WO2018056665A2 - 액상 플라즈마를 포함하는 아토피 또는 건선 치료용 조성물 - Google Patents

액상 플라즈마를 포함하는 아토피 또는 건선 치료용 조성물 Download PDF

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WO2018056665A2
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이윤상
이명훈
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    • H05H2240/00—Testing
    • H05H2240/20—Non-thermal plasma

Definitions

  • the present invention relates to atopic or psoriasis treatment composition comprising a liquid plasma. More specifically, the present invention provides a method for producing a liquid plasma for the prevention or treatment of atopic dermatitis, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of atopic dermatitis using the liquid plasma prepared by the method, and atopic composition using the liquid plasma A method for preventing or treating dermatitis. The present invention also relates to a method for producing a liquid plasma for preventing or treating psoriasis, a pharmaceutical composition for preventing or treating psoriasis using a liquid plasma prepared by the method, and a method for preventing or treating psoriasis using the liquid plasma. .
  • Atopic dermatitis a typical atopic dermatitis, is a chronic and chronic dermatitis accompanied by severe itching and secondary infections. It is present in westerners and about 10% of children suffer from this disease. have. In Korea, atopic dermatitis is rapidly increasing, but the treatment is not easy and the cause is not known, and most of them rely on symptomatic treatment. Recently, it is known that atopic dermatitis is caused by immunological abnormalities, and new treatments have been attempted accordingly.
  • Allergic disease type 1 hypersensitivity
  • IgE class antibody an antigen-specific IgE class antibody
  • Atopy also means a specific constitution reaction.
  • Atopic dermatitis includes allergic rhinitis, asthma, food allergy, and atopic dermatitis.
  • Th cells responsible for immune function in the human body are Th1 and Th2, which are balanced with each other and secrete substances that inhibit each other's function.
  • Th2 cells which are balanced with each other and secrete substances that inhibit each other's function.
  • patients with atopic dermatitis have more Th2 cells than Th1, resulting in an imbalance between them.
  • the secretion of allergic eosinophils and interleukin (IL) -4, IL-5, IL-10, etc. in Th2 cells increases, whereas inhibition of IgE production in Th1 cells The secretion of the substance is reduced. This increased IgE activates basophils and mast cells.
  • IL interleukin
  • an IgE antibody binds to an IgE receptor (Fc ⁇ RI) and an allergen cross-links two Fc ⁇ RI / IgE conjugates to activate cells, degranulation of intracellular granules occurs.
  • physiologically active substances such as histamine and leukotriene are secreted out of the cell, causing atopic dermatitis symptoms such as strong pruritus, erythema, edema, and inflammation (Cellular and Molecular Immunology, Abbas et al., 2nd Edition, Saunders, Phildelphia, Journal of Dermatological Science, 36, 1-9, 2004).
  • drugs such as steroids and antihistamines are used to treat atopic dermatitis
  • immunosuppressive agents are used in severe cases.
  • these drugs have many problems due to their temporary effects, severe side effects such as osteoporosis, avascular necrosis, arteriosclerosis, glaucoma, and the possibility of carcinogenesis. Therefore, in order to alleviate and treat atopic dermatitis, it is urgently needed to develop a new therapeutic agent having a good therapeutic effect, fewer side effects, and a continuous therapeutic effect.
  • NF-kB activates the gene expression mechanism that causes inflammation, which is involved in the immune response or inflammatory response (TNF (tumor necrosis factor), IL-1 (interleukin-1), IL-6, IL-8, GM-CSF) , Inos (inducible nitric oxide synthase), ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), E-selectin, MHC class I, II molecules, etc. It is known as a transcription factor to increase the expression. Therefore, NF-kB activity regulation can be usefully used for the treatment of chronic and acute inflammatory diseases, and NF-kB inhibitors are expected to have a therapeutic effect on atopic dermatitis.
  • TNF tumor necrosis factor
  • IL-1 interleukin-1
  • IL-6 interleukin-6
  • IL-8 GM-CSF
  • Inos inducible nitric oxide synthase
  • ICAM-1 intercellular adhesion molecule 1
  • E-selectin intercellular adhesion
  • Psoriasis is an immune-mediated autoimmune skin disease induced by chronic activation of inflammatory cell infiltration in the skin and dysregulation of epidermal keratinocytes. Histologically, psoriasis is considered to be thickening and scaling of the epidermis and hyperproliferative parakeratosis in skin biopsy. Yet, the pathogenesis of psoriasis has not been fully elucidated, and has been reported to be related to a complex mechanism involving the interaction between inflammatory cytokines and immune cell infiltration such as T cells. ) And Th17-mediated cytokines such as IL-17A, IL-22 and IL-23 have been reported to induce psoriasis triggers.
  • Topical treatments are therapies including steroids, coal tar, anthraline, vitamin D3 and analogs thereof, retinoids and sunburn, and the like, which have the side effects of skin thinning, stretch marks, burns, irritation and photosensitivity.
  • steroids can induce resistance, affecting subsequent steroid treatment.
  • Phototherapy involves the administration of soralene with ultraviolet B or ultraviolet A, with the disadvantage that the skin ages quickly and the incidence of skin cancer is increased.
  • Internal administration is the administration of immunomodulators such as cyclosporin and is currently the most used method.
  • the present invention is to solve the problems of psoriasis treatment, and to develop a treatment that can effectively treat psoriasis has been the subject of a major problem, and research has been made, but there is no known effective treatment.
  • the low temperature atmospheric plasma refers to a plasma in which the energy of the ions and electrons of the plasma is greater than the energy possessed by the ions, and is also referred to as a low temperature atmospheric pressure plasma.
  • low-temperature plasma is generated when the high-pressure electric discharge in the exhaust gas causes electrons generated by the discharge to collide with the molecules of the exhaust gas to change the outer electron state of the gas molecules.
  • OH, COOH, CHO, etc. excitation molecules, and ions are charged positively or negatively to become an electrically neutral gas.
  • Plasma is classified into a high temperature thermal plasma having high electron, ion, and molecular temperature, and a low temperature plasma having only electron temperature.
  • the high temperature thermal plasma can be used to melt the material to obtain a high temperature, and the low temperature plasma can be applied to materials or conditions that cannot be applied to high temperature because only the temperature of the electron is high, and the device has a simple advantage. Since such plasmas induce various chemical reactions, many studies have been made to apply them to various fields. However, it is not yet known how to treat psoriasis using it.
  • the present invention relates to atopic or psoriasis treatment composition comprising a liquid plasma, the liquid plasma of the present invention is remarkably effective in suppressing an overactive immune response, and the effect of inhibiting the production and proliferation of psoriasis is remarkable, atopic It is expected to be greatly utilized for the prevention and treatment of immune hypersensitivity reactions and psoriasis including dermatitis.
  • the present invention has been made to solve the problems of the prior art, and relates to a composition for treating atopic or psoriasis containing a liquid plasma.
  • the present inventors have made intensive efforts to solve the problems of conventional atopic dermatitis and to develop a method for the fundamental treatment of atopic dermatitis, thereby completing a liquid plasma that can prevent or treat atopic dermatitis by inhibiting the activity of mast cells. It came to the following.
  • the present invention provides a method of producing a liquid plasma for the prevention or treatment of atopic dermatitis, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of atopic dermatitis using the liquid plasma prepared by the method, and the prevention of atopic dermatitis using the liquid plasma or It is an object to provide a treatment method.
  • Liquid plasma according to the present invention can inhibit the activity of mast cells important for allergic reactions and various immune hypersensitivity elements such as STAT6 and NF-kB. Therefore, it is expected that the liquid plasma according to the present invention can be effectively used for the prevention or treatment of atopic dermatitis.
  • liquid plasma of the present invention is remarkably effective in suppressing the generation and proliferation of psoriasis.
  • the present invention provides a method for producing a liquid plasma for the prevention or treatment of atopic dermatitis or psoriasis, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of atopic dermatitis or psoriasis using the liquid plasma prepared by the method, and the method
  • An object of the present invention is to provide a method for preventing or treating atopic dermatitis or psoriasis using liquid plasma.
  • psoriasis is a erythematous skin lesion covered with a clear border of silvery white scale (the gray-white matter from dead skin cells), mainly elbows, knees, hips, scalp, etc. Occurs in areas of high irritation.
  • Pulmonary papules (a pulmonary rash) appear on the skin during skin disease, plaque, pustules, deprived psoriasis, psoriatic arthritis and various clinical manifestations. It is an inflammatory skin disease. According to the shape of the lesion can be further divided into plaque, interrogation, water droplets, pustules, erythematosis.
  • platelet psoriasis is most commonly observed as a representative clinical form of psoriasis.
  • Individual lesions have a clear circumference and border, reddish, covered with silver-white scales, and common areas are elbows, knees, hips, scalp, etc., which occur symmetrically.
  • Chronic plaque cases are called psoriasis vulgaris.
  • Interrogative psoriasis rarely occurs when psoriasis occurs in areas where the skin overlaps, such as in the armpits and groin, and is also called oyster psoriasis or inverted psoriasis.
  • Diffuse psoriasis develops rapidly after tonsillitis caused by streptococcus, with small droplets of 0.5-1.5 cm in size spread throughout the body. Patients' blood tests may increase the levels of antibodies to streptococcal toxin (ASO).
  • Pulmonary psoriasis is an acute form of psoriasis that is rarely seen, including local pulmonary psoriasis with pustules on the hands and soles, and systemic pulmonary psoriasis with the whole body. In the case of acute systemic molding, there are systemic symptoms such as chills, high fever, malaise, joint pain, and leukocytosis.
  • psoriasis scleroderma is a form of acute psoriasis that is accompanied by erythema and sulcus over the entire skin. Severe droughts are sometimes called deprived psoriasis. Severe symptoms tend to be more itchy and invasive to the face. Psoriatic arthritis is observed in 5-10% of patients with psoriasis. Asymmetrically invading one or a few joints, invading the distal interphalangeal joint, symmetrically causing arthritis, or arthritis mutilans resulting in severe deformation of the joint , Spondylitis and other clinical forms. In addition, most psoriasis patients are accompanied by an early nail lesion.
