KR20180032489A - 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 건선의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 액상 플라즈마는 건선의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 건선의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법{Method for treating of preventing psoriasis with liquid type plasma}

본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 건선의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

건선(psoriasis)은 피부에서 염증성 세포 침윤의 만성적 활성화와 표피 각질 세포의 조절 장애에 의해 유도된 면역-매개 자가면역 피부 질환이다. 조직학적으로, 건선은 피부 조직 검사에서 표피의 비후(thickening)와 인설(scaling), 및 과증식성 부전각화증(hyperproliferative parakeratosis)으로 여겨지고 있다. 아직, 건선의 발병 메커니즘이 완전히 규명되지는 않았으며, 염증성 사이토카인과 T 세포와 같은 면역 세포 침윤 간의 상호작용을 포함하는 복잡한 메커니즘과 관련되어 있는 것으로 보고되고 있으며, 최근 연구에서 Th17(T helper 17) 세포 및 IL-17A, IL-22 및 IL-23과 같은 Th17-매개 사이토카인이 건선 촉발을 유도한다고 보고되었다.

이러한 건선의 일반적인 치료에는 국소 투약, 광선 요법 및 내복 투약법이 있다. 국소 치료는 스테로이드, 콜타르, 안트랄린, 비타민 D3 및 그의 유사체, 레티노이드 및 햇볕 등을 포함하는 치료이며, 이러한 국소 치료는 피부 얇아짐, 튼살, 화상, 자극 및 광과민증의 부작용이 있다. 또한, 스테로이드는 내성을 유도할 수 있어 이후의 스테로이드 치료에 영향을 준다. 광선 요법은 자외선 B 또는 자외선 A와 함께 쏘랄렌의 투여를 포함하며, 피부가 빨리 노화되고, 피부암 발병률이 증가된다는 단점이 있다. 내복 투여는 사이클로스포린과 같은 면역조절제를 투여하는 것이고, 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이다. 하지만, 장시간 사용에 따른 신장독성(nephrotoxicity)이나 고혈압을 일으키는 문제점이 있다. 따라서, 현재 건선 치료가 갖는 문제점을 해결하고, 건선을 효과적으로 치료할 수 있는 치료법 개발이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 아직 효과적인 치료법에 대해서 알려진 바가 없다.

한편, 저온 대기압 플라즈마란 플라즈마를 구성하는 이온과 전자 중 전자가 갖는 에너지가 이온이 소유한 에너지보다 큰 상태의 플라즈마를 말하며, 저온 상압 플라즈마라고도 한다. 즉, 저온 플라즈마란 배출가스 중에서 고압의 전기방전을 행하면 방전에 의해 발생된 전자가 배출가스의 분자와 충돌하여 가스분자의 외곽 전자상태가 변하게 되어 생성되는 것으로, 반응성이 풍부한 화학적 활성종인 라디칼(예를 들면, OH, COOH, CHO 등), 여기분자, 이온이 양 또는 음으로 하전되어 전기적으로 중성상태의 가스가 되는 것을 말한다. 플라즈마는 전자, 이온, 분자의 온도가 모두 높은 고온 열플라즈마와 전자 온도만 높은 저온 플라즈마로 구분된다. 고온 열플라즈마는 고온을 얻을 수 있어 물질을 용융하는데 활용되고, 저온 플라즈마는 전자의 온도만 높기 때문에 고온을 적용할 수 없는 재료나 조건에 적용할 수 있고 장치가 간단한 장점이 있다. 이러한 플라즈마는 다양한 화학반응을 유기하므로 이를 활용하여 다양한 분야에 적용하기 위한 연구가 많이 이루어지고 있다. 그러나 아직까지 이를 이용하여 건선을 치료하는 방법에 대해서는 알려져 있지 않다.

