WO2018047338A1 - 動物用免疫賦活剤の製造方法、動物用免疫賦活剤及び動物用飼料 - Google Patents

動物用免疫賦活剤の製造方法、動物用免疫賦活剤及び動物用飼料 Download PDF

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正義 矢ノ師
川上　茂樹
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an animal immunostimulant, an animal immunostimulant, and an animal feed using the animal immunostimulant.
  • cold water disease of sweetfish it is bacterial and highly contagious, and it can be seen not only in cultured sweetfish but also in natural sweetfish.
  • Ayu who developed cold water disease, has white body turbidity, as well as symptoms such as bleeding at the bottom of the lid and ulcers on the body surface.
  • Antibiotics have been used to prevent and treat these infectious diseases, but public health problems due to drug residues in livestock and farmed fish and the appearance of multidrug-resistant bacteria have been pointed out. ing. Further, it is known that a long-term administration of antibiotics forms a unique flora in which bacteria having resistance to the drug are selectively increased and causes new diseases. Under these circumstances, the use of antibiotics is banned.
  • Bacillus polymyxa which is a microorganism belonging to the genus Bacillus
  • Bacillus polymixers are known to produce high-molecular-weight levan and proteins by culturing in a medium containing sucrose and a nitrogen source (such as yeast extract).
  • the animal feed containing the Bacillus polymixer described in Patent Document 2 is intended to promote fattening of domestic animals, and the relationship between the Bacillus polymixer and the improvement of immunity has not been studied at all. Absent.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an animal immunostimulant capable of improving the immunity of an animal, an animal immunostimulant, and an animal feed using the animal immunostimulant. .
  • the method for producing an animal immunostimulant of the present invention is obtained in a fermentation pre-stage in which a Bacillus polymixer is cultured at a temperature of more than 25 ° C. to 35 ° C. or less in a medium containing a carbon source and a nitrogen source, Molecular weight of polysaccharides and proteins produced by the Bacillus polymixer by adding an organic acid to the culture after the late fermentation process for storing the obtained culture at 25 ° C. or lower for 30 days or more, and the culture after the late fermentation process And a molecular weight adjusting step for adjusting.
  • an animal immunostimulator of (1) by adding an organic acid to the culture after fermentation, the polysaccharide and protein polymer chains produced by the Bacillus polymixer are disrupted, Since the molecular weight is appropriately adjusted, an animal immunostimulant containing a relatively low molecular weight polysaccharide and a peptide can be obtained.
  • the animal immunostimulant containing the relatively low molecular weight polysaccharide and peptide can improve the immunity of the animal. The reason is not clear, but it is assumed that relatively low molecular weight polysaccharides and peptides improve intestinal flora of animals and activate natural killer cells, thereby preventing infection.
  • the “polysaccharide” refers to a saccharide in which three or more monosaccharide molecules are polymerized.
  • the pH of the culture is adjusted to 5.0 or less by adding an organic acid to the culture. According to this configuration, an animal immunostimulant containing a polysaccharide and a peptide having a molecular weight suitable for further improving the immunity of the animal can be obtained.
  • the said culture medium further contains a vitamin, a mineral, or these combination. According to this structure, fermentation can be promoted.
  • the culture after the molecular weight adjustment step contains a low-molecular polysaccharide having a molecular weight of 1000 or less, and the polysaccharide in the culture It is preferable that content of the said low molecular polysaccharide with respect to whole quantity is 80 mass% or more. According to this configuration, an animal immunostimulant containing a polysaccharide having a molecular weight distribution suitable for further improving the immunity of the animal can be obtained.
  • the content of the low molecular polysaccharide with respect to the total amount of polysaccharide in the culture is preferably 99% by mass or less. According to this configuration, an animal immunostimulant containing a polysaccharide having a molecular weight distribution suitable for further improving the immunity of the animal can be obtained.
  • the low-molecular-weight polysaccharide is preferably levan having a molecular weight of 1000 or less (hereinafter also referred to as “oligolevan”). According to this structure, the animal immunostimulant containing the polysaccharide suitable for further improving the immunity of an animal is obtained.
  • the organic acid is preferably citric acid. Since citric acid is highly safe and can easily adjust the pH of the culture, the molecular weight of polysaccharides and proteins can be easily adjusted.
  • the storage period of the culture is preferably 100 days or less. According to this configuration, the manufacturing cost can be reduced.
  • the carbon source contains a carbohydrate. According to this structure, the production of polysaccharides by the Bacillus polymixer can be promoted.
  • the carbohydrate is preferably a disaccharide. According to this configuration, the production of polysaccharides by the Bacillus polymixer can be further promoted.
  • the disaccharide is preferably sucrose. According to this configuration, it is possible to further promote the production of a polysaccharide (levan) by a Bacillus polymixer.
  • the said nitrogen source contains a yeast extract. According to this configuration, protein production by the Bacillus polymixer can be promoted.
  • the animal immunostimulant of the present invention is an animal immunostimulant containing a polysaccharide and a peptide, comprising a low-molecular polysaccharide having a molecular weight of 1000 or less as the polysaccharide, and the total amount of the polysaccharide Content of the said low molecular polysaccharide is 80 mass% or more, It is characterized by the above-mentioned.
  • an animal immunostimulant containing a polysaccharide having a molecular weight distribution suitable for improving the immunity of animals and a peptide can be provided.
  • the content of the low-molecular polysaccharide with respect to the total amount of the polysaccharide is preferably 99% by mass or less. According to this configuration, an animal immunostimulant containing a polysaccharide having a molecular weight distribution suitable for further improving the immunity of the animal can be provided.
  • the content of the peptide with respect to 100 parts by mass of the polysaccharide is preferably 1 part by mass or more and 20 parts by mass or less. According to this structure, the animal immunostimulant which contains a polysaccharide and a peptide in the ratio suitable for further improving the immunity of an animal can be provided.
  • the low-molecular polysaccharide is preferably levan having a molecular weight of 1000 or less. According to this structure, the animal immunostimulant containing the polysaccharide suitable for improving the immunity of an animal more can be provided.
