of apparent molecular weight determined.
  • a calibration curve is produced by analyzing, under the same chromatographic conditions, a mixture of peptides / reference proteins and apparent molecular weight known and between 100 Da and 30 kDa.
  • the chromatogram representing the variation of absorbance at 214 nm during the chromatographic analysis of the peptide composition according to the invention determines the proportion of peptides with an apparent molecular weight of less than 1400 Da by evaluating the ratio of the value of the area extending under the curve-that is, the sum of the areas extending under the peaks of the curve-corresponding to peptides of apparent molecular weight less than 1400 Da over the value of the total area extending under the entire curve-that is, the sum of the areas extending under each peak of the curve-and corresponding to all the peptides of the peptide composition .
  • the invention therefore relates to a composition of peptides derived from an enzymatic hydrolysis of collagen from skins of temperate water fish by a cysteine protease of plant origin, each peptide of the composition having an amino acid number of between 2 and a few tens, preferably between 2 amino acids and 100 amino acids.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the glycine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 20.0% and 22.4%, especially between 20.0% and 21.9%, in particular between 20.4% and 21.4%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the glycine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 22.4%. and 24.9%, especially between 22.9% and 24.4%, in particular between 23.0% and 24.0%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which hydroxyproline is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 7.0% and 9.0%, in particular between 7.5% and 8.5%, preferably between 7.7% and 8.5%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the hydroxyproline is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 9.5. % and 11.5%, in particular between 10.0% and 11.0%, preferably of the order of 10.5%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the glutamic acid is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 8.0. % and 13.0%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the glutamic acid is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 8.0. % and 10.0%, in particular between 8.5% and 9.5%, preferably between 9.0% and 9.5%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the glutamic acid is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 10, 5% and 12.5%, in particular between 11.0% and 12.0%, preferably in the order of 11.6%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the arginine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 6.9%. and 10.9%, between 7.9% and 9.9%, in particular between 8.0% and 9.0%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the alanine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 7.3%. and 11.5%, especially between 8.0% and 10.0%, in particular between 8.1% and 9.6%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the aspartic acid is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 3.1. % and 7.1%, especially between 4.1% and 6.1%, in particular between 4.6% and 5.6%, preferably between 5.0% and 5.5%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the lysine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 1.5% and 5.5%, especially between 2.5% and 4.5%, in particular between 3.0% and 4.0%, preferably between 3.1% and 3.6%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the serine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 1.5% and 5.5%, especially between 2.5% and 4.5%, in particular between 3.0% and 4.0%, preferably between 3.2% and 3.6%.
  • the composition according to the invention has an aminogram wherein threonine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0.7% and 4.7%, especially between 1.7% and 3.7%, in particular between 2.2% and 3.2%, preferably between 2.4% and 2.8%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the leucine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0.6% and 4.6%, especially between 1.6% and 3.6%, in particular between 2.1% and 3.1%, preferably between 2.4% and 2.9%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the phenylalanine is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0.3% and 4.3%, especially between 1.3% and 3.3%, in particular between 1.8% and 2.8%, preferably between 1.8% and 2.4%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the valine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0% and 4, 0%, especially between 1.0% and 3.0%, in particular between 1.5% and 2.5%, preferably between 1.8% and 2.5%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the isoleucine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0% and 3%. , 5%, especially between 0.5% and 2.5%, in particular between 0.9% and 2.0%, preferably between 0.9% and 1.6%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the hydroxylysine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0% and 3%. , 5%, especially between 0.5% and 2.5%, in particular between 1.0% and 2.0%, preferably of the order of 1.5%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the histidine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0% and 3%. , 3%, especially between 0% and 2.3%, in particular between 0.5% and 1.5.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the methionine is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0% and 2, 5%, especially between 0% and 2.0%, in particular between 0.5% and 1.8%, preferably between 0.7% and 1.6%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which the tyrosine is in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0% and 1, 5%, especially between 0% and 1.0%, in particular between 0% and 0.9%, preferably between 0.2% and 0.8%.
  • the composition according to the invention has an aminogram in which cysteine and cystine are together in molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 0. % and 2%, especially between 0% and 1.0%, in particular between 0% and 0.5%, preferably of the order of 0.03%.
  • composition according to the invention has an aminogram in which the essential amino acids (lysine, methionine, phenylalanine, threonine, valine, leucine and isoleucine and histidine) are between 15% and 20% together. %.
  • At least 90% -particularly at least 95% -peptide of the peptide composition have an apparent molecular weight of less than 15 000 Da (Dalton), in particular between 200 Da and 15,000 Da, of preferably between 200 Da and 14 000 Da, in particular between 200 Da and 13 000 Da.
  • at least 90% of the peptides of the composition have an apparent molecular weight of between 200 Da and 12,000 Da.
  • the peptides of the composition according to the invention have a narrow apparent molecular weight distribution extending over a narrow range of between one hundred and a few thousand daltons, that is to say excluding high molecular weight peptides exhibiting more than 100 amino acids, and also having a low proportion of apparent low molecular weight peptides.
  • the peptides of the composition have a value of average apparent molecular weight of between 2500 Da and 3600 Da, especially between 2700 Da and 3600 Da.
  • Each peptide of the peptide composition according to the invention having a mass contribution in the composition the value of the average apparent molecular weight of peptides of the composition corresponds to the average of each value, called the weighted value, of the apparent molecular weight of each peptide. weighted by a value representative of the mass contribution of each peptide in the composition.
  • the representative value of the mass contribution of each peptide or group of peptides in the composition is expressed as a percentage of the value of the area under the curve corresponding to said peptide or to said group of peptides on the value of the total area under the curve. corresponding to all the peptides of the composition.
  • the value of the weighted apparent molecular weight of a group of peptides corresponding to the same peak of a chromatogram corresponds to the value of the apparent molecular weight found at the (maximum) peak of this peak of the chromatogram, multiplied by the ratio of the value of the area extending under the curve of this peak over the (total) area extending under the curve of the chromatogram.
  • "Area extending under the curve” or "area under the curve” or “area extending under the peak” or “Area under the peak” means the area of the surface extending between the curve describing the peak of the chromatogram and the baseline of the chromatogram.
  • the area under one of the peaks of the chromatogram extends between two minima of the chromatogram curve framing a peak (or maximum) of the chromatogram curve.
  • the peptide composition according to the invention exhibits during its analysis by exclusion chromatography in which each peptide of the peptide composition is eluted with a retention time representative of the apparent molecular weight of this peptide, a representative elution curve (i.e. a chromatogram) of the peptides having an area value under this curve (i.e., an area value representative of the mass quantity of peptides) corresponding to peptides with an apparent molecular weight greater than 10,000 Da, in particular between 10,000 Da and 50,000 Da, such as the ratio of this area value over the total area under the curve (corresponding to all the peptides of the composition) is less than 15%, especially less than 10%. According to certain particular embodiments, this ratio is between 2.5% and 8.5%.
  • the peptide composition according to the invention may be free of any high molecular weight peptide. According to these other particular embodiments, the peptide composition according to the invention is formed of water-soluble peptides.
  • the peptide composition according to the invention exhibits during its analysis by exclusion chromatography in which each peptide of the peptide composition is eluted with a retention time representative of the apparent molecular weight of this peptide, a representative elution curve (i.e. a chromatogram) of the peptides having an area value under this curve (i.e., an area value representative of the mass quantity of peptides) corresponding to the peptides of apparent molecular weight between 1800 Da and 10 000 Da such that the ratio of this area value to the total area under the curve (corresponding to all the peptides of the composition) is greater than 35% -including between 35% and 70%, in particular between 45% and 65%. According to certain particular embodiments, this ratio is between 49% and 55%.
  • the peptide composition according to the invention exhibits during its analysis by exclusion chromatography in which each peptide of the peptide composition is eluted with a retention time representative of the apparent molecular weight of this peptide, a representative elution curve (i.e. a chromato gram) of the peptides having an area value under this curve (i.e., an area value representative of the mass quantity of peptides ) corresponding to the peptides of apparent molecular weight between 600 Da and 1800 Da such that the ratio of this area value over the total area under the curve (corresponding to all the peptides of the composition) is between 15 % and 45% -in particular between 20% and 40%, especially between 25% and 35%. According to certain particular embodiments, this ratio is between 27% and 32%.
  • the peptide composition according to the invention exhibits during its analysis by exclusion chromatography in which each peptide of the peptide composition is eluted with a retention time representative of the apparent molecular weight of this peptide, a representative elution curve (i.e. a chromato gram) of the peptides having an area value under this curve (i.e., an area value representative of the mass quantity of peptides ) corresponding to the peptides of apparent molecular weight less than 600 Da such that the ratio of this area value to the total area under the curve (corresponding to all the peptides of the composition) is less than 10%. According to certain particular embodiments, this ratio is between 8.5% and 14.5%.
  • composition according to the invention present by chromatographic analysis on an anion exchange column in which each peptide of the peptide composition is eluted from the column with a retention time representative of its charge:
  • the ratio of this area value under the peak corresponding to the anionic peptides to the sum of the area values under the peaks corresponding to the anionic peptides, the neutral peptides and the cationic peptides of the composition is between 27.0% and 45%, especially between 30% and 45%, in particular between 35% and 43%, preferably between 35% and 40%;
  • the value of the area under the peak corresponding to the anionic peptides, the value of the area under the peak corresponding to the cationic peptides and the value of the area under the peak corresponding to the neutral peptides being determined by chromatographic analysis in conditions described below:
  • chromatographic column of dimensions 100 x 7.8 mm comprising as stationary phase a hydrophilic anion exchange resin functionalized with quaternary ammonium groups, and with a particle size of 10 ⁇ ;
  • the peptides of the composition according to the invention exhibit, during a hydrophobicity analysis by reverse phase liquid chromatography, a retention time of between 16 min and 36 min;
  • hydrophobicity analysis being carried out under the following conditions: using a chromatography column of dimensions 250 ⁇ 4.6 mm having a stationary phase formed of silica grafted with butyl groups, with a particle size of 5 ⁇ and a porosity value of 300 A;
  • a composition according to the invention comprises hydrophobic peptides by nature which are eluted from the above-mentioned column and under the conditions specified above with a retention time corresponding to a percentage of acetonitrile between 12% and 38%.
  • the median retention time of the peptides of the composition according to the invention is 26 min corresponding to a percentage of acetonitrile of 25% in the eluent.
  • the peptide composition is in the liquid state. It may be a solution of the peptide composition according to the invention in a liquid solvent, especially in an aqueous solvent.
  • the peptide composition is in the solid state.
  • the peptide composition may be in the form of a split state solid. It may be in particular a solid at least partially dehydrated state.
  • the peptide composition according to the invention can be in the form of a powder.
  • the peptide composition is free of carbohydrate.
  • the peptide composition is free of fat.
  • the dry matter content of the peptide composition comprises a mass proportion of collagen peptides greater than 95%, especially greater than 99%.
  • the peptide composition has an amount of collagen peptides such that the ratio of the collagen peptide mass of the dry matter of the peptide composition to the dry matter mass of the peptide composition is greater than 95%, especially greater than 99%.
  • the peptides of the composition are water-soluble.
  • the peptides of the peptide composition are 100% soluble in water.
  • the peptide composition is hydro-compatible.
  • the peptides of the peptide composition are derived from a controlled enzymatic hydrolysis of skin collagen of at least one fish selected from the group consisting of fish of the family Pangasiidae - in particular Pangasius hypophtalmus (or Pangasianodon hypophtalmus), Pagasius pangasius, Pangasius bocourti and the family Cichlidae - especially the genus Oreochromis, especially Oreochromis niloticus or the genus Tilapia -.
  • the peptides of the peptide composition are derived from a controlled enzymatic hydrolysis of skin collagen of at least one sinful fish in temperate water from a temperate region.
  • the invention also extends to the use of such a peptide composition in a therapeutic treatment of the human or animal body.
  • the invention therefore also extends to such a peptide composition for use as a medicament.
  • the invention therefore extends to such a peptide composition for its use as a medicament in the preventive or curative treatment of at least one pathology of the human or animal body.
  • the invention also extends in particular to a peptide composition for use as a medicament in at least one of the following treatments:
  • the invention also extends to any use of a peptide composition according to the invention in human nutrition. According to some embodiments, the invention also extends to any use of a peptide composition according to the invention in human nutrition to the exclusion of any use as a medicament. In particular, advantageously the composition according to the invention is used as a dietary supplement.
  • the invention also extends to a peptide composition obtained by a process in which:
  • - skins of temperate water fish are selected, in particular from the family Pangasiidae and / or the family of
  • At least one step of acid or alkali treatment of the skin adapted to allow extraction of at least a portion of the collagen of the skins, then;
  • At least one liquid / solid extraction of the collagen is carried out in water brought to a temperature of between 60 ° C. and 98 ° C. vs.
  • a separation step is then carried out -particularly a step of separation by decantation- of a fraction comprising solids (and fats) and of a solution comprising the collagen extracted, then the solution comprising the collagen extracted is subjected to a purification step, for example by filtration on land and / or demineralization on an ion exchange resin, adapted to form a purified solution comprising collagen, the dry matter of the purified solution comprising a mass proportion of collagen of at least 99%, especially at least 99.5%, in particular at least 99.8%.
  • a purified collagen solution comprising substantially pure collagen is formed.
  • such a purified solution of substantially colorless collagen is formed.
  • such a purified collagen solution is formed substantially substantially completely elastin-free.
  • the purified solution is concentrated to form a purified collagen gel and the purified collagen gel is then subjected to the collagen hydrolysis step.
  • Such a method makes it possible to obtain a peptide composition according to the invention that is substantially colorless. Such a method makes it possible to obtain a peptide composition according to the invention substantially free of elastin. In particular, it makes it possible to obtain such a peptide composition according to the invention without any chromatographic step of purification of the peptide composition.
  • a subsequent step of filtering the peptide composition is carried out.
  • a step of pasteurization of the peptide composition is also carried out for a period of at least 2 minutes at a time.
  • Pasteurization temperature between 85 ° C and 90 ° C minimum.
  • a step of drying the peptide composition is carried out.
  • This spray drying step is carried out so as to form a composition according to the invention which is substantially dehydrated and in the form of a powder.
  • the invention therefore extends to a peptide composition obtained by a process in which:
  • At least one acid treatment step of the skins adapted to allow extraction of at least a portion of the collagen from the skins, then;
  • said peptide composition having an overall amino acid analysis wherein:
  • the glycine is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 20.0% and 24.5%;
  • the hydroxyproline is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 6.0% and 12.0%;
  • the proline is in molar quantity such that the ratio of this quantity to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 10.6% and 14.6%;
  • the peptide composition exhibiting, in an exclusion chromatography analysis, in which each peptide of the peptide composition is eluted with a retention time representative of the apparent molecular weight of that peptide, an elution curve (c ') that is, a curve or a chromatogram elution profile) of peptides having a value of area under the curve (i.e., a value of area representative of the mass quantity of peptides) corresponding to peptides of apparent molecular weight less than 1400 Da such that the ratio of this area value to the total area under the curve (corresponding to all the peptides of the composition) is less than 40%;
  • a filtration column of dimensions 300 x 7.8 mm comprising a stationary phase formed of a silica gel with a porosity of 5 ⁇ ;
  • the column being maintained at a temperature of 40 ° C .;
  • the invention also relates to a peptide composition, such a peptide composition for its use as a medicament, a process for obtaining such a peptide composition and such a peptide composition obtained by such a method of obtaining characterized in combination. by all or some of the characteristics mentioned above or below.
  • FIG. 1 is a representative chromatogram of an analysis of a peptide composition according to the invention by gel filtration
  • FIG. 2 is a representative chromatogram of an HPLC analysis of a peptide composition according to the invention on an anion exchange resin
  • FIG. 3 is a representative chromatogram of an analysis of a peptide composition according to the invention by reverse phase chromatography
  • FIG. 4 is a graphical representation representative of the evolution of the body mass of mice whose colonic inflammation is induced by sodium dextran sulfate (DSS);
  • FIG. 5 is a graphical representation in histogram of the result of an IL1 assay in the mouse colon by the ELIS A method
  • FIG. 6 is a graphical representation in histogram of the result of an IL6 assay in the mouse colon by the ELISA method
  • FIG. 7 is a graphical representation in histogram of the result of a TNF-assay in the mouse colon by the ELISA method
  • FIG. 8 is a graphical representation in histogram of the result of a TGF- ⁇ assay in the mouse colon by the ELISA method
  • FIG. 9 is a graphical graphical representation of the result of a PCR assay of the fungal flora in the mouse colon.
