KR20180032490A

KR20180032490A - 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법

Info

Publication number: KR20180032490A
Application number: KR1020170100291A
Authority: KR
Inventors: 김철호; 이윤상; 이명훈
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2017-08-08
Publication date: 2018-03-30
Also published as: KR20190087358A; KR102062320B1

Abstract

본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 액상 플라즈마는 과민성 면역반응을 억제하는 효과가 현저하므로 아토피성 피부염을 포함하는 면역 과민반응의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법{Method for treating of preventing atopic dermatitis with liquid type plasma}

본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

대표적인 아토피성 피부질환인 아토피성 피부염은 심한 가려움과 이에 따른 2차 감염으로 염증을 동반하는 만성적이고 고질적인 피부염으로, 서구인에게 많아 약 10%의 어린이가 이 병으로 고생하고 있으며 근래에 점차 증가하고 있다. 한국에서도 아토피 피부염이 급격히 증가하고 있으나, 그 치료가 쉽지 않고 원인이 규명되지 않아, 대부분이 증상 치료에 의존하고 있는 실정이다. 최근 아토피 피부염이 면역학적 이상으로 유발된다는 것이 알려지면서 이에 따른 새로운 치료들이 시도되고 있다.

면역반응이 부적절하게 또는 과민하게 나타나는 것을 과민반응(Hypersensitivity)이라고 한다. 제1형 과민반응(Type1 Hypersensitivity)인 알러지성 질환은 항원특이적인 IgE급 항체에 의해 유도되는 반응으로, 같은 항원에 노출되더라도 사람에 따라 이 반응이 나타나지 않을 수도 있고 잘 나타날 수도 있기 때문에, 이 반응을 특이 체질반응이라는 뜻으로 아토피(Atopy)라고도 부른다. 아토피에는 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis) 등이 있다.

인체에서 면역기능을 담당하는 T-헬퍼(Th) 세포에는 Th1과 Th2가 있는데, 이들은 서로 균형을 이루고 있으며 서로의 기능을 억제하는 물질을 분비한다. 그러나, 아토피성 피부염 환자는 Th2 세포가 Th1에 비해 많아 이들간의 불균형을 초래한다. 즉, Th2 세포에서 알레르기에 관여하는 호산구와 IgE 항체를 증가시키는 인터루킨(Interleukin, IL)-4, IL-5, IL-10 등의 분비가 많아지게 되고, 반면에 Th1 세포에서 IgE의 생성을 억제하는 물질의 분비가 감소하게 된다. 이렇게 증가된 IgE에 의해 호염구와 비만세포(Mast Cell)이 활성화된다. IgE 항체가 IgE 수용체(FcεRI)에 결합하고 알러젠이 두개의 FcεRI/IgE 결합체를 교차 연결하여 세포를 활성화하면, 세포내 과립의 방출(Degranulation)이 나타난다. 이때, 히스타민, 류코트리엔 등과 같은 생리활성물질이 세포밖으로 분비되어 강한 소양감, 홍반, 부종, 염증 등의 아토피성 피부염 증상을 유발한다(Cellular and Molecular Immunology, Abbas et al., 2nd Edition, Saunders, Phildelphia, Journal of Dermatological Science, 36, 1-9, 2004).

현재 아토피성 피부염의 치료에는 스테로이드제와 항히스타민제 등의 약물이 많이 사용되고 있으며, 중증에는 면역 억제제가 사용되고 있다. 그러나, 이러한 약물은 대부분 그 효과가 일시적이고, 골다공증, 무혈성괴사, 동맥경화, 녹내장, 발암 가능성 등의 부작용이 심하여 많은 문제점을 가지고 있다. 따라서, 아토피성 피부염의 완화 및 치료를 위하여, 치료 효과가 좋고 부작용이 적으며 지속적인 치료 효과를 나타내는 새로운 치료제의 개발이 절실히 필요하다.