  • the animal immunostimulant of (14) to (17) may be an immunostimulator for fish and shellfish.
  • the animal immunostimulant of (18) may be an immunostimulant applied to sweetfish, tuna, salmon, eel, puffer, yellowtail, amberjack, red sea bream, or a combination thereof.
  • the animal feed of the present invention is an animal feed containing the animal immunostimulant according to any one of (14) to (19).
  • an animal immunostimulant capable of improving the immunity of an animal can be produced. Moreover, according to the animal immunostimulant and animal feed of the present invention, the immunity of the animal can be improved.
  • the method for producing an animal immunostimulant of the present embodiment was obtained in a fermentation initial step of culturing a Bacillus polymixer at a temperature of more than 25 ° C. and not more than 35 ° C. in a medium containing a carbon source and a nitrogen source, and the fermentation early step. Adjust the molecular weights of the polysaccharides and proteins produced by the Bacillus polymixer by adding organic acids to the late fermentation stage where the culture is stored at 25 ° C. or lower for 30 days or more and the culture after the late fermentation stage And a molecular weight adjusting step.
  • an animal immunostimulant of the present embodiment by adding an organic acid to the culture after fermentation, the molecular weight of the polysaccharide and protein produced by the Bacillus polymixer is appropriately adjusted and compared. An animal immunostimulant containing a low molecular weight polysaccharide and a peptide is obtained.
  • the animal immunostimulant containing the relatively low molecular weight polysaccharide and peptide can improve the immunity of the animal.
  • the manufacturing method of the animal immunostimulant of this embodiment is explained in full detail.
  • the pre-fermentation step is a step of culturing the Bacillus polymixer at a temperature higher than 25 ° C. and lower than 35 ° C. in a medium containing a carbon source and a nitrogen source. In this step, the Bacillus polymixer produces a high molecular weight polysaccharide and a protein.
  • the medium used in this step contains a carbon source and a nitrogen source.
  • the carbon source is preferably a saccharide from the viewpoint of promoting the production of polysaccharides by a Bacillus polymixer, such as monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as sucrose, lactose and maltose, starch, oligosaccharides, Examples thereof include polysaccharides such as glycogen.
  • saccharides those containing disaccharides are more preferred, and those containing sucrose are more preferred.
  • levan is produced by a Bacillus polymixer.
  • the nitrogen source is not particularly limited as long as it becomes a nitrogen source of protein produced by a Bacillus polymixer.
  • Yeast extract, peptone, etc. can be used, and yeast is used from the viewpoint of promoting protein production by the Bacillus polymixer. It is preferable to use an extract.
  • the medium is prepared, for example, by adding the above-described carbon source and nitrogen source to purified water and then sterilizing.
  • the content of the carbon source in the medium is, for example, about 1% by mass to 20% by mass.
  • content of the nitrogen source in a culture medium is about 0.1 mass% or more and 10 mass% or less, for example.
  • other components can be added to the medium in this step to such an extent that the effects of the present invention are not hindered.
  • vitamins, minerals, or combinations thereof are added as other components, fermentation can be promoted.
  • content of the vitamin in a culture medium is about 0.1 mass% or more and about 5 mass% or less, for example.
  • content of the mineral in a culture medium is about 0.01 mass% or more and about 1 mass% or less, for example.
  • the Bacillus polymixer is cultured at a temperature higher than 25 ° C. and lower than 35 ° C.
  • temperature conditions 27 degreeC or more and 32 degrees C or less are preferable from a viewpoint of promoting fermentation.
  • the fermentation time in this process is not specifically limited, For example, it is about 1 week or more and 100 days or less.
  • the late fermentation process is a process of storing the culture obtained in the above-described early fermentation process at 25 ° C. or lower for 30 days or longer. In this step, the molecular weights of the polysaccharides and proteins produced by the Bacillus polymixer in the above-described pre-fermentation step are appropriately adjusted.
  • the culture is stored at 25 ° C. or lower for 30 days or longer.
  • the temperature condition is preferably 6 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher, and even more preferably 20 ° C. or higher from the viewpoint of facilitating the molecular weight adjustment of the polysaccharide and protein in the molecular weight adjusting step described later.
  • As fermentation time (storage period) in this process 100 days or less are preferable from a viewpoint of manufacturing cost reduction.
  • an enzyme preparation or the like can be aseptically added to the medium to the extent that the effects of the present invention are not hindered.
  • the molecular weight adjustment step is a step of appropriately adjusting the molecular weights of the polysaccharides and proteins produced by the Bacillus polymixer by adding an organic acid to the culture after the above-described late fermentation step. In this step, it is preferable to aseptically add the sterilized organic acid to the culture from the viewpoint of preventing contamination of the culture.
  • Organic acid examples include acetic acid, malic acid, and citric acid, and citric acid, and citric acid is preferably used. Since citric acid is highly safe and can easily adjust the pH of the culture, the molecular weight of polysaccharides and proteins can be easily adjusted.
  • PH of culture it is preferable to adjust the pH of the culture to 5.0 or less by adding an organic acid to the culture.
  • an animal immunostimulant containing a polysaccharide and a peptide having a molecular weight suitable for further improving the immunity of the animal can be obtained.
  • the lower limit of the pH of the culture after this step is preferably 4.0.
  • the manufacturing method of the animal immunostimulant of this embodiment may be provided with other processes, such as a solid-liquid separation process, in addition to the process mentioned above.
  • a solid-liquid separation process examples include a step of cooling the culture after the molecular weight adjustment step to 15 ° C. or lower and then filtering.
  • the polysaccharide varies depending on the carbon source and the like of the medium. For example, when sucrose is used as the carbon source, a low molecular weight levan can be obtained. Regarding the molecular weight distribution of the polysaccharide, it is preferable that the content of a low-molecular polysaccharide having a molecular weight of 1000 or less (hereinafter also simply referred to as “low-molecular polysaccharide”) relative to the total amount of polysaccharide in the culture is 80% by mass or more. More preferably, it is 85% by mass or more.