  • psoriasis activates psoriasis-related T lymphocytes by stimulation of psoriasis antigens in people with a genetic predisposition to psoriasis, and the resulting cytokines induce hyperplasia of keratinocytes.
  • CLA + T lymphocytes specific to the skin are continuously introduced into the skin lesion and generated. Therefore, psoriasis lesions are classified as chronic lymphocytic mediated autoimmune diseases.
  • T lymphocyte-mediated skin disease can be used in the same sense, and the T lymphocyte-mediated skin disease is systemic lupus erythematosus, cutaneous lupus erythematosus (cutaneous). It is preferably one or more selected from the group consisting of lupus erythematosus, scleroderma, psoriasis, dermatomyositis, and chronic dermatitis, but is not limited thereto.
  • non-thermal atmospheric pressure plasma refers to an ionized gas that satisfies Debye shielding. This, along with the three basic states of matter, gas, liquid, and solid, is considered to be another state and is expressed in the fourth state.
  • the neutral gas is phase-transferred into the plasma by an external voltage, and electrons and cations may be generated by excitation and ionization of the neutral gas, and radicals in which molecular gas is excited may exist.
  • a known plasma generating apparatus can be used without limitation, and preferably using nitrogen gas, but is not limited thereto.
  • liquid type plasma refers to generating a high-density high-energy plasma in a liquid, to be produced by exposure to atmospheric nonthermal plasma (NTP) at atmospheric pressure Can be.
  • NTP atmospheric nonthermal plasma
  • liquid plasma may be used interchangeably with the term “plasma-conditioned liquid material” and the term “liquid material” may be used without limitation in the form of a liquid, but preferably Preferably water, saline, buffer, or medium, most preferably medium.
  • the liquid plasma of the present invention can be supplied in the form of a liquid composition, it is convenient to distribute and carry, and it is possible to simultaneously provide moisturizing and treatment in atopic and psoriasis in which moisturization is important.
  • moisturizing and treatment in atopic and psoriasis in which moisturization is important.
  • there is less cell damage than the plasma treatment directly on the atopy or psoriasis skin there is no risk of skin damage, such as burns caused by the wrong operation of the user, there is an advantage that can be uniformly applied to a wide and curved area.
  • culture media means a medium capable of supporting cell growth and survival in vitro, and is conventionally used in the art suitable for culturing cells. Include all media. Depending on the type of cells, medium and culture conditions can be selected.
  • the basal medium used for culturing the cells is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), and generally includes a carbon source, a nitrogen source and a trace element component.
  • CCMM cell culture minimum medium
  • Such cell culture basal mediums include, for example, Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI1640, F-10, Mini essential Essential (G-12), and Glasgow's. Minimal essential medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, but are not limited to these.
  • treatment refers to any action that improves or advantageously changes the symptoms of atopic dermatitis or psoriasis and the resulting diseases by using the liquid plasma according to the present invention.
  • Those skilled in the art to which the present application belongs will be able to determine the exact criteria of atopic dermatitis or psoriasis, and determine the degree of improvement, improvement and treatment with reference to the data presented by the Korean Medical Association.
  • prevention means any action that inhibits or delays the development of atopic dermatitis or psoriasis and other diseases thereby using the liquid plasma according to the present invention. It will be apparent to those skilled in the art that the compositions herein having a therapeutic effect on atopic dermatitis or psoriasis can be prevented using the liquid plasma according to the present invention before the initial symptoms or symptoms of atopic dermatitis or psoriasis appear.
  • the term "pharmaceutical composition” means a composition to be administered for a specific purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a liquid plasma prepared by irradiating a plasma to a liquid substance as an active ingredient, and may include a protein and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent involved therein.
  • Said "pharmaceutically acceptable" carrier or excipient means that which has been approved by the governmental regulatory authority, or listed in government or other generally approved pharmacopoeia for use in vertebrates, and more particularly in humans. do.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may be in the form of suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous carriers, and may be prepared in the form of solids or semisolids.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may include formulating agents such as suspending, stabilizing, dissolving and / or dispersing agents and may be sterilized.
  • the pharmaceutical composition may be stable under the conditions of manufacture and storage, and may be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria or fungi.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be in sterile powder form for reconstitution with a suitable carrier prior to use.
  • the pharmaceutical compositions may be in unit-dose form, in microneedle patches, in ampoules, or in other unit-dose containers, or in multi-dose containers.
  • the pharmaceutical composition may be stored in a freeze-dried (freeze-dried) state, which requires the addition of a sterile liquid carrier, eg, water for injection just before use.
  • a sterile liquid carrier eg, water for injection just before use.
  • Immediately injectable solutions and suspensions may be prepared as sterile powders, granules or tablets.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be formulated or included in the form of microspheres in a liquid.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may comprise their pharmaceutically acceptable compounds and / or mixtures at concentrations between 0.001 and 100,000 U / kg.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may include suitable excipients, preservatives, suspending agents, additional stabilizers, dyes, buffers, antibacterial agents, antifungal agents, and isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride.
  • suitable excipients such as used herein, the term "stabilizer” refers to a compound that is optionally used in the pharmaceutical compositions of the present invention to increase shelf life.
  • the stabilizer can be a sugar, an amino acid, or a polymer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, and the carrier may be a solvent or a dispersion medium.
  • pharmaceutically acceptable carriers include water, saline, ethanol, polyols (eg glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols), oils, and suitable mixtures thereof.
  • sterilization techniques applied to the pharmaceutical compositions of the present invention include filtration through bacteria-inhibiting filters, terminal sterilization, incorporation of sterile preparations, irradiation, sterile gas irradiation, heating, vacuum drying and freeze drying. do.
  • administration means introducing the composition of the present invention to a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the present invention may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • the composition is most preferably provided in the form of an application on the skin or subcutaneous or intradermal injection, but is not limited thereto.
  • the method of treatment of the present invention may comprise administering the pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount.
  • the effective amount is defined as the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type and formulation of the patient and the age, body weight, general health condition, sex and diet, time of administration, route of administration And various factors, including the rate of secretion of the composition, the duration of treatment, and the drugs used concurrently.
  • the method for preparing a liquid plasma for preventing or treating allergic diseases wherein the carrier gas in step (a) is nitrogen, helium, argon, And it provides a liquid plasma manufacturing method for the prevention or treatment of allergic diseases of any one or more selected from the group consisting of oxygen, wherein the irradiation in step (b) is 5 to a distance of 0.1cm to 15cm from the surface of the liquid material It provides a method for producing a liquid plasma for the prevention or treatment of allergic diseases, characterized in that performed for 30 minutes to 30 minutes, wherein the liquid substance in step (c) is water, saline, buffer, or allergic medium It provides a method for producing a liquid plasma for the prevention or treatment of diseases, wherein the allergic diseases are allergic rhinitis (Allergic Rhinitis), asthma (Asthma) ), A food allergy, or Atopic Dermatitis, a method for producing a liquid plasma for preventing or treating an allergic disease.
  • the carrier gas in step (a) is nitrogen, helium,
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases comprising a liquid plasma prepared by any one or more of the above methods as an active ingredient, wherein the pharmaceutical composition is an oral formulation, parenteral formulation Or it provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases, characterized in that the topical formulation, the pharmaceutical composition alone or methods for using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases, characterized in that it is used in combination with, the allergic diseases are allergic rhinitis (Allergic Rhinitis), asthma (Asthma), food allergy, or atopy Provided is a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of allergic diseases, which are Atopic Dermatitis.
  • a method for preventing or treating an allergic disease comprising administering any one or more of the pharmaceutical composition to the subject, wherein the allergic disease is allergic rhinitis (Allergic Rhinitis),
  • the allergic disease is allergic rhinitis (Allergic Rhinitis)
  • the methods of preventing or treating allergic diseases such as asthma, food allergy, or atopic dermatitis.
  • the present invention there is provided a use for the prevention or treatment of allergic diseases of any one or more of the pharmaceutical composition, wherein the allergic disease is Allergic Rhinitis, Asthma, Food allergy ( Food Allergy), or Atopic Dermatitis, for the prophylaxis or treatment of allergic diseases.
  • the allergic disease is Allergic Rhinitis, Asthma, Food allergy ( Food Allergy), or Atopic Dermatitis, for the prophylaxis or treatment of allergic diseases.
  • the method comprises the steps of: (a) filling a plasma generating apparatus with a carrier gas; (b) generating a plasma by supplying a voltage of 5 kV to 20 kV and a frequency of 10 to 30 kHz to the plasma generator; And (c) irradiating the generated plasma to a liquid substance.
  • a liquid plasma manufacturing method for preventing or treating T lymphocyte-mediated skin disease wherein the carrier gas in step (a) is nitrogen or helium. It provides a liquid plasma manufacturing method for the prevention or treatment of T lymphocyte-mediated skin disease, which is at least one selected from the group consisting of argon, and oxygen, wherein the irradiation in step (b) is 0.1 cm from the surface of the liquid material.
  • It provides a liquid plasma manufacturing method for the prevention or treatment of T lymphocyte-mediated skin disease, characterized in that it is carried out for 5 minutes to 120 minutes at a distance of 15 to 15 cm, wherein the liquid substance in step (c) is water, It provides a method for producing a liquid plasma for the prevention or treatment of saline, buffer, or medium for lymphocyte-mediated skin diseases, and mediating the T lymphocyte mediation.