이에 본 발명의 출원인들은 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 건선의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 건선의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 건선의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “건선(psoriasis)”이란, 경계가 분명한 은백색의 인설(각질이 죽어 생기는 회백색 물질(scale))로 덮여 있는 홍반성 피부 병변으로, 주로 팔꿈치, 무릎, 엉덩이, 두피 등 자극을 많이 받는 부위에 발생한다. 작은 구진(papule, 丘疹: 피부병의 증세 중 피부면에 나타나는 발진(發疹))에서부터 판상, 농포성, 박탈성 건선, 건선 관절염 등 다양한 임상 양상을 나타내고, 악화와 호전이 경우에 따라 반복되는 만성 염증성 피부 질환이다. 보다 병변의 형태에 따라 판상, 간찰부, 물방울양, 농포성, 홍피증 등으로 나눌 수 있다. 구체적으로, 판상건선은 건선의 대표적인 임상형으로 가장 흔히 관찰된다. 개개의 병변은 주위와 경계가 명확한 판상으로 붉은색을 띠며 은백색의 비늘로 덮여 있고, 흔히 발생하는 부위로는 팔꿈치, 무릎, 엉덩이, 두피 등이며 대칭적으로 발생한다. 만성적인 판상형인 경우를 심상성건선(psoriasis vulgaris)이라고 한다. 간찰부건선은 드물게 겨드랑이와 사타구니처럼 피부가 겹치는 부위에 건선이 발생하는 경우를 지징하고, 굴측건선, 또는 역건선이라고도 명명된다. 물방울양건선은 연쇄상구균에 의한 편도선염 후 0.5~1.5cm 크기의 작은 물방울 같은 구진이 전신에 산재되어 급속히 나타난다. 환자의 혈액검사에서 연쇄상구균 독소에 대한 항체(ASO) 수치가 증가할 수 있다. 농포성건선은 드물게 보는 건선의 급성 형태로 손, 발바닥에 농포가 나타나는 국소성농포성건선, 전신에 나타나는 전신성농포성건선이 있다. 급성 전신성형의 경우 오한, 고열, 권태감, 관절통 등의 전신증상이 있고, 백혈구증다증이 동반되기도 한다. 마지막으로 건선홍피증은 전신 피부에 걸쳐서 홍반과 인설이 동반되어 나타나는 급성 건선의 한 형태이다. 인설이 심한 경우를 박탈성건선이라고 부르기도 한다. 증상이 심하면 가려움증이 심하고 얼굴을 침범하는 경향이 있다. 건선관절염은 건선 환자의 5~10% 정도에서 관찰된다. 비대칭적으로 하나 또는 소수의 관절을 침범하는 형, 말단지관절(distal interphalangeal joint)을 침범하는 형, 대칭적으로 다발성의 관절염을 일으키는 형, 관절의 심한 변형을 초래하는 단절성관절염(arthritis mutilans) 형, 척추염형 등 여러 가지 임상 형태가 있다. 또한 건선 환자의 대부분에서 조갑 손발톱 병변이 동반되는 경우가 많다.

현재까지 축적된 연구결과에 의하면 건선은 건선에 대한 유전적 발병인자를 갖고 있는 사람에서 건선항원의 자극에 의해 건선관련 T림프구가 활성화되고, 그에 따라 생성된 사이토카인이 각질형성세포의 과증식을 유도하고, 피부에 특이적인 CLA+ T림프구들이 지속적으로 피부병변으로 유입되어 생성되는 것으로 이해되고 있다. 따라서 건선 병변을 만성화되는 T림프구 매개성 자가면역질환으로 분류한다. 상기 T림프구 매개성 자가면역질환의 피부 영역으로서, T림프구 매개성 피부질환이 동일한 의미로 사용될 수 있고, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 “비열 대기압 플라즈마(non-thermal atmospheric pressure plasma)”란, 디바이 차폐(Debye shielding)을 만족하는 이온화된 기체를 말한다. 이는 물질의 기본적인 세 가지 상태인 기체, 액체, 고체와 더불어 또 하나의 상태로 여겨지며 제 4상태로 표현된다. 본 발명에 따른 플라즈마는 외부 전압에 의해 중성 기체가 플라즈마로 상전이 하여 중성 기체의 여기, 이온화에 의하여 전자 및 양이온이 발생할 수 있고, 분자 가스가 여기된 라디칼이 존재할 수 있다. 상기 플라즈마 생성 장치는 본 발명의 목적에 따른 저온 대기압 플라즈마를 생성할 수 있다면, 공지된 플라즈마 생성 장치를 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 질소 가스를 사용하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서 “액상 플라즈마(Liquid type plasma, LTP)”란, 고밀도 고에너지 플라즈마를 액체 속에서 발생시키는 것을 의미하며, 대기압의 상온 비열 플라즈마(nonthermal plasma, NTP)에 노출시켜 제조될 수 있다. 상기 용어 “액상 플라즈마”는 용어 “플라즈마 처리된 액상 물질(plasma-conditioned liquid material)"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 상기의 “액상 물질”은 액상 형태의 물질은 제한없이 사용 가능하나, 바람직하게는 물, 식염수, 완충액, 또는 배지이고, 가장 바람직하게는 배지이다.