  • the animal immunostimulant containing the polysaccharide which has the molecular weight distribution suitable for improving the immunity of an animal more.
  • the content of the low-molecular polysaccharide with respect to the total amount of polysaccharide is preferably 99% by mass or less, and more preferably 95% by mass or less.
  • the molecular weight distribution of the polysaccharide can be controlled by the type and amount of the organic acid added in the molecular weight adjustment step.
  • (peptide) Peptides are obtained by dividing the protein polymer chain produced by the Bacillus polymixer in the molecular weight adjusting step or the like.
  • the content of the peptide having a molecular weight of 1000 or less relative to the total amount of the peptide in the culture is preferably 80% by mass or more and 85% by mass or more from the same viewpoint as the polysaccharide. More preferred. From the same viewpoint, the content of a peptide having a molecular weight of 1000 or less relative to the total amount of the peptide is preferably 99% by mass or less, and more preferably 95% by mass or less.
  • the molecular weight distribution of the peptide can also be controlled by the type and amount of the organic acid added in the molecular weight adjustment step.
  • the ratio of the polysaccharide and peptide in culture (animal immunostimulant), the content of the peptide with respect to 100 mass parts of polysaccharide is 1 mass part or more and 20 mass parts from a viewpoint of further improving the immunity of an animal. It is preferable that the amount is 1 part by mass or more and 10 parts by mass or less.
  • the ratio between the polysaccharide and the peptide can be controlled, for example, by adjusting the ratio of the carbon source and the nitrogen source in the medium.
  • the animal immunostimulant of this embodiment is an animal immunostimulant containing a polysaccharide and a peptide, which contains a low-molecular polysaccharide having a molecular weight of 1000 or less as the polysaccharide, and the low-molecular-weight polysaccharide with respect to the total amount of polysaccharide.
  • the saccharide content is 80% by mass or more.
  • an animal immunostimulant containing a polysaccharide having a molecular weight distribution suitable for improving animal immunity and a peptide can be provided. Since the animal immunostimulant of this embodiment is the same as the suitable culture (animal immunostimulant) obtained by the manufacturing method of the animal immunostimulant mentioned above, the overlapping description is abbreviate
  • the animal to which the animal immunostimulant of the present embodiment is applied is not particularly limited, but when applied to seafood, the effect of improving immunity can be further exerted.
  • the seafood include sweetfish, tuna, salmon, eel, pufferfish, yellowtail, amberjack, red sea bream, and the like, and can also be applied to seafood that is a combination of these species. Above all, it is effective in preventing the occurrence of cold water disease in sweetfish.
  • the animal feed of this embodiment is an animal feed in which the animal immunostimulant of the above-described embodiment is blended.
  • the animal immunostimulant containing a polysaccharide having a molecular weight distribution suitable for improving the immunity of the animal and the peptide is blended, Performance can be improved.
  • the animal immunostimulant used in the animal feed of the present embodiment is the same as the animal immunostimulant of the above-described embodiment, a duplicate description is omitted.
  • the animal feed of the present embodiment can contain the above-described animal immunostimulant in any amount, but is preferably 0.1% by mass or more and 30% by mass or less in terms of dry mass with respect to the total mass of the feed. Preferably, 0.2 to 20% by mass of the above animal immunostimulant is contained.
  • an animal feed can be produced by mixing the appropriate amount of the animal immunostimulant with a feed raw material.
  • ⁇ Preparation of immunostimulator 1> In purified water, a carbon source (5% by mass of sucrose, 1% by mass of glucose and 1% by mass of ⁇ -starch), a nitrogen source (0.5% by mass of yeast extract), and a vitamin (3% by mass of vegetable extract) , Mineral (Bincho charcoal ash extraction mineral 0.02 mass% and phosphate 0.02 mass%), and then sterilized at 120 ° C. for 15 minutes and cooled to prepare a medium. Bacillus polymixer cultivated in this medium was inoculated, cultured at 30 ° C. for 60 days (early fermentation process), and then stored at room temperature of 20 ° C. to 25 ° C. for 90 days (late fermentation process).
  • the sterilized 50% by mass aqueous citric acid solution is aseptically added to the culture to adjust the pH of the culture to 4.5 (molecular weight adjustment step), and then cooled to 15 ° C. or lower and filtered (solid liquid Separation step), and the obtained filtrate was used as an immunostimulant 1 used in Example 1 described later.
  • the content of levan was 7.8 g / 100 mL and the content of peptide was 0.3 g / 100 mL. Therefore, it turned out that the immunostimulant 1 contains 3.8 mass parts of peptides with respect to 100 mass parts of levan.
  • the immunostimulant 2 used in the comparative example 1 mentioned later was prepared in the same procedure except not having performed the molecular weight adjustment process in preparation of the said immunostimulant 1.
  • the obtained immunostimulant 2 as a result of performing a composition analysis similarly to the immunostimulant 1, it turned out that protein and a peptide are contained 3.8 mass parts in total with respect to 100 mass parts of levan. .
  • test solution 0.2 g of each immunostimulant was collected, and 10 mL of a mixed solution of water, acetonitrile and trifluoroacetic acid (volume ratio 55: 45: 0.1) was added. This solution was allowed to stand at 25 ° C. overnight and then filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 ⁇ m, and the resulting solution was used as a test solution.
  • Ayu (fry stage) used for the test was raised outdoors by pouring groundwater (20 ° C) into a concrete 2t water tank (2m x 3m x 0.35m) so that water was changed four times a day. .
  • This water tank was divided into three test zones, the first test zone, the second test zone, and the third test zone, and 100 ayu (fry stage) that were not infected with cold water disease were introduced into each test zone. At this time, it was confirmed by statistical analysis that no significant difference in body weight occurred between the test groups.
  • Example 1 in which the content of oligolevan relative to the total amount of levan was adjusted to an appropriate range by performing the molecular weight adjustment step, no sweetfish infected with cold water disease was found.