  • FIG. 10 is a graphical representation in histogram of the result of a Saccharomyces cerevisiae PCR assay in the mouse colon
  • FIG. 11 is a graphical representation in histogram of the result of a PCR assay of enterobacteria in the mouse colon
  • FIG. 12 is a graphical representation in histogram of the result of a PCR assay of firmicutes in the mouse colon
  • FIG. 13 is a graphical representation in histogram of the result of a PCR assay for bacteroidetes in the mouse colon;
  • FIG. 14 is a graphical representation in histogram of the result of a PCR assay of Faecalibacterium prausnitzii in the mouse colon;
  • FIG. 15 is a graphical representation in histogram of the result of a Lactobacille murinus PCR assay in the mouse colon;
  • FIG. 16 is a graphical representation in histogram of a quantitative RT-PCR analysis of messenger RNAs of TGF- ⁇ in the mouse colon;
  • FIG. 17 is a graphical representation in histogram of a quantitative RT-PCR analysis of the messenger RNAs of the
  • iNOS Inducible NO-synthase
  • FIG. 18 is a graphical representation in histogram of a quantitative RT-PCR analysis of messenger RNAs of Fizz1 in the mouse colon;
  • FIG. 19 is a graphical representation in histogram of a quantitative RT-PCR analysis of messenger RNAs of 5-LOX in the mouse colon;
  • FIG. 20 is a graphical representation in histogram of a quantitative RT-PCR analysis of the messenger RNAs of 12/15-LOX in the mouse colon.
  • PROCESS FOR PREPARING A COMPOSITION ACCORDING TO THE INVENTION Temperate water fish skins are harvested or purchased, in particular fish of the family Pangasiidae - in particular Pangasius hypophtalmus (or Pangasianodon hypophtalmus), Pagasius pangasius, of Pangasius bocourti and / or catfish or of the Cichlidae family - in particular of the genus Oreochromis, in particular Oreochromis niloticus or the genus Tilapia-.
  • a succession of steps of washing the skin, acid treatment of the washed skin and extraction and purification of collagen are carried out.
  • An enzymatic hydrolysis step of the fish skin collagen thus obtained is then carried out so as to form the composition according to the invention.
  • water is heated to a temperature between 70 ° C and 75 ° C.
  • a mass of fish skin collagen is gradually poured into hot water and with stirring, such that the proportion of mass of collagen in the water is 45%, and the pH of the solution is adjusted to pH 6.0.
  • a quantity of cysteine protease of vegetable origin is then added to the solution of collapsed collagen.
  • At least one protease of Carica papa ⁇ a in particular lypaine (Lypaine®, LYVEN, Collombelles, France) in the dry state, is chosen as cysteine protease.
  • the ratio of the cysteine protease mass to the collagen mass is adapted according to the desired hydrolysis conditions. For example, the ratio of the cysteine protease mass to the collagen mass is 0.2%.
  • the temperature of the solution is maintained between 65 ° C. and 70 ° C., which is suitable for promoting the enzymatic activity of the cysteine protease and for maintaining the optimum fluidity of the collagen hydrolyzate, taking into account that the Viscosity of the collagen hydrolyzate decreases with the hydrolysis time.
  • the solution is maintained at this temperature for a duration of the order of 45 minutes.
  • the enzymatic hydrolysis reaction is stopped by heating the collagen hydrolyzate to a temperature above the denaturation temperature of the cysteine protease, for example at a temperature between 85 ° C and 90 ° C for 20 minutes.
  • the hydrolyzate of Fish skin collagen is optionally subjected to a filtration step and then to a pasteurization step for a period of at least 2 minutes at a pasteurization temperature between 85 ° C and 90 ° C minimum.
  • the hydrolyzate of collagen or collagen peptides is then subjected to a drying step under conditions suitable for forming a composition according to the invention formed of a powder of predetermined particle size.
  • a characterization of a peptide composition according to the invention is also carried out by the distribution of the apparent molecular weights of the peptides, by the polarity of the peptides and not the hydrophobicity of the peptides.
  • the apparent molecular weight distribution of the constituent peptides of a composition according to the invention is analyzed by gel permeation on a liquid chromatography column of dimensions 300 ⁇ 7.8 mm in which the stationary phase consists of a gel based on silica (BioSep-SEC-S2000, Phenomenex, Peck, France) with a porosity of 5 ⁇ .
  • the filtration column being maintained at a temperature of 40 ° C.
  • the mobile phase consists of a mixture comprising (A) ultrapure water supplemented with trifluoroacetic acid (0.1% by volume) and (B) acetonitrile (A / B, 75/25, v / v).
  • the flow rate of the mobile phase is maintained at 0.6 ml / min.
  • the volume of the solution comprising the peptide composition to be analyzed is 25 ⁇ L ⁇ .
  • the detection is carried out at the outlet of the gel permeation column by the measurement of absorbance at the wavelength of 214 nm.
  • a calibration curve is obtained for determining an apparent molecular weight as a function of the retention time.
  • known peptides of molecular weight between 100 Da and 30 kDa are chosen.
  • the known standards are proline, glutathione, ribonuclease A and trypsin, with apparent molecular weights of 115 Da, 307 Da, 13.7 kDa and 28.2 kDa, respectively.
  • the apparent molecular weights and the retention times expressed in minutes of the standards are given in Table 1 below:
  • the peptides are eluted from the column successively according to their decreasing apparent molecular weight.
  • the retention time values of each peptide family of the analyte corresponding to a peak of the chromatogram are recorded at the apex of each peak of the chromatogram and translated into an apparent molecular weight value as compared to the calibration curve.
  • the relative values of the amounts of each peptide family correspond to the value of the air under the curve corresponding to each peak of the chromatograph. These values are expressed as the ratio of the area under the curve corresponding to a family of peptides to the sum of the area values of each peptide family.
  • the proportion of peptides of the composition according to the invention - whose chromatogram is shown in FIG. 1 and whose values are given in Table 2 - whose apparent molecular weight is less than 1400 Da is 31.2% (apparent molecular weight of values 983 Da and 333 Da) with respect to all the peptides of the composition.
  • the average apparent molecular weight of the peptides of the composition according to the invention whose apparent molecular weight values are given in Table 2 is 3442 Da.
  • the average apparent molecular weight of the peptides of the composition is defined as the average of the weighted apparent molecular weight values corresponding to each group of peptides of the composition corresponding to the same peak of the chromatogram.
  • the value of the weighted apparent molecular weight of a group of peptides from the same peak of the chromatogram corresponds to the value of the apparent molecular weight at the peak (maximum) of the peak weighted by the ratio of the value of the area under the curve of the peak corresponding to the (total) area under the curve of the chromatogram.
  • Area under the curve or “area under the peak” means the area of the surface extending between the curve describing the peak of the chromatogram and the baseline of the chromatogram. In particular, the area under one of the peaks of the chromatogram extends between two minima of the chromatogram curve framing a peak (or maximum) of the chromatogram curve.
  • compositions according to the invention - whose values are given in Table 3 - and whose molecular weight is less than 1400 Da is 35.2% (corresponding essentially to the apparent molecular weights of 983 Da and 340 da).
  • the proportion of anionic peptides in the composition according to the invention is analyzed, the distribution of apparent molecular weights is given in Table 2, that is to say the proportion of peptides with a negative charge at pH 8.35.
  • the proportion of neutral and / or cationic peptides in the composition according to the invention is also analyzed, ie the proportion of peptides presenting a generally neutral charge at pH 8.35 or having a positive charge at pH 8. 35.
  • Such an analysis is carried out by ion exchange high performance liquid chromatography (HPLC) in which the stationary phase is an anion exchange resin (Hydrophase HP-SAX, Interchim, Montluzzo, France) with a particle size of 10 ⁇ .
  • HPLC ion exchange chromatography column is 100 x 7.8 mm in size.
  • the ion exchange HPLC column is conditioned in tris (hydroxymethyl) amino methane (Tris) buffer at a concentration of 5 mM in water and the pH is adjusted to 8.35.
  • the temperature of the column is maintained at a temperature of 25 ° C.
  • the flow rate of the mobile phase in the column and 1 mL / min.
  • a sample of the peptide composition to be analyzed is prepared so that its concentration is 2 g / L by dilution in ultrapure water.
  • a volume of 90 ⁇ l ⁇ of this solution to be analyzed is introduced at the top of the column.
  • the detection is carried out by measuring the absorbance continuously at 214 nm.
  • the mobile phase consists of 5 mM Tris pH 8.35 (solution A) for a period of 7 minutes, then a mobile phase in which a solution B formed of 5mM Tris, 5M NaC, pH 8.35 linearly increases from 0% to 100% in solution A in 30 minutes. Elution is then maintained with solution B for 2 minutes.
  • the chromatogram obtained is represented in FIG. 2.
  • the anionic peptides leave the column with a retention time of between 10 min and 17.5 min corresponding to a NaCt concentration of between 0.5 M and 1.7 M.
  • the proportion of anionic peptides in the peptide composition according to the invention for which the analysis represented in FIG. 2 is 36.9%.
  • the neutral and cationic peptides leave the column with a retention time of between 1 minute and 8 minutes.
  • the proportion of neutral and cationic peptides in the peptide composition according to the invention in the analysis shown in FIG. 2 is 57.5%.
  • compositions according to the invention As a generalization, this analysis is reproduced on three peptide compositions according to the invention.
  • the average proportion of anionic peptides in these compositions according to the invention is between 27.9% and 42.5% and the average proportion of neutral and cationic peptides in these compositions according to the invention is between 57.5% and 72%. , 1%.
  • the hydrophobicity of the peptides constituting the composition according to the invention is analyzed by reverse phase liquid chromatography on a silica column grafted with butyl groups (Vydac 214TP TM C 4 , Grace, Epernon, France) dimensions 250 x 4.6 mm.
  • the granulometry of the silica is 5 ⁇ and its porosity is 300 A.
  • the column is conditioned in ultrapure acidified water with 0.1% trifluoroacetic acid.
  • the temperature of the column is maintained at a temperature of 40 ° C.
  • the flow rate of the mobile phase in the column and 0.6 mL / min.
  • a sample of the peptide composition to be analyzed is prepared so that its concentration is 2 g / L by dilution in ultrapure water.
  • a volume of 100 ⁇ L ⁇ of this solution to be analyzed is introduced at the top of the column.
  • the detection is performed by measuring the absorbance continuously at the wavelength of 214 nm.
  • the mobile phase consists of acidified water (solution A) for a period of 7 minutes, then a mobile phase in which a solution B formed of Acidified water with 0.1% (by volume) trifluoroacetic acid and comprising 40% acetonitrile increases linearly from 0% to 100% in solution A in 30 minutes.
  • the chromatogram obtained is represented in FIG. 3.
  • the peptides of the composition according to the invention leave the column with a retention time of between 16 min and 36 min corresponding to a percentage of acetonitrile of between 12% and 38% in the eluent.
  • the median retention time of the peptides of the composition according to the invention is 26 min corresponding to a percentage of acetonitrile of 25% in the eluent.
  • mice The effect of a composition according to the invention on the induced gastric candidiasis in female C57BL / 6 mice, aged 8 weeks and weighing between 20-25 g, is analyzed. These mice are fed for a period of 21 days with the composition according to the invention at a rate of 4 g / kg / day. 21 th day, is induced gastrointestinal candidiasis by gavage to each mouse with a quantity of 5.10 7 yeast cells. Between 2 days (D2) and 7 days (D7) after induction, the feces of the mice are collected and the yeast load (CFU / mg of stool) is evaluated on a chromogenic medium. The results are given in Table 4 below in comparison with the values measured in mice whose digestive candidiasis is induced but which are not treated with the composition according to the invention.
  • composition according to the invention induces a decrease in the load of Candida albicans.
  • Macrophages / monocytes of healthy human subjects are cultured for 24 hours in the presence of a pretreatment composition (control without collagen peptides, invention, excluding the invention, Table 7) at a concentration of 100 ⁇ g / ml of culture medium.
  • a pretreatment composition control without collagen peptides, invention, excluding the invention, Table 7.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • type 1 macrophage receptors specifically stimulated by a phorbol ester ("12-myristate-13-acetate-phorbol, TPA") at a concentration of 100 ⁇
  • type 2 macrophage receptors specifically stimulated with non-opsonized Zymosan (ZNO) at a concentration of 100 ⁇ g / mL.
  • ZNO non-opsonized Zymosan
  • the level of free radical production of oxygen is measured by chemiluminescence in the presence of luminol at a concentration of 66 ⁇ .
  • Table 7 represent the average values obtained with three tests.
  • Non-induced by ZNO and TPA present a level of production of oxygen free radicals substantially constant according to the nature of the pretreatment (without collagen, according to the invention and outside the invention).
  • the macrophages / monocytes pretreated with a peptide composition according to the invention exhibit an increased expression of type 2 macrophage receptors.
  • M2 anti-inflammatory revealed by the intensity of chemiluminescence (5.06 10 8 ua) induced by ZNO, compared to macrophages / monocytes pretreated with a composition of peptides outside the invention, that is to say from hydrolysis enzymatic collagen cold water fish skin (3.91 10 8 ua).
  • the macrophages / monocytes pretreated with a peptide composition according to the invention that is to say derived from an enzymatic hydrolysis of collagen from skins of temperate water fish, have a decreased expression of type 1 macrophage receptors.
  • Inflammatory (Ml) levels revealed by TPA-induced chemiluminescence intensity (6.75 10 8 ua), by compared to macrophages / monocytes pretreated with a composition of peptides outside the invention, that is to say from an enzymatic hydrolysis of collagen cold water fish skins (1.40 10 9 ua).
  • the peptide composition according to the invention has an anti-inflammatory phenotype compared to a composition of peptides outside the invention, that is to say from an enzymatic hydrolysis of collagen cold water fish skins by increasing the level of expression of macrophage type 2 (M2) anti-inflammatory receptors and by decreasing the level of expression of inflammatory macrophage type 1 (M1) receptors.
  • M2 macrophage type 2
  • M1 inflammatory macrophage type 1
  • composition of peptides according to the invention derived from skins of temperate water fish and having an aminogram in which:
  • the glycine is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 20.0% and 24.5%;
  • the hydroxyproline is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 6.0% and 12.0%;
  • the proline is in a molar amount such that the ratio of this amount to the sum of the molar amounts of the amino acids in the composition is between 10.6% and 14.6%;
  • the anti-inflammatory effect of the peptide composition according to the invention is demonstrated on a murine model of pharmacological inflammation induced by sodium dextran sulfate (DSS, MP Biomedical LLC, Canada) characterized by weight loss and diarrhea bloody.
  • the effect of the peptide composition according to the invention is studied to limit the weight loss of DSS-treated mice. 7 to 10 days old female C57BL / 6 laboratory mice weighing between 20 and 25 grams are treated for 7 days (D 1 to 7 ) with DSS dissolved at a rate of 1.5% (w / v). ) in the drinking water of the mice.
  • mice are also treated for 12 days (July to 12 ) with the composition according to the invention at a rate of 0.1 g / kg / day; 1 g / kg / day and 4 g / kg / day.
  • This quantity of composition according to the invention is delivered in the drinking water of the mice.
  • the mice are euthanized.
  • mice Five batches of mice are prepared, each batch comprising 10 mice, of which:
  • batch 2 is treated with DSS for 7 days and with the composition according to the invention at the rate of 0.1 g / kg / day for 12 days;
  • batch 3 is treated with DSS for 7 days and with the composition according to the invention at a rate of 1 g / kg / day for 12 days;
  • batch 4 is treated with DSS for 7 days and with the composition according to the invention at the rate of 4 g / kg / day for 12 days;
  • mice which are not treated with DSS and for which the inflammation is not induced, and which are not treated with a peptide composition according to the invention.
  • composition according to the invention makes it possible to limit, or even to cancel almost completely, the weight loss caused by the inflammation induced by sodium dextran sulfate (DSS) in mice.
  • the composition according to the invention is capable of being used as a medicament, especially for the treatment of colonic inflammation.