  • Skin diseases are composed of systemic lupus erythematosus, cutaneous lupus erythematosus, scleroderma, psoriasis, dermatomyositis, and chronic dermatitis. It provides a liquid plasma production method for the prevention or treatment of any one or more T lymphocyte-mediated skin diseases selected from.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of T lymphocyte-mediated skin diseases comprising a liquid plasma prepared by any one or more of the above methods as an active ingredient, wherein the pharmaceutical composition is an oral dosage form. It provides a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of T lymphocyte-mediated skin disease, characterized in that the parenteral formulation or topical formulation, the pharmaceutical composition alone or surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of T lymphocyte-mediated skin disease, characterized in that it is used in combination with methods using a reaction modulator, the T lymphocyte-mediated skin disease is systemic lupus erythematosus, Cutaneous lupus erythematosus, scleroderma, psoriasis, dermatitis It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of T lymphocyte-mediated skin disease, which is at least one selected from the group consisting of omyositis, and chronic dermatitis
  • a method for preventing or treating T lymphocyte-mediated skin disease comprising administering any one or more of the pharmaceutical compositions to the subject, wherein the T lymphocyte-mediated skin disease is erythematous Any one selected from the group consisting of systemic lupus erythematosus, cutaneous lupus erythematosus, scleroderma, psoriasis, dermatomyositis, and chronic dermatitis
  • erythematous Any one selected from the group consisting of systemic lupus erythematosus, cutaneous lupus erythematosus, scleroderma, psoriasis, dermatomyositis, and chronic dermatitis
  • Provided is a method for preventing or treating T lymphocyte-mediated skin disease.
  • the pharmaceutical composition of any one or more of the above provides a use for the prevention or treatment of T lymphocyte-mediated skin disease, wherein the T lymphocyte-mediated skin disease is systemic lupus erythematosus, skin T lymphocyte-mediated dermatosis, which is at least one selected from the group consisting of cutaneous lupus erythematosus, scleroderma, psoriasis, dermatomyositis, and chronic dermatitis It provides a prophylactic or therapeutic use.
  • the present invention relates to atopic or psoriasis treatment composition
  • atopic or psoriasis treatment composition comprising a liquid plasma
  • the liquid plasma of the present invention is remarkably effective in suppressing an overactive immune response, and the effect of inhibiting the production and proliferation of psoriasis is remarkable, atopic It is expected to be greatly utilized for the prevention and treatment of immune hypersensitivity reactions or psoriasis including dermatitis.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of H & E staining of the skin tissue of atopic dermatitis causing factor and / or plasma treated NC / Nga mouse according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the result of toluidine blue staining the skin tissue of atopic dermatitis inducing factor and / or plasma treated NC / Nga mouse according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of EPX staining skin tissue of atopic dermatitis causing factor and / or plasma treated NC / Nga mouse according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of confirming the expression level of p-STAT6 in HaCaT cells stimulated with IL-4 and liquid plasma treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of confirming the expression level of IL-6 in mast cells stimulated with PMA and A23187 and liquid plasma treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a view showing the results of confirming the expression level of TNF- ⁇ in mast cells treated with PMA and A23187 and liquid plasma treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing the results confirmed that the activity of NF-kB is inhibited in mast cells treated with PMA and A23187 and liquid plasma treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a time frame for IMQ and / or NTP processing to verify the psoriasis treatment efficacy of plasma according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing changes in the stratum corneum formation of mouse skin treated with IMQ and / or NTP according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing that vehicle cream and / or nitrogen gas of IMQ does not significantly affect the formation of stratum corneum of mouse skin, according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 11A to 11E are diagrams illustrating that NTP treatment does not significantly affect inflammatory response factors of mouse skin, according to an embodiment of the present invention.
  • 12A to 12D are diagrams illustrating changes of infiltration amount of CD4 + T cells, CD11c + cells, CD11b + cells, and Gr-1 + cells by IMQ stimulation and NTP treatment, according to an embodiment of the present invention.
  • 13A to 13E illustrate changes in expression levels of inflammatory response factors (IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, and CCL20) by IMQ stimulation and NTP treatment, according to an embodiment of the present invention. to be.
  • FIG. 14 is a view showing the degree of inhibition of differentiation of Th17 cells by IMQ stimulation and NTP treatment, according to an embodiment of the present invention.
  • 15A and 15B are schematic views illustrating a method of preparing LTP in comparison with NTP according to an embodiment of the present invention.
  • 16 is a view showing the degree of inhibition of the differentiation of Th17 cells when No LTP, LTP 30, or LTP 60 treatment according to an embodiment of the present invention.
  • 17 is a diagram showing the degree of inhibition of differentiation of Th1 cells during No LTP, LTP 30, or LTP 60 treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 is a diagram showing the degree of inhibition of the activity of BMDC by LTP treatment according to an embodiment of the present invention by expression of CD80, CD86 and MHC II.
  • 19A to 19E are diagrams showing the result of decreasing the expression of inflammatory cytokines by LTP treatment in TNF- ⁇ treated BMDCs according to an embodiment of the present invention.
  • 20A to 20E are diagrams showing the results of decreasing the expression of inflammatory cytokines by LTP treatment in LPS (Lipopolysaccharide) treated BMDC according to one embodiment of the present invention.
  • 21A to 21E are diagrams illustrating changes in gene expression of interleukin and cytokine by LTP treatment in HaCaT cells activated with TNF- ⁇ and IFN- ⁇ according to one embodiment of the present invention.
  • 22A to 22G show changes in gene expression of interleukin and cytokine by LTP treatment in LPS stimulated HaCaT cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 23a and 23b is a view showing a change in STAT3 activation (pSTAT3) by LTP treatment in IL-6 stimulated HaCaT cells according to an embodiment of the present invention.
  • 24A to 24C show changes in PD-L1 expression by LTP treatment in TNF- ⁇ and IFN- ⁇ , or LPS stimulated HaCaT cells according to one embodiment of the present invention.
  • p-STAT6 (ABcam), and STAT6 (Human keratinocyte cell line, HaCaT), and mast cells were used for western blotting. Protein expression level of cell signaling technology) was confirmed.
  • IL-4 is a hypersensitive activator and is known to promote inflammatory cytokines.
  • p-STAT6 the phosphorylation of transcription activator
  • LTP liquid plasma
  • NC / Nga mice (6 weeks old, male, Orient Bio, Korea) were randomly selected and treated as shown in Table 1.
  • the plasma treatment group the plasma generated by maintaining the gas flow rate of 10 L / min, the voltage of 15 kVp-p, and the frequency of 15 kHz was irradiated with a plasma generator using nitrogen (N2) gas as a non-thermal atmospheric plasma generation source.
  • N2 nitrogen
  • the skin tissue of the mice was obtained one day after the last treatment for histological analysis.
  • the obtained dorsal skin tissue was fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours, paraffin embedded and cut into 4.5 ⁇ m thickness, and the shape of the skin tissue was observed by H & E (hematoxylin and eosin) staining, and toluidine.
  • H & E hematoxylin and eosin
  • Invasion of mast cells in skin tissue was examined by toludine blue staining and eosinophil influx was observed by EPX (Eosinophil peroxidase) antibody (Santa Cruz Biotechnology) staining. The results were quantified and shown in FIGS. 1 to 3.
  • Example 1-2 Effect of Liquid Plasma Treatment on Atopic Dermatitis
  • HaCaT human keratinocyte cell line
  • mast cells were obtained from Korea Cell Line Bank
  • mast cells were obtained from C57BL / 6 mouse bone marrow cells at 37 ° C., 5% CO 2 in RPMI 1640 medium supplemented with mIL-3 (10 ng / ml) and mSCF (50 ng / ml).
  • mIL-3 10 ng / ml
  • mSCF 50 ng / ml
  • Liquid plasma was prepared by irradiating the plasma generated under the conditions of Example 1-1 to the culture medium (RPMI 1640 or DMEM) for 60 seconds per ml.
  • the HaCaT cells were replaced with a liquid plasma-treated culture medium, and then cultured for 1 hour, the HaCaT cells were stimulated with 30 ng / ml of IL-4 (interleukin-4), and after 15 minutes, cells were obtained. Loting confirmed the protein expression levels of p-STAT6 (ABcam), and STAT6 (Cell signaling Technology).
  • IL-4 is a hypersensitive activator and is known to promote inflammatory cytokines.
  • p-STAT6 a hypersensitive activator and is known to promote inflammatory cytokines.
  • p-STAT6 phosphorylation of transcription activator
  • LTP liquid plasma
  • Example 1-3 In atopic dermatitis plasma Direct processing and liquid phase plasma Comparison of the effects of treatment
  • plasma direct treatment The effect of the plasma direct treatment on the liquid plasma and the cells of the present invention was compared.
  • plasma direct treatment plasma was generated under the same conditions using the same plasma apparatus used in liquid plasma production, but the plasma was directly exposed to a culture dish in which epidermal cells are cultured.
  • Example 2-1 Confirmation of psoriasis treatment effect of non-thermal atmospheric plasma (NTP)
  • Example 2-1-1 Effect of Psoriasis Treatment on Animal Model by Non-thermal Atmospheric Plasma (NTP)
  • an animal model in which psoriasis was induced was applied to the back skin of a C57 / BL6 mouse with imiquimod (IMQ).
  • IMQ cream (sigma, USA) was applied per day to induce psoriasis-like skin, and on days 3 and 4, a voltage of 15 kV at a distance of 2 cm from the epidermis of the mouse Then, the skin tissues were analyzed by immunohistochemical staining by sacrifice of mice on day 5 after the non-thermal plasma was treated for 60 seconds using a plasma generator using a nitrogen gas as a carrier gas and a frequency of 15 kHz. The imiquimod and plasma-treated time frames are shown in FIG. 8.
  • mice treated with IMQ the thickness of the stratum corneum was significantly increased, causing psoriasis, but in the mice treated with IMQ and NTP, the thickness of the stratum corneum was reduced by more than 50% compared to the mice treated with IMQ only. .
  • the results are shown in FIG. The above results are shown in FIG. 10 to demonstrate the effect of the plasma effect.
  • Plasma treatment in normal mouse skin did not affect skin tissue, and mice treated with vehicle cream of IMQ only, or vehicle cream and nitrogen gas only, did not develop skin inflammation. Plasma treatment, however, has been shown to inhibit skin inflammation similar to IMQ-induced psoriasis.
