KR20240049724A - 신규 산화질소 공여전달체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 저분자량의 레반을 포함하는 산화질소 공여전달체(Nitric Oxide Donor Transpoter, NODT)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 저분자량 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 산화질소 전달체 조성물은 우수한 항염증 효능, 혈관이완 효능 및 면역 증진 효능을 가지고 있으므로, 의약품 또는 건강식품 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 산화질소 공여전달체 및 그의 용도{Novel nitric oxide donor transporters and uses thereof}
본 발명은 신규 산화질소 공여전달체(Nitric Oxide Donor Transpoter, NODT), 이의 제조방법, 상기 산화질소 전달체을 포함하는 항염증 또는 면역증진용 조성물로의 용도에 관한 것이다.
레반(Levan)은 많은 식물과 미생물에 존재하는 자연 발생 프룩탄이다. 이 중합체는 2,6 베타 글리코시드 결합으로 연결된 단당류인 과당으로 구성된다. 레반은 상대적으로 낮은 분자량의 분지형 및 선형 구조를 모두 가질 수 있다. 분지된 레반은 길이가 9 단위인 기초 사슬을 가진 매우 작은 구형 구조를 형성한다. 2,1 분지는 메틸 에테르가 구형을 형성하고 생성하도록 한다. 레반의 끝은 또한 글루코실 잔기를 포함하는 경향이 있다. 분지형 레반은 선형 구조보다 더 안정적인 경향이 있다. 그러나, 가지의 양과 중합의 길이는 종에 따라 달라지는 경향이 있다. 가장 짧은 레반은 2개의 과당 분자와 말단 포도당 분자의 사슬인 6-케스토스이다.
레반은 고세균, 균류, 박테리아 및 일부 식물 종에서 합성된다. 레반은 포도당과 과당을 포함하는 이당류인 자당에서 합성된다. 식물에서 액포는 프럭탄 생산이 일어나는 곳이다. Sucrose:sucrose/fructan 6-fructosyltransferase는 액포에서 fructosyltransferase로 베타 2,6 연결을 생성하여 선형 형태의 레반을 형성한다. 박테리아는 또한 레반을 형성하기 위해 levansucrase로 알려진 fructosyltransferase를 사용한다. 박테리아의 이러한 효소는 레반의 선형 기저 사슬에서 2,1 연결을 형성하여 분기점이 발생하도록 한다. 많은 박테리아가 세포 외부에서 레반을 생성한다.
레반은 식품, 음료, 화장품, 심지어 의약품과 같은 많은 산업 분야에서 제품에 사용되고 있다. 이처럼 다용도로 사용될 수 있는 이유는 레반은 피부나 눈에 어떤 형태의 자극도 일으키지 않으며 알레르기 반응을 나타내지 않으며 세포 독성의 위협도 제기하지 않기 때문이다. 식품 산업에서 레반은 프리바이오틱 효과 및 콜레스테롤 저하 능력이 알려져 있으며, 유제품에 섬유질이나 감미료로 포함되거나 무알코올 음료의 초고과당 시럽에 사용된다. 화장품 산업에서 레반은 다양한 젤과 무스에 사용되는 모발 유지 효과를 생성하는 필름을 형성하는 역할을 하고, 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백에 사용할 수 있다. 의약품 산업에서 레반은 화상 조직, 항염증 및 양식에 사용된다. 레반을 박막으로 결합함으로써 회복 및 치유 과정을 증가시키는 메탈로프로테이나제로 알려진 효소를 활성화할 수 있고, 레반은 응집 세포와 상호 작용하고 혈관에 대한 접착에 영향을 주어 축적을 감소시키며, Pantoea aglomerans ZMR7에 의해 생산된 레반은 치료되지 않은 암세포에 비해 횡문근육종(RD) 및 유방암(MDA) 세포의 생존력을 감소시키는 것으로 보고된 바 있다.