  • Transverse histological sections of mouse colon treated with DSS alone show, after bichromatic staining with hematoxylin and eosin, important infiltrations of inflammatory cells in the mucosa and the submucosa.
  • the thickness of the epithelium is reduced.
  • the epithelium shows extensive ulcerations.
  • the transverse histological sections of mouse colon treated with DSS and with the composition according to the invention at the rate of 0.1 g / kg / day, 1 g / kg / day and 4 g / kg / day show, after dichromatic staining by the hematoxylin and eosin of the tight and rectilinear tubular glands representative of a healthy and functional epithelium.
  • a macroscopic score is calculated from Wallace scale scores for stool appearance, damaged colon, colon weight, and colon length.
  • Wallace scale (ES Kimball, NH Wallace, CR Scnneider, MR D'Andrea and PJ Hornby, 2004, Neurogastroenterol Motil, 16, 811-818 Vanilloid receptor 1 antagonists attenuate disease severity in sodium dextran sulphate-induced colitis in mice) .
  • the value of the macroscopic score is all the higher as the colon is inflammatory and is weaker as the colon is healthy.
  • the mean values and the standard deviation of the macroscopic score of the mice of batches 1 to 5 are given in Table 5 below.
  • a decrease in the macroscopic score induced by the treatment with the composition according to the invention is observed, that is to say an improvement in the inflammatory state of the colon induced by the composition according to the invention.
  • mice On day 12 , the mice were euthanized and the level of expression in the colon of pro-inflammatory cytokines by the ELISA technique was assayed:
  • IL- ⁇ The level of IL- ⁇ is analyzed by the ELISA technique and expressed in picogram ( ⁇ g) of IL-1 per milligram (mg) of colon. The results are shown in FIG. 5 in which the first column (white column) corresponds to the analysis performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mice of batch 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 4.
  • the fourth column (column horizontal hatching) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 3.
  • the fifth column (grayed-out column) corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 2.
  • the sixth column black solid column) corresponds to the analysis carried out in the mice of batch 5.
  • This effect was confirmed by IL-1 messenger RNA analysis by quantitative RT-PCR in particular (p ⁇ 0.01) for the doses of 0.1 g / kg / day and 1 g / kg / day;
  • IL6 The level of IL6 is analyzed by the ELISA technique and expressed in picogram (pg) of IL6 per milligram (mg) of colon. The results are shown in FIG. 6 in which the first column (white column) corresponds to the analysis performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mice of batch 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 4.
  • the fourth column (column horizontal hatching) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 3.
  • the fifth column (grayed-out column) corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 2.
  • the sixth column black solid column) corresponds to the analysis carried out in mice of batch 5.
  • a statistically significant decrease in the expression of IL6 in the colon of mice treated with the peptide composition according to the invention is observed for doses of 0.1 g / kg / day (p ⁇ 0). , 01), 1 g / kg / day (p ⁇ 0.01) and 4 g / kg / day (p ⁇ 0.05) compared with the colon of mice whose inflammation is induced by the DSS and with respect to the mice of which inflammation is induced by DSS and treated with hydrolysed casein.
  • This effect was confirmed by IL6 messenger RNA analysis by quantitative RT-PCR;
  • TNF- ⁇ The level of TNF- ⁇ is analyzed by the ELISA technique and expressed in picogram ( ⁇ g) of TNF- ⁇ per milligram (mg) of colon. The results are shown in FIG. 7 in which the first column (white column) corresponds to the analysis performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mice of batch 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 4.
  • the fourth column (column horizontal hatching) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 3.
  • fifth column shade column
  • the sixth column black solid column corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 5.
  • RT-PCR Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • the quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) analysis of the messenger RNAs of the inducible NO-synthase (iNOS) is shown in FIG. 17 in which the first column (white column) corresponds to the analysis carried out on control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mice of batch 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 4.
  • the fourth column (column horizontal hatching) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 3.
  • the fifth column (grayed-out column) corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 2.
  • the sixth column black solid column corresponds to the analysis carried out in lot 5 mice.
  • mice On day 12 , the mice were euthanized and the level of expression in the colon of anti-inflammatory markers was analyzed: - TGF- ⁇ .
  • the TGF- ⁇ level is analyzed by the ELISA technique and expressed in picogram (pg) of TGF- ⁇ per milligram (mg) of colon.
  • the results are shown in FIG. 8 in which the first column (white column) corresponds to the analysis performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mice of batch 1.
  • the third column vertical hatch column
  • mice The fourth column (column horizontal hatching) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 3.
  • the fifth column corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 2.
  • the sixth column (black solid column) corresponds to the analysis carried out in mice of batch 5.
  • a stimulation of the expression of TGF- ⁇ in the colon of mice treated with the peptide composition according to the invention is observed for the dose of 0.1 ⁇ g / kg / day relative to the colon of mice whose inflammation is induced by DSS. This effect was confirmed by analysis of messenger RNAs of TGF- ⁇ by quantitative RT-PCR, in particular for the doses of 0.1 g / kg / day and 1 g / kg / day of peptide composition according to the invention ( figure 16);
  • Fizzl is a marker of anti-inflammatory M2 macrophages.
  • the quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) analysis of the messenger RNAs of Fizzl is shown in FIG. 18 in which the first column (white column) corresponds to the analysis performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mice of batch 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 4.
  • the fourth column column (column horizontal hatching) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 3.
  • the fifth column (grayed-out column) corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 2.
  • the sixth column corresponds to the analysis carried out on mice in batch 5.
  • a statistically significant increase in Fizzl messenger RNA reduced by DSS was observed, for doses of 0.1 g / kg / day (p ⁇ 0.05), 1 g / kg / day (p ⁇ 0.01) and 4 g / kg / day (p ⁇ 0.05) composition of peptides according to the invention;
  • mice were euthanized and the colic flora of these mice was quantified by PCR ("Polymerase Chain Reaction"). The values are normalized with respect to the total amount of bacteria or fungi and relative to ⁇ -actin. ⁇ -actin is the reference gene allowing normalization with respect to the amount of colonic tissue analyzed. In particular, we quantify:
  • the ratio R of the amount of fungal ribosomal DNA ITS1-2 on the amount of DNA of ⁇ -actin is shown in FIG. 9 in which the first column (white column) corresponds to the assay performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the assay carried out on the mice of batch 1.
  • the third column corresponds to the assay performed on the mice of batch 4.
  • the fourth column horizontal hatched column
  • the fifth column corresponds to the assay performed on the mice in batch 2.
  • the sixth column solid black column corresponds to the assay performed on the mice in batch 5.
  • the composition of peptides according to the invention restore the fungal flora especially at a dose of 4 g / kg / day;
  • the ratio R of the quantity of 26S ribosomal DNA on the amount of DNA of ⁇ -actin is shown in FIG. 10.
  • the first column (white column) corresponds to the assay performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the assay carried out on the mice of the batch 1.
  • the third column (vertical hatched column) corresponds to the assay carried out on the mice of the lot 4.
  • the fourth column horizontal hatched column
  • the fifth column corresponds to the assay performed on the mice of batch 2.
  • the sixth column corresponds to the assay performed on the mice of batch 5.
  • the peptide composition according to the invention restores in a statistically significant manner the Saccharomyces cerevisiae flora at doses of 0.1 g / kg / day (p ⁇ 0.05), 1 g / kg / day (p ⁇ 0.05) and 4 g / kg / day (p ⁇ 0.05).
  • S. cerevisiae has an anti-inflammatory potential
  • the ratio R of the quantity of 16S ribosomal DNA to the amount of ⁇ -actin DNA is shown in FIG. 11.
  • the first column (white column) corresponds to the assay performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the assay performed on the batch 1 mice.
  • the third column (grayed column) corresponds to the assay performed on the batch 2 mice.
  • the fourth column (solid black column) corresponds to the assay performed. in the mice of batch 5.
  • the peptide composition according to the invention makes it possible to reduce the DSS-induced enterobacteria flora at a concentration of 0.1 g / kg / day. Enterobacteria are associated with pro-inflammatory potential;
  • the ratio R of the amount of such 16S ribosomal DNA on the amount of ⁇ -actin DNA is shown in FIG. 12.
  • the first column (white column) corresponds to the assay performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the assay carried out on the mice of batch 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the assay performed on the mice of batch 4.
  • the fourth column (horizontal hatched column) corresponds to the assay carried out on the mice in batch 3.
  • the fifth column corresponds to the assay performed on the mice of batch 2.
  • the sixth column corresponds to the assay carried out on the mice of batch 5.
  • the peptide composition according to the invention induces the statistically significant reduction of the firmicutes flora induced by DSS at 0.1 g / kg / day (p ⁇ 0.05), 1 g / kg / day (p ⁇ 0.05) and 4 g / kg / day (p ⁇ 0.05), but also decreased flora of firmicutes not induced at these same concentrations. It should be noted that the increase of firmicutes flora is generally observed in a known manner during digestive inflammation ("IBD, Inflammatory Bowel Diseases");
  • the ratio R of the amount of such a 16S ribosomal DNA on the amount of ⁇ -actin DNA is shown in FIG. 13.
  • the first column corresponds to the assay performed on the mice of batch 1.
  • the second column corresponds to the assay carried out on the mice of batch 4.
  • the third column corresponds to the assay carried out on the mice of batch 3.
  • the fourth column corresponds to the assay
  • the fifth column (black solid column) corresponds to the assay carried out on the mice of batch 5.
  • the peptide composition according to the invention induces a statistically significant decrease of the bacteroidetes flora induced by DSS at concentrations 0.1 g / kg / day (p ⁇ 0.05), 1 g / kg / day (p ⁇ 0.05) and 4 g / kg / day (p ⁇ 0.05).
  • the increase of bacteroidetes is generally observed in a known manner during digestive inflammation ("IBD");
  • the ratio R of the amount of such specific DNA on the amount of DNA of ⁇ -actin is shown in FIG. 14.
  • the first column (white column) corresponds to the assay performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the assay carried out on the mice of batch 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the assay carried out on the mice of batch 4.
  • the fourth column (horizontal hatched column) corresponds to the assay carried out on the mice of lot 3.
  • the fifth column (grayed column) corresponds to the assay carried out on the mice of batch 2.
  • the sixth column black solid column corresponds to the assay carried out on the mouse of lot 5.
  • the peptide composition according to the invention induces the statistically significant increase of Faecalibacterium praustnizii flora destroyed by DSS at a concentration of 0.1 g / kg / day (p ⁇ 0.01), 1 g / kg / day (p ⁇ 0.01) and 4 g / kg / day (p ⁇ 0.01).
  • the increase of Faecalibacterium praustnizii is generally observed in a known manner during digestive inflammation ("IBD"). Faecalibacterium praustnizii would also have anti-inflammatory properties;
  • the ratio R of the amount of such specific DNA to the amount of ⁇ -actin DNA is shown in FIG. 15 in which the first column (white column) corresponds to the assay performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the assay carried out on the mice of batch 1.
  • the third column vertical hatch column
  • the fourth column (horizontal hatched column) corresponds to
  • the fifth column (gray column) corresponds to the assay performed on the mice in batch 2.
  • the sixth column solid black column corresponds to the assay performed on the mice in batch 5.
  • composition of Peptides according to the invention induced the increase of Lactobacillus murinus flora at concentrations of 0.1 g / kg / day, 1 g / kg / day and 4 g / kg / day (p ⁇ 0.05). Lactobacillus murinus also has anti-inflammatory properties.
  • 5-LOX The quantitative reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR) analysis of the messenger RNAs of the enzyme 5-lipoxygenase (5-LOX) is represented in FIG. 19 in which the first column (white column ) is the analysis performed on the control mice.
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mouse of lot 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 4.
  • the fourth column horizontal hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 3.
  • the fifth column shade column
  • the sixth column black solid column corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 5.
  • the peptide composition according to the invention has an inhibitory effect on the expression of 5-LOX favoring the production of pro-inflammatory lipid mediators;
  • 12/15-LOX The quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) analysis of the messenger RNAs of the 12/15-lipoxygenase enzyme (12/15-LOX) is represented in FIG.
  • the first column white column
  • the second column (oblique hatched column) corresponds to the analysis carried out on the mice of batch 1.
  • the third column (vertical hatch column) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 4.
  • the fourth column (column horizontal hatching) corresponds to the analysis carried out on the mice in lot 3.
  • the fifth column (grayed-out column) corresponds to the analysis carried out on the mice in batch 2.
  • the sixth column black solid column corresponds to the analysis carried out in mice of batch 5.

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Abstract

L'invention concerne une composition de peptides présentant un aminogramme dans lequel : - la glycine, l'hydroxyproline et la proline sont en quantités molaires telles que le rapport de chaque quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris respectivement entre 20,0 % et 24,5 %, entre 6,0% et 12,0% et entre 10,6 % et 14,6 %; - la composition de peptides comprenant une quantité de peptides de poids moléculaire inférieur à 1400 Da telle que le rapport de cette quantité sur la quantité de peptides de la composition est inférieur à 40 %; le poids moléculaire et la quantité des peptides de la composition étant déterminés par chromatographie d'exclusion. L'invention concerne également une telle composition pour son utilisation comme médicament. Elle concerne également une telle composition pour son utilisation comme complément alimentaire.

Description

COMPOSITION DE PEPTIDES DE COLLAGÈNE DE PEAU DE POISSON ET SON UTILISATION À TITRE DE MÉDICAMENT
L'invention concerne une composition de peptides de collagène de peau(x) de poisson(s). L'invention concerne en particulier une telle composition de peptides obtenue par hydrolyse enzymatique de collagène de peau(x) de poisson(s). L'invention concerne également une telle composition pour son utilisation à titre de médicament. L'invention concerne donc l'utilisation d'une telle composition pour le traitement curatif ou préventif d'une pathologie affectant le corps humain ou animal. L'invention concerne en particulier une telle composition pour son utilisation à titre de médicament dans le traitement d'une candidose digestive chez l'homme ou l'animal et/ou dans le traitement d'une inflammation intestinale chez l'homme ou l'animal. L'invention concerne également une telle composition pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement stimulant du microbiote.
On connaît de FR 2 720 067 une poudre de peptides obtenue par hydrolyse par la papaïne d'une matière première riche en collagène, provenant de la peau ou du squelette de poissons, de mollusques ou de crustacés. Dans la poudre de peptides obtenue, 38 % des peptides présentent un poids moléculaire compris entre 10 000 Da et 50 000 Da. La composition de peptides de FR 2 720 067 présente une large gamme de poids moléculaires, en particulier une proportion supérieure à 10 % de peptides dont le poids moléculaire est supérieur à 10 000 Da. La composition de peptides de FR 2 720 067 est hétérogène par la taille des peptides et présente une fraction de peptides hydrosolubles seulement comprise entre 80% et 90%. De telles poudres de peptides de haut poids moléculaire supérieur à 10 000 Da ne sont pas parfaitement hydrosolubles. Elles ne sont également pas totalement absorbables par le tube digestif et posent donc le problème de leur biodisponibilité.
FR 2 720 067 décrit aussi l'utilisation d'une telle poudre de peptides obtenue à partir de poissons vivants dans les grandes profondeurs dans le traitement curatif d'une inflammation des tendons des articulations des membres inférieurs (genoux, boulets et sabots) de chevaux de course. L'obtention d'une telle composition pose problème. Elle nécessite en effet le prélèvement de poissons abyssaux. En outre, une telle poudre est limitée dans son utilisation au traitement d'une inflammation articulaire.
L'invention vise donc à pallier ces inconvénients.
L'invention vise à proposer une nouvelle composition de peptides issue d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peau(x) de poisson(s) d'eaux tempérées, lesdits peptides étant hydrosolubles -c'est à dire hydrosolubles à 100%- et totalement absorbables par le tube digestif.
L'invention vise également à proposer une nouvelle composition de peptides formée par hydrolyse enzymatique de collagène de peau(x) de poisson(s) d'eaux tempérées.
L'invention vise aussi à proposer une telle composition de peptides susceptible de pouvoir être utilisée comme médicament.
L'invention vise en particulier à proposer une telle composition de peptides issue d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peau(x) de poisson(s) d'eaux tempérées et susceptible de pouvoir être utilisée comme médicament.