본 발명의 액상 플라즈마는 액상 조성물의 형태로 공급 가능하므로 유통 및 휴대가 편리하고, 보습이 중요한 건선에 있어서 보습과 치료를 동시에 제공하는 것이 가능하다. 또한, 건선 피부에 직접 플라즈마를 처리하는 것보다 세포 손상이 적고, 사용자의 잘못된 기기 조작에 의한 화상 등 피부 손상의 위험이 전혀 없으며, 넓고 굴곡된 면적에도 균일하게 도포 가능한 장점이 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “배지(culture media)”란, 인 비트로(in vitro)에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양조건을 선택할 수 있다. 세포의 배양에 사용되는 기본배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 기본 배지에는 예를 들면, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12,(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서 “치료”란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 건선 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 건선의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구체예에서 “예방”이란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 건선 또는 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 건선에 치료효과가 있는 본원의 조성물은 건선의 초기증상 또는 증상이 나타나기 전에 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 명세서에 있어서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 플라즈마를 액상 물질에 조사하여 제조한 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.

비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있고, 멸균될 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.

몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함할 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시 형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 추가적인 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 또는 폴리머일 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.

본 명세서에 있어서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 약학조성물은 피부 위에 도포하거나 피하 또는 피내에 주사하는 형태로 제공되는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계; (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 5kV 내지 20kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및 (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하고, 상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 5분 내지 120분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하고, 상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 건선의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 건선의 생성 및 증식을 억제하는 효과가 현저하므로, 건선의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 플라즈마의 건선 치료 효능을 검증하기 위하여 IMQ 및/또는 NTP 처리하는 모식도와 마우스의 등 피부 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ 및/또는 NTP 처리한 마우스 피부의 각질층 형성 변화를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ의 비히클(vehicle) 크림 및/또는 질소 가스가 마우스 피부의 각질층 형성에 유의미한 영향을 미치지 않음을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, NTP 처리가 마우스 피부의 염증 반응 인자에 유의미한 영향을 미치지 않음을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ 자극 및 NTP 처리에 의한 CD4 + T 세포, CD11c + 세포, CD11b + 세포 및 Gr-1 + 세포의 침윤량 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ 자극 및 NTP 처리에 의한 염증 반응 인자(IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, 및 CCL20)의 발현량 변화를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, IMQ 자극 및 NTP 처리에 의한 Th17 세포의 분화 억제 정도를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, LTP의 제조 방법을 NTP와 비교하여 나타낸 모식도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, No LTP, LTP 30, 또는 LTP 60 처리 시 Th17 세포의 분화가 억제 정도를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, No LTP, LTP 30, 또는 LTP 60 처리 시 Th1세포의 분화가 억제 정도를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, LTP 처리에 의한 BMDC의 활성이 억제 정도를 CD80, CD86 및 MHC II의 발현으로 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, TNF-α 또는 LPS(Lipopolysaccharide) 처리된 BMDC에서 LTP 처리에 의해 염증성 사이토카인의 발현이 감소하는 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, TNF-α 및 IFN-γ로 활성화된 HaCaT 세포에서 LTP 처리에 의한 인터루킨 및 사이토카인의 유전자 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, LPS 자극된 HaCaT 세포에서 LTP 처리에 의한 인터루킨 및 사이토카인의 유전자 발현 변화를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, IL-6 자극된 HaCaT 세포에서 LTP 처리에 의한 STAT3 활성화(pSTAT3) 변화를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, TNF-α 및 IFN-γ, 또는 LPS 자극된 HaCaT 세포에서 LTP 처리에 의한 PD-L1 발현 변화를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 비열 대기압 플라즈마(NTP)의 건선 치료 효과 확인