  • Comparative Example 1 in which the molecular weight adjustment step was not performed, 8 sweetfish were infected with cold water disease because the content of oligolevane was small.
  • Comparative Example 2 which did not mix an immunostimulant, 27 sweetfish infected with cold water disease. From these results, it was found that according to the present invention, an animal immunostimulant capable of improving the immunity of animals can be produced.
  • the method for producing an animal immunostimulant of the present invention is suitable as a method for producing an immunostimulant for improving the immunity of an animal to be bred, for example, in the livestock industry, fishery industry and the like.
  • the animal immunostimulant and animal feed of the present invention are suitable for feed for improving the immunity of animals to be bred, for example, in the livestock industry, fishery industry and the like.

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Abstract

本発明は、動物の免疫能を向上させることができる動物用免疫賦活剤の製造方法、動物用免疫賦活剤及びこの動物用免疫賦活剤を用いた動物用飼料を提供することを目的とする。本発明の動物用免疫賦活剤の製造方法は、炭素源及び窒素源を含有する培地においてバチルス・ポリミキサを２５℃超３５℃以下で培養する発酵前期工程と、前記発酵前期工程において得られた培養物を２５℃以下で３０日以上保存する発酵後期工程と、前記発酵後期工程後の培養物に有機酸を添加することによって、前記バチルス・ポリミキサにより生産された多糖類及びタンパク質の分子量を調整する分子量調整工程とを備える。

Description

動物用免疫賦活剤の製造方法、動物用免疫賦活剤及び動物用飼料
　本発明は、動物用免疫賦活剤の製造方法、動物用免疫賦活剤及びこの動物用免疫賦活剤を用いた動物用飼料に関するものである。
　畜産業及び水産業において、毎年、細菌やウイルスによる感染症の流行、蔓延が起こっている。具体的な疾病としては、豚の大腸菌症やサルモネラ症、牛の口蹄疫、鶏のサルモネラ症、アユの冷水病等がある。
　特にアユの冷水病に関しては、細菌性で伝染性が強く、養殖アユだけでなく天然アユでも見られるようになった。冷水病を発症したアユは、体表の白濁が生じる他、鰓蓋下部の出血や体表の潰瘍等の症状が見られる。
　これらの感染症を予防、治療するため、従来から抗生物質が使用されてきたが、畜肉や養殖魚等における薬剤の残留による公衆衛生上の問題や、多剤耐性菌の出現の問題が指摘されている。また抗生物質の長期投与により、その薬剤に耐性を有する菌が選択的に増加した特異な菌叢が形成され、新たな疾病を引き起こすことが知られている。これらの状況から、抗生物質の使用が禁止される方向にある。
　抗生物質投与の代替方法として、免疫を賦活する成分（免疫賦活剤）を配合した動物用飼料を給餌することにより、動物の免疫を高め疾病を予防する方法が検討されている（特許文献１参照）。しかし、上述したアユの冷水病のような伝染性が強い疾病に対しては、従来の免疫賦活剤では充分な効果が得られなかった。
　他方、飼育動物の肥育の促進等を目的として、バチルス属に属する微生物であるバチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ）を配合した動物用飼料が検討されている（特許文献２参照）。バチルス・ポリミキサは、ショ糖及び窒素源（酵母エキス等）を含有する培地で培養することにより、高分子量のレバン及びタンパク質を生産することが知られている。
特開２０１５－１７２０１９号公報 特開２００８－２５３２２６号公報
　しかし、特許文献２に記載のバチルス・ポリミキサを含む動物用飼料は、飼育動物の肥育の促進等を目的とするものであり、バチルス・ポリミキサと免疫能の向上との関係については何ら検討されていない。
　本発明においては、動物の免疫能を向上させることができる動物用免疫賦活剤の製造方法、動物用免疫賦活剤及びこの動物用免疫賦活剤を用いた動物用飼料を提供することを目的とする。
（１）　本発明の動物用免疫賦活剤の製造方法は、炭素源及び窒素源を含有する培地においてバチルス・ポリミキサを２５℃超３５℃以下で培養する発酵前期工程と、前記発酵前期工程において得られた培養物を２５℃以下で３０日以上保存する発酵後期工程と、前記発酵後期工程後の培養物に有機酸を添加することによって、前記バチルス・ポリミキサにより生産された多糖類及びタンパク質の分子量を調整する分子量調整工程とを備える。
　前記（１）の動物用免疫賦活剤の製造方法によれば、発酵後の培養物に有機酸を添加することによって、バチルス・ポリミキサにより生産された多糖類及びタンパク質の高分子鎖が分断され、その分子量が適度に調整されるため、比較的低分子量の多糖類と、ペプチドとを含有する動物用免疫賦活剤が得られる。この比較的低分子量の多糖類とペプチドとを含有する動物用免疫賦活剤は、動物の免疫能を向上させることができる。その理由は定かではないが、比較的低分子量の多糖類とペプチドとが動物の腸内フローラを改善すると共に、ナチュラルキラー細胞を活性化させるため、感染を防ぐことができるものと推測される。なお、上記「多糖類」は、単糖分子が３つ以上重合した糖類をさす。
（２）　前記（１）の動物用免疫賦活剤の製造方法の分子量調整工程において、前記培養物に有機酸を添加することによって前記培養物のｐＨを５．０以下にすることが好ましい。この構成によれば、動物の免疫能をより向上させるのに適した分子量の多糖類及びペプチドを含有する動物用免疫賦活剤が得られる。