L'invention vise à proposer une telle composition de peptides présentant en même temps une distribution de leurs poids moléculaires apparents s'étendant sur un intervalle étroit compris entre une centaine et quelques milliers de daltons, c'est-à-dire excluant des peptides de haut poids moléculaires apparents, et présentant également une proportion faible de peptides de bas poids moléculaires apparents.
L'invention vise à proposer une telle composition de peptides susceptible de pouvoir être utilisée comme médicament dans le traitement de la candidose intestinale.
L'invention vise également à proposer une telle composition de peptides susceptible de pouvoir être utilisée comme médicament dans le traitement de maladies inflammatoires digestives, notamment de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI).
L'invention vise également à proposer une telle composition de peptides susceptible de pouvoir être utilisée pour favoriser l'équilibre et le maintien de la flore (ou microbiote) intestinale.
L'invention vise également à proposer l'utilisation d'une telle composition de peptides issue d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peau(x) de poisson(s) d'eaux tempérées à titre de complément alimentaire.
Pour ce faire, l'invention concerne une composition de peptides présentant un aminogramme dans lequel :
- la glycine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 20,0 % et 24,5 % ;
- l'hydroxyproline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 6,0 % et 12,0 %, notamment compris entre 7,0 % et 11,0 % ;
- la proline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 10,6 % et 14,6 %, notamment compris entre 11,6 % et 13,6 %, en particulier compris entre 12,1 % et 13,1 %, de préférence de l'ordre de 12,6 % ; la composition de peptides présentant, lors d'une analyse par chromatographie d'exclusion lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué avec un temps de rétention représentatif du poids moléculaire apparent de ce peptide, une courbe d'élution (c'est-à-dire une courbe d'élution d'un chromatogramme) des peptides présentant une valeur d'aire sous la courbe (c'est-à-dire une valeur d'aire représentative de la quantité massique de peptides) correspondant aux peptides de poids moléculaire apparent inférieur à 1400 Da telle que le rapport de cette valeur d'aire sur l'aire totale sous la courbe (correspondant à l'ensemble des peptides de la composition) est inférieur à 40 %, notamment inférieur à 38 %, de préférence compris entre 30% et 38%, en particulier compris entre 30 % et 35 % ;
ladite analyse étant réalisée comme décrit ci-après ;
o sur une colonne de filtration de dimensions 300 x 7,8 mm comprenant une phase stationnaire formée d'un gel de silice d'une porosité de 5 μπι ;
o la colonne étant maintenue à la température de 40° C ;
o avec, à titre de phase mobile, une solution formée (A) d'eau ultra pure comprenant 0,1% en volume d'acide trifluoroacétique et (B) d'acétonitrile, dans laquelle le rapport volumique A/B est de 75/25 ;
o en introduisant en tête de la colonne de filtration sur gel un volume d'une solution comprenant de la composition de peptides ;
o le débit de la phase mobile dans la colonne étant de 0,6 mL/min, et ; o les peptides de la composition étant détectés par absorbance à la longueur d'onde de 214 nm.
Dans tout le texte, on entend par « aminogramme », la liste des acides aminés libres formant par enchaînement (ou liaison) peptidique la séquence d'un peptide ou les séquences des peptides d'un mélange de peptides. Un tel aminogramme est obtenu par analyse -notamment par analyse globale ou par analyse séquentielle- des acides aminés constitutifs d'un peptide ou d'un mélange de peptides.
En particulier, on détermine la nature et la quantité des acides aminés constitutifs des peptides de la composition selon l'invention par toute méthode d'analyse globale connue en elle-même de l'homme du métier. En particulier, on réalise cette analyse conformément à la norme ISO 13903:2005 par dosage des acides aminés libres et totaux au moyen d'un analyseur d'acides aminés ou au moyen d'un équipement de chromatographie liquide à haute performance (CLHP). L' hydroxyproline est dosée par analyse en flux continu et détection colorimétrique.
L' aminogramme obtenu par analyse globale de la composition selon l'invention est représentatif de la composition en acides aminés de collagène de peaux de poissons d'eaux tempérées. L'invention concerne donc une telle composition de peptides issue d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux tempérées par une protéase à cystéine d'origine végétale -notamment une protéase de la classe EC 3.4.22.2-. Les inventeurs ont découvert que l'utilisation d'une telle protéase à cystéine permet d'obtenir une composition de peptides qui sont hydrosolubles -c'est à dire hydrosolubles à 100%- et qui sont totalement absorbables par le tube digestif et qui présentent une répartition de poids moléculaires apparents qui s'étend sur un intervalle étroit compris entre une centaine et quelques milliers de daltons, c'est-à-dire excluant des peptides de haut poids moléculaires apparents, et présentant également une proportion faible de peptides de bas poids moléculaires apparents.
En outre, on réalise une séparation des peptides de la composition de peptides selon l'invention en fonction de leur poids moléculaire apparent en soumettant la composition de peptides à une étape de séparation analytique par chromatographie liquide sur une colonne de filtration sur gel de silice (BioSep-SEC-S2000, Phenomenex, Le Peck, France) poreuse et de haute densité surfacique en groupements silanols.
On utilise à titre de phase mobile une solution comprenant (A) de l'eau ultra pure additionnée d'acide trifluoroacétique (0,1% en volume) et (B) de l'acétonitrile (A/B ; 75/25 ; v/v). La colonne de filtration sur gel est maintenue à la température de 40°C pendant l'analyse. Le débit de la phase mobile dans la phase stationnaire est de 0,6 mL/min. Le volume de composition de peptides à analyser introduite en tête de colonne de gel filtration est de 25 μL· et la détection et réalisée en continu par absorbance à la longueur d'onde de 214 nm. On obtient un chromatogramme sur lequel chaque pic est caractérisé par une valeur de durée ou de temps de rétention (exprimée en minutes suivant l'introduction du mélange à analyser en tête de colonne) déterminée à la valeur maximale d' absorbance du pic. On détermine le poids moléculaire apparent de chaque peptide correspondant à cette valeur de temps de rétention à la valeur maximale d'absorbance de chaque pic au moyen d'une courbe d'étalonnage prédéterminée obtenue par analyse -dans les mêmes conditions chromatographiques que décrite ci-dessus- de peptides de poids moléculaires apparents déterminés. On réalise par exemple une telle courbe d'étalonnage en analysant dans ces mêmes conditions chromatographiques un mélange de peptides/protéines de référence et de poids moléculaires apparents connus et compris entre 100 Da et 30 kDa.
Le chromatogramme représentant la variation d'absorbance à 214 nm au cours de l'analyse chromatographique de la composition de peptides selon l'invention, on détermine la proportion de peptides de poids moléculaire apparent inférieur à 1400 Da en évaluant le rapport de la valeur de l'aire s'étendant sous la courbe -c'est-à-dire la valeur de la somme des aires s'étendant sous les pics de la courbe- correspondant aux peptides de poids moléculaire apparent inférieur à 1400 Da sur la valeur de l'aire totale s'étendant sous la totalité de la courbe -c'est-à-dire la valeur de la somme des aires s'étendant sous chaque pic de la courbe- et correspondant à l'ensemble des peptides de la composition de peptides.
L'invention concerne donc une composition de peptides issus d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux tempérées par une protéase à cystéine d'origine végétale, chaque peptide de la composition présentant un nombre d'acides aminés compris entre 2 et quelques dizaines, de préférence compris entre 2 acides aminés et 100 acides aminés.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la glycine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 20,0 % et 22,4 %, notamment compris entre 20,0 % et 21,9 %, en particulier compris entre 20,4 % et 21,4 %.
Dans certains autres modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la glycine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 22,4 % et 24,9 %, notamment compris entre 22,9 % et 24,4 %, en particulier compris entre 23,0 % et 24,0 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'hydroxyproline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 7,0 % et 9,0 %, en particulier compris entre 7,5 % et 8,5 %, de préférence compris entre 7,7 % et 8,5 %.
Dans certains autres modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'hydroxyproline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 9,5 % et 11,5 %, en particulier compris entre 10,0 % et 11,0 %, de préférence de l'ordre de 10,5 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'acide glutamique est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 8,0 % et 13,0 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'acide glutamique est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 8,0 % et 10,0 %, en particulier compris entre 8,5 % et 9,5 %, de préférence compris entre 9,0 % et 9,5 %.
Dans certains autres modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'acide glutamique est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 10,5 % et 12,5 %, en particulier compris entre 11,0 % et 12,0 %, de préférence de l'ordre de 11,6 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'arginine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 6,9 % et 10,9 %, notamment compris entre 7,9 % et 9,9 %, en particulier compris entre 8,0 % et 9,0 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'alanine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 7,3 % et 11,5 %, notamment compris entre 8,0 % et 10,0 %, en particulier compris entre 8,1 % et 9,6 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'acide aspartique est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 3,1 % et 7,1 %, notamment compris entre 4,1 % et 6,1 %, en particulier compris entre 4,6 % et 5,6 %, de préférence compris entre 5,0 % et 5,5 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la lysine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 1,5 % et 5,5 %, notamment compris entre 2,5 % et 4,5 %, en particulier compris entre 3,0 % et 4,0 %, de préférence compris entre 3,1 % et 3,6 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la sérine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 1,5 % et 5,5 %, notamment compris entre 2,5 % et 4,5 %, en particulier compris entre 3,0 % et 4,0 %, de préférence compris entre 3,2 % et 3,6 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la thréonine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0,7 % et 4,7 %, notamment compris entre 1,7 % et 3,7 %, en particulier compris entre 2,2 % et 3,2 %, de préférence compris entre 2,4 % et 2,8 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la leucine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0,6 % et 4,6 %, notamment compris entre 1,6 % et 3,6 %, en particulier compris entre 2,1 % et 3,1 %, de préférence compris entre 2,4 % et 2,9 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la phénylalanine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0,3 % et 4,3 %, notamment compris entre 1,3 % et 3,3 %, en particulier compris entre 1,8 % et 2,8 %, de préférence compris entre 1,8 % et 2,4 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la valine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0 % et 4,0 %, notamment compris entre 1,0 % et 3,0 %, en particulier compris entre 1,5 % et 2,5 %, de préférence compris entre 1,8 % et 2,5 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'isoleucine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0 % et 3,5 %, notamment compris entre 0,5 % et 2,5 %, en particulier compris entre 0,9 % et 2,0 %, de préférence compris entre 0,9 % et 1,6 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'hydroxylysine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0 % et 3,5 %, notamment entre 0,5 % et 2,5 %, en particulier entre 1,0 % et 2,0 %, de préférence de l'ordre de 1,5 %. Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel l'histidine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0 % et 3,3%, notamment compris entre 0 % et 2,3 %, en particulier compris entre 0,5 % et 1,5 .
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la méthionine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0 % et 2,5 %, notamment compris entre 0 % et 2,0 %, en particulier compris entre 0,5 % et 1,8 %, de préférence compris entre 0,7 % et 1,6 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la tyrosine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0 % et 1,5 %, notamment compris entre 0 % et 1,0 %, en particulier compris entre 0 % et 0,9 %, de préférence compris entre 0,2 % et 0,8 %.
Dans certains modes de réalisation, la composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel la cystéine et la cystine sont ensembles en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 0 % et 2 %, notamment entre 0 % et 1,0 %, en particulier entre 0 % et 0,5 %, de préférence de l'ordre de 0,03 %.
La composition selon l'invention présente un aminogramme dans lequel les acides aminés essentiels (la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine et l'histidine) sont ensembles compris entre 15 % et 20 %.
Avantageusement, dans certains modes de réalisation selon l'invention, au moins 90% -notamment au moins 95%- des peptides de la composition de peptides présentent un poids moléculaire apparent inférieur à 15 000 Da (Dalton), notamment compris entre 200 Da et 15 000 Da, de préférence compris entre 200 Da et 14 000 Da, en particulier compris entre 200 Da et 13 000 Da. Avantageusement, dans certains modes de réalisation selon l'invention, au moins 90% des peptides de la composition présentent un poids moléculaire apparent compris entre 200 Da et 12 000 Da.
Les peptides de la composition selon l'invention présentent une répartition de poids moléculaires apparents resserrée s 'étendant sur un intervalle étroit compris entre une centaine et quelques milliers de daltons, c'est- à-dire excluant des peptides de haut poids moléculaires apparents présentant plus de 100 acides aminés, et présentant également une proportion faible de peptides de bas poids moléculaires apparents.
Avantageusement, dans certains modes de réalisation selon l'invention, les peptides de la composition présentent une valeur de poids moléculaire apparent moyen comprise entre 2 500 Da et 3 600 Da, notamment comprise entre 2700 Da et 3600 Da. Chaque peptide de la composition de peptides selon l'invention présentant une contribution massique dans la composition, la valeur du poids moléculaire apparent moyen de peptides de la composition correspond à la moyenne de chaque valeur, dite valeur pondérée, du poids moléculaire apparent de chaque peptide pondérée par une valeur représentative de la contribution massique de chaque peptide dans la composition. La valeur représentative de la contribution massique de chaque peptide ou groupe de peptides dans la composition est exprimée en pourcentage de la valeur de l'aire sous la courbe correspondant audit peptide ou audit groupe de peptides sur la valeur de l'aire totale sous la courbe correspondant à l'ensemble des peptides de la composition.
En pratique, la valeur du poids moléculaire apparent pondéré d'un groupe de peptides correspondant à un même pic d'un chromatogramme correspond à la valeur du poids moléculaire apparent relevée au sommet (maximum) de ce pic du chromatogramme, multipliée par le rapport de la valeur de l'aire s'étendant sous la courbe de ce pic sur l'aire (totale) s'étendant sous la courbe du chromatogramme. On entend par « aire s'étendant sous la courbe » ou « aire sous la courbe » ou « aire s'étendant sous le pic » ou « aire sous le pic », l'aire de la surface s'étendant entre la courbe décrivant le pic du chromatogramme et la ligne de base du chromatogramme. En particulier, l'aire sous l'un des pics du chromatogramme s'étend entre deux minima de la courbe du chromatogramme encadrant un sommet (ou maximum) de la courbe du chromatogramme.
Selon certains modes de réalisation, la composition de peptides selon l'invention présente lors de son analyse par chromatographie d'exclusion lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué avec un temps de rétention représentatif du poids moléculaire apparent de ce peptide, une courbe représentative de l'élution (c'est-à-dire un chromatogramme) des peptides présentant une valeur d'aire sous cette courbe (c'est-à-dire une valeur d'aire représentative de la quantité massique de peptides) correspondant aux peptides de poids moléculaire apparent supérieur à 10 000 Da -notamment compris entre 10 000 Da et 50 000 Da telle que le rapport de cette valeur d'aire sur l'aire totale sous la courbe (correspondant à l'ensemble des peptides de la composition) est inférieur à 15 %, notamment inférieur à 10 %. Selon certains modes particuliers de réalisation, ce rapport est compris entre 2.5 % et 8,5 %.
Selon d'autres modes particuliers de réalisation, la composition de peptides selon l'invention peut être exempte de tout peptide de haut poids moléculaire. Selon ces autres modes particuliers de réalisation, la composition de peptides selon l'invention est formée de peptides hydrosolubles.
Selon certains modes de réalisation, la composition de peptides selon l'invention présente lors de son analyse par chromatographie d'exclusion lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué avec un temps de rétention représentatif du poids moléculaire apparent de ce peptide, une courbe représentative de l'élution (c'est-à-dire un chromatogramme) des peptides présentant une valeur d'aire sous cette courbe (c'est-à-dire une valeur d'aire représentative de la quantité massique de peptides) correspondant aux peptides de poids moléculaire apparent compris entre 1 800 Da et à 10 000 Da telle que le rapport de cette valeur d'aire sur l'aire totale sous la courbe (correspondant à l'ensemble des peptides de la composition) est supérieur à 35% -notamment compris entre 35% et 70%, en particulier compris entre 45% et 65%. Selon certains modes particuliers de réalisation, ce rapport est compris entre 49 % et 55 %.