실시예 1-1. 비열 대기압 플라즈마(NTP)에 의한 동물모델에서의 건선 치료 효과

비열 플라즈마의 건선 치료 효능을 검증하기 위하여, 이미퀴모드(imiquimod, IMQ)를 제모한 C57/BL6 마우스의 등 피부에 도포하여 건선을 유발한 동물 모델을 이용하였다. 8주령 C57/BL6 마우스 등 부위를 제모한 뒤 하루에 62.5mg의 IMQ 크림(sigma, 미국)을 도포하여 건선 유사한 피부를 유도하고, 3일째 및 4일째에 마우스의 표피로부터 2cm 떨어진 거리에서 전압 15kV 및 주파수 15kHz의 전원이 공급되고 캐리어 가스로는 질소 가스를 이용하는 플라즈마 발생장치를 이용하여 비열 플라즈마를 60초 동안 처리한 후 5일째에 마우스를 희생시켜 피부 조직을 면역 조직 화학 염색법으로 분석하였다. 상기 이미퀴모드 및 플라즈마 처리 모식도와 마우스의 등 피부 사진을 도 1에 기재하였다.

실험 결과 IMQ가 처리된 마우스의 경우 각질층의 두께가 현저히 증가되어 건선이 유발되었으나, IMQ 및 NTP가 함께 처리된 마우스의 경우 IMQ만 처리된 마우스에 비해 각질층의 두께가 50% 이상 감소하였음이 확인되었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 상기의 결과는 플라즈마의 의한 효과임을 증명한 실험을 도 3에 나타내었다. 정상적인 마우스 피부에서의 플라즈마 처리는 피부 조직에 영향을 주지 않았고, IMQ의 비히클(vehicle) 크림만 투여하거나, 비히클(vehicle) 크림과 질소 가스만 처리한 마우스는 피부 염증이 발생하지 않았다. 그러나 플라즈마 처리는 IMQ로 유도된 건선과 유사한 피부 염증을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 플라즈마 처리가 정상 피부 조직에서 부작용을 유발하지 않는다는 것을 다양한 염증 반응 인자(IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, 및 CCL20)의 발현량 비교로 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실시예 2-2. 비열 대기압 플라즈마(NTP)에 의한 동물모델에서 면역 세포 침윤 억제 효과

비열 플라즈마가 IMQ로 유도된 건선과 유사한 피부 염증에서 면역 세포 침윤을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 마우스 피부의 단일 세포 현탁액을 유세포 계측법(FACS)으로 분석하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 실험 결과, IMQ 처리된 마우스 피부에서는 CD4 + T 세포, CD11c + 세포, CD11b + 세포 및 Gr-1 + 세포의 침윤이 증가하는 것으로 나타났고, IMQ 및 플라즈마 처리된 피부에서는 면역 세포 침윤이 억제되는 것으로 나타났다.

또한, 염증 반응 인자(IL-6, IL-17, IL-22, CXCL1, 및 CCL20)의 발현량도 비교하고, 이를 도 6에 나타내었다. 실시예 1-1의 결과에서, 정상 피부에의 플라즈마 처리는 염증 반응 인자 변화를 일으키지 않음을 확인하였다. 그러나 실험 결과, IMQ 처리한 피부는 음성대조군 또는 플라즈마 단독 처리군에 비하여 사이토카인 및 케모카인의 발현이 2배 이상 증가하는데 비하여, IMQ 및 플라즈마 처리된 피부에서는 상기 사이토카인 및 케모카인의 발현이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다.