（３）　前記（１）又は（２）の動物用免疫賦活剤の製造方法において、前記培地が、ビタミン、ミネラル又はこれらの組み合わせを更に含有することが好ましい。この構成によれば、発酵を促進させることができる。
（４）　前記（１）から（３）の動物用免疫賦活剤の製造方法において、前記分子量調整工程後の培養物が分子量１０００以下の低分子多糖類を含有し、前記培養物中の多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が８０質量％以上であることが好ましい。この構成によれば、動物の免疫能をより向上させるのに適した分子量分布を持つ多糖類を含有する動物用免疫賦活剤が得られる。
（５）　前記（４）の動物用免疫賦活剤の製造方法の分子量調整工程後において、前記培養物中の多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が９９質量％以下であることが好ましい。この構成によれば、動物の免疫能を更に向上させるのに適した分子量分布を持つ多糖類を含有する動物用免疫賦活剤が得られる。
（６）　前記（４）又は（５）の動物用免疫賦活剤の製造方法において、前記低分子多糖類が分子量１０００以下のレバン（以下、「オリゴレバン」ともいう）であることが好ましい。この構成によれば、動物の免疫能を更に向上させるのに適した多糖類を含有する動物用免疫賦活剤が得られる。
（７）　前記（１）から（６）の動物用免疫賦活剤の製造方法において、前記有機酸がクエン酸であることが好ましい。クエン酸は安全性が高い上、培養物のｐＨの調整を容易に行うことができるため、多糖類及びタンパク質の分子量調整が容易となる。
（８）　前記（１）から（７）の動物用免疫賦活剤の製造方法の発酵後期工程において、前記培養物の保存期間が１００日以下であることが好ましい。この構成によれば、製造コストの低減が可能となる。
（９）　前記（１）から（８）の動物用免疫賦活剤の製造方法の発酵後期工程において、前記培養物を６℃以上で保存することが好ましい。この構成によれば、発酵後期工程において多糖類及びタンパク質の分子量が適度に調整されるため、有機酸添加による分子量調整が容易となる。
（１０）　前記（１）から（９）の動物用免疫賦活剤の製造方法において、前記炭素源が糖質を含有することが好ましい。この構成によれば、バチルス・ポリミキサによる多糖類の生産を促進させることができる。
（１１）　前記（１０）の動物用免疫賦活剤の製造方法において、前記糖質が二糖類であることが好ましい。この構成によれば、バチルス・ポリミキサによる多糖類の生産をより促進させることができる。
（１２）　前記（１１）の動物用免疫賦活剤の製造方法において、前記二糖類がショ糖であることが好ましい。この構成によれば、バチルス・ポリミキサによる多糖類（レバン）の生産を更に促進させることができる。
（１３）　前記（１）から（１２）の動物用免疫賦活剤の製造方法において、前記窒素源が酵母エキスを含有することが好ましい。この構成によれば、バチルス・ポリミキサによるタンパク質の生産を促進させることができる。
（１４）　本発明の動物用免疫賦活剤は、多糖類及びペプチドを含有する動物用免疫賦活剤であって、前記多糖類として分子量１０００以下の低分子多糖類を含有し、前記多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が８０質量％以上であることを特徴とする。
　前記（１４）の動物用免疫賦活剤によれば、動物の免疫能を向上させるのに適した分子量分布を持つ多糖類と、ペプチドとを含有する動物用免疫賦活剤を提供できる。
（１５）　前記（１４）の動物用免疫賦活剤において、前記多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が９９質量％以下であることが好ましい。この構成によれば、動物の免疫能を更に向上させるのに適した分子量分布を持つ多糖類を含有する動物用免疫賦活剤を提供できる。
（１６）　前記（１４）又は（１５）の動物用免疫賦活剤において、前記多糖類１００質量部に対する前記ペプチドの含有量が１質量部以上２０質量部以下であることが好ましい。この構成によれば、動物の免疫能を更に向上させるのに適した比率で多糖類及びペプチドを含有する動物用免疫賦活剤を提供できる。
（１７）　前記（１４）から（１６）の動物用免疫賦活剤において、前記低分子多糖類が分子量１０００以下のレバンであることが好ましい。この構成によれば、動物の免疫能をより向上させるのに適した多糖類を含有する動物用免疫賦活剤を提供できる。
（１８）　前記（１４）から（１７）の動物用免疫賦活剤は、魚介類用の免疫賦活剤であってもよい。
（１９）　前記（１８）の動物用免疫賦活剤は、アユ、マグロ類、サケ類、ウナギ類、フグ類、ブリ、カンパチ、マダイ又はこれらの組み合わせに適用する免疫賦活剤であってもよい。
（２０）　本発明の動物用飼料は、前記（１４）から（１９）のいずれかに記載の動物用免疫賦活剤を含有する動物用飼料である。
　前記（２０）の動物用飼料によれば、動物の免疫能を向上させるのに適した分子量分布を持つ多糖類と、ペプチドとを含有する動物用免疫賦活剤が配合されているため、動物の免疫能を向上させることができる。
　本発明の動物用免疫賦活剤の製造方法によれば、動物の免疫能を向上させることができる動物用免疫賦活剤を製造できる。また、本発明の動物用免疫賦活剤及び動物用飼料によれば、動物の免疫能を向上させることができる。
　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
＜動物用免疫賦活剤の製造方法＞
　本実施形態の動物用免疫賦活剤の製造方法は、炭素源及び窒素源を含有する培地においてバチルス・ポリミキサを２５℃超３５℃以下で培養する発酵前期工程と、前記発酵前期工程において得られた培養物を２５℃以下で３０日以上保存する発酵後期工程と、前記発酵後期工程後の培養物に有機酸を添加することによって、前記バチルス・ポリミキサにより生産された多糖類及びタンパク質の分子量を調整する分子量調整工程とを備える。本実施形態の動物用免疫賦活剤の製造方法によれば、発酵後の培養物に有機酸を添加することによって、バチルス・ポリミキサにより生産された多糖類及びタンパク質の分子量が適度に調整され、比較的低分子量の多糖類と、ペプチドとを含有する動物用免疫賦活剤が得られる。この比較的低分子量の多糖類とペプチドとを含有する動物用免疫賦活剤は、動物の免疫能を向上させることができる。以下、本実施形態の動物用免疫賦活剤の製造方法について詳述する。