Selon certains modes de réalisation, la composition de peptides selon l'invention présente lors de son analyse par chromatographie d'exclusion lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué avec un temps de rétention représentatif du poids moléculaire apparent de ce peptide, une courbe représentative de l'élution (c'est-à-dire un chromato gramme) des peptides présentant une valeur d'aire sous cette courbe (c'est-à-dire une valeur d'aire représentative de la quantité massique de peptides) correspondant aux peptides de poids moléculaire apparent compris entre 600 Da et 1 800 Da telle que le rapport de cette valeur d'aire sur l'aire totale sous la courbe (correspondant à l'ensemble des peptides de la composition) est compris entre 15% et 45% -notamment compris entre 20% et 40%, en particulier compris entre 25% et 35%. Selon certains modes particuliers de réalisation, ce rapport est compris entre 27 % et 32 %.
Selon certains modes de réalisation, la composition de peptides selon l'invention présente lors de son analyse par chromatographie d'exclusion lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué avec un temps de rétention représentatif du poids moléculaire apparent de ce peptide, une courbe représentative de l'élution (c'est-à-dire un chromato gramme) des peptides présentant une valeur d'aire sous cette courbe (c'est-à-dire une valeur d'aire représentative de la quantité massique de peptides) correspondant aux peptides de poids moléculaire apparent inférieur à 600 Da telle que le rapport de cette valeur d'aire sur l'aire totale sous la courbe (correspondant à l'ensemble des peptides de la composition) est inférieur à 10%. Selon certains modes particuliers de réalisation, ce rapport est compris entre 8,5 % et 14,5 %.
Avantageusement, la composition selon l'invention, présente par analyse chromatographique sur une colonne échangeuse d'anions lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué de la colonne avec un temps de rétention représentatif de sa charge :
- une valeur d'aire sous un pic correspondant aux peptides anioniques ;
- une valeur d'aire sous un pic correspondant aux peptides neutres, et ; - une valeur d'aire sous un pic correspondant aux peptides cationiques ; telle que le rapport de cette valeur d'aire sous le pic correspondant aux peptides anioniques sur la somme des valeurs des aires sous les pics correspondants aux peptides anioniques, aux peptides neutres et aux peptides cationiques de la composition est compris entre 27,0 % et 45 %, notamment compris entre 30 % et 45 %, en particulier compris entre 35 % et 43 %, de préférence compris entre 35 % et 40 %;
la valeur de l'aire sous le pic correspondant aux peptides anioniques, la valeur de l'aire sous le pic correspondant aux peptides cationiques et la valeur de l'aire sous le pic correspondant aux peptides neutres étant déterminées par l'analyse chromatographique dans des conditions décrites ci-après :
o en utilisant une colonne chromatographique de dimensions 100 x 7,8 mm comprenant à titre de phase stationnaire une résine hydrophile échangeuse d'anions fonctionnalisée par des groupements ammonium quaternaires, et de granulométrie de 10 μπι ;
o en utilisant à titre de première phase mobile d'élution des peptides cationiques et des peptides neutres, un tampon (C) aqueux Tris 5 mM à pH 8,35 pendant une durée de 7 minutes à compter de l'introduction en tête de colonne de la composition à analyser, puis une deuxième phase mobile d'élution des peptides anioniques dans laquelle le rapport du volume d'un tampon (D) formé de Tris 5mM, NaCt 5 M à pH 8,35 sur le volume de tampon (C ) augmente linéairement de 0 % à 100 % en 30 minutes ;
o avec un débit de la phase mobile de 1 mL/min dans la colonne ;
o l'analyse étant réalisée à une température de 25 °C, et ;
o avec une détection par absorbance à la longueur d'onde de 214 nm en sortie de colonne.
Avantageusement selon l'invention, les peptides de la composition selon l'invention présentent lors d'une analyse d'hydrophobie par chromatographie liquide en phase inverse, un temps de rétention compris entre 16 min et 36 min ;
ladite analyse d'hydrophobie étant réalisée dans les conditions ci-après : o en utilisant une colonne de chromatographie de dimensions 250 x 4,6 mm présentant une phase stationnaire formée de silice greffée par des groupements butyle, d'une valeur de granulométrie de 5 μπι et d'une valeur de porosité de 300 A ;
o en utilisant à titre de première phase mobile d'élution des peptides hydrophiles, une solution (E) d'acide trifluoroacétique à 0,1% dans l'eau ultrapure pendant une durée de 7 minutes à compter de l'introduction en tête de colonne de la composition à analyser, puis une deuxième phase mobile d'élution des peptides hydrophobes dans laquelle le rapport du volume d'une solution (F) d'acide trifluoroacétique à 0,1% (en volume) dans l'eau comprenant 40% d'acétonitrile sur le volume de la solution (E) augmente linéairement de 0 % à 40 % en 30 minutes ;
o avec un débit de la phase mobile de 0,6 mL/min dans la colonne ; o l'analyse étant réalisée à une température de 40°C, et ;
o avec une détection par absorbance à la longueur d'onde de 214 nm en sortie de colonne.
Dans certains modes de réalisation, une composition selon l'invention comprend des peptides hydrophobes par nature qui sont élués de la colonne ci-dessus mentionnées et dans les conditions ci-dessus précisées avec un temps de rétention correspondant à un pourcentage d'acétonitrile compris entre 12 % et 38 %. Le temps de rétention médian des peptides de la composition selon l'invention est de 26 min correspondant à un pourcentage d'acétonitrile de 25 % dans l'éluant.
Avantageusement selon l'invention, la composition de peptides est à l'état liquide. Il peut s'agir d'une solution de la composition de peptides selon l'invention dans un solvant liquide, notamment dans un solvant aqueux.
Avantageusement selon l'invention, la composition de peptides est à l'état solide. La composition de peptides peut être sous la forme d'un solide à l'état divisé. Il peut s'agir en particulier d'un solide à l'état au moins partiellement déshydraté. La composition de peptides selon l'invention peut être sous forme d'une poudre.
Avantageusement selon l'invention, la composition de peptides est exempte d'hydrate de carbone.
Avantageusement selon l'invention, la composition de peptides est exempte de matière grasse.
Avantageusement selon l'invention, la matière sèche de la composition de peptides comprend une proportion massique de peptides de collagène supérieure à 95%, notamment supérieure à 99%. Ainsi, la composition de peptides présente une quantité de peptides de collagène telle que le rapport de la masse des peptides de collagène de la matière sèche de la composition de peptides sur la masse de matière sèche de la composition de peptides est supérieur à 95%, notamment supérieur à 99%.
Avantageusement selon l'invention, les peptides de la composition sont hydrosolubles. Avantageusement, les peptides de la composition de peptides sont solubles à 100% dans l'eau. Avantageusement, la composition de peptides est hydro-compatible.
Avantageusement selon l'invention, les peptides de la composition de peptides sont issus d'une hydrolyse enzymatique contrôlée de collagène de peau d'au moins un poisson choisi dans le groupe formé des poissons de la famille des Pangasiidae -notamment de Pangasius hypophtalmus (ou Pangasianodon hypophtalmus), de Pagasius pangasius, de Pangasius bocourti- et de la famille des Cichlidae -notamment du genre Oreochromis, en particulier d' Oreochromis niloticus ou du genre Tilapia -. Avantageusement, les peptides de la composition de peptides sont issus d'une hydrolyse enzymatique contrôlée de collagène de peau d'au moins un poisson péché dans une eau tempérée d'une région tempérée.
L'invention s'étend également à l'utilisation d'une telle composition de peptides dans un traitement thérapeutique du corps humain ou animal. L'invention s'étend donc également à une telle composition de peptides pour son utilisation à titre de médicament. L'invention s'étend donc à une telle composition de peptides pour son utilisation à titre de médicament dans le traitement préventif ou curatif d'au moins une pathologie du corps humain ou animal.
L'invention s'étend également en particulier à une composition de peptides pour son utilisation comme médicament dans au moins l'un des traitements suivants :
- traitement d'une pathologie digestive ;
- traitement d'une candidose intestinale ;
- traitement d'une inflammation digestive, et ;
- maintien du microbiote intestinal.
L'invention s'étend également à toute utilisation d'une composition de peptides selon l'invention en alimentation humaine. Selon certains modes de réalisation, l'invention s'étend également à toute utilisation d'une composition de peptides selon l'invention en alimentation humaine à l'exclusion de toute utilisation à titre de médicament. En particulier, avantageusement la composition selon l'invention est utilisée à titre de complément alimentaire.
L'invention s'étend également à une composition de peptide obtenue par un procédé dans lequel :
- on sélectionne des peaux de poissons d'eaux tempérées -notamment de la famille des Pangasiidae et/ou de la famille des
Cichlidae-, puis ;
- on réalise successivement :
. au moins une étape de lavage des peaux, puis ;
. au moins une étape de traitement acide ou alcalin des peaux adapté pour permettre une extraction d'au moins une partie du collagène des peaux, puis ;
. au moins une étape d'hydrolyse du collagène par au moins une protéase à cystéine d'origine végétale -en particulier au moins une protéase de Carica papaïa- à une température inférieure à 75 °C, puis ;
. une interruption de l'hydrolyse enzymatique par chauffage de l'hydrolysat de collagène à une température supérieure à la température de dénaturation de chaque protéase à cystéine de façon à former la composition de peptides.
Avantageusement, dans un procédé selon l'invention, après l'étape de traitement acide ou alcalin des peaux, on réalise au moins une extraction liquide/solide du collagène dans de l'eau portée à une température comprise entre 60°C et 98°C. Avantageusement, dans un procédé selon l'invention, on réalise ensuite une étape de séparation -notamment une étape de séparation par décantation- d'une fraction comprenant des matières solides (et des matières grasses) et d'une solution comprenant le collagène extrait, puis on soumet la solution comprenant le collagène extrait à une étape de purification, par exemple par filtration sur terres et/ou déminéralisation sur une résine échangeuse d'ions, adaptée pour former une solution purifiée comprenant du collagène, la matière sèche de la solution purifiée comprenant une proportion massique de collagène d'au moins 99%, notamment d'au moins 99,5%, en particulier d'au moins 99,8%. On forme une solution purifiée de collagène comprenant du collagène sensiblement pur. En particulier, on forme une telle solution purifiée de collagène sensiblement incolore. En particulier, on forme une telle solution purifiée de collagène sensiblement -notamment totalement- exempt d'élastine. On concentre la solution purifiée de façon à former un gel de collagène purifié et on soumet ensuite le gel de collagène purifié à l'étape d'hydrolyse du collagène.
Un tel procédé permet l'obtention d'une composition de peptides selon l'invention sensiblement incolore. Un tel procédé permet l'obtention d'une composition de peptides selon l'invention sensiblement exempte d'élastine. En particulier il permet l'obtention d'une telle composition de peptides selon l'invention sans aucune étape chromatographique de purification de la composition de peptides.
Dans un tel procédé, avantageusement et selon l'invention, on réalise une étape ultérieure de filtration de la composition de peptides. Avantageusement, on réalise également une étape de pasteurisation de la composition de peptides pendant une durée d'au moins 2 minutes à une température de pasteurisation comprise entre 85°C et 90°C minimum.
Dans un tel procédé, avantageusement et selon l'invention, on réalise une étape de séchage de la composition de peptides. On réalise cette étape de séchage par atomisation de façon à former une composition selon l'invention sensiblement déshydratée et sous la forme d'une poudre.
L'invention s'étend donc à une composition de peptides obtenue par un procédé dans lequel :
- on sélectionne des peaux de poissons d'eaux tempérées -notamment de la famille des Pangasiidae et/ou de la famille des Cichlidae-, puis ;
- on réalise successivement :
. au moins une étape de lavage des peaux, puis ;
. au moins une étape de traitement acide des peaux adapté pour permettre une extraction d'au moins une partie du collagène des peaux, puis ;
. au moins une étape d'hydrolyse du collagène par au moins une protéase à cystéine d'origine végétale -en particulier au moins une protéase de Carica papaïa- à une température inférieure à 75 °C, puis ;
. une interruption de l'hydrolyse enzymatique par chauffage de l'hydrolysat de collagène à une température supérieure à la température de dénaturation de chaque protéase à cystéine de façon à former la composition de peptides ;
ladite composition de peptides présentant une analyse globale des acides aminés dans laquelle :
- la glycine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 20,0 % et 24,5 % ;
- l'hydroxyproline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 6,0 % et 12,0 % ;
- la proline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 10,6 % et 14,6 %;
la composition de peptides présentant, lors d'une analyse par chromatographie d'exclusion lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué avec un temps de rétention représentatif du poids moléculaire apparent de ce peptide, une courbe d'élution (c'est-à-dire une courbe ou un profil d'élution d'un chromatogramme) des peptides présentant une valeur d'aire sous la courbe (c'est-à-dire une valeur d'aire représentative de la quantité massique de peptides) correspondant aux peptides de poids moléculaire apparent inférieur à 1400 Da telle que le rapport de cette valeur d'aire sur l'aire totale sous la courbe (correspondant à l'ensemble des peptides de la composition) est inférieur à 40 % ;
ladite analyse étant réalisée comme décrit ci- après ;
o sur une colonne de filtration de dimensions 300 x 7,8 mm comprenant une phase stationnaire formée d'un gel de silice d'une porosité de 5 μπι ;
o la colonne étant maintenue à la température de 40° C ;
o avec, à titre de phase mobile, une solution formée (A) d'eau ultra pure comprenant 0,1% en volume d'acide trifluoroacétique et (B) d'acétonitrile, dans laquelle le rapport volumique A/B est de 75/25 ;
o en introduisant en tête de la colonne de filtration sur gel un volume d'une solution comprenant de la composition de peptides ;
o le débit de la phase mobile dans la colonne étant de 0,6 mL/min, et ; o les peptides de la composition étant détectés par absorbance à la longueur d'onde de 214 nm.
L'invention concerne également une composition de peptides, une telle composition de peptides pour son utilisation comme médicament, un procédé d'obtention d'une telle composition de peptides et une telle composition de peptides obtenue par un tel procédé d'obtention caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante donnée à titre non limitatif et qui se réfère aux figures annexées, dans lesquelles :
- la figure 1 est un chromatogramme représentatif d'une analyse d'une composition de peptides selon l'invention par filtration sur gel ;
- la figure 2 est un chromatogramme représentatif d'un analyse HPLC d'une composition de peptides selon l'invention sur une résine échangeuse d'anions ;
- la figure 3 est un chromatogramme représentatif d'un analyse d'une composition de peptides selon l'invention par chromatographie en phase inverse ;
- la figure 4 est une représentation graphique représentative de l'évolution de la masse corporelle de souris dont l'inflammation colique est induite par le dextran sulfate de sodium (DSS) ;
- la figure 5 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage d'ILi dans le colon de souris par la méthode ELIS A ;
- la figure 6 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage d'IL6 dans le colon de souris par la méthode ELISA ;
- la figure 7 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage de TNF- dans le colon de souris par la méthode ELISA ;
- la figure 8 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage de TGF-β dans le colon de souris par la méthode ELISA ;
- la figure 9 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage par PCR de la flore fongique dans le colon de souris ;
- la figure 10 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage par PCR de Saccharomyces cerevisiae dans le colon de souris ; - la figure 11 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage par PCR des entérobactéries dans le colon de souris ;
- la figure 12 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage par PCR des firmicutes dans le colon de souris ;
- la figure 13 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage par PCR des bacteroidetes dans le colon de souris ;
- la figure 14 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage par PCR de Faecalibacterium prausnitzii dans le colon de souris ;
- la figure 15 est une représentation graphique en histogramme du résultat d'un dosage par PCR de Lactobacille murinus dans le colon de souris ;
- la figure 16 est une représentation graphique en histogramme d'une analyse par RT-PCR quantitative des ARN messagers du TGF-β dans le colon de souris ;
- la figure 17 est une représentation graphique en histogramme d'une analyse par RT-PCR quantitative des ARN messagers de la
NO-synthase inductible (iNOS) dans le colon de souris, et ;
- la figure 18 est une représentation graphique en histogramme d'une analyse par RT-PCR quantitative des ARN messagers de Fizzl dans le colon de souris ;
- la figure 19 est une représentation graphique en histogramme d'une analyse par RT-PCR quantitative des ARN messagers de la 5-LOX dans le colon de souris ;
- la figure 20 est une représentation graphique en histogramme d'une analyse par RT-PCR quantitative des ARN messagers de la 12/15-LOX dans le colon de souris. Procédé de préparation d'une composition selon l'invention On prélève ou on achète des peaux de poissons d'eaux de régions tempérées, notamment de poisson de la famille des Pangasiidae -notamment de Pangasius hypophtalmus (ou Pangasianodon hypophtalmus), de Pagasius pangasius, de Pangasius bocourti- et/ou de poisson-chat ou de la famille des Cichlidae -notamment du genre Oreochromis, en particulier d'Oreochromis niloticus ou du genre Tilapia-.