상기 도 5 및 도 6의 결과로부터, 비열 플라즈마 치료가 염증성 사이토카인 및 케모카인의 유전자 발현 저해를 통해 건선과 유사한 피부 염증을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-3. 비열 대기압 플라즈마(NTP)에 의한 동물모델에서 Th17 세포 분화 억제 효과

본 발명에 따른 비열 플라즈마에 의해 C57/BL6 마우스의 배액 림프절에서 IMQ에 의해 유도된 Th17 세포의 분화가 플라즈마에 의해 억제되는지 여부를 관찰하였다. Th17 세포는 건선의 발병 기전에 중요한 것으로 알려져 있다. Th17 세포의 분화 정도는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 유세포 분석기(FACS)로 분석하였다.

실험 결과, 마우스에 IMQ를 처리하면 배액 림프절에서 Th17 세포가 증가하지만, 이는 플라즈마 처리에 의해 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다. 이를 도 7에 기재하였다.

실시예 2. 액상 플라즈마(LTP)의 건선 치료 효과 확인

실시예 2-1. 액상 플라즈마(LTP)의 제조

액상 플라즈마는 상기 실시예 1-1의 조건으로 발생시킨 플라즈마를 배양 배지(RPMI 1640 또는 DMEM)에 ㎖당 0초(No LTP) 30초(LTP 30) 또는 60초(LTP 60)간 조사하는 방법으로 제조하였다. 상기 실시예 1의 비열 대기압 플라즈마(NTP)와 액상 플라즈마(LTP) 처리의 모식도를 도 8에 기재하였다.

실시예 2-2. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 Th17 세포의 분화 억제 효과

실시예 1의 비열 대기압 플라즈마와 동일하게, 액상 플라즈마에 의해서도 Th17 세포의 분화가 억제되는지 여부를 관찰하기 위하여 C57/BL6 정상 마우스의 CD4+ T 세포를 분리하였으며, 분리된 세포를 anti-CD3 10ng/㎖, anti-CD28 5ng/㎖, IL-6 10ng/㎖, TGF-β 5ng/㎖, IFN-γ 항체, 및 IL-4 항체를 포함하는 RPMI1640 배양액에서 Th17 세포로 분화시켰다. 이때, 상기 배양액은 No LTP, LTP 30, 또는 LTP 60을 사용하였다. 각 배양액에서의 Th17 세포의 분화 정도를 유세포기(FACS)를 통해 관찰하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 실험 결과, 플라즈마 처리되지 않은 배양액(No LTP)에서는 IL-17을 발현하는 Th17의 분화가 이루어졌으나, 플라즈마 처리된 배양액 LTP 30 및 LTP 60에서는 Th17의 분화가 현저히 억제됨을 확인하였다.

실시예 2-3. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 Th1 세포의 분화 억제 효과

액상 플라즈마에 의해 Th1 세포의 분화가 억제되는지 여부를 관찰하기 위하여 실시예 2-2에서 마우스로부터 분리된 세포를 CD4+ T 세포를 anti-CD3 10ng/㎖, anti-CD28 5ng/㎖ 및 IL-12 10ng/㎖을 포함하는 RPMI1640 배양액에서 Th1 세포로 분화시켰다. 이때, 상기 배양액은 No LTP, LTP 30, 또는 LTP 60을 사용하였다. 각 배양액에서의 Th1세포의 분화 정도를 유세포기(FACS)를 통해 관찰하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 실험 결과, 플라즈마 처리되지 않은 배양액(No LTP)에서는 Th1 세포의 분화가 유도되었으나, 플라즈마 처리된 배양액 LTP 30 및 LTP 60에서는 Th1 세포의 분화가 현저히 억제됨이 확인하였다. 특히, 배양액 LTP 60에서는 Th1세포로의 분화가 거의 발생하지 않는 것으로 나타났다.