한편, NF-kB는 염증을 일으키는 유전자 발현 기구를 작동시켜 면역반응이나 염증반응에 관여하는 TNF(tumor necrosis factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, GM-CSF, Inos(inducible nitric oxide synthase), ICAM-1(intercellular adhesion molecule 1), E-selectin, MHC class I, II 분자 등의 발현을 증가시키는 전사인자로 알려져 있다. 따라서 NF-kB의 활성 조절이 만성 및 급성 염증 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, NF-kB 억제제는 아토피성 피부염 치료효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 출원인들은 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 과민성 면역반응을 억제하는 효과가 현저하므로 아토피성 피부염을 포함하는 면역 과민반응의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 종래 아토피성 피부염 치료제 문제점을 해결할 수 있고 아토피성 피부염의 근본적인 치료를 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 비만세포의 활성을 억제 시킴으로써 아토피성 피부염을 예방 또는 치료할 수 있는 액상 플라즈마를 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 상기 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 액상 플라즈마는 STAT6 와 NF-kB 등 다양한 면역 과민반응 요소들과알러지 반응에 중요한 비만세포의 활성을 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 액상 플라즈마는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “비열 대기압 플라즈마(non-thermal atmospheric pressure plasma)”란, 저온(cold) 또는 비평형(non-equlibrium) 플라즈마라고도 명명되며 열 플라즈마(thermal plasma)에 반대되는 개념이다. 비교적 낮은 압력 하에서 낮은 에너지를 가지고 쉽게 만들어질 수 있으며, 반응 가스의 온도가 대기의 온도와 비슷하지만 전자의 온도만 그보다 약 10 내지 100 배 높은 상태에 있는 특징이 있다. 상압이나 고압에서의 비열 대기압 플라즈마는 화학적으로 반응성이 매우 큰 반응물을 생성하여, 일반적인 방법으로는 실현되기 어렵거나 불가능한 화학반응을 촉진시킬 수 있는 특성을 가지고 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “액상 플라즈마(Liquid type plasma, LTP)”란, 고밀도 고에너지 플라즈마를 액체 속에서 발생시키는 것을 의미하며, 대기압의 상온 비열 플라즈마(nonthermal plasma, NTP)에 노출시켜 제조될 수 있다. 상기 용어 “액상 플라즈마”는 용어 “플라즈마 처리된 액상 물질(plasma-conditioned liquid material)"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 상기의 “액상 물질”은 액상 형태의 물질은 제한없이 사용 가능하나, 바람직하게는 물, 식염수, 완충액, 또는 배지이고, 가장 바람직하게는 배지이다.

본 발명의 액상 플라즈마는 액상 조성물의 형태로 공급 가능하므로 유통 및 휴대가 편리하고, 보습이 중요한 아토피에 있어서 보습과 치료를 동시에 제공하는 것이 가능하다. 또한, 아토피 피부에 직접 플라즈마를 처리하는 것보다 세포 손상이 적고, 사용자의 잘못된 기기 조작에 의한 화상 등 피부 손상의 위험이 전혀 없으며, 넓고 굴곡된 면적에도 균일하게 도포 가능한 장점이 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “배지(culture media)”란, 인 비트로(in vitro)에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양조건을 선택할 수 있다. 세포의 배양에 사용되는 기본배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 기본 배지에는 예를 들면, DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서 “치료”란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 아토피성 피부염 또는 이로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 아토피성 피부염의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구체예에서 “예방”이란, 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 아토피성 피부염 또는 이로 인한 다른 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 아토피에 치료효과가 있는 본원의 조성물은 아토피성 피부염의 초기증상 또는 증상이 나타나기 전에 본 발명에 따른 액상 플라즈마를 이용하여 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 명세서에 있어서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 플라즈마를 액상 물질에 조사하여 제조한 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.

비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있고, 멸균될 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.

몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함할 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 추가적인 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 또는 폴리머일 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.

본 명세서에 있어서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 약학조성물은 피부 위에 도포하거나 피하 또는 피내에 주사하는 형태로 제공되는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, (a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계; (b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 13kV의 전압 및 15 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및 (c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하고, 상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 5분 내지 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공하며, 상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하고, 상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 액상 플라즈마를 이용한 아토피성 피부염의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, 본 발명의 액상 플라즈마는 과민성 면역반응을 억제하는 효과가 현저하므로, 아토피성 피부염을 포함하는 면역 과민반응의 예방 및 치료에 크게 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, NC/Nga 마우스에 아토피 피부염 유발 인자 및/또는 플라즈마를 처리한 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 아토피 피부염 유발 인자 및/또는 플라즈마 처리된 NC/Nga 마우스의 피부 조직을 H & E 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 아토피 피부염 유발 인자 및/또는 플라즈마 처리된 NC/Nga 마우스의 피부 조직을 톨루이딘 블루 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 아토피 피부염 유발 인자 및/또는 플라즈마 처리된 NC/Nga 마우스의 피부 조직을 EPX 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, IL-4로 자극하고 액상 플라즈마 처리한 HaCaT 세포에서 p-STAT6 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, PMA 및 A23187로 자극하고 액상 플라즈마 처리한 비만세포에서 IL-6 및 TNF-α의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, PMA 및 A23187로 자극하고 액상 플라즈마 처리한 비만세포에서 NF-kB의 활성이 억제됨을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 아토피 피부염에서의 플라즈마 처리 효과 확인