On réalise une succession d'étapes de lavage de la peau, de traitement acide de la peau lavée et d'extraction et de purification du collagène. On réalise ensuite une étape d'hydrolyse enzymatique du collagène de peaux de poissons ainsi obtenu de façon à former la composition selon l'invention. Pour ce faire, on chauffe de l'eau à une température comprise entre 70°C et 75°C. On verse progressivement dans l'eau chaude et sous agitation une masse de collagène de peaux de poissons telle que la proportion de massique de collagène dans l'eau soit de 45%, et on ajuste le pH de la solution à pH 6,0. On ajoute ensuite à la solution de collagène refondu une quantité de protéase à cystéine d'origine végétale. On choisit à titre de protéase à cystéine au moins une protéase de Carica papaïa, notamment la lypaine (Lypaine®, LYVEN, Collombelles, France) à l'état sec. Le rapport de la masse de protéase à cystéine sur la masse de collagène est adapté selon les conditions d'hydrolyse souhaitées. Par exemple, Le rapport de la masse de protéase à cystéine sur la masse de collagène est de 0,2%. On maintient la température de la solution à une valeur comprise entre 65 °C et 70°C adaptée pour favoriser l'activité enzymatique de la protéase à cystéine et pour maintenir la fluidité optimale de l'hydrolysat de collagène en tenant compte du fait que la viscosité de l'hydrolysat de collagène diminue avec le temps d'hydrolyse. On maintient la solution à cette température pendant une durée de l'ordre de 45 minutes.
On stoppe la réaction d'hydrolyse enzymatique par chauffage de l'hydrolysat de collagène à une température supérieure à la température de dénaturation de la protéase à cystéine, par exemple à une température comprise entre 85°C et 90°C pendant 20 minutes. L'hydrolysat de collagène de peaux de poisson est éventuellement soumis à une étape de filtration puis à une étape de pasteurisation pendant une durée d'au moins 2 minutes à une température de pasteurisation comprise entre 85°C et 90°C minimum.
L'hydrolysat de collagène ou peptides de collagène est ensuite soumis à une étape de séchage dans des conditions propres à former une composition selon l'invention formée d'une poudre de granulométrie prédéterminée.
Caractérisations structurelles des peptides de la composition selon l'invention
Composition en acides aminés
On réalise une caractérisation de la composition de peptides issus d'une hydrolyse de collagène de peaux de poissons d'eaux tempérées selon l'invention par dosage des acides aminés libres et totaux au moyen d'un analyseur d'acides aminés ou au moyen d'un équipement de chromatographie liquide à haute performance (CLHP/HPLC) conformément à la norme ISO 13903:2005. À titre de comparaison, on détermine la composition en acides aminés d'un hydrolysat de collagène de peaux de poissons d'eaux froides (colin d'Alaska, «Alaska pollock »), péchés dans les eaux profondes de la mer de Béring (Alaska). Les résultats comparatifs sont présentés au tableau 6 ci-après.
Acide aminé, Collagène de poisson d'eau Collagène de poisson d'eau froide % en moles tempérée selon l'invention à titre de comparaison
Glycine 20,0 - 24,5 25,1-34,7
Alanine 7,3-11,3 8,6-10,9
Proline 10,6-14,6 8,4-9,8
Acide glutamique 8,0-13,0 4,2-6,8
Sérine 1,5-5,5 6,3-8,6
Arginine 6,9-10,9 6,2-10,3
Hydroxyproline 6,0-12,0 5,2-5,5
Acide aspartique 3,1-7,1 3,7-5,2
Thréonine 0,7 - 4,7 3,3-3,7
Lysine 1,5-5,5 3,2-4,5
Leucine 0,6-4,6 1,8-3,6
Valine 0-4,0 1,6-2,9 Histidine 0 - 3,3 1,5 - 1,6
Phénylalanine 0,3 - 4,3 1,3 - 2,4
Méthionine 0 - 2,5 1,2 - 2,9
Isoleucine 0 - 3,5 1,0 - 2,0
Hydroxylysine 0 - 3,5 0 - 0,9
Tyrosine 0 - 1,5 0,3 - 1,0
Cystéine 0 - 2,0 0
Tryptophane 0 0
Tableau 6
On réalise également une caractérisation d'une composition de peptides selon l'invention par la distribution des poids moléculaires apparents des peptides, par la polarité des peptides et pas l'hydrophobie des peptides.
Analyse des poids moléculaires apparents des peptides
On analyse la distribution en poids moléculaires apparent des peptides constitutifs d'une composition selon l'invention par perméation de gel sur une colonne de chromatographie liquide de dimensions 300 x 7,8 mm dans laquelle la phase stationnaire est constituée d'un gel à base de silice (BioSep-SEC-S2000, Phénomenex, Le Peck, France) d'une porosité de 5 μπι. La colonne de filtration étant maintenue à une température de 40° C. La phase mobile est constituée d'un mélange comprenant (A) de l'eau ultra pure additionnée d'acide trifluoroacétique (0,1% en volume) et (B) de l'acétonitrile (A/B ; 75/25 ; v/v). Le débit de la phase mobile est maintenu à 0,6 mL/min. Le volume de la solution comprenant la composition de peptides à analyser est de 25 μL·. La détection est réalisée en sortie de la colonne de perméation de gel par la mesure d'absorbance à la longueur d'onde de 214 nm. On réalise en parallèle une courbe d'étalonnage de détermination d'un poids moléculaire apparent en fonction du temps de rétention. Pour réaliser cette courbe d'étalonnage on choisit des peptides connus de poids moléculaire compris entre 100 Da et 30 kDa. Les étalons connus sont la proline, la glutathionne, la ribonucléase A et la trypsine, de poids moléculaires apparents respectifs de 115 Da, 307 Da, 13,7 kDa et 28,2 kDa. Les poids moléculaires apparents et les temps de rétention exprimés en minutes des étalons sont donnés au tableau 1 ci-après :
Figure imgf000028_0001
Tableau 1
Les peptides sont élués de la colonne successivement en fonction de leur poids moléculaire apparent décroissant. Les valeurs des temps de rétention de chaque famille de peptides de la composition à analyser correspondant à un pic du chromatogramme sont relevées au sommet de chaque pic du chromatogramme et traduites en valeur de poids moléculaire apparent par comparaison avec la courbe d'étalonnage. Les valeurs relatives des quantités de chaque famille de peptides correspondent à la valeur de l'air sous la courbe correspondant à chaque pic du chromatographe. Ces valeurs sont exprimées par le rapport de la valeur de l'aire sous la courbe correspondant à une famille de peptides sur la somme des valeurs des aires de chaque famille de peptides.
Les valeurs des temps de rétention (min), des poids moléculaires apparents correspondant (Da) et du pourcentage de l'aire sous la courbe (exprimée en pourcentage de l'aire totale sous la courbe) correspondant à chaque famille de peptides du chromatogramme représenté en figure 1 sont données au tableau 2 ci-après. On identifie chaque groupe de peptides correspondant à un pic du chromatogramme par la valeur du poids moléculaire apparent correspondant au maximum de ce pic du chromatogramme.
Temps de rétention (min) Poids moléculaire Aire sous la courbe (%) apparent (Da)
11,130 10869 6,6
11,560 8096 7,0
12,072 5703 9,6
12,430 4461 13,0 12,962 3100 13,6
13,678 1897 19,0
14,638 983 21,6
16,217 333 9,6
Tableau 2
La proportion de peptides de la composition selon l'invention -dont le chromatogramme est représenté en figure 1 et dont les valeurs sont données au tableau 2- dont le poids moléculaire apparent est inférieur à 1400 Da est de 31,2 % (poids moléculaires apparents de valeurs 983 Da et 333 Da) par rapport à l'ensemble des peptides de la composition.
Le poids moléculaire apparent moyen des peptides de la composition selon l'invention dont les valeurs de poids moléculaire apparent sont données au tableau 2 est de 3442 Da. On définit le poids moléculaire apparent moyen des peptides de la composition comme la moyenne des valeurs de poids moléculaires apparents pondérés correspondant à chaque groupe de peptides de la composition correspondant à un même pic du chromatogramme. La valeur du poids moléculaire apparent pondéré d'un groupe de peptides d'un même pic du chromatogramme correspond à la valeur du poids moléculaire apparent au sommet (maximum) du pic pondérée par le rapport de la valeur de l'aire sous la courbe du pic correspondant sur l'aire (totale) sous la courbe du chromatogramme. On entend par « aire sous la courbe » ou « aire sous le pic », l'aire de la surface s 'étendant entre la courbe décrivant le pic du chromatogramme et la ligne de base du chromatogramme. En particulier, l'aire sous l'un des pics du chromatogramme s'étend entre deux minima de la courbe du chromatogramme encadrant un sommet (ou maximum) de la courbe du chromatogramme.
À titre de la généralisation, sont présentées au tableau 3 ci- après, les valeurs moyennes des temps de rétention (min), des poids moléculaires apparents correspondant (Da) et du pourcentage de l'aire sous la courbe de chaque famille de peptides correspondant à des analyses distinctes de trois compositions de peptides selon l'invention. Temps de rétention (min) Poids moléculaire (Da) Aire (%)
11,13 ± 0,15 10870 ± 830 4,6 ± 2
11,50 ± 0,20 8596 ± 700 5,6 ± 2
11,7 ± 0,1 7180 ± 100 4,5 ± 1
12,27 ± 0,3 5703 ± 400 9,6 ± 2
12,45 ± 0,20 4430 ± 100 13,0 ± 1
13,00 ± 0,06 3100 ± 100 13,5 ± 1
13,67 ± 0,06 1870 ± 40 20,0 ± 1
14,64 ± 0,02 983 ± 20 22,5 ± 2
16,18 ± 0,04 340 ± 10 12,0 ± 2,5
16,79 ± 0,01 224 ± 5 0,7 ± 0,15
Tableau 3
La proportion moyenne de peptides de compositions selon l'invention -dont les valeurs sont données au tableau 3- et dont le poids moléculaire est inférieur à 1400 Da est de 35,2 % (correspondants essentiellement aux poids moléculaires apparents de 983 Da et de 340 Da).
Analyse de la polarité des peptides constitutifs
On analyse la proportion de peptides anioniques dans la composition selon l'invention dont la distribution des poids moléculaires apparents est donnée au tableau 2, c'est-à-dire la proportion de peptides présentant une charge négative à pH 8,35. On analyse également la proportion de peptides neutres et/ou cationiques dans la composition selon l'invention, c'est-à- dire la proportion de peptides présentant une charge globalement neutre à pH 8,35 ou présentant une charge positive à pH 8,35. On réalise une telle analyse par chromatographie liquide haute performance (HPLC) d'échange d'ions dans laquelle la phase stationnaire est une résine échange d'anions (Hydrophase HP- SAX, Interchim, Montluçon, France) de granulométrie 10 μιη. La colonne de chromatographie HPLC d'échange d'ions est de dimensions 100 x 7,8 mm.
On conditionne la colonne de chromatographique HPLC par échange d'ions dans un tampon tris(hydroxyméthyl)amino méthane) (Tris) à une concentration de 5 mM dans l'eau et dont le pH est ajusté à la valeur de 8,35. La température de la colonne est maintenue une température de 25° C. Le débit de la phase mobile dans la colonne et de 1 mL/min. On prépare un échantillon de la composition de peptides à analyser de sorte que sa concentration soit de 2 g/L par dilution dans l'eau ultrapure. On introduit en tête de colonne un volume de 90 μL· de cette solution à analyser. La détection est réalisée par mesure de l'absorbance en continu à 214 nm.
À compter de l'introduction de l'échantillon en tête de la colonne, la phase mobile est constituée de Tris 5 mM à pH 8,35 (solution A) pendant une durée de 7 minutes, puis d'une phase mobile dans laquelle une solution B formée de Tris 5mM, NaC 5 M, pH 8,35 augmente linéairement de 0 % à 100 % dans la solution A en 30 minutes. On maintient ensuite l'élution par la solution B pendant 2 minutes.
Le chromatogramme obtenu est représenté en figure 2. Les peptides anioniques sortent de la colonne avec un temps de rétention compris entre 10 min et 17,5 min correspondants à une concentration en NaCt comprise entre 0,5 M et 1,7 M. La proportion de peptides anioniques dans la composition de peptides selon l'invention dont l'analyse représentée en figure 2 est de 36,9 %. Les peptides neutres et cationiques sortent de la colonne avec un temps de rétention comprise entre 1 minute et 8 minutes. La proportion de peptides neutres et cationiques dans la composition de peptides selon l'invention dans l'analyse représentée en figure 2 est de 57,5 %.
À titre de la généralisation, on reproduit cette analyse sur trois compositions de peptides selon l'invention. La proportion moyenne de peptides anioniques dans ces compositions selon l'invention est comprise entre 27,9 % et 42,5 % et la proportion moyenne de peptides neutres et cationiques dans ces compositions selon l'invention est comprise entre 57,5 % et 72,1 %.
Analyse de l'hydrophobie des peptides constitutifs
On analyse l'hydrophobie des peptides constitutifs de la composition selon l'invention par chromatographie liquide en phase inverse sur une colonne de silice greffée par des groupements butyle (Vydac 214TP™ C4, Grâce, Epernon, France) de dimensions 250 x 4,6 mm. La granulométrie de la silice est de 5 μπι et sa porosité est de 300 A.
On conditionne la colonne dans l'eau ultrapure acidifiée avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique. La température de la colonne est maintenue une température de 40°C. Le débit de la phase mobile dans la colonne et de 0,6 mL/min. On prépare un échantillon de la composition de peptides à analyser de sorte que sa concentration soit de 2 g/L par dilution dans l'eau ultrapure. On introduit en tête de colonne un volume de 100 μL· de cette solution à analyser. La détection est réalisée par mesure de l'absorbance en continu à la longueur d'onde de 214 nm.
À compter de l'introduction de l'échantillon en tête de la colonne, la phase mobile est constituée d'eau acidifiée (solution A) pendant une durée de 7 minutes, puis d'une phase mobile dans laquelle une solution B formée d'eau acidifiée avec 0,1% (en volume) d'acide trifluoroacétique et comprenant 40% d'acétonitrile augmente linéairement de 0 % à 100 % dans la solution A en 30 minutes.
Le chromatogramme obtenu est représenté en figure 3. Les peptides de la composition selon l'invention sortent de la colonne avec un temps de rétention compris entre 16 min et 36 min correspondants à un pourcentage d'acétonitrile compris entre 12 % et 38 % dans l'éluant. Le temps de rétention médian des peptides de la composition selon l'invention est de 26 min correspondant à un pourcentage d'acétonitrile de 25 % dans l'éluant.
Effets biologiques d'une composition selon l'invention Effet sur la colonisation par Candida albicans et sur la candidose digestive
On analyse l'effet d'une composition selon l'invention sur la candidose digestive induite chez des souris femelles C57BL/6, âgées de 8 semaines et d'un poids compris entre 20-25g. On nourrit ces souris pendant une durée de 21 jours avec la composition selon l'invention à raison de 4 g/Kg/jour. Au 21eme jour, on induit la candidose digestive par gavage de chaque souris avec une quantité de 5.107 cellules de levure. Entre 2 jours (J2) et 7 jours (J7) après induction, on collecte les selles des souris et on évalue la charge en levure (CFU/mg de selles) sur un milieu chromogène. Les résultats sont donnés au tableau 4 ci-après en comparaison avec les valeurs mesurées sur des souris dont une candidose digestive est induite mais qui ne sont pas traitées avec la composition selon l'invention.
Figure imgf000033_0001
Tableau 4
La composition selon l'invention induit une diminution de la charge de Candida albicans.
Composition de peptides selon l'invention antiinflammatoire
On réalise une analyse comparative de la stimulation de l'expression des récepteurs des macrophages de type 1 (Ml) inflammatoires et/ou des récepteurs des macrophages de type 2 (M2) antiinflammatoires par une composition de peptides selon l'invention issus d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux tempérées et par une composition de peptides issus d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux froides (hors invention).