본 발명자는 사과, 당근 및 비트의 혼합 주스의 발효물로부터 유효 친수성 물질을 추출하였고, 상기 유효 친수성 물질의 성분 분석 결과, 저분자량의 레반, 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하며, 상기 유효 친수성 물질의 효능 분석 결과, 우수한 항염증 효능, 혈관이완 효능 및 면역증진 효능을 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 저분자량의 레반을 포함하는 산화질소 공여전달체(Nitric Oxide Donor Transpoter, NODT)를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 본 발명에 따른 산화질소 공여전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 산화질소 공여전달체를 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 산화질소 공여전달체를 포함하는 혈관이완용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 산화질소 공여전달체를 포함하는 면역증진용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 비트즙, 당근즙 및 사과즙을 혼합한 혼합 주스의 발효물을 제조하는 단계;
ii) 상기 혼합 주스의 발효물에 증류수를 첨가한 후 원심분리하여 상층액을 분리하여 수득하는 단계;
iii) 상기 상층액을 농축 후 건조시킨 다음, 알코올류 용매를 첨가하여 분산시킨 후 원심분리하여 상층액을 제거하여 침전물을 수득하는 단계; 및
iv) 상기 침전물에 증류수를 첨가한 후 분산시킨 다음, 동결 건조하여 유효 친수성 성분을 수득하는 단계;를 포함하는,
분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관이완용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관이완용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 건강식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 종래 알려진 레반과 달리 저분자량의 레반을 포함하는 조성물을 획득하였으며, 상기 조성물은 In Vitro 및 In Vivo에서 우수한 항염증 효능, 혈관이완 효능 및 면역 증진 효능을 가지고 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 저분자량의 레반을 포함하는 조성물은 항염증, 혈관이완 또는 면역 증진을 위한 약학적 조성물, 건강식품 또는 일반식품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 비교예로서 시그마 알드리치 레반(표준시약)의 GPC(Gel permeation chromatography) 분석에 의한 분자량 분포를 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 GPC 분석에 의한 분자량 분포를 보여주는 그림이다.
도 3은 비교예로서 시그마 알드리치 레반(표준시약)의 NMR(Nuclear Magnet Resonance spectrometer) 1H-NMR 분석에 의한 분자 구조를 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 NMR 1H-NMR 분석에 의한 분자 구조를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 NMR 1H-NMR 분석에서 레반 검출 범위가 3.5 ~ 4.3 ppm를 확대한 그림이다.
도 6은 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 NMR 1H-NMR 분석에서 타유효 친수성 물질 피크 검출을 보여주는 그림이다.
도 7은 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 NMR 1H-NMR 분석에서 betanin의 존재를 보여주는 그림이다.
도 8은 비교예로서 시그마 알드리치 레반(표준시약)의 GC-MS(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer) 분석에 의한 분자 구조를 보여주는 그림이다.
도 9는 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 GC-MS 분석에 의한 분자 구조를 보여주는 그림으로서, 레반의 존재를 보여주는 그림이다.
도 10은 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 GC-MS 분석에서 단당류(monosaccharide)의 존재를 보여주는 그림이다.
도 11은 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 GC-MS 분석에서 이당류(disaccharide)의 존재를 보여주는 그림이다.
도 12는 본 발명에 따른 유효 친수성 물질의 GC-MS 분석에서 다당류(polysaccharide)의 존재를 보여주는 그림이다.
도 13은 LPS 처리된 CaCo2 세포에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(BJ) 및 베타닌이 ROS 생성에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. A는 처리된 세포의 형광 현미경 이미지이고, B는 LPS, BJ 및 베타닌으로 처리된 CaCo2 세포에서 ROS의 형광 강도를 측정한 결과 그래프이다(n=4, *p<0.05, **p<0.01, ##p<0.01).
도 14는 DSS 유도 대장염 마우스에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(BJ) 및 베타닌이 질병 활성 지수(DAI)에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. A는 쥐의 항문과 대변 이미지이고, B는 DSS 유도 대장염 마우스의 질병 활성 지수(DAI)를 측정한 결과 그래프이다(n=6-9, *p<0.05, **p<0.01, ##p<0.01, ###p<0.001).
도 15는 DSS 유도 대장염 마우스에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(BJ) 및 베타닌이 대장 길이에 미치는 영향을 보여주는 그림이다(n=6-9, *p<0.05, ###p<0.001).
도 16은 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 주간 체중에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 17은 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 비장 조직 중량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(A: 조직 절대 중량, B: 체중 대비 상대 중량, p<0.05).
도 18은 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 흉선 조직 중량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(A: 조직 절대 중량, B: 체중 대비 상대 중량, p<0.05).