  • Example 2-1-2 Specific heat atmospheric pressure To plasma (NTP) Inhibitory Effects of Immune Cell Infiltration on Animal Models
  • Example 2-1-1 the expression levels of inflammatory response factors (IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, and CCL20) were also compared, and these are shown in FIGS. 13A to 13E.
  • IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, and CCL20 inflammatory response factors
  • non-thermal plasma treatment can effectively alleviate psoriasis-like skin inflammation through the inhibition of gene expression of inflammatory cytokines and chemokines.
  • Example 2-1-3 Specific heat atmospheric pressure To plasma (NTP) In animal models Th17 Cell differentiation inhibitory effect
  • Th17 cells are known to be important for the pathogenesis of psoriasis.
  • the degree of differentiation of Th17 cells was analyzed by flow cytometry (FACS) in the same manner as in Example 2-1-1.
  • Example 2-2 Confirmation of psoriasis treatment effect of liquid plasma (LTP)
  • Example 2-1-1 The liquid plasma was irradiated with plasma generated under the conditions of Example 2-1-1 to culture medium (RPMI 1640 or DMEM) for 0 seconds (mL LTP) 30 seconds (LTP 30) or 60 seconds (LTP 60) per ml. It was prepared by the method.
  • the schematic diagrams of the non-thermal atmospheric plasma (NTP) and liquid plasma (LTP) treatments of Example 2-1 are shown in FIGS. 15A and 15B.
  • Example 2-2-2 Inhibitory Effect of Th17 Cell Differentiation by Liquid Plasma (LTP)
  • CD4 + T cells of C57 / BL6 normal mice were isolated to observe whether the differentiation of Th17 cells was inhibited by liquid plasma, and the separated cells were 10ng of anti-CD3.
  • / 17, 5ng / ml anti-CD28, 10ng / ml IL-6, 5ng / ml TGF- ⁇ , IFN- ⁇ antibody, and IL-4 antibody cultures were differentiated into Th17 cells.
  • the culture medium was No LTP, LTP 30, or LTP 60 was used.
  • the degree of differentiation of Th17 cells in each culture was observed through flow cytometry (FACS), and the results are shown in FIG. 16. As a result, it was confirmed that the differentiation of Th17 expressing IL-17 was performed in the non-plasma culture (No LTP), but the differentiation of Th17 was significantly suppressed in the plasma-treated cultures LTP 30 and LTP 60.
  • Example 2-2-3 Inhibition Effect of Th1 Cell Differentiation by Liquid Plasma (LTP)
  • Th1 cells were replaced with 10ng / ml CD4 + T cells, 5ng / ml anti-CD3, 5ng / ml anti-CD28 and IL- Differentiation was made into Th1 cells in RPMI1640 culture containing 12 10 ng / ml.
  • the culture medium was No LTP, LTP 30, or LTP 60 was used.
  • the degree of differentiation of Th1 cells in each culture was observed through flow cytometry (FACS), and the results are shown in FIG. 17.
  • Example 2-2-4 Inhibitory Effect of BMDC Cells by Liquid Plasma (LTP)
  • bone marrow derived dendritic cells BMDC
  • bone marrow cells of C57 / BL6 normal mice were isolated, and the isolated bone marrow cells were prepared as described above.
  • TNF- ⁇ (20 ⁇ g / ml) in the same culture as 2-2-2
  • CD80, CD86 and MHC II which are activation markers of dendritic cells
  • IL-6, IL-17, TNF- ⁇ , CXCL1, CCL20, PD-L1, and GAPDH were purchased from commercially available (Qiagen, Hilden, Germany), human IL-1 ⁇ , IL-8, IL-10, IFN- ⁇ , and TGF- ⁇ 1 primer sets were synthesized using the sequences shown in Table 2 below. GAPDH was used as a negative control.
  • Example 2-2-5 Liquid Plasma (LTP) Activated by Of the epithelial cell (HaCaT) Inflammation inhibitory effect confirmed
  • Example 2-2-6 Liquid Plasma (LTP) Activated by HaCaT BMDC Increased PD-1 Expression in Cells
  • PD-L1 expression in DC has been reported to inhibit T cell activation via PD-1 / PD-L1 binding. Therefore, it has been suggested that overexpression or high expression of PD-L1 may induce T cell inactivation and may be helpful in the treatment of autoimmune diseases in which CD4 + T cells are abnormally activated. Recently, it has been reported that administration of recombinant PD-L1 has improved skin inflammation induced by IMQ in mice.
  • liquid plasma treatment induces PD-L1 expression in HaCaT cells.
  • RNA levels of PD-L1 were increased in TNF ⁇ / IFN- ⁇ -stimulated, or LPS-stimulated HaCaT cells, and liquid plasma treatment in the stimulated cells further enhanced PD-L1 expression.
  • Example 2-3 Specific heat atmospheric pressure Plasma (NTP) Liquid Of plasma (LTP) psoriasis Comparison of treatment effects
  • Plasma direct treatment generates plasma under the same conditions using the same plasma apparatus used in liquid plasma production, but directly exposes the plasma to a culture dish in which HaCaT cells stimulated by TNF- ⁇ and IFN- ⁇ are incubated. Method was used.
  • the liquid plasma of the present invention is remarkably effective in alleviating the symptoms of atopic dermatitis
  • the liquid plasma of the present invention is a skin inflammatory disease including psoriasis. It was found to be remarkably effective in prevention and treatment.
  • the liquid plasma of the present invention Since the liquid plasma of the present invention has a remarkable effect of suppressing an overactive immune response and a remarkable effect of suppressing the generation and proliferation of psoriasis, the liquid plasma of the present invention will be widely used for the prevention and treatment of immune hypersensitivity or psoriasis including atopic dermatitis It is expected.

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Abstract

본 발명은 액상 플라즈마를 포함하는 아토피 또는 건선 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아토피성 피부염 또는 건선의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염 또는 건선의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염 또는 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

액상 플라즈마를 포함하는 아토피 또는 건선 치료용 조성물
본 발명은 액상 플라즈마를 포함하는 아토피 또는 건선 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 건선의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
대표적인 아토피성 피부질환인 아토피성 피부염은 심한 가려움과 이에 따른 2차 감염으로 염증을 동반하는 만성적이고 고질적인 피부염으로, 서구인에게 많아 약 10%의 어린이가 이 병으로 고생하고 있으며 근래에 점차 증가하고 있다. 한국에서도 아토피 피부염이 급격히 증가하고 있으나, 그 치료가 쉽지 않고 원인이 규명되지 않아, 대부분이 증상 치료에 의존하고 있는 실정이다. 최근 아토피 피부염이 면역학적 이상으로 유발된다는 것이 알려지면서 이에 따른 새로운 치료들이 시도되고 있다.
면역반응이 부적절하게 또는 과민하게 나타나는 것을 과민반응(Hypersensitivity)이라고 한다. 제1형 과민반응(Type1 Hypersensitivity)인 알러지성 질환은 항원특이적인 IgE급 항체에 의해 유도되는 반응으로, 같은 항원에 노출되더라도 사람에 따라 이 반응이 나타나지 않을 수도 있고 잘 나타날 수도 있기 때문에, 이 반응을 특이 체질반응이라는 뜻으로 아토피(Atopy)라고도 부른다. 아토피에는 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis) 등이 있다.
인체에서 면역기능을 담당하는 T-헬퍼(Th) 세포에는 Th1과 Th2가 있는데, 이들은 서로 균형을 이루고 있으며 서로의 기능을 억제하는 물질을 분비한다. 그러나, 아토피성 피부염 환자는 Th2 세포가 Th1에 비해 많아 이들간의 불균형을 초래한다. 즉, Th2 세포에서 알레르기에 관여하는 호산구와 IgE 항체를 증가시키는 인터루킨(Interleukin, IL)-4, IL-5, IL-10 등의 분비가 많아지게 되고, 반면에 Th1 세포에서 IgE의 생성을 억제하는 물질의 분비가 감소하게 된다. 이렇게 증가된 IgE에 의해 호염구와 비만세포(Mast Cell)이 활성화된다. IgE 항체가 IgE 수용체(FcεRI)에 결합하고 알러젠이 두개의 FcεRI/IgE 결합체를 교차 연결하여 세포를 활성화하면, 세포내 과립의 방출(Degranulation)이 나타난다. 이때, 히스타민, 류코트리엔 등과 같은 생리활성물질이 세포밖으로 분비되어 강한 소양감, 홍반, 부종, 염증 등의 아토피성 피부염 증상을 유발한다(Cellular and Molecular Immunology, Abbas et al., 2nd Edition, Saunders, Phildelphia, Journal of Dermatological Science, 36, 1-9, 2004).
현재 아토피성 피부염의 치료에는 스테로이드제와 항히스타민제 등의 약물이 많이 사용되고 있으며, 중증에는 면역 억제제가 사용되고 있다. 그러나, 이러한 약물은 대부분 그 효과가 일시적이고, 골다공증, 무혈성괴사, 동맥경화, 녹내장, 발암 가능성 등의 부작용이 심하여 많은 문제점을 가지고 있다. 따라서, 아토피성 피부염의 완화 및 치료를 위하여, 치료 효과가 좋고 부작용이 적으며 지속적인 치료 효과를 나타내는 새로운 치료제의 개발이 절실히 필요하다.
한편, NF-kB는 염증을 일으키는 유전자 발현 기구를 작동시켜 면역반응이나 염증반응에 관여하는 TNF(tumor necrosis factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, GM-CSF, Inos(inducible nitric oxide synthase), ICAM-1(intercellular adhesion molecule 1), E-selectin, MHC class I, II 분자 등의 발현을 증가시키는 전사인자로 알려져 있다. 따라서 NF-kB의 활성 조절이 만성 및 급성 염증 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, NF-kB 억제제는 아토피성 피부염 치료효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.