［発酵前期工程］
　発酵前期工程は、炭素源及び窒素源を含有する培地においてバチルス・ポリミキサを２５℃超３５℃以下で培養する工程である。本工程においてバチルス・ポリミキサは、高分子量の多糖類と、タンパク質とを生産する。
（培地）
　本工程において使用される培地は炭素源及び窒素源を含有する。炭素源としては、バチルス・ポリミキサによる多糖類の生産を促進させる観点から糖質が好ましく、例えばブドウ糖、果糖等の単糖類や、ショ糖、乳糖、麦芽糖等の二糖類、あるいは澱粉、オリゴ糖、グリコーゲン等の多糖類などが挙げられる。糖質の中では、二糖類を含有するものがより好ましく、ショ糖を含有するものが更に好ましい。本工程において炭素源としてショ糖を用いると、バチルス・ポリミキサによりレバンが生産される。
　上記窒素源としては、バチルス・ポリミキサにより生産されるタンパク質の窒素源となるものであれば特に限定されず、酵母エキス、ペプトン等が使用でき、バチルス・ポリミキサによるタンパク質の生産を促進させる観点から酵母エキスを使用することが好ましい。
　培地は、例えば上述した炭素源及び窒素源を精製水に添加した後、殺菌することによって調製される。培地中の炭素源の含有量は、例えば１質量％以上２０質量％以下程度である。また、培地中の窒素源の含有量は、例えば０．１質量％以上１０質量％以下程度である。
　また、本工程における培地には、本発明の効果を妨げない程度に他の成分を添加することができる。例えば、他の成分として、ビタミン、ミネラル又はこれらの組み合わせを添加すると、発酵を促進させることができる。ビタミンを添加する場合、培地中のビタミンの含有量は、例えば０．１質量％以上５質量％以下程度である。また、ミネラルを添加する場合、培地中のミネラルの含有量は、例えば０．０１質量％以上１質量％以下程度である。
（発酵条件）
　本工程では、２５℃超３５℃以下の温度でバチルス・ポリミキサを培養する。温度条件としては、発酵を促進させる観点から２７℃以上３２℃以下が好ましい。なお、本工程における発酵時間は、特に限定されないが、例えば１週間以上１００日以下程度である。
［発酵後期工程］
　発酵後期工程は、上述した発酵前期工程において得られた培養物を２５℃以下で３０日以上保存する工程である。本工程では、上述した発酵前期工程においてバチルス・ポリミキサにより生産された多糖類及びタンパク質の分子量が適度に調整される。
（発酵条件）
　発酵後期工程では、培養物を２５℃以下で３０日以上保存する。温度条件としては、後述する分子量調整工程において多糖類及びタンパク質の分子量調整を容易にする観点から、６℃以上が好ましく、１０℃以上がより好ましく、２０℃以上が更に好ましい。また、本工程における発酵時間（保存期間）としては、製造コスト低減の観点から１００日以下が好ましい。なお、本工程においては、本発明の効果を妨げない程度に酵素製剤等を培地に無菌的に添加することもできる。
［分子量調整工程］
　分子量調整工程は、上述した発酵後期工程後の培養物に有機酸を添加することによって、バチルス・ポリミキサにより生産された多糖類及びタンパク質の分子量を適度に調整する工程である。本工程では、培養物の汚染防止の観点から、殺菌した有機酸を培養物に無菌的に添加することが好ましい。
（有機酸）
　本工程で使用される有機酸としては、例えば酢酸、リンゴ酸、クエン酸等が挙げられ、クエン酸を用いるのが好ましい。クエン酸は安全性が高い上、培養物のｐＨの調整を容易に行うことができるため、多糖類及びタンパク質の分子量調整が容易となる。
（培養物のｐＨ）
　本工程において培養物に有機酸を添加することによって、培養物のｐＨを５．０以下にすることが好ましい。培養物のｐＨを５．０以下にすることにより、動物の免疫能をより向上させるのに適した分子量の多糖類及びペプチドを含有する動物用免疫賦活剤が得られる。同様の観点から、本工程後の培養物のｐＨの下限としては４．０が好ましい。
［他の工程］
　本実施形態の動物用免疫賦活剤の製造方法は、上述した工程以外に、固液分離工程等の他の工程を備えていてもよい。上記固液分離工程としては、例えば分子量調整工程後の培養物を１５℃以下に冷却した後、ろ過する工程が挙げられる。
［培養物（動物用免疫賦活剤）］
　上述した各工程を経て、比較的低分子量の多糖類と、ペプチドとを含有する培養物（動物用免疫賦活剤）が得られる。この比較的低分子量の多糖類とペプチドとを含有する培養物は、動物の免疫能を向上させることができる。
（多糖類）
　多糖類としては、培地の炭素源等により異なるが、例えばショ糖を炭素源とした場合は低分子量のレバンが得られる。多糖類の分子量分布については、培養物中の多糖類全量に対する分子量１０００以下の低分子多糖類（以下、単に「低分子多糖類」ともいう）の含有量が８０質量％以上であることが好ましく、８５質量％以上であることがより好ましい。この場合、動物の免疫能をより向上させるのに適した分子量分布を持つ多糖類を含有する動物用免疫賦活剤とすることができる。同様の観点から、多糖類全量に対する低分子多糖類の含有量が９９質量％以下であることが好ましく、９５質量％以下であることがより好ましい。なお、多糖類の分子量分布は、上記分子量調整工程において添加する有機酸の種類や添加量等により制御できる。
（ペプチド）
　ペプチドは、バチルス・ポリミキサにより生産されたタンパク質の高分子鎖が上記分子量調整工程等において分断されて得られる。ペプチドの分子量分布についても、上記多糖類と同様の観点から、培養物中のペプチド全量に対する分子量１０００以下のペプチドの含有量が８０質量％以上であることが好ましく、８５質量％以上であることがより好ましい。同様の観点から、ペプチド全量に対する分子量１０００以下のペプチドの含有量が９９質量％以下であることが好ましく、９５質量％以下であることがより好ましい。なお、ペプチドの分子量分布についても、上記分子量調整工程において添加する有機酸の種類や添加量等により制御できる。
（多糖類とペプチドとの比率）
　培養物（動物用免疫賦活剤）中の多糖類とペプチドとの比率については、動物の免疫能を更に向上させる観点から、多糖類１００質量部に対するペプチドの含有量が１質量部以上２０質量部以下であることが好ましく、１質量部以上１０質量部以下であることがより好ましい。多糖類とペプチドとの比率は、例えば培地中の炭素源と窒素源との比率等を調整することにより制御できる。
（その他の成分）
　培養物（動物用免疫賦活剤）には、上述した成分以外に、例えばバチルス・ポリミキサの残渣や、培地に含まれる成分、あるいは発酵後期工程、分子量調整工程等で必要に応じて添加した成分等が含まれていてもよい。