실시예 2-4. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 BMDC 세포의 활성 억제 효과

본 발명에 따른 액상 플라즈마에 의해 골수 유래 수지상 세포(bone marrow derived dendritic cells, BMDC)의 활성이 억제되는지 여부를 관찰하기 위하여 C57/BL6 정상 마우스의 골수세포를 분리하였으며 분리된 골수세포를 상기 실시예 2-2와 동일한 배양액에서 TNF-α(20μg/㎖)로 활성화 시킨 후, 수지상 세포의 활성화 표지 인자인 CD80, CD86 및 MHC II의 발현을 측정하였다. TNF-α는 건선의 병인에 관여하는 것으로 알려져 있다. 실험 결과, TNF-α 자극은 BDCM에서 CD80, CD86 및 MHCII의 발현을 향상시키는 데 비하여, 플라즈마 처리된 배양액 LTP 30 및 LTP 60의 경우 CD80, CD86 및 MHC II의 발현과 TNF-α의 생성이 크게 감소됨을 확인하였다. 이를 도 11에 나타내었다.

또한, TNF-α 또는 LPS(Lipopolysaccharide) 처리된 BMDC에서 염증성 사이토카인의 발현을 확인하였다. 본 발명에 사용된 인터루킨 및 사이토카인 중에서, mouse IL-6, IL-17, TNF-α, CXCL1, CCL20, PD-L1, 및 GAPDH의 프라이머 세트는 시판되는 것을 구매하여 사용하였고(Qiagen, Hilden, Germany), human IL-1β, IL-8, IL-10, IFN-γ, 및 TGF-β1의 프라이머 세트를 하기 표 1에 기재된 서열로 합성하여 사용하였다. GAPDH는 음성대조군으로 사용하였다.

hIL-1β	Forward(순방향)	5'ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA3'
	Reverse(역방향)	5'GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT3'
hIL-8	Forward(순방향)	5'ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT3'
	Reverse(역방향)	5'TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCT3'
hIL-10	Forward(순방향)	5' CATCGATTTCTTCCCTGTGAA3'
	Reverse(역방향)	5' TCTTGGAGCTTATTAAAGGCATTC3'
hIFN-γ	Forward(순방향)	5'CTAATTATTCGGTAACTGACTTGA3'
	Reverse(역방향)	5'ACAGTTCAGCCATCACTTGGA3'
hTGF-β1	Forward(순방향)	5'CCCAGCATCTGCAAAGCTC3'
	Reverse(역방향)	5'GTCAATGTACAGCTGCCGCA3'

실험결과, TNF-α 또는 LPS(Lipopolysaccharide) 처리된 BMDC에서 염증성 사이토카인의 발현이 증가하였고, 액상 플라즈마에 의해서는 염증성 사이토카인의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 혈장이 T 세포 활성화 및 분화를 억제하는 DC 활성화를 부정적으로 조절할 수 있음을 시사한다. 상기 결과를 도 12에 나타내었다.

실시예 2-5. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 활성화된 HaCaT(epithelial cell)의 염증 억제 효과 확인

건선과 유사한 피부에서 액상 플라즈마의 염증 억제 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포에서 염증성 인자의 발현을 분석하였다. 이를 위해 먼저, HaCaT 세포를 TNF-α 및 IFN-γ로 활성화시키고, 액상 플라즈마를 처리하고, 건선에 관여하는 인터루킨 및 사이토카인의 유전자 발현을 리얼타임 PCR로 측정 하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. 실험 결과, 액상 플라즈마는 TNF-α 및 IFN-γ에 의해 자극된 HaCaT 세포에서 염증 완화 효과가 있는 것으로 나타났다.

LPS 자극 된 HaCaT 세포에서의 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ, TGF-β1 및 VEGFA 유전자 발현에 대한 액상 플라즈마의 저해 효과도 확인하였다. 실험결과, IL-1β, IL-6, IL-8, 및 IFN-γ는 LPS 자극에 의해 증가한 발현량이 액상 플라즈마 처리에 의해 감소하는 효과가 있었고, IL-10 및 VEGFA는 액상 플라즈마 처리에 의해 발현량이 더 증가하며, TGF-β1은 유의미한 변화가 없는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 14에 나타내었다.