건선(psoriasis)은 피부에서 염증성 세포 침윤의 만성적 활성화와 표피 각질 세포의 조절 장애에 의해 유도된 면역-매개 자가면역 피부 질환이다. 조직학적으로, 건선은 피부 조직 검사에서 표피의 비후(thickening)와 인설(scaling), 및 과증식성 부전각화증(hyperproliferative parakeratosis)으로 여겨지고 있다. 아직, 건선의 발병 메커니즘이 완전히 규명되지는 않았으며, 염증성 사이토카인과 T 세포와 같은 면역 세포 침윤 간의 상호작용을 포함하는 복잡한 메커니즘과 관련되어 있는 것으로 보고되고 있으며, 최근 연구에서 Th17(T helper 17) 세포 및 IL-17A, IL-22 및 IL-23과 같은 Th17-매개 사이토카인이 건선 촉발을 유도한다고 보고되었다.
이러한 건선의 일반적인 치료에는 국소 투약, 광선 요법 및 내복 투약법이 있다. 국소 치료는 스테로이드, 콜타르, 안트랄린, 비타민 D3 및 그의 유사체, 레티노이드 및 햇볕 등을 포함하는 치료이며, 이러한 국소 치료는 피부 얇아짐, 튼살, 화상, 자극 및 광과민증의 부작용이 있다. 또한, 스테로이드는 내성을 유도할 수 있어 이후의 스테로이드 치료에 영향을 준다. 광선 요법은 자외선 B 또는 자외선 A와 함께 쏘랄렌의 투여를 포함하며, 피부가 빨리 노화되고, 피부암 발병률이 증가된다는 단점이 있다. 내복 투여는 사이클로스포린과 같은 면역조절제를 투여하는 것이고, 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이다. 하지만, 장시간 사용에 따른 신장독성(nephrotoxicity)이나 고혈압을 일으키는 문제점이 있다. 따라서, 현재 건선 치료가 갖는 문제점을 해결하고, 건선을 효과적으로 치료할 수 있는 치료법 개발이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 아직 효과적인 치료법에 대해서 알려진 바가 없다.
한편, 저온 대기압 플라즈마란 플라즈마를 구성하는 이온과 전자 중 전자가 갖는 에너지가 이온이 소유한 에너지보다 큰 상태의 플라즈마를 말하며, 저온 상압 플라즈마라고도 한다. 즉, 저온 플라즈마란 배출가스 중에서 고압의 전기방전을 행하면 방전에 의해 발생된 전자가 배출가스의 분자와 충돌하여 가스분자의 외곽 전자상태가 변하게 되어 생성되는 것으로, 반응성이 풍부한 화학적 활성종인 라디칼(예를 들면, OH, COOH, CHO 등), 여기분자, 이온이 양 또는 음으로 하전되어 전기적으로 중성상태의 가스가 되는 것을 말한다. 플라즈마는 전자, 이온, 분자의 온도가 모두 높은 고온 열플라즈마와 전자 온도만 높은 저온 플라즈마로 구분된다. 고온 열플라즈마는 고온을 얻을 수 있어 물질을 용융하는데 활용되고, 저온 플라즈마는 전자의 온도만 높기 때문에 고온을 적용할 수 없는 재료나 조건에 적용할 수 있고 장치가 간단한 장점이 있다. 이러한 플라즈마는 다양한 화학반응을 유기하므로 이를 활용하여 다양한 분야에 적용하기 위한 연구가 많이 이루어지고 있다. 그러나 아직까지 이를 이용하여 건선을 치료하는 방법에 대해서는 알려져 있지 않다.
이에 본 발명의 출원인들은 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 액상 플라즈마를 포함하는 아토피 또는 건선 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 과민성 면역반응을 억제하는 효과가 현저하고, 건선의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 아토피성 피부염을 포함하는 면역 과민반응 및 건선의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 액상 플라즈마를 포함하는 아토피 또는 건선 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 종래 아토피성 피부염 치료제 문제점을 해결할 수 있고 아토피성 피부염의 근본적인 치료를 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 비만세포의 활성을 억제 시킴으로써 아토피성 피부염을 예방 또는 치료할 수 있는 액상 플라즈마를 완성하기에 이르렀다. 본 발명은 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따른 액상 플라즈마는 STAT6 와 NF-kB 등 다양한 면역 과민반응 요소들과알러지 반응에 중요한 비만세포의 활성을 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 액상 플라즈마는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한 본 발명의 액상 플라즈마는 건선의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하다.
따라서 본 발명은 아토피성 피부염 또는 건선의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염 또는 건선의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염 또는 건선의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “건선(psoriasis)”이란, 경계가 분명한 은백색의 인설(각질이 죽어 생기는 회백색 물질(scale))로 덮여 있는 홍반성 피부 병변으로, 주로 팔꿈치, 무릎, 엉덩이, 두피 등 자극을 많이 받는 부위에 발생한다. 작은 구진(papule, 丘疹: 피부병의 증세 중 피부면에 나타나는 발진(發疹))에서부터 판상, 농포성, 박탈성 건선, 건선 관절염 등 다양한 임상 양상을 나타내고, 악화와 호전이 경우에 따라 반복되는 만성 염증성 피부 질환이다. 보다 병변의 형태에 따라 판상, 간찰부, 물방울양, 농포성, 홍피증 등으로 나눌 수 있다. 구체적으로, 판상건선은 건선의 대표적인 임상형으로 가장 흔히 관찰된다. 개개의 병변은 주위와 경계가 명확한 판상으로 붉은색을 띠며 은백색의 비늘로 덮여 있고, 흔히 발생하는 부위로는 팔꿈치, 무릎, 엉덩이, 두피 등이며 대칭적으로 발생한다. 만성적인 판상형인 경우를 심상성건선(psoriasis vulgaris)이라고 한다. 간찰부건선은 드물게 겨드랑이와 사타구니처럼 피부가 겹치는 부위에 건선이 발생하는 경우를 지징하고, 굴측건선, 또는 역건선이라고도 명명된다. 물방울양건선은 연쇄상구균에 의한 편도선염 후 0.5~1.5cm 크기의 작은 물방울 같은 구진이 전신에 산재되어 급속히 나타난다. 환자의 혈액검사에서 연쇄상구균 독소에 대한 항체(ASO) 수치가 증가할 수 있다. 농포성건선은 드물게 보는 건선의 급성 형태로 손, 발바닥에 농포가 나타나는 국소성농포성건선, 전신에 나타나는 전신성농포성건선이 있다. 급성 전신성형의 경우 오한, 고열, 권태감, 관절통 등의 전신증상이 있고, 백혈구증다증이 동반되기도 한다. 마지막으로 건선홍피증은 전신 피부에 걸쳐서 홍반과 인설이 동반되어 나타나는 급성 건선의 한 형태이다. 인설이 심한 경우를 박탈성건선이라고 부르기도 한다. 증상이 심하면 가려움증이 심하고 얼굴을 침범하는 경향이 있다. 건선관절염은 건선 환자의 5~10% 정도에서 관찰된다. 비대칭적으로 하나 또는 소수의 관절을 침범하는 형, 말단지관절(distal interphalangeal joint)을 침범하는 형, 대칭적으로 다발성의 관절염을 일으키는 형, 관절의 심한 변형을 초래하는 단절성관절염(arthritis mutilans) 형, 척추염형 등 여러 가지 임상 형태가 있다. 또한 건선 환자의 대부분에서 조갑 손발톱 병변이 동반되는 경우가 많다.
현재까지 축적된 연구결과에 의하면 건선은 건선에 대한 유전적 발병인자를 갖고 있는 사람에서 건선항원의 자극에 의해 건선관련 T림프구가 활성화되고, 그에 따라 생성된 사이토카인이 각질형성세포의 과증식을 유도하고, 피부에 특이적인 CLA+ T림프구들이 지속적으로 피부병변으로 유입되어 생성되는 것으로 이해되고 있다. 따라서 건선 병변을 만성화되는 T림프구 매개성 자가면역질환으로 분류한다. 상기 T림프구 매개성 자가면역질환의 피부 영역으로서, T림프구 매개성 피부질환이 동일한 의미로 사용될 수 있고, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 “비열 대기압 플라즈마(non-thermal atmospheric pressure plasma)”란, 디바이 차폐(Debye shielding)을 만족하는 이온화된 기체를 말한다. 이는 물질의 기본적인 세 가지 상태인 기체, 액체, 고체와 더불어 또 하나의 상태로 여겨지며 제 4상태로 표현된다. 본 발명에 따른 플라즈마는 외부 전압에 의해 중성 기체가 플라즈마로 상전이 하여 중성 기체의 여기, 이온화에 의하여 전자 및 양이온이 발생할 수 있고, 분자 가스가 여기된 라디칼이 존재할 수 있다. 상기 플라즈마 생성 장치는 본 발명의 목적에 따른 저온 대기압 플라즈마를 생성할 수 있다면, 공지된 플라즈마 생성 장치를 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 질소 가스를 사용하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 “액상 플라즈마(Liquid type plasma, LTP)”란, 고밀도 고에너지 플라즈마를 액체 속에서 발생시키는 것을 의미하며, 대기압의 상온 비열 플라즈마(nonthermal plasma, NTP)에 노출시켜 제조될 수 있다. 상기 용어 “액상 플라즈마”는 용어 “플라즈마 처리된 액상 물질(plasma-conditioned liquid material)"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 상기의 “액상 물질”은 액상 형태의 물질은 제한없이 사용 가능하나, 바람직하게는 물, 식염수, 완충액, 또는 배지이고, 가장 바람직하게는 배지이다.