Des macrophages/monocytes de sujets humains sains sont cultivés pendant 24 heures en présence d'une composition de prétraitement (contrôle sans peptides de collagène, Invention, Hors invention, tableau 7) à une concentration de 100μg/mL de milieu de culture. On évalue l'effet de ce prétraitement sur l'expression des récepteurs caractéristiques des macrophages de type 1 (Ml, inflammatoires) et sur l'expression des récepteurs caractéristiques des macrophages de type 2 (M2, antiinflammatoires) par le niveau de production de radicaux libres de l'oxygène (« Reactive Oxygen Species, ROS ») par les récepteurs des macrophages de type 1 spécifiquement stimulés par un ester de phorbol (« 12-myristate-13-acetate-phorbol, TPA ») à une concentration de 100 μΜ ou par les récepteurs des macrophages de type 2 spécifiquement stimulés par le Zymosan non opsonisé (ZNO) à une concentration de 100 μg/mL. On mesure le niveau de production de radicaux libres de l'oxygène par chimioluminescence en présence de luminol à une concentration de 66 μΜ. Les résultats présentés au tableau 7 ci-après représentent les valeurs moyennes obtenues avec trois essais.
Figure imgf000034_0001
Tableau 7
On observe que les macrophages/monocytes non traités
(non induits) par ZNO et TPA présentent un niveau de production de radicaux libres de l'oxygène sensiblement constant selon la nature du prétraitement (sans collagène, selon l'invention et hors invention).
Les macrophages/monocytes prétraités par une composition de peptides selon l'invention, c'est-à-dire issus d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux tempérées, présentent une expression augmentée des récepteurs de macrophages de type 2 (M2) antiinflammatoires révélée par l'intensité de chimioluminescence (5,06 108 u.a.) induite par ZNO, par rapport aux macrophages/monocytes prétraités par une composition de peptides hors invention, c'est-à-dire issus d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux froides (3,91 108 u.a.).
Les macrophages/monocytes prétraités par une composition de peptides selon l'invention, c'est-à-dire issus d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux tempérées, présentent une expression diminuée des récepteurs de macrophages de type 1 (Ml) inflammatoires révélée par l'intensité de chimioluminescence (6,75 108 u.a.) induite par TPA, par rapport aux macrophages/monocytes prétraités par une composition de peptides hors invention, c'est-à-dire issus d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux froides (1,40 109 u.a.).
La composition de peptides selon l'invention présente un phénotype antiinflammatoire par rapport à une composition de peptides hors invention, c'est-à-dire issus d'une hydrolyse enzymatique de collagène de peaux de poissons d'eaux froides par augmentation du niveau d'expression des récepteurs des macrophages de type 2 (M2) antiinflammatoires et par diminution du niveau d'expression des récepteurs des macrophages de type 1 (Ml) inflammatoires.
La préparation d'une composition de peptides selon l'invention issus de peaux de poissons d'eaux tempérées et présentant un aminogramme dans lequel :
- la glycine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 20,0 % et 24,5 % ;
- l'hydroxyproline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 6,0 % et 12,0 % ;
- la proline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 10,6 % et 14,6 % ;
présente un tel phénotype antiinflammatoire confirmé par les essais d'inflammation colique sur un modèle murin et non retrouvé avec une composition de peptides issus de peaux de poissons d'eaux froides et présentant un aminogramme tel que décrit au tableau 6.
Inflammation colique sur un modèle murin
L'effet anti-inflammatoire de la composition de peptides selon l'invention est démontré sur un modèle murin d'inflammation pharmacologique induit par le dextran sulfate de sodium (DSS, MP Biomédical LLC, Canada) caractérisée par une perte de poids et des diarrhées sanglantes. On étudie l'effet de la composition de peptides selon l'invention pour limiter la perte de poids de souris traitées au DSS. On traite pendant 7 jours (Ji à J7) des souris de laboratoire C57BL/6 femelles âgées de 10 à 11 semaines et de masse comprise entre 20 et 25 grammes, avec du DSS dissout à raison de 1,5% (poids/volume) dans l'eau de boisson des souris. On traite également pendant 12 jours (Ji à J12) ces souris avec la composition selon l'invention à raison de 0,1 g/Kg/jour ; 1 g/Kg/jour et 4 g/Kg/jour. On délivre cette quantité de composition selon l'invention dans l'eau de boisson des souris. À J12, les souris sont euthanasiées.
On prépare 5 lots de souris, chaque lot comprenant 10 souris, dont :
- le lot 1 est traité par le DSS pendant 7 jours ;
- le lot 2 est traité par le DSS pendant 7 jours et avec la composition selon l'invention à raison de 0,1 g/Kg/jour pendant 12 jours ;
- le lot 3 est traité par le DSS pendant 7 jours et avec la composition selon l'invention à raison de 1 g/Kg/jour pendant 12 jours ;
- le lot 4 est traité par le DSS pendant 7 jours et avec la composition selon l'invention à raison de 4 g/Kg/jour pendant 12 jours ;
- le lot 5 est traité par le DSS pendant 7 jours et avec de la caséine hydrolysée non conforme à l'invention à raison de 0,1 g/Kg/jour pendant 12 jours.
On réalise en parallèle un contrôle sur 5 souris qui ne sont pas traitées par le DSS et pour lesquelles l'inflammation n'est pas induite, et qui ne sont pas traitées avec une composition de peptide selon l'invention.
1. Étude du poids corporel
On mesure chaque jour le poids de chaque souris et on calcule la perte de poids subie par chaque souris de chaque lot. Les résultats sont présentés en figure 4, dans laquelle le contrôle est représenté par des cercles ouverts (O), le lot 1 est représenté par des cercles pleins (·), le lot 2 est représenté par des carrés ouverts (□), le lot 3 est représenté par des carrés pleins (■), le lot 4 est représenté par des triangles ouverts (Δ) et le lot 5 est représenté par des triangles pleins ( A ). On observe que dès 0,lg/Kg/jour (lot 2, □), la composition selon l'invention limite la perte de poids des souris. Cette limitation est également observée pour 1 g/Kg/jour (lot 3,■) et pour 4 g/Kg/jour (lot 4, Δ). Elle n'est pas observée pour le traitement avec la caséine hydrolysée (lot 5, A ) pour lequel la perte de poids est comparable à la perte de poids des souris du lot 1 (·)·
La composition selon l'invention permet de limiter, voire d'annuler quasiment intégralement, la perte de poids engendrée par l'inflammation induite par le dextran sulfate de sodium (DSS) chez la souris. La composition selon l'invention est susceptible de pouvoir être utilisée à titre de médicament, notamment pour le traitement de l'inflammation colique.
2. Histologie
Les coupes histologiques transversales de colon de souris traitées par le DSS seul présentent après coloration bichromatique par l'hématoxyline et l'éosine d'importantes infiltrations de cellules inflammatoires au niveau de la muqueuse et de la sous muqueuse. L'épaisseur de l'épithélium est réduite. L'épithélium présente des ulcérations étendues. Les coupes histologiques transversales de colon de souris traitées par le DSS et par la composition selon l'invention à raison de 0,1 g/Kg/jour, 1 g/Kg/jour et 4 g/Kg/jour présentent après coloration bichromatique par l'hématoxyline et l'éosine des glandes tubulaires serrées et rectilignes représentatives d'un épithélium sain et fonctionnel.
3. Score macroscopique
On calcule pour chaque condition de traitement un score macroscopique à partir de notations établies selon l'échelle de Wallace relatives à l'aspect des selles, à l'aspect endommagé du colon, au poids du colon et à la longueur du colon, selon l'échelle de Wallace (E. S. Kimball, N. H. Wallace, C. R. Scnneider, M. R. D'Andréa et P. J. Hornby; 2004 ; Neurogastroenterol Motil ; 16, 811-818. Vanilloid receptor 1 antagonists attenuate disease severity in dextran sulphate sodium- induced colitis in mice). La valeur du score macroscopique est d'autant plus élevée que le colon est inflammatoire et est d'autant plus faible que le colon est sain. Les valeurs moyennes et l'écart- type du score macroscopique des souris des lots 1 à 5 sont données au tableau 5 ci-après.
Figure imgf000038_0001
Il est observé une diminution du score macroscopique induit par le traitement avec la composition selon l'invention, c'est-à-dire une amélioration de l'état inflammatoire du colon induite par la composition selon l'invention.
4. Inhibition de l'expression de marqueurs proinflammatoires chez la souris
À J12, on euthanasie les souris et on dose le niveau d'expression au niveau du colon de cytokines pro-inflammatoires par la technique d' ELIS A :
- IL-Ιβ : Le taux d'IL-Ιβ est analysé par la technique ELIS A et exprimé en picogramme (pg) d'IL-i par milligramme (mg) de colon. Les résultats sont représentés en figure 5 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 5. On observe une diminution statistiquement significative (p<0,05) de l'expression d' IL l-β dans le colon de souris traitées avec la composition de peptides selon l'invention pour des doses de 0,lg/Kg/jour, lg/Kg/jour et 4g/Kg/jour par rapport au colon de souris dont l'inflammation est induite par le DSS et par rapport aux souris dont l'inflammation est induite par le DSS et traitée avec la caséine hydrolysée. Cet effet a été confirmé par analyse des ARN messagers de IL-i par RT-PCR quantitative en particulier (p<0,01) pour les doses de 0, lg/Kg/jour et lg/Kg/jour ;
- IL6 : Le taux d'IL6 est analysé par la technique ELIS A et exprimé en picogramme (pg) d'IL6 par milligramme (mg) de colon. Les résultats sont représentés en figure 6 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 5. On observe une diminution statistiquement significative de l'expression d'IL6 dans le colon de souris traitées avec la composition de peptides selon l'invention pour des doses de 0, lg/Kg/jour (p<0,01), lg/Kg/jour (p<0,01) et 4g/Kg/jour (p<0,05) par rapport au colon de souris dont l'inflammation est induite par le DSS et par rapport aux souris dont l'inflammation est induite par le DSS et traitée avec la caséine hydrolysée. Cet effet a été confirmé par analyse des ARN messagers de IL6 par RT-PCR quantitative ;
- TNF-oc : Le taux de TNF-oc est analysé par la technique ELISA et exprimé en picogramme (pg) de TNF-α par milligramme (mg) de colon. Les résultats sont représentés en figure 7 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 5. On observe une diminution statistiquement significative de l'expression du TNF-α dans le colon de souris traitées avec la composition de peptides selon l'invention pour des doses de 0,lg/Kg/jour (p<0,05), lg/Kg/jour (p<0,05) et 4g/Kg/jour (p<0,05) par rapport au colon de souris dont l'inflammation est induite par le DSS et par rapport aux souris dont l'inflammation est induite par le DSS et traitée avec la caséine hydrolysée.
L'analyse par RT-PCR {« Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ») quantitative des ARN messagers de MCP1 montre une diminution statistiquement significative de ces ARNm induits par le DSS, en particulier pour les doses de 0,1 g/Kg/jour (p<0,01) et 1 g/Kg/jour (p<0,05) de composition de peptides selon l'invention.
L'analyse par RT-PCR {« Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ») quantitative des ARN messagers de la NO- synthase inductible (iNOS) est représentée en figure 17 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 5. Il a été observé une diminution statistiquement significative des ARNm de iNOS induits par le DSS pour les doses de 0,1 g/Kg/jour (p<0,05) et 1 g/Kg/jour (p<0,05) de la composition de peptides selon l'invention.
5. Stimulation de l'expression de marqueurs antiinflammatoires chez la souris
À J12, on euthanasie les souris et on analyse le niveau d'expression au niveau du colon de marqueurs anti-inflammatoires : - TGF-β. Le taux de TGF-β est analysé par la technique ELISA et exprimé en picogramme (pg) de TGF-β par milligramme (mg) de colon. Les résultats sont représentés en figure 8 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 5. On observe une stimulation de l'expression du TGF-β dans le colon de souris traitées avec la composition de peptides selon l'invention pour la dose de 0,lg/Kg/jour par rapport au colon de souris dont l'inflammation est induite par le DSS. Cet effet a été confirmé par analyse des ARN messagers de TGF-β par RT-PCR quantitative, en particulier pour les doses de 0,1 g/Kg/jour et 1 g/Kg/jour de composition de peptides selon l'invention (figure 16) ;
- Fizzl : Fizzl est un marqueur des macrophages M2 anti- inflammatoires. L'analyse par RT-PCR (« Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ») quantitative des ARN messagers de Fizzl est représentée en figure 18 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 5. Il a été observé une augmentation statistiquement significative des ARN messagers de Fizzl diminués par le DSS, pour les doses de 0,1 g/Kg/jour (p<0,05), 1 g/Kg/jour (p<0,01) et 4 g/Kg/jour (p<0,05) de composition de peptides selon l'invention ;
- il a également été observé une augmentation statistiquement significative des ARN messagers de Yml diminués par le DSS, pour les doses de 1 g/Kg/jour (p<0,05) de composition de peptides selon l'invention.
6. Effet de la composition de peptides selon l'invention sur la flore colique - microbiote du colon
A J12, on euthanasie les souris et on quantifie par PCR (« Polymerase Chain Reaction ») la flore colique de ces souris. Les valeurs sont normalisées par rapport à la quantité totale de bactéries ou de champignons et par rapport à la β-actine. La β-actine constitue le gène de référence permettant une normalisation par rapport à la quantité de tissu colique analysé. On quantifie en particulier :
- la flore fongique totale par l'amplification quantitative de l'ADN ribosomique fongique ITSl-2. Le rapport R de la quantité d'ADN ribosomique fongique ITSl-2 sur la quantité d'ADN de la β-actine est représenté en figure 9 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond au dosage effectué sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 5. La composition de peptides selon l'invention restore la flore fongique en particulier à la dose de 4g/Kg/jour ;
- la levure Saccharomyces cerevisiae par l'amplification quantitative de l'ADN ribosomique 26S. Le rapport R de la quantité d'ADN ribosomique 26S sur la quantité d'ADN de la β-actine est représenté en figure 10. La première colonne (colonne blanche) correspond au dosage effectué sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 5. La composition de peptides selon l'invention restore de façon statistiquement significative la flore Saccharomyces cerevisiae aux doses de 0,1 g/Kg/jour (p<0,05), lg/Kg/jour (p<0,05) et 4g/Kg/jour (p<0,05). En l'espèce, S. cerevisiae présente un potentiel anti-inflammatoire ;
- la flore d'entérobactéries par l'amplification quantitative de l'ADN ribosomique 16S. Le rapport R de la quantité d'ADN ribosomique 16S sur la quantité d'ADN de la β-actine est représenté en figure 11. La première colonne (colonne blanche) correspond au dosage effectué sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne grisée) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 2. La quatrième colonne (colonne pleine noire) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 5. La composition de peptides selon l'invention permet la diminution de la flore d'entérobactéries induite par le DSS à la concentration de 0,1 g/Kg/jour. Les entérobactéries sont associées à un potentiel pro-inflammatoire ;
- la flore de firmicutes par l'amplification quantitative de l'ADN ribosomique 16S sur un fragment du gène permettant l'analyse de la diversité dans le phylum. Le rapport R de la quantité d'un tel ADN ribosomique 16S sur la quantité d'ADN de la β-actine est représenté en figure 12. La première colonne (colonne blanche) correspond au dosage effectué sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 5. La composition de peptides selon l'invention induit la diminution statistiquement significative de la flore de firmicutes induite par le DSS aux concentrations de 0,1 g/Kg/jour (p<0,05), lg/Kg/jour (p<0,05) et 4 g/Kg/jour (p<0,05) mais aussi induit la diminution de la flore de firmicutes non induite à ces mêmes concentrations. Il est à noter que l'augmentation de la flore de firmicutes est généralement observée de façon connue au cours de l'inflammation digestive (« IBD, Inflammatory Bowel Diseases ») ;
- la flore de bacteroidetes par l'amplification quantitative de l'ADN ribosomique 16S sur un fragment du gène permettant l'analyse de la diversité dans le phylum. Le rapport R de la quantité d'un tel ADN ribosomique 16S sur la quantité d'ADN de la β-actine est représenté en figure 13. La première colonne (colonne à hachures obliques) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 1. La deuxième colonne (colonne à hachures verticales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 4. La troisième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 3. La quatrième colonne (colonne grisée) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 2. La cinquième colonne (colonne pleine noire) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 5. La composition de peptides selon l'invention induit la diminution statistiquement significative de la flore bacteroidetes induite par le DSS aux concentrations de 0,1 g/Kg/jour (p<0,05), lg/Kg/jour (p<0,05) et 4 g/Kg/jour (p<0,05). L'augmentation des bacteroidetes est généralement observée de façon connue au cours de l'inflammation digestive (« IBD ») ;
- la flore de Faecalibacterium praustnizii par l'amplification quantitative d'ADN spécifique. Le rapport R de la quantité d'un tel ADN spécifique sur la quantité d'ADN de la β-actine est représenté en figure 14. La première colonne (colonne blanche) correspond au dosage effectué sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 5. La composition de peptides selon l'invention induit l'augmentation statistiquement significative de la flore de Faecalibacterium praustnizii détruite par le DSS à la concentration de 0,1 g/Kg/jour (p<0,01), 1 g/Kg/jour (p<0,01) et 4 g/Kg/jour (p<0,01). L'augmentation de Faecalibacterium praustnizii est généralement observée de façon connue au cours de l'inflammation digestive (« IBD »). Faecalibacterium praustnizii aurait également des propriétés anti-inflammatoires ;
- la flore de Lactobacillus murinus par l'amplification quantitative d'un ADN spécifique. Le rapport R de la quantité d'un tel ADN spécifique sur la quantité d'ADN de la β-actine est représenté en figure 15 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond au dosage effectué sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond au dosage effectué sur les souris du lot 5. La composition de peptides selon l'invention induit l'augmentation de la flore de Lactobacillus murinus aux concentrations de 0,1 g/Kg/jour, 1 g/Kg/jour et 4 g/Kg/jour (p<0,05). Lactobacillus murinus aurait également des propriétés anti-inflammatoires.