아토피 피부염에서의 플라즈마 처리 효과를 확인하기 위해서, NC/Nga 마우스(6 주령, 수컷, 오리엔트바이오社, 한국)를 무작위로 선정하여 표 1과 같이 처리하였다.

그룹	비고
음성 대조군	아무런 처리를 하지 않음(Non-treatment)
양성 대조군	Biostir(집먼지 진드기) 처리(Biostir only)
플라즈마 대조군	플라즈마(NTP) 처리(NTP only)
플라즈마 실험군	Biostir(집먼지 진드기) 처리 후, 플라즈마(NTP) 처리(Biostir + NTP)

구체적으로, 마우스의 등쪽 털을 완전히 제거한 후, 피부 장벽을 파괴하기 위하여 4 % SDS 용액 200㎕를 도포하고, 아토피 피부염 유발 인자인 Biostir(집먼지 진드기)를 4일에 한번씩, 총 3주 동안 처리하였다. 플라즈마 처리군을 위해서는, 질소(N2) 가스를 비열 대기압 플라즈마 생성원으로 사용하는 플라즈마 발생 장치로 가스 유속 10L/min, 전압 15kVp-p, 및 주파수 15 kHz를 유지하여 발생시킨 플라즈마를 조사하였다. 상기 Biostir 또는/및 플라즈마(NTP) 처리된 마우스의 사진을 도 1에 기재하였다.

조직학적 분석을 위해 마지막 처리 하루 후에 마우스의 피부 조직을 수득하였다. 수득된 등쪽 피부 조직은 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 24 시간 동안 고정하고, 파라핀 포매하여 4.5μm 두께로 박절하였고, H & E(hematoxylin and eosin)염색으로 피부조직의 형태를 관찰하였고, 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색으로 피부조직내 비만세포의 침윤을 조사하였으며, EPX(Eosinophil peroxidase) 항체(Santa Cruz Biotechnology) 염색으로 호산구의 조직 내 유입을 관찰하였다. 상기 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

실험 결과, 음성 대조군과 비교하여 플라즈마 대조군에서는 표피의 형태가 크게 다르지 않은 것으로 나타났으나, 양성 대조군의 경우 표피가 매우 두껍게 다각화되고, 비만세포(mast cell)나 호산구(eosinophils)의 조직 내 유입이 크게 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 플라즈마 실험군의 경우, 양성 대조군에 비하여 표피 두께가 현저하게 감소하고, 비만세포(mast cell)나 호산구(eosinophils)의 조직 내 유입이 음성 대조군보다도 낮은 수준으로 유지하는 것을 알 수 있었다. 이는 플라즈마 처리가 아토피 피부염의 증상을 현저하게 완화시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 2. 아토피 피부염에서의 액상 플라즈마 처리 효과 확인

아토피 피부염에서의 액상 플라즈마 처리 효과를 확인하기 위해서, 사람 각질형성세포(Human keratinocyte cell line, HaCaT), 및 비만세포(mast cell)를 이용하여 실험을 수행하였다. HaCaT 세포는 한국세포주은행으로부터 수득하였고, 비만세포는 C57BL/6 마우스의 골수 세포를 mIL-3(10ng/㎖) 및 mSCF(50ng/㎖)가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 8주간 배양한 뒤, 유세포분석으로 분화 정도를 선별하여 수득하였다. 액상 플라즈마는 상기 실시예 1의 조건으로 발생시킨 플라즈마를 배양 배지(RPMI 1640 또는 DMEM)에 ㎖당 60초간 조사하는 방법으로 제조하였다.