본 발명의 액상 플라즈마는 액상 조성물의 형태로 공급 가능하므로 유통 및 휴대가 편리하고, 보습이 중요한 아토피 및 건선에 있어서 보습과 치료를 동시에 제공하는 것이 가능하다. 또한, 아토피 또는 건선 피부에 직접 플라즈마를 처리하는 것보다 세포 손상이 적고, 사용자의 잘못된 기기 조작에 의한 화상 등 피부 손상의 위험이 전혀 없으며, 넓고 굴곡된 면적에도 균일하게 도포 가능한 장점이 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “배지(culture media)”란, 인 비트로(in vitro)에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양조건을 선택할 수 있다. 세포의 배양에 사용되는 기본배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 기본 배지에는 예를 들면, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 “치료”란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 아토피성 피부염 또는 건선 및 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 아토피성 피부염 또는 건선의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구체예에서 “예방”이란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 아토피성 피부염 또는 건선 및 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 아토피성 피부염 또는 건선에 치료효과가 있는 본원의 조성물은 아토피성 피부염 또는 건선의 초기증상 또는 증상이 나타나기 전에 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에 있어서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 플라즈마를 액상 물질에 조사하여 제조한 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.
비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있고, 멸균될 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.
몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함할 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 추가적인 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 또는 폴리머일 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
본 명세서에 있어서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 약학조성물은 피부 위에 도포하거나 피하 또는 피내에 주사하는 형태로 제공되는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계; (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 13kV의 전압 및 15 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및 (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하고, 상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 5분 내지 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 약학조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하고, 상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 약학조성물의 알러지성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공하고, 상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인 알러지성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계; (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 5kV 내지 20kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및 (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하고, 상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 5분 내지 120분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 약학조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하고, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 약학조성물의 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 용도를 제공하고, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 액상 플라즈마를 포함하는 아토피 또는 건선 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 과민성 면역반응을 억제하는 효과가 현저하고, 건선의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 아토피성 피부염을 포함하는 면역 과민반응 또는 건선의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 아토피 피부염 유발 인자 및/또는 플라즈마 처리된 NC/Nga 마우스의 피부 조직을 H & E 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 아토피 피부염 유발 인자 및/또는 플라즈마 처리된 NC/Nga 마우스의 피부 조직을 톨루이딘 블루 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 아토피 피부염 유발 인자 및/또는 플라즈마 처리된 NC/Nga 마우스의 피부 조직을 EPX 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, IL-4로 자극하고 액상 플라즈마 처리한 HaCaT 세포에서 p-STAT6 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, PMA 및 A23187로 자극하고 액상 플라즈마 처리한 비만세포에서 IL-6 의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, PMA 및 A23187로 자극하고 액상 플라즈마 처리한 비만세포에서 TNF-α의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, PMA 및 A23187로 자극하고 액상 플라즈마 처리한 비만세포에서 NF-kB의 활성이 억제됨을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 플라즈마의 건선 치료 효능을 검증하기 위하여 IMQ 및/또는 NTP 처리하는 타임 프레임을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ 및/또는 NTP 처리한 마우스 피부의 각질층 형성 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ의 비히클(vehicle) 크림 및/또는 질소 가스가 마우스 피부의 각질층 형성에 유의미한 영향을 미치지 않음을 나타낸 도이다.
도 11a 내지 도 11e 는 본 발명의 일 실시예에 따른, NTP 처리가 마우스 피부의 염증 반응 인자에 유의미한 영향을 미치지 않음을 나타낸 도이다.
도 12a 내지 도 12d 는 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ 자극 및 NTP 처리에 의한 CD4 + T 세포, CD11c + 세포, CD11b + 세포 및 Gr-1 + 세포의 침윤량 변화를 나타낸 도이다.
도 13a 내지 도 13e 는 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ 자극 및 NTP 처리에 의한 염증 반응 인자(IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, 및 CCL20)의 발현량 변화를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ 자극 및 NTP 처리에 의한 Th17 세포의 분화 억제 정도를 나타낸 도이다.
도 15a와 도 15b 는 본 발명의 일 실시예에 따른, LTP의 제조 방법을 NTP와 비교하여 나타낸 모식도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, No LTP, LTP 30, 또는 LTP 60 처리 시 Th17 세포의 분화가 억제 정도를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, No LTP, LTP 30, 또는 LTP 60 처리 시 Th1세포의 분화가 억제 정도를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른, LTP 처리에 의한 BMDC의 활성이 억제 정도를 CD80, CD86 및 MHC II의 발현으로 나타낸 도이다.
도 19a 내지 도 19e 는 본 발명의 일 실시예에 따른, TNF-α 처리된 BMDC에서 LTP 처리에 의해 염증성 사이토카인의 발현이 감소하는 결과를 나타낸 도이다.
도 20a 내지 도 20e 는 본 발명의 일 실시예에 따른, LPS(Lipopolysaccharide) 처리된 BMDC에서 LTP 처리에 의해 염증성 사이토카인의 발현이 감소하는 결과를 나타낸 도이다.
도 21a 내지 도 21e 는 본 발명의 일 실시예에 따른, TNF-α 및 IFN-γ로 활성화된 HaCaT 세포에서 LTP 처리에 의한 인터루킨 및 사이토카인의 유전자 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 22a 내지 도 22g 는 본 발명의 일 실시예에 따른, LPS 자극된 HaCaT 세포에서 LTP 처리에 의한 인터루킨 및 사이토카인의 유전자 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 23a와 도 23b 는 본 발명의 일 실시예에 따른, IL-6 자극된 HaCaT 세포에서 LTP 처리에 의한 STAT3 활성화(pSTAT3) 변화를 나타낸 도이다.
도 24a 내지 도 24c 는 본 발명의 일 실시예에 따른, TNF-α 및 IFN-γ, 또는 LPS 자극된 HaCaT 세포에서 LTP 처리에 의한 PD-L1 발현 변화를 나타낸 도이다.
아토피 피부염에서의 액상 플라즈마 처리 효과를 확인하기 위해서, 사람 각질형성세포(Human keratinocyte cell line, HaCaT), 및 비만세포(mast cell)를 이용하여 웨스턴 블랏팅으로 p-STAT6 (ABcam), 및 STAT6(Cell signaling Technology)의 단백질 발현량을 확인하였다. IL-4는 과민성 활성인자로서, 염증성 사이토카인을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 실험 결과, IL-4와 액상 플라즈마(LTP)를 병용 처리한 그룹에서 IL-4만 처리한 그룹에 비해서 전사활성인자의 인산화(p-STAT6)가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 액상 플라즈마 처리가 면역 과민 반응을 현저하게 완화시킬 수 있음을 의미한다.
또한 건선과 유사한 피부에서 액상 플라즈마의 염증 억제 효과를 확인하기 위하여, HaCaT에서 STAT3 활성화에 액상 플라즈마가 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. STAT3 활성화는 Th17 세포 분화 및 건선 발병에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 실험 결과, 액상 플라즈마 처리가 IL-6 자극 된 HaCaT 세포에서 STAT3 활성화(pSTAT3)를 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 액상 플라즈마가 STAT3 신호 전달 경로를 억제하여 마우스에서 건선의 억제를 초래할 수 있음을 시사한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 액상 플라즈마의 아토피 피부염 치료 효과 확인
실시예 1-1. 아토피 피부염에서의 플라즈마 처리 효과 확인
아토피 피부염에서의 플라즈마 처리 효과를 확인하기 위해서, NC/Nga 마우스(6 주령, 수컷, 오리엔트바이오社, 한국)를 무작위로 선정하여 표 1과 같이 처리하였다.
그룹 비고
음성 대조군 아무런 처리를 하지 않음(Non-treatment)
양성 대조군 Biostir(집먼지 진드기) 처리(Biostir only)
플라즈마 대조군 플라즈마(NTP) 처리(NTP only)
플라즈마 실험군 Biostir(집먼지 진드기) 처리 후, 플라즈마(NTP) 처리(Biostir + NTP)
구체적으로, 마우스의 등쪽 털을 완전히 제거한 후, 피부 장벽을 파괴하기 위하여 4 % SDS 용액 200㎕를 도포하고, 아토피 피부염 유발 인자인 Biostir(집먼지 진드기)를 4일에 한번씩, 총 3주 동안 처리하였다. 플라즈마 처리군을 위해서는, 질소(N2) 가스를 비열 대기압 플라즈마 생성원으로 사용하는 플라즈마 발생 장치로 가스 유속 10L/min, 전압 15kVp-p, 및 주파수 15 kHz를 유지하여 발생시킨 플라즈마를 조사하였다.
조직학적 분석을 위해 마지막 처리 하루 후에 마우스의 피부 조직을 수득하였다. 수득된 등쪽 피부 조직은 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 24 시간 동안 고정하고, 파라핀 포매하여 4.5μm 두께로 박절하였고, H & E(hematoxylin and eosin)염색으로 피부조직의 형태를 관찰하였고, 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색으로 피부조직내 비만세포의 침윤을 조사하였으며, EPX(Eosinophil peroxidase) 항체(Santa Cruz Biotechnology) 염색으로 호산구의 조직 내 유입을 관찰하였다. 상기 결과를 정량화하여 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
실험 결과, 음성 대조군과 비교하여 플라즈마 대조군에서는 표피의 형태가 크게 다르지 않은 것으로 나타났으나, 양성 대조군의 경우 표피가 매우 두껍게 다각화되고, 비만세포(mast cell)나 호산구(eosinophils)의 조직 내 유입이 크게 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 플라즈마 실험군의 경우, 양성 대조군에 비하여 표피 두께가 현저하게 감소하고, 비만세포(mast cell)나 호산구(eosinophils)의 조직 내 유입이 음성 대조군보다도 낮은 수준으로 유지하는 것을 알 수 있었다. 이는 플라즈마 처리가 아토피 피부염의 증상을 현저하게 완화시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 1-2. 아토피 피부염에서의 액상 플라즈마 처리 효과 확인
아토피 피부염에서의 액상 플라즈마 처리 효과를 확인하기 위해서, 사람 각질형성세포(Human keratinocyte cell line, HaCaT), 및 비만세포(mast cell)를 이용하여 실험을 수행하였다. HaCaT 세포는 한국세포주은행으로부터 수득하였고, 비만세포는 C57BL/6 마우스의 골수 세포를 mIL-3(10ng/㎖) 및 mSCF(50ng/㎖)가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 8주간 배양한 뒤, 유세포분석으로 분화 정도를 선별하여 수득하였다. 액상 플라즈마는 상기 실시예 1-1의 조건으로 발생시킨 플라즈마를 배양 배지(RPMI 1640 또는 DMEM)에 ㎖당 60초간 조사하는 방법으로 제조하였다.