7. Effet de la composition de peptides selon l'invention sur les enzymes du métabolisme lipidique de l'acide arachidonique :
- 5-LOX : L'analyse par RT-PCR (« Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ») quantitative des ARN messagers de l'enzyme 5-lipoxygenase (5-LOX) est représentée en figure 19 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 5. Il a été observé une diminution statistiquement significative de l'expression de la 5-LOX pour des doses de la composition de peptides selon l'invention de 0,1 g/Kg/jour (p<0,01) et 1 g/Kg/jour (p<0,01) par rapport au contrôle non induit par le DSS. La composition de peptides selon l'invention présente un effet inhibiteur de l'expression de la 5-LOX favorisant la production de médiateurs lipidiques pro-inflammatoires ;
- 12/15-LOX : L'analyse par RT-PCR (« Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ») quantitative des ARN messagers de l'enzyme 12/15-lipoxygenase (12/15-LOX) est représentée en figure 20 dans laquelle la première colonne (colonne blanche) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du contrôle. La deuxième colonne (colonne à hachures obliques) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 1. La troisième colonne (colonne à hachures verticales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 4. La quatrième colonne (colonne à hachures horizontales) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 3. La cinquième colonne (colonne grisée) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 2. La sixième colonne (colonne pleine noire) correspond à l'analyse effectuée sur les souris du lot 5. Il a été observé une augmentation statistiquement significative de l'expression de la 12/15-LOX pour des doses de la composition de peptides selon l'invention de 0,1 g/Kg/jour (p<0,01) et 1 g/Kg/jour (p<0,01) par rapport au contrôle induit par le DSS.
Il va de soi que l'invention peut faire l'objet de nombreuses variantes de réalisation et d'applications. En particulier, différentes utilisations à titre de médicament peuvent varier sans sortir de la portée de protection de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
II- Composition de peptides présentant un aminogramme dans lequel :
- la glycine est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 20,0 % et 24,5 % ;
- l'hydroxyproline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 6,0 % et 12,0 % ;
- la proline est en quantité molaire telle que le rapport de cette quantité sur la somme des quantités molaires des acides aminés dans la composition est compris entre 10,6 % et 14,6 % ;
la composition de peptides présentant, lors d'une analyse par chromatographie d'exclusion lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué avec un temps de rétention représentatif du poids moléculaire apparent de ce peptide, une courbe d'élution des peptides présentant une valeur d'aire sous la courbe correspondant aux peptides de poids moléculaire apparent inférieur à 1400 Da telle que le rapport de cette valeur d'aire sur l'aire totale sous la courbe est inférieur à 40 % ;
ladite analyse étant réalisée comme décrit ci- après ;
o sur une colonne de filtration de dimensions 300 x 7,8 mm comprenant une phase stationnaire formée d'un gel de silice d'une porosité de 5 μπι ;
o la colonne étant maintenue à la température de 40° C ;
o avec, à titre de phase mobile, une solution formée (A) d'eau ultra pure comprenant 0,1% en volume d'acide trifluoroacétique et (B) d'acétonitrile, dans laquelle le rapport volumique A/B est de 75/25 ;
o en introduisant en tête de la colonne de filtration sur gel un volume d'une solution comprenant de la composition de peptides ;
o le débit de la phase mobile dans la colonne étant de 0,6 mL/min, et ; o les peptides de la composition étant détectés par absorbance à la longueur d'onde de 214 nm. 21- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que chaque peptide de la composition présente un poids moléculaire apparent compris entre 200 Da et 12 000 Da.
31- Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les peptides présentent une valeur de poids moléculaire apparent moyen comprise entre 2 500 Da et 3 600 Da.
Al- Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle présente par analyse chromatographique sur une colonne échangeuse d'anions lors de laquelle chaque peptide de la composition de peptides est élué de la colonne avec un temps de rétention représentatif de sa charge :
- une valeur d'aire sous un pic correspondant aux peptides anioniques ;
- une valeur d'aire sous un pic correspondant aux peptides neutres, et ;
- une valeur d'aire sous un pic correspondant aux peptides cationiques ; telle que le rapport de cette valeur d'aire sous le pic correspondant aux peptides anioniques sur la somme des valeurs d'aire sous les pics correspondants aux peptides anioniques, aux peptides neutres et aux peptides cationiques de la composition est compris entre 27,0 % et 45 % ;
la valeur de l'aire sous le pic correspondant aux peptides anioniques, la valeur de l'aire sous le pic correspondant aux peptides cationiques et la valeur de l'aire sous le pic correspondant aux peptides neutres étant déterminées par l'analyse chromatographique dans des conditions décrites ci-après :
o en utilisant une colonne chromatographique de dimensions 100 x 7,8 mm comprenant à titre de phase stationnaire une résine hydrophile échangeuse d'anions fonctionnalisée par des groupements ammonium quaternaires, et de granulométrie de 10 μπι ;
o en utilisant à titre de première phase mobile d'élution des peptides cationiques et des peptides neutres, un tampon (C) aqueux Tris 5 mM à pH 8,35 pendant une durée de 7 minutes à compter de l'introduction en tête de colonne de la composition à analyser, puis une deuxième phase mobile d'élution des peptides anioniques dans laquelle le rapport du volume d'un tampon (D) formé de Tris 5mM, NaCt 5 M à pH 8,35 sur le volume de tampon (C ) augmente linéairement de 0 % à 100 % en 30 minutes ;
o avec un débit de la phase mobile de 1 mL/min dans la colonne ;
o l'analyse étant réalisée à une température de 25 °C, et ;
o avec une détection par absorbance à la longueur d'onde de 214 nm en sortie de colonne
5/- Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les peptides présentent lors d'une analyse d'hydrophobie par chromatographie liquide en phase inverse, un temps de rétention compris entre 16 min et 36 min ;
ladite analyse d'hydrophobie étant réalisée dans les conditions ci-après :
o en utilisant une colonne de chromatographie de dimensions 250 x 4,6 mm présentant une phase stationnaire formée de silice greffée par des groupements butyle, d'une valeur de granulométrie de 5 μπι et d'une valeur de porosité de 300 A ;
o en utilisant à titre de première phase mobile d'élution des peptides hydrophiles, une solution (E) d'acide trifluoroacétique à 0,1% dans l'eau ultrapure pendant une durée de 7 minutes à compter de l'introduction en tête de colonne de la composition à analyser, puis une deuxième phase mobile d'élution des peptides hydrophobes dans laquelle le rapport du volume d'une solution (F) d'acide trifluoroacétique à 0,1% dans l'eau comprenant 40% d'acétonitrile sur le volume de la solution (E) augmente linéairement de 0 % à 40 % en 30 minutes ;
o avec un débit de la phase mobile de 0,6 mL/min dans la colonne ; o l'analyse étant réalisée à une température de 40°C, et ;
o avec une détection par absorbance à la longueur d'onde de 214 nm en sortie de colonne.
6/- Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est à l'état liquide.
11- Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est solide à l'état divisé. 8/- Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est exempte d'hydrate de carbone.
91- Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est exempte de matière grasse.
10/- Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les peptides de la composition sont hydrosolubles.
11/- Composition selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que les peptides de la composition sont issus d'une hydrolyse enzymatique contrôlée de collagène de peau d'au moins un poisson choisi dans le groupe formé des poissons de la famille des Pangasiidae et de la famille des Cichlidae.
12/- Composition selon l'une des revendications 1 à 11 pour son utilisation à titre de médicament.
13/- Composition selon la revendication 12, pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie digestive.
14/- Composition selon l'une des revendications 11 ou 12, pour son utilisation dans le traitement d'une candidose intestinale.
15/- Composition selon l'une des revendications 11 ou 12, pour son utilisation dans le traitement d'une inflammation digestive.
16/- Composition selon l'une des revendications 11 ou 12, pour son utilisation dans le maintien du microbiote intestinal.
17/- Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 11, en alimentation humaine.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11028148B2 (en) 2017-09-28 2021-06-08 Geltor, Inc. Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof
US11168126B2 (en) 2019-04-12 2021-11-09 Geltor, Inc. Recombinant elastin and production thereof
US11174300B2 (en) 2020-01-24 2021-11-16 Geltor, Inc. Animal-free dietary collagen

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3058142B1 (fr) * 2016-10-28 2023-11-24 Gelatines Weishardt Composition de peptides de collagene de peau de poisson et son utilisation a titre de medicament
CN109602896A (zh) * 2019-01-11 2019-04-12 无限极（中国）有限公司 一种胶原蛋白肽和弹性蛋白肽的组合物及其制备方法和应用
CN111220720B (zh) * 2019-12-05 2022-07-22 上海上药第一生化药业有限公司 胰蛋白酶及其酶原的纯度检测方法
CN114053165B (zh) * 2020-08-06 2023-10-20 大江生医股份有限公司 生物活性物质用于制备改善皮肤状态的组合物的用途
TWI788003B (zh) * 2020-08-21 2022-12-21 大江生醫股份有限公司 生物活性物質用於製備改善毛孔及皺紋的組合物的用途
TWI743960B (zh) 2020-08-21 2021-10-21 大江生醫股份有限公司 生物活性物質用於製備提升細胞粒線體活性的組合物的用途
CN114073756B (zh) * 2020-08-21 2024-04-16 大江生医股份有限公司 生物活性物质用于制备抗老化的组合物的用途
CN114740105B (zh) * 2022-03-17 2023-11-07 重庆医药高等专科学校 一种脯氨酸和n-甲基脯氨酸的液相色谱分离检测方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2720067A1 (fr) 1994-05-17 1995-11-24 Dielen Lab Hydrolysat de protéines d'animaux marins, procédé d'obtention et applications.
WO2007090504A1 (fr) * 2006-02-10 2007-08-16 Masterfam, S.L. Collagene hydrolyse et ses utilisations
WO2010074552A1 (fr) * 2008-12-23 2010-07-01 Universiti Putra Malaysia (Upm) Extraction de collagène d'animaux aquatiques

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5308619B2 (ja) * 2006-06-05 2013-10-09 株式会社アドバンス 健康食品
KR101095698B1 (ko) * 2006-11-15 2011-12-20 가부시키가이샤 메이지 콜라겐 펩티드 조성물 및 이것을 함유하는 음식품
DE102007002295A1 (de) * 2007-01-09 2008-07-10 Gelita Ag Nahrungsmittelprodukt auf Proteinbasis und Verfahren zur Herstellung
JP2009280508A (ja) * 2008-05-20 2009-12-03 Hikari Ishii 血管老化抑制剤および老化防止抑制製剤
US20120040055A1 (en) * 2009-04-28 2012-02-16 Meiji Co., Ltd. Collagen peptide composition having good ability to enter the blood and food or beverage containing the same
US20140296151A1 (en) * 2011-10-14 2014-10-02 Council Of Scientific And Industrial Research Peptides from fish gelatine
FR3058142B1 (fr) * 2016-10-28 2023-11-24 Gelatines Weishardt Composition de peptides de collagene de peau de poisson et son utilisation a titre de medicament

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2720067A1 (fr) 1994-05-17 1995-11-24 Dielen Lab Hydrolysat de protéines d'animaux marins, procédé d'obtention et applications.
WO2007090504A1 (fr) * 2006-02-10 2007-08-16 Masterfam, S.L. Collagene hydrolyse et ses utilisations
WO2010074552A1 (fr) * 2008-12-23 2010-07-01 Universiti Putra Malaysia (Upm) Extraction de collagène d'animaux aquatiques

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOONPICHARN SADABPONG ET AL: "Identification of bioactive peptide fromOreochromis niloticusskin gelatin", JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, SPRINGER (INDIA) PRIVATE LTD, INDIA, vol. 53, no. 2, 14 November 2015 (2015-11-14), pages 1222 - 1229, XP035965845, ISSN: 0022-1155, [retrieved on 20151114], DOI: 10.1007/S13197-015-2091-X *
E. S. KIMBALL; N. H. WALLACE; C. R. SCNNEIDER; M. R. D'ANDREA; P. J. HORNBY, NEUROGASTROENTEROL MOTIL, vol. 16, 2004, pages 811 - 818
JIANG LIANG ET AL: "The Protective Effects of Long-Term Oral Administration of Marine Collagen Hydrolysate from Chum Salmon on Collagen Matrix Homeostasis in the Chronological Aged Skin of Sprague-Dawley Male Rats", JOURNAL OF FOOD SCIENCE, vol. 75, no. 8, 24 September 2010 (2010-09-24), US, pages H230 - H238, XP055437801, ISSN: 0022-1147, DOI: 10.1111/j.1750-3841.2010.01782.x *
RAMADASS SATIESH KUMAR ET AL: "Type I collagen and its daughter peptides for targeting mucosal healing in ulcerative colitis: A new treatment strategy", EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 91, 13 May 2016 (2016-05-13), pages 216 - 224, XP029637499, ISSN: 0928-0987, DOI: 10.1016/J.EJPS.2016.05.015 *
STEPHEN A KLOTZ1J2 ET AL: "Gelatin fragments block adherence of Candida albicans to extracellular matrix proteins", MICROBIOLOGY, 1 January 1995 (1995-01-01), pages 2681 - 2684, XP055397427, Retrieved from the Internet <URL:http://www.microbiologyresearch.org/docserver/fulltext/micro/141/10/mic-141-10-2681.pdf?expires=1502272970&id=id&accname=guest&checksum=2E6345737127ABFE65B175E4B7B8BBFD> *
ZHANG YUFENG ET AL: "Purification and characterization of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of tilapia (Oreochromis niloticus) skin gelatin", PEPTIDES (NEW YORK), vol. 38, no. 1, November 2012 (2012-11-01), pages 13 - 21, XP002772867 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11028148B2 (en) 2017-09-28 2021-06-08 Geltor, Inc. Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof
US11041015B2 (en) 2017-09-28 2021-06-22 Geltor, Inc. Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof
US11180541B2 (en) 2017-09-28 2021-11-23 Geltor, Inc. Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof
US11214609B2 (en) 2017-09-28 2022-01-04 Geltor, Inc. Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof
US11168126B2 (en) 2019-04-12 2021-11-09 Geltor, Inc. Recombinant elastin and production thereof
US11174300B2 (en) 2020-01-24 2021-11-16 Geltor, Inc. Animal-free dietary collagen
US11332505B2 (en) 2020-01-24 2022-05-17 Geltor, Inc. Animal-free dietary collagen

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