먼저, HaCaT 세포를 액상 플라즈마가 처리된 배양 배지로 교체 한 후 1시간 배양 후 상기 HaCaT 세포를 30ng/㎖의 IL-4(인터루킨-4)로 자극하고, 15분 후에 세포를 수득하여, 웨스턴 블랏팅으로 p-STAT6 (ABcam), 및 STAT6(Cell signaling Technology)의 단백질 발현량을 확인하였다. IL-4는 과민성 활성인자로서, 염증성 사이토카인을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 실험 결과, IL-4와 액상 플라즈마(LTP)를 병용 처리한 그룹에서 IL-4만 처리한 그룹에 비해서 전사활성인자의 인산화(p-STAT6)가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 액상 플라즈마 처리가 면역 과민 반응을 현저하게 완화시킬 수 있음을 의미한다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다.

다음으로, 액상 플라즈마로 한시간 전 처리 한 후, 비만세포를 활성화 시킬 수 있는 PMA(proteain kinase C activator) 50nM, 및 A23187(Calcimycin) 1mM로 비만세포를 자극한 뒤, 6시간을 추가로 배양하고, qPCR로 IL-6(인터루킨-6) 및 TNF-α의 유전자 발현량을 확인하였다. qPCR은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 실험 결과, IL-6와 TNF-α 모두 염증유발인자와 액상 플라즈마(LTP)를 병용 처리한 그룹에서 PMA/A23187 만 처리한 그룹에 비해서 유전자 발현량이 크게 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 6에 나타내었다.

마지막으로, 비만세포를 액상 플라즈마가 처리된 배양 배지로 1 시간 전 처리 후, 상기와 동일하게 비만세포 활성인자로 자극한 뒤, 30분을 추가로 배양하고 웨스턴 블랏팅으로 NF-kB의 활성을 확인하였다. 실험 결과, 염증유발인자와 액상 플라즈마(LTP)를 병용 처리한 그룹에서 염증유발인자만 처리한 그룹에 비해서 NF-kB의 인산화(p-NF-kB)가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다.

실시예 3. 아토피 피부염에서의 플라즈마 직접 처리와 액상 플라즈마 처리의 효과 비교

본 발명의 액상 플라즈마와 세포에 대한 플라즈마 직접 처리의 효과를 비교하였다. 플라즈마 직접 처리는 액상 플라즈마 제조 시 사용한 것과 동일한 플라즈마 장치를 이용하여, 동일한 조건으로 플라즈마를 발생시키되, 표피세포가 배양되고 있는 배양 접시에 플라즈마를 직접 노출시키는 방법을 이용하였다.

상기 액상 플라즈마 또는 플라즈마 직접 처리한 세포들을 비교한 결과, 플라즈마 직접 처리한 세포들은 세포 표면이 건조되는 현상이 나타나는 것으로 분석되었다. 아토피에 있어서 보습이 매우 중요하다는 것을 고려할 때, 보습제 등 액상 물질의 형태로 제공할 수 있는 액상 플라즈마의 유용성이 현저한 것으로 판단된다.

상기 실시예 1 내지 3의 결과로부터, 본 발명의 액상 플라즈마가 아토피 피부염의 증상 완화에 현저하게 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

Claims

(a) 플라즈마 발생 장치에 캐리어 가스를 충진하는 단계;
(b) 상기 플라즈마 발생 장치에 1kV 내지 13kV의 전압 및 15 내지 30kHz의 주파수를 공급하여 플라즈마를 발생시키는 단계; 및
(c) 상기 발생된 플라즈마를 액상 물질에 조사하는 단계를 포함하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서의 캐리어 가스는 질소, 헬륨, 아르곤, 및 산소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서의 조사는 액상 물질의 표면으로부터 0.1cm 내지 15cm 떨어진 거리에서 5분 내지 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서의 액상 물질은 물, 식염수, 완충액, 또는 배지인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 액상 플라즈마 제조 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 유효성분으로 포함하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 6항에 있어서,
상기 약학조성물은 경구용 제형, 비경구용 제형 또는 국소용 제형인 것을 특징으로 하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 6항에 있어서,
상기 약학조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 6항에 있어서,
상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나 이상의 방법으로 제조된 액상 플라즈마를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법.
제 10항에 있어서,
상기 알러지성 질환은 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 음식 알러지(Food Allergy), 또는 아토피성 피부염(Atopic Dermatitis)인, 알러지성 질환의 예방 또는 치료 방법.