＜動物用免疫賦活剤＞
　次に、本発明の動物用免疫賦活剤の好適な実施形態について説明する。本実施形態の動物用免疫賦活剤は、多糖類及びペプチドを含有する動物用免疫賦活剤であって、多糖類として分子量１０００以下の低分子多糖類を含有し、多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が８０質量％以上であることを特徴とする。本実施形態の動物用免疫賦活剤によれば、動物の免疫能を向上させるのに適した分子量分布を持つ多糖類と、ペプチドとを含有する動物用免疫賦活剤を提供できる。本実施形態の動物用免疫賦活剤は、上述した動物用免疫賦活剤の製造方法で得られる好適な培養物（動物用免疫賦活剤）と同様であるため、重複する説明は省略する。
　本実施形態の動物用免疫賦活剤が適用される動物は、特に限定されないが、魚介類に適用すると、免疫能を向上させる効果をより発揮させることができる。魚介類としては、アユ、マグロ類、サケ類、ウナギ類、フグ類、ブリ、カンパチ、マダイ等が挙げられ、これらの複数種を組み合わせた魚介類に適用することもできる。中でも、アユの冷水病の発生防止に効果的である。
＜動物用飼料＞
　次に、本発明の動物用飼料の好適な実施形態について説明する。本実施形態の動物用飼料は、上述した実施形態の動物用免疫賦活剤が配合された動物用飼料である。本実施形態の動物用飼料によれば、動物の免疫能を向上させるのに適した分子量分布を持つ多糖類と、ペプチドとを含有する動物用免疫賦活剤が配合されているため、動物の免疫能を向上させることができる。本実施形態の動物用飼料で用いられる動物用免疫賦活剤は、上述した実施形態の動物用免疫賦活剤と同様であるため、重複する説明は省略する。
　本実施形態の動物用飼料は、上記動物用免疫賦活剤を任意の量で含有することができるが、飼料総質量に対して乾燥質量で好ましくは０．１質量％以上３０質量％以下、より好ましくは０．２質量％以上２０質量％以下の上記動物用免疫賦活剤を含有する。例えば上記適切な量の動物用免疫賦活剤を飼料原料と混合し、動物用飼料を製造することができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　アユの冷水病の予防効果に関し、以下に示す方法により本発明の実施例及び比較例について検討した。
＜免疫賦活剤１の調製＞
　精製水に、炭素源（ショ糖５質量％、ブドウ糖１質量％及びα－澱粉１質量％）と、窒素源（酵母エキス０．５質量％）と、ビタミン（野菜抽出エキス３質量％）と、ミネラル（備長炭灰抽出ミネラル０．０２質量％及びリン酸塩０．０２質量％）とを配合した後、１２０℃で１５分間殺菌し、冷却して培地を調製した。この培地に訓養したバチルス・ポリミキサを植菌し、３０℃で６０日間培養し（発酵前期工程）、その後、２０℃～２５℃の室温にて９０日間保存した（発酵後期工程）。次いで、殺菌した５０質量％クエン酸水溶液を培養物に無菌的に添加することによって培養物のｐＨを４．５にした後（分子量調整工程）、１５℃以下に冷却してろ過し（固液分離工程）、得られたろ液を後述する実施例１で使用する免疫賦活剤１とした。得られた免疫賦活剤１について公知の方法で組成分析を行った結果、レバンの含有量は７．８ｇ／１００ｍＬであり、ペプチドの含有量は０．３ｇ／１００ｍＬであった。よって、免疫賦活剤１は、レバン１００質量部に対してペプチドを３．８質量部含有していることが分かった。
＜免疫賦活剤２の調製＞
　上記免疫賦活剤１の調製において分子量調整工程を行わなかったこと以外は同様の手順にて後述する比較例１で使用する免疫賦活剤２を調製した。なお、得られた免疫賦活剤２について、免疫賦活剤１と同様に組成分析を行った結果、レバン１００質量部に対してタンパク質及びペプチドを合計３．８質量部含有していることが分かった。
＜免疫賦活剤中のレバンの分子量分布＞
　上記免疫賦活剤１及び免疫賦活剤２に含まれるレバンの分子量分布は、以下に示す方法にて測定した。
［標準溶液の調製］
　下記表１に示す分子量標準品を水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混合液（容量比で５５：４５：０．１）に溶解させて０．０５～０．１Ｗ／Ｖ％の標準溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［試験溶液の調製］
　各免疫賦活剤０．２ｇを採取し、水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混合液（容量比で５５：４５：０．１）１０ｍＬを加えた。この溶液を２５℃で一晩放置した後、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、得られた溶液を試験溶液とした。
［分子量分布の測定］
　上述した標準溶液及び試験溶液について、下記に示す高速液体クロマトグラフ操作条件で測定し、得られた結果を島津製作所社の「ＣＬＡＳＳ－ＶＰ用ＧＰＣオプションソフトウェア」により解析した。なお、各ピークの分子量の推定は、分子量標準品の溶出時間及び分子量をもとに作成した検量線を用いて行った。
（高速液体クロマトグラフ操作条件）
機種：昭和電工社の「Shodex GPC-101」
検出器：昭和電工社の紫外分光光度計「UV-41」
カラム：東ソー社の「TSKgel G2500PWXL（φ7.8mm×300mm）」
カラム温度：４０℃
移動相：水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混合液（容量比で５５：４５：０．１）
液量：０．５ｍＬ／分
測定波長：２２０ｎｍ
測定レンジ：０．０３２ＡＵＦＳ
注入量：２０μＬ
＜アユ用飼料の調製＞
　市販の飼料（日本配合飼料社の「ＥＰ-２Ｃ」）１００質量部に対して、上述した免疫賦活剤１及び免疫賦活剤２をそれぞれ１０質量部混合し、実施例１及び比較例１のアユ用飼料を調製した。また、免疫賦活剤を混合しないアユ用飼料（日本配合飼料社の「ＥＰ-２Ｃ」）を比較例２のアユ用飼料として用いた。これらの飼料は４℃にて冷蔵保存を行った。
＜試験区の設定＞
　試験に用いるアユ（稚魚期）の飼育は、屋外において、コンクリート製の２ｔ水槽（２ｍ×３ｍ×０．３５ｍ）に地下水（２０℃）を１日４回換水されるように注水して行った。この水槽を第１試験区、第２試験区及び第３試験区の３つの試験区に区分けし、各試験区に冷水病に感染していないアユ（稚魚期）を１００匹ずつ導入した。なお、この際、統計分析により各試験区の間で体重における有意な差が生じていないことを確認した。
＜アユへの給餌方法＞