먼저, HaCaT 세포를 액상 플라즈마가 처리된 배양 배지로 교체 한 후 1시간 배양 후 상기 HaCaT 세포를 30ng/㎖의 IL-4(인터루킨-4)로 자극하고, 15분 후에 세포를 수득하여, 웨스턴 블랏팅으로 p-STAT6 (ABcam), 및 STAT6(Cell signaling Technology)의 단백질 발현량을 확인하였다. IL-4는 과민성 활성인자로서, 염증성 사이토카인을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 실험 결과, IL-4와 액상 플라즈마(LTP)를 병용 처리한 그룹에서 IL-4만 처리한 그룹에 비해서 전사활성인자의 인산화(p-STAT6)가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 액상 플라즈마 처리가 면역 과민 반응을 현저하게 완화시킬 수 있음을 의미한다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다.
다음으로, 액상 플라즈마로 한시간 전 처리 한 후, 비만세포를 활성화 시킬 수 있는 PMA(proteain kinase C activator) 50nM, 및 A23187(Calcimycin) 1mM로 비만세포를 자극한 뒤, 6시간을 추가로 배양하고, qPCR로 IL-6(인터루킨-6) 및 TNF-α의 유전자 발현량을 확인하였다. qPCR은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 수행하였다. 실험 결과, IL-6와 TNF-α 모두 염증유발인자와 액상 플라즈마(LTP)를 병용 처리한 그룹에서 PMA/A23187 만 처리한 그룹에 비해서 유전자 발현량이 크게 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 5와 도 6에 나타내었다.
마지막으로, 비만세포를 액상 플라즈마가 처리된 배양 배지로 1 시간 전 처리 후, 상기와 동일하게 비만세포 활성인자로 자극한 뒤, 30분을 추가로 배양하고 웨스턴 블랏팅으로 NF-kB의 활성을 확인하였다. 실험 결과, 염증유발인자와 액상 플라즈마(LTP)를 병용 처리한 그룹에서 염증유발인자만 처리한 그룹에 비해서 NF-kB의 인산화(p-NF-kB)가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다.
실시예 1-3. 아토피 피부염에서의 플라즈마 직접 처리와 액상 플라즈마 처리의 효과 비교
본 발명의 액상 플라즈마와 세포에 대한 플라즈마 직접 처리의 효과를 비교하였다. 플라즈마 직접 처리는 액상 플라즈마 제조 시 사용한 것과 동일한 플라즈마 장치를 이용하여, 동일한 조건으로 플라즈마를 발생시키되, 표피세포가 배양되고 있는 배양 접시에 플라즈마를 직접 노출시키는 방법을 이용하였다.
상기 액상 플라즈마 또는 플라즈마 직접 처리한 세포들을 비교한 결과, 플라즈마 직접 처리한 세포들은 세포 표면이 건조되는 현상이 나타나는 것으로 분석되었다. 아토피에 있어서 보습이 매우 중요하다는 것을 고려할 때, 보습제 등 액상 물질의 형태로 제공할 수 있는 액상 플라즈마의 유용성이 현저한 것으로 판단된다.
실시예 2. 액상 플라즈마의 건선 치료 효과 확인
실시예 2-1. 비열 대기압 플라즈마(NTP)의 건선 치료 효과 확인
실시예 2-1-1. 비열 대기압 플라즈마(NTP)에 의한 동물모델에서의 건선 치료 효과
비열 플라즈마의 건선 치료 효능을 검증하기 위하여, 이미퀴모드(imiquimod, IMQ)를 제모한 C57/BL6 마우스의 등 피부에 도포하여 건선을 유발한 동물 모델을 이용하였다. 8주령 C57/BL6 마우스 등 부위를 제모한 뒤 하루에 62.5mg의 IMQ 크림(sigma, 미국)을 도포하여 건선 유사한 피부를 유도하고, 3일째 및 4일째에 마우스의 표피로부터 2cm 떨어진 거리에서 전압 15kV 및 주파수 15kHz의 전원이 공급되고 캐리어 가스로는 질소 가스를 이용하는 플라즈마 발생장치를 이용하여 비열 플라즈마를 60초 동안 처리한 후 5일째에 마우스를 희생시켜 피부 조직을 면역 조직 화학 염색법으로 분석하였다. 상기 이미퀴모드 및 플라즈마 처리한 타임 프레임을 도 8에 기재하였다.
실험 결과 IMQ가 처리된 마우스의 경우 각질층의 두께가 현저히 증가되어 건선이 유발되었으나, IMQ 및 NTP가 함께 처리된 마우스의 경우 IMQ만 처리된 마우스에 비해 각질층의 두께가 50% 이상 감소하였음이 확인되었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 상기의 결과는 플라즈마의 의한 효과임을 증명한 실험을 도 10에 나타내었다. 정상적인 마우스 피부에서의 플라즈마 처리는 피부 조직에 영향을 주지 않았고, IMQ의 비히클(vehicle) 크림만 투여하거나, 비히클(vehicle) 크림과 질소 가스만 처리한 마우스는 피부 염증이 발생하지 않았다. 그러나 플라즈마 처리는 IMQ로 유도된 건선과 유사한 피부 염증을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 플라즈마 처리가 정상 피부 조직에서 부작용을 유발하지 않는다는 것을 다양한 염증 반응 인자(IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, 및 CCL20)의 발현량 비교로 확인하였다. 그 결과를 도 11a 내지 도 11e 에 나타내었다.
실시예 2-1-2. 비열 대기압 플라즈마(NTP)에 의한 동물모델에서 면역 세포 침윤 억제 효과
비열 플라즈마가 IMQ로 유도된 건선과 유사한 피부 염증에서 면역 세포 침윤을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 마우스 피부의 단일 세포 현탁액을 유세포 계측법(FACS)으로 분석하고, 그 결과를 도 12a 내지 도 12d 에 나타내었다. 실험 결과, IMQ 처리된 마우스 피부에서는 CD4 + T 세포, CD11c + 세포, CD11b + 세포 및 Gr-1 + 세포의 침윤이 증가하는 것으로 나타났고, IMQ 및 플라즈마 처리된 피부에서는 면역 세포 침윤이 억제되는 것으로 나타났다.
또한, 염증 반응 인자(IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, 및 CCL20)의 발현량도 비교하고, 이를 도 13a 내지 도 13e 에 나타내었다. 실시예 2-1-1의 결과에서, 정상 피부에의 플라즈마 처리는 염증 반응 인자 변화를 일으키지 않음을 확인하였다. 그러나 실험 결과, IMQ 처리한 피부는 음성대조군 또는 플라즈마 단독 처리군에 비하여 사이토카인 및 케모카인의 발현이 2배 이상 증가하는데 비하여, IMQ 및 플라즈마 처리된 피부에서는 상기 사이토카인 및 케모카인의 발현이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다.
상기 도 12 및 도 13의 결과로부터, 비열 플라즈마 치료가 염증성 사이토카인 및 케모카인의 유전자 발현 저해를 통해 건선과 유사한 피부 염증을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-1-3. 비열 대기압 플라즈마(NTP)에 의한 동물모델에서 Th17 세포 분화 억제 효과
본 발명에 따른 비열 플라즈마에 의해 C57/BL6 마우스의 배액 림프절에서 IMQ에 의해 유도된 Th17 세포의 분화가 플라즈마에 의해 억제되는지 여부를 관찰하였다. Th17 세포는 건선의 발병 기전에 중요한 것으로 알려져 있다. Th17 세포의 분화 정도는 실시예 2-1-1과 동일한 방법으로 유세포 분석기(FACS)로 분석하였다.
실험 결과, 마우스에 IMQ를 처리하면 배액 림프절에서 Th17 세포가 증가하지만, 이는 플라즈마 처리에 의해 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다. 이를 도 14에 기재하였다.
실시예 2-2. 액상 플라즈마(LTP)의 건선 치료 효과 확인
실시예 2-2-1. 액상 플라즈마(LTP)의 제조
액상 플라즈마는 상기 실시예 2-1-1의 조건으로 발생시킨 플라즈마를 배양 배지(RPMI 1640 또는 DMEM)에 ㎖당 0초(No LTP) 30초(LTP 30) 또는 60초(LTP 60)간 조사하는 방법으로 제조하였다. 상기 실시예 2-1의 비열 대기압 플라즈마(NTP)와 액상 플라즈마(LTP) 처리의 모식도를 도 15a 와 도 15b 에 기재하였다.
실시예 2-2-2. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 Th17 세포의 분화 억제 효과
실시예 2-1의 비열 대기압 플라즈마와 동일하게, 액상 플라즈마에 의해서도 Th17 세포의 분화가 억제되는지 여부를 관찰하기 위하여 C57/BL6 정상 마우스의 CD4+ T 세포를 분리하였으며, 분리된 세포를 anti-CD3 10ng/㎖, anti-CD28 5ng/㎖, IL-6 10ng/㎖, TGF-β 5ng/㎖, IFN-γ 항체, 및 IL-4 항체를 포함하는 RPMI1640 배양액에서 Th17 세포로 분화시켰다. 이때, 상기 배양액은 No LTP, LTP 30, 또는 LTP 60을 사용하였다. 각 배양액에서의 Th17 세포의 분화 정도를 유세포기(FACS)를 통해 관찰하고, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 실험 결과, 플라즈마 처리되지 않은 배양액(No LTP)에서는 IL-17을 발현하는 Th17의 분화가 이루어졌으나, 플라즈마 처리된 배양액 LTP 30 및 LTP 60에서는 Th17의 분화가 현저히 억제됨을 확인하였다.