도 19는 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 혈중 백혈구 함량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 20은 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 혈중 과립구 함량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 21은 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 혈중 림프구 함량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 22는 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 혈중 중간구 함량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 23은 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 혈중 TNF-α 함량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 24는 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 혈중 IFN-γ 함량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 25는 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 혈중 IL-2 함량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 26은 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 비장 조직에 미치는 영향을 보여주는 그림이다(A:Normal, B: Control, C: NOD 125 mg/kg, D: NOD 625 mg/kg, E: NOD 1250 mg/kg, F: HemoH 1000 mg/kg, 4x, scale bar = 100 um).
도 27은 Cyclophosphomide로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 비장 조직에 미치는 영향을 보여주는 그림이다(A:Normal, B: Control, C: NOD 125 mg/kg, D: NOD 625 mg/kg, E: NOD 1250 mg/kg, F: HemoH 1000 mg/kg, 10x, scale bar = 100 um).
도 28은 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 비장세포 생존률에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 29는 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 Cyclophosphomide 처리된 비장세포의 생존률을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 30은 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 AR42J 세포의 생존률에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 31은 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 자연 살해 세포 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
도 32는 본 발명에 따른 유효 친수성 물질(NOD)이 Cyclophosphomide 처리된 비장세포의 TNF-α 생성량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(p<0.05).
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 상세한 설명은 생략할 수 있다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적 의미로 한정되어 해석되지 아니하며, 본 발명의 기술적 사항에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예이며, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것이 아니므로, 본 출원 시점에서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있다.
본 발명은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반 외에 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및/또는 이당류(disaccharide)를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물은 산화질소 전달체(Nitric Oxide Transpoter, NOT)로서 기능을 할 수 있다.
상기 조성물은 비트즙, 당근즙 및 사과즙으로 구성된 혼합 주스의 발효물로부터 추출된 추출물 또는 이의 분획물로부터 획득할 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 비트즙, 당근즙 및 사과즙을 혼합한 혼합 주스의 발효물을 제조하는 단계;
ii) 상기 혼합 주스의 발효물에 증류수를 첨가한 후 원심분리하여 상층액을 분리하여 수득하는 단계;
iii) 상기 상층액을 농축 후 건조시킨 다음, 알코올류 용매를 첨가하여 분산시킨 후 원심분리하여 상층액을 제거하여 침전물을 수득하는 단계; 및
iv) 상기 침전물에 증류수를 첨가한 후 분산시킨 다음, 동결 건조하여 유효 친수성 성분을 수득하는 단계;를 포함하는,
분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 비트즙은 비트를 세척한 후, 껍질을 벗기는 제1 단계; 및 상기 비트를 착즙하는 제2 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
여기서, 상기 제1단계에서 비트는 껍질을 벗긴 다음, 200 내지 250℃에서 30초 내지 1분간 굽는 공정을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2단계 이후 착즙액을 0 내지 10℃에서 3일 내지 4일간 저온 숙성하는 공정을 더 포함할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 비트즙, 당근즙 및 사과즙은 각각 20 내지 50 중량%, 10 내지 30 중량% 및 30 내지 50 중량%으로 혼합할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 미생물은 아르스롭시스 트런카타(Arthropsis truncata), 키프로나나(Coniochaeta cipronana), 브레비박테리움 래벤스퍼젠스(brevibacterium ravenspurgense), 브라키박테리움 후광마아렌스(Brachybacterium huguangmaarense) 및 아르트로박터 크리탈로포이에테스(Arthrobacter crystallopoietes)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종 이상일 수 있으며, 상기 미생물은 수탁번호 KACC 83040BP로 기탁된 아르스롭시스 트런카타(Arthropsis truncata) BRF-1 균주, 수탁번호 KACC 83039BP로 기탁된 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주, 수탁번호 KACC 81149BP로 기탁된 브레비박테리움 래벤스퍼젠스(brevibacterium ravenspurgense) BRM 균주, 수탁번호 KACC 81150BP로 기탁된 브라키박테리움 후광마아렌스(Brachybacterium huguangmaarense) BRM-3 균주, 및 수탁번호 KACC 81151BP로 기탁된 아르트로박터 크리탈로포이에테스(Arthrobacter crystallopoietes) BRM-9 균주로 구성된 군으로부터 선택된 어느 한 종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관이완용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 혼합약재 추출물을 함유하는조성물의 투여로 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 혼합약재 추출물을 함유하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 혼합약재 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관이완용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "건강식품"은, 건강기능식품, 건강보조식품 또는 일반식품을 모두 포함하는 것으로 의미한다.