　上述したアユ用飼料を各試験区へ給餌する方法としては、ヤマハ社の自動給餌器「ＹＤＦ－１６０ＳＯ」を用い、タイマーを使用して１日３回（９時、１３時、１７時）、目視により観察しながら満腹まで食べさせる方法（飽食摂餌）を採用した。この際、第１試験区には実施例１のアユ用飼料、第２試験区には比較例１のアユ用飼料、第３試験区には比較例２のアユ用飼料をそれぞれ給餌した。この給餌方法により６０日間飼育した。
＜冷水病の確認方法＞
　６０日間の飼育期間中、アユの体表に白濁が生じたことを目視で確認できた場合、当該アユが冷水病に感染したものと判断した。この目視確認を各試験区で行い、飼育期間中に冷水病に感染したアユの個体数を計測した。結果を表２に示す。なお、表２において、レバン全量に対するオリゴレバン（分子量１０００以下のレバン）の含有量は、レバンとペプチド（又はタンパク質）との比率、及び上述した分子量分布の測定結果から算出したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、分子量調整工程を行うことによってレバン全量に対するオリゴレバンの含有量を適切な範囲とした実施例１については、冷水病に感染したアユは見られなかった。一方、分子量調整工程を行わなかった比較例１については、オリゴレバンの含有量が少ないため、８匹のアユが冷水病に感染した。また、免疫賦活剤を混合しなかった比較例２については、２７匹のアユが冷水病に感染した。これらの結果から、本発明によれば、動物の免疫能を向上させることができる動物用免疫賦活剤を製造できることが分かった。
　本発明の動物用免疫賦活剤の製造方法は、例えば畜産業、水産業等において、飼育する動物の免疫能を向上させるための免疫賦活剤の製造方法として好適である。また、本発明の動物用免疫賦活剤及び動物用飼料は、例えば畜産業、水産業等において、飼育する動物の免疫能を向上させるための飼料に好適である。

 

Claims (20)

  1. 　炭素源及び窒素源を含有する培地においてバチルス・ポリミキサを２５℃超３５℃以下で培養する発酵前期工程と、
    　前記発酵前期工程において得られた培養物を２５℃以下で３０日以上保存する発酵後期工程と、
    　前記発酵後期工程後の培養物に有機酸を添加することによって、前記バチルス・ポリミキサにより生産された多糖類及びタンパク質の分子量を調整する分子量調整工程と
    を備える動物用免疫賦活剤の製造方法。
  2. 　前記分子量調整工程において、前記培養物に有機酸を添加することによって前記培養物のｐＨを５．０以下にする請求項１に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  3. 　前記培地が、ビタミン、ミネラル又はこれらの組み合わせを更に含有する請求項１又は請求項２に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  4. 　前記分子量調整工程後の培養物が分子量１０００以下の低分子多糖類を含有し、
    　前記培養物中の多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が８０質量％以上である請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  5. 　前記分子量調整工程後において、前記培養物中の多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が９９質量％以下である請求項４に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  6. 　前記低分子多糖類が分子量１０００以下のレバンである請求項４又は請求項５に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  7. 　前記有機酸がクエン酸である請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  8. 　前記発酵後期工程において、前記培養物の保存期間が１００日以下である請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  9. 　前記発酵後期工程において、前記培養物を６℃以上で保存する請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  10. 　前記炭素源が糖質を含有する請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  11. 　前記糖質が二糖類である請求項１０に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  12. 　前記二糖類がショ糖である請求項１１に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  13. 　前記窒素源が酵母エキスを含有する請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤の製造方法。
  14. 　多糖類及びペプチドを含有する動物用免疫賦活剤であって、
    　前記多糖類として分子量１０００以下の低分子多糖類を含有し、
    　前記多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が８０質量％以上であることを特徴とする動物用免疫賦活剤。
  15. 　前記多糖類全量に対する前記低分子多糖類の含有量が９９質量％以下である請求項１４に記載の動物用免疫賦活剤。
  16. 　前記多糖類１００質量部に対する前記ペプチドの含有量が１質量部以上２０質量部以下である請求項１４又は請求項１５に記載の動物用免疫賦活剤。
  17. 　前記低分子多糖類が分子量１０００以下のレバンである請求項１４から請求項１６のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤。
  18. 　魚介類用の免疫賦活剤である請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤。
  19. 　前記魚介類が、アユ、マグロ類、サケ類、ウナギ類、フグ類、ブリ、カンパチ、マダイ又はこれらの組み合わせである請求項１８に記載の動物用免疫賦活剤。
  20. 　請求項１４から請求項１９のいずれか１項に記載の動物用免疫賦活剤が配合された動物用飼料。

     
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