또한, HaCaT에서 STAT3 활성화에 액상 플라즈마가 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. STAT3 활성화는 Th17 세포 분화 및 건선 발병에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 그 결과를 도 15에 나타내었다. 실험 결과, 액상 플라즈마 처리가 IL-6 자극 된 HaCaT 세포에서 STAT3 활성화(pSTAT3)를 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 액상 플라즈마가 STAT3 신호 전달 경로를 억제하여 마우스에서 건선의 억제를 초래할 수 있음을 시사한다.

실시예 2-6. 액상 플라즈마(LTP)에 의한 활성화된 HaCaT과 BMDC 세포에서의 PD-1 발현 증가 확인

본 발명에 따른 액상 플라즈마에 의해 활성화된 HaCaT과 BMDC 세포에서 PD-L1의 발현이 증가되는지 여부를 확인하고, 그 결과를 도 16에 나타내었다. DC에서의 PD-L1 발현은 PD-1 / PD-L1 결합을 통해 T 세포 활성화를 억제한다는 것이 보고되었다. 따라서, PD-L1의 과발현 또는 고 발현은 T 세포의 불활성화를 유도할 수 있고, CD4 + T 세포가 비정상적으로 활성화되는 자가면역질환의 치료에 도움이 될 수 있다고 제안되고 있다. 최근, 재조합 PD-L1의 투여로 마우스에서 IMQ에 의해 유발된 피부 염증이 개선되었다는 보고도 있었다.

실험결과, HaCaT 세포에서 액상 플라즈마 처리가 PD-L1 발현을 유도한다는 것으로 나타났다. 또한, TNFα / IFN-γ- 자극, 또는 LPS- 자극된 HaCaT 세포에서 PD-L1의 RNA 수준이 증가하였고, 자극된 세포에서의 액상 플라즈마 처리는 PD-L1 발현을 더욱 향상시켰다. 이러한 결과는 액상 플라즈마 치료가 PD-L1 유전자 발현의 조절을 통해 건선과 유사한 피부 염증을 완화시킬 수 있음을 시사한다.

실시예 3. 비열 대기압 플라즈마(NTP)와 액상 플라즈마(LTP)의 건선 치료 효과 비교

본 발명의 액상 플라즈마(LTP)와 세포에 대한 플라즈마 직접 처리(NTP)의 효과를 비교하였다. 플라즈마 직접 처리는 액상 플라즈마 제조 시 사용한 것과 동일한 플라즈마 장치를 이용하여, 동일한 조건으로 플라즈마를 발생시키되, TNF-α 및 IFN-γ에 의해 자극된 HaCaT 세포가 배양되고 있는 배양 접시에 플라즈마를 직접 노출시키는 방법을 이용하였다.

상기 액상 플라즈마 또는 플라즈마 직접 처리한 세포들을 비교한 결과, 플라즈마 직접 처리한 세포들은 세포 표면이 건조되는 현상이 나타나는 것으로 분석되었다. 건선에 있어서 보습이 매우 중요하다는 것을 고려할 때, 보습제 등 액상 물질의 형태로 제공할 수 있는 액상 플라즈마의 유용성이 현저한 것으로 판단된다.

상기 실시예 1 내지 3의 결과로부터, 본 발명의 액상 플라즈마가 건선을 포함하는 피부 염증성 질환의 예방 및 치료에 현저하게 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

Claims (11)

1. (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계;
   (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 5kV 내지 20kV의 전압 및 10 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및
   (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 5분 내지 120분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
   
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
7. 제 6항에 있어서,
   상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
8. 제 6항에 있어서,
   상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
9. 제 6항에 있어서,
   상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 방법.
    
11. 제 10항에 있어서,
    상기 T림프구 매개성 피부질환은 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부 홍반성 루푸스(cutaneous lupus erythematosus), 피부 경화증(scleroderma), 건선(psoriasis), 피부 근염(dermatomyositis), 및 만성 피부염(chronic dermatitis)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, T림프구 매개성 피부질환의 예방 또는 치료 방법.
    

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