상기 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
상기 건강식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량%에 1 중량% 내지 15 중량% 포함되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.
<실시예 1> 유효 친수성 물질의 제조
<1-1> 혼합 주스의 준비
비트 1Kg을 깨끗한 물에 세척한 뒤 껍질을 벗긴 후, 착즙기를 이용하여 착즙하여 비트 착즙액을 얻었다. 이후 당근즙 및 사과즙을 첨가해 잘 섞어 혼합물을 제조한 후, 5℃의 저장고에서 3일 동안 저온 숙성하였다. 이때, 비트즙, 당근즙 및 사과즙은 2 : 2 : 6의 중량 비율로 혼합하여 혼합 주스를 제조하였다.
상기 혼합 주스 100 mg에 수탁번호 KACC 83040BP로 기탁된 아르스롭시스 트런카타(Arthropsis truncata) BRF-1 균주, 수탁번호 KACC 83039BP로 기탁된 코니오차이타 키프로나나(Coniochaeta cipronana) BRF-B4 균주, 수탁번호 KACC 81149BP로 기탁된 브레비박테리움 래벤스퍼젠스(brevibacterium ravenspurgense) BRM 균주, 수탁번호 KACC 81150BP로 기탁된 브라키박테리움 후광마아렌스(Brachybacterium huguangmaarense) BRM-3 균주, 및 수탁번호 KACC 81151BP로 기탁된 아르트로박터 크리탈로포이에테스(Arthrobacter crystallopoietes) BRM-9 균주 5종을 각각 농도별(0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg 및 8 mg)로 첨가한 후, 상온에서 1 ~ 10일 동안 발효시켰다.
이렇게 제조한 발효물을 펄스전기장치(Pulsed Electric Field, PEF)를 이용하여 비가열 저온 멸균하였다.
<1-2> 유효 친수성 물질의 추출
상기 실시예 <1-1>에서 제조된 혼합 주스에 DIW를 첨가하여 녹인 후, 8000 RPM, 30분, 5℃로 원심분리(1차 필터: 비수용성 불순물 제거 공정)하여 상층액을 분리(레반 + 수용성 불순물이 용해됨)하였다. 그런 다음, 상기 상층액을 증발기(evaporator)를 이용하여 80 RPM, 50℃, 120 mbar로 농축하였다. 그런 다음, 상기 농축액을 80 RPM, 47℃, 120 mbar로 건조시켰다. 농축액을 건조시킨 후, 이소프로필알코올(isopropyl alcohol, IPA)을 1 : 4의 부피 비율로 첨가하여 분산시킨 후, 8000 RPM, 30분, 5℃로 원심분리(2차 필터: 불순물 제거 공정)하여 상층액을 제거하였다. 그런 다음, 침전물에 증류수를 첨가한 후 10분 동안 소니케이션으로 분산시켰다. 그런 다음, 동결 건조 후 최종 유효 친수성 성분을 추출하였다(수득률: 20%).
<실시예 2> 유효 친수성 물질의 분석
<2-1> GPC 분석
상기 <실시예 1>에서 제조된 유효 친수성 성분에 대해, 한국고분자시험연구소(주)에 GPC(Gel permeation chromatography) 분석을 의뢰하여 연구보고서를 받았다(보고일자: 2022년 8월 17일).
시료 정보는 다음과 같다.
NO. 시료명 Koptri 시료명 구분
1 LEVAN Koptri-22-05-08964-1 추출된 유효 친수성 물질
2 LEVAN 표준 물질 Koptri-22-05-08964-2 시그마 알드리치의
레반(표준시약)
GPC 분석 조건은 다음과 같다.