실시예 2-2-3. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 Th1 세포의 분화 억제 효과
액상 플라즈마에 의해 Th1 세포의 분화가 억제되는지 여부를 관찰하기 위하여 실시예 2-2-2에서 마우스로부터 분리된 세포를 CD4+ T 세포를 anti-CD3 10ng/㎖, anti-CD28 5ng/㎖ 및 IL-12 10ng/㎖을 포함하는 RPMI1640 배양액에서 Th1 세포로 분화시켰다. 이때, 상기 배양액은 No LTP, LTP 30, 또는 LTP 60을 사용하였다. 각 배양액에서의 Th1세포의 분화 정도를 유세포기(FACS)를 통해 관찰하고, 그 결과를 도 17에 나타내었다. 실험 결과, 플라즈마 처리되지 않은 배양액(No LTP)에서는 Th1 세포의 분화가 유도되었으나, 플라즈마 처리된 배양액 LTP 30 및 LTP 60에서는 Th1 세포의 분화가 현저히 억제됨이 확인하였다. 특히, 배양액 LTP 60에서는 Th1세포로의 분화가 거의 발생하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 2-2-4. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 BMDC 세포의 활성 억제 효과
본 발명에 따른 액상 플라즈마에 의해 골수 유래 수지상 세포(bone marrow derived dendritic cells, BMDC)의 활성이 억제되는지 여부를 관찰하기 위하여 C57/BL6 정상 마우스의 골수세포를 분리하였으며 분리된 골수세포를 상기 실시예 2-2-2와 동일한 배양액에서 TNF-α(20μg/㎖)로 활성화 시킨 후, 수지상 세포의 활성화 표지 인자인 CD80, CD86 및 MHC II의 발현을 측정하였다. TNF-α는 건선의 병인에 관여하는 것으로 알려져 있다. 실험 결과, TNF-α 자극은 BDCM에서 CD80, CD86 및 MHCII의 발현을 향상시키는 데 비하여, 플라즈마 처리된 배양액 LTP 30 및 LTP 60의 경우 CD80, CD86 및 MHC II의 발현과 TNF-α의 생성이 크게 감소됨을 확인하였다. 이를 도 18에 나타내었다.
또한, TNF-α 또는 LPS(Lipopolysaccharide) 처리된 BMDC에서 염증성 사이토카인의 발현을 확인하였다. 본 발명에 사용된 인터루킨 및 사이토카인 중에서, mouse IL-6, IL-17, TNF-α, CXCL1, CCL20, PD-L1, 및 GAPDH의 프라이머 세트는 시판되는 것을 구매하여 사용하였고(Qiagen, Hilden, Germany), human IL-1β, IL-8, IL-10, IFN-γ, 및 TGF-β1의 프라이머 세트를 하기 표 2에 기재된 서열로 합성하여 사용하였다. GAPDH는 음성대조군으로 사용하였다.
hIL-1β Forward(순방향) 5'ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA3'
Reverse(역방향) 5'GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT3'
hIL-8 Forward(순방향) 5'ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT3'
Reverse(역방향) 5'TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCT3'
hIL-10 Forward(순방향) 5' CATCGATTTCTTCCCTGTGAA3'
Reverse(역방향) 5' TCTTGGAGCTTATTAAAGGCATTC3'
hIFN-γ Forward(순방향) 5'CTAATTATTCGGTAACTGACTTGA3'
Reverse(역방향) 5'ACAGTTCAGCCATCACTTGGA3'
hTGF-β1 Forward(순방향) 5'CCCAGCATCTGCAAAGCTC3'
Reverse(역방향) 5'GTCAATGTACAGCTGCCGCA3'
실험결과, TNF-α 또는 LPS(Lipopolysaccharide) 처리된 BMDC에서 염증성 사이토카인의 발현이 증가하였고, 액상 플라즈마에 의해서는 염증성 사이토카인의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 혈장이 T 세포 활성화 및 분화를 억제하는 DC 활성화를 부정적으로 조절할 수 있음을 시사한다. 상기 결과를 도 19a 내지 도 19e 와 도 20a 내지 도 20e 에 나타내었다.
실시예 2-2-5. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 활성화된 HaCaT(epithelial cell)의 염증 억제 효과 확인
건선과 유사한 피부에서 액상 플라즈마의 염증 억제 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포에서 염증성 인자의 발현을 분석하였다. 이를 위해 먼저, HaCaT 세포를 TNF-α 및 IFN-γ로 활성화시키고, 액상 플라즈마를 처리하고, 건선에 관여하는 인터루킨 및 사이토카인의 유전자 발현을 리얼타임 PCR로 측정 하였다. 그 결과를 도 21a 내지 도 21e 에 나타내었다. 실험 결과, 액상 플라즈마는 TNF-α 및 IFN-γ에 의해 자극된 HaCaT 세포에서 염증 완화 효과가 있는 것으로 나타났다.
LPS 자극 된 HaCaT 세포에서의 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ, TGF-β1 및 VEGFA 유전자 발현에 대한 액상 플라즈마의 저해 효과도 확인하였다. 실험결과, IL-1β, IL-6, IL-8, 및 IFN-γ는 LPS 자극에 의해 증가한 발현량이 액상 플라즈마 처리에 의해 감소하는 효과가 있었고, IL-10 및 VEGFA는 액상 플라즈마 처리에 의해 발현량이 더 증가하며, TGF-β1은 유의미한 변화가 없는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 22a 내지 도 22g 에 나타내었다.
또한, HaCaT에서 STAT3 활성화에 액상 플라즈마가 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. STAT3 활성화는 Th17 세포 분화 및 건선 발병에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 그 결과를 도 23a 와 도 23b 에 나타내었다. 실험 결과, 액상 플라즈마 처리가 IL-6 자극 된 HaCaT 세포에서 STAT3 활성화(pSTAT3)를 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 액상 플라즈마가 STAT3 신호 전달 경로를 억제하여 마우스에서 건선의 억제를 초래할 수 있음을 시사한다.
실시예 2-2-6. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 활성화된 HaCaT과 BMDC 세포에서의 PD-1 발현 증가 확인
본 발명에 따른 액상 플라즈마에 의해 활성화된 HaCaT과 BMDC 세포에서 PD-L1의 발현이 증가되는지 여부를 확인하고, 그 결과를 도 24a 내지 도 24c 에 나타내었다. DC에서의 PD-L1 발현은 PD-1 / PD-L1 결합을 통해 T 세포 활성화를 억제한다는 것이 보고되었다. 따라서, PD-L1의 과발현 또는 고 발현은 T 세포의 불활성화를 유도할 수 있고, CD4 + T 세포가 비정상적으로 활성화되는 자가면역질환의 치료에 도움이 될 수 있다고 제안되고 있다. 최근, 재조합 PD-L1의 투여로 마우스에서 IMQ에 의해 유발된 피부 염증이 개선되었다는 보고도 있었다.
실험결과, HaCaT 세포에서 액상 플라즈마 처리가 PD-L1 발현을 유도한다는 것으로 나타났다. 또한, TNFα / IFN-γ- 자극, 또는 LPS- 자극된 HaCaT 세포에서 PD-L1의 RNA 수준이 증가하였고, 자극된 세포에서의 액상 플라즈마 처리는 PD-L1 발현을 더욱 향상시켰다. 이러한 결과는 액상 플라즈마 치료가 PD-L1 유전자 발현의 조절을 통해 건선과 유사한 피부 염증을 완화시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 2-3. 비열 대기압 플라즈마(NTP)와 액상 플라즈마(LTP)의 건선 치료 효과 비교
본 발명의 액상 플라즈마(LTP)와 세포에 대한 플라즈마 직접 처리(NTP)의 효과를 비교하였다. 플라즈마 직접 처리는 액상 플라즈마 제조 시 사용한 것과 동일한 플라즈마 장치를 이용하여, 동일한 조건으로 플라즈마를 발생시키되, TNF-α 및 IFN-γ에 의해 자극된 HaCaT 세포가 배양되고 있는 배양 접시에 플라즈마를 직접 노출시키는 방법을 이용하였다.
상기 액상 플라즈마 또는 플라즈마 직접 처리한 세포들을 비교한 결과, 플라즈마 직접 처리한 세포들은 세포 표면이 건조되는 현상이 나타나는 것으로 분석되었다. 건선에 있어서 보습이 매우 중요하다는 것을 고려할 때, 보습제 등 액상 물질의 형태로 제공할 수 있는 액상 플라즈마의 유용성이 현저한 것으로 판단된다.
상기 실시예 1의 결과로부터 본 발명의 액상 플라즈마가 아토피 피부염의 증상 완화에 현저하게 효과가 있다는 것을 알 수 있었고, 상기 실시예 2의 결과로부터 본 발명의 액상 플라즈마가 건선을 포함하는 피부 염증성 질환의 예방 및 치료에 현저하게 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 액상 플라즈마는 과민성 면역반응을 억제하는 효과가 현저하고, 건선의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 아토피성 피부염을 포함하는 면역 과민반응 또는 건선의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

Claims (26)

  1. (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계;
    (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 13kV의 전압 및 15 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및
    (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 5분 내지 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  10. 제 6항 내지 제 9항 중 어느 하나 이상의 약학조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  12. 제 6항 내지 제 9항 중 어느 하나 이상의 약학조성물의 알러지성 질환의 예방 또는 치료 용도.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료 용도.
  14. (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계;
    (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 5kV 내지 20kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및
    (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 5분 내지 120분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  17. 제 14항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  18. 제 14항에 있어서,
    상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
  19. 제 14항 내지 제 18항 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  21. 제 19항에 있어서,
    상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  22. 제 19항에 있어서,
    상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  23. 제 19항 내지 제 22항 중 어느 하나 이상의 약학조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 방법.
  25. 제 19항 내지 제 22항 중 어느 하나 이상의 약학조성물의 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 용도.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 용도.
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