(1) 시료전처리: 제공된 시료를 그대로 사용
(2) 시료용해상태:
(2)-1. Koptri-22-05-08964-1: 완전 용해
(2)-2. Koptri-22-05-08964-2: 일부 용해
(3) 시료용액여과: 0.45 ㎛ Nylon filter
(4) 분석기기: Tosoh 社 EcoSEC HLC-8420 GPC
(5) 검출기: RI-detector
(6) 이동상: 0.1 M NaNO3
(7) 컬럼: Tskgel guard PWxl+ 2 x TSKgel GMPWxl + TSKgel G2500PWxl
(8) 온도: 40℃
(9) 유속: 1.0 mL/min
(10) 주입양 및 시료농도: 50 ㎕, 3 mg/mL
(11) 표준물질: Polysaccharide
(12) 데이터처리: EcoSEC Elite-WS
시료명 Mn Mw Mp Mw/Mn
Koptri-22-05-08964-1 218 358 156 1.65
Koptri-22-05-08964-2 48 100 685 000 1, 270 000 14.25
Mn: 수 평균 분자량
Mw: 중량 평균 분자량
Mp: 최대 피크에서의 분자량
Mw/Mn: 분산도
그 결과, 시그마 알드리치 레반(표준시약)의 중량 평균 분자량 Mw는 685000인 반면, <실시예 1>의 유효 친수성 물질의 4개의 분자량 분포 확인 결과 대략적으로 Mw 156 ~ 2100인 것을 확인하였다(도 1 및 도 2).
<2-2> 1 H-NMR 분석
상기 <실시예 1>에서 제조된 유효 친수성 성분에 대해, 한국고분자시험연구소(주)에 1H-NMR(Nuclear Magnet Resonance spectrometer) 분석을 의뢰하여 연구보고서를 받았다(보고일자: 2022년 8월 9일).
시료 정보는 다음과 같다.
NO. 시료명 Koptri 시료명 구분
1 LEVAN Koptri-22-00-08960-1 추출된 유효 친수성 물질
2 LEVAN 표준 물질 Koptri-22-00-08960-2 시그마 알드리치의
레반(표준시약)
분석 조건은 다음과 같다.
(1) 분석기기 : Bruker 사, AVANCE 600 (600MHz)
(2) 용매 : Deuterium Oxide (system peak : 4.81 (TSP))
(3) TSP Reference : None
(4) Sample 농도 : Unknown
그 결과, 시그마 알드리치 레반(표준시약)은 기존 논문(BioMed Research International, vol.2009, Article ID 179106, 6 pages, 2009; 및 Procedia Chemistry 16, 292-298, 2015)대로 나왔으며, <실시예 1>의 유효 친수성 물질에서 레반 및 betanin(색소)의 존재를 확인하였다(도 3 내지 도 7).
<2-3> GC-MS Library 분석
상기 <실시예 1>에서 제조된 유효 친수성 성분에 대해, 한국고분자시험연구소(주)에 GC-MS(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer) 분석을 의뢰하여 연구보고서를 받았다(보고일자: 2022년 8월 16일).
시료 정보는 다음과 같다.
NO. 시료명 Koptri 시료명 구분
1 LEVAN Koptri-22-07-08394-1 추출된 유효 친수성 물질
2 LEVAN 표준 물질 Koptri-22-07-08394-2 시그마 알드리치의
레반(표준시약)
시료 전처리 조건은 다음과 같다.
(1) 시료전처리 : Koptri-NB-VI20-SW0.5-DL-DI3
(2) 시료용해상태 : 용해
(3) 시료용액여과 : 0.45 ㎛ Teflon filter
분석 조건은 다음과 같다.
(1) 측정기기 : Agilent 7890A, 5975C GC-MS
(2) 컬럼 : DB-5MS UI
(3) 주입양 : 1 ㎕, Split ratio 5:1
(4) 운반기체 : He, 1.0 mL/min
(5) 분자량 범위 : Scan mode (30 ~ 500 m/z)
그 결과, <실시예 1>의 유효 친수성 물질에서 레반, 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)의 존재를 확인하였다(도 8 내지 도 12).
<2-4> 원소분석
<실시예 1>의 유효 친수성 물질의 성분 분석을 위해, 원소분석기(Elemental analyzer)를 이용하여 원소 분석을 수행하였다.
그 결과, 유효 친수성 물질이 기존의 레반(levan)과 상당히 비슷한 C, H, N 함량을 보이는 것을 확인하였다(도 33).
<2-5> 주사전자현미경 분석
<실시예 1>의 유효 친수성 물질의 성분 분석을 위해, 주사전자현미경(Scanning electron micrograph, SEM)을 이용하여 입자의 형태를 분석하였다. 기존 레반의 형태와 비교하기 위해 선행문헌(Marta Domzal-Kedzia, et al., Bioorganic Chemistry, Volume 93, 2019, 102787; 및 Ibrahim Shaba Mohammed, et al., 10.3390/su12125100, 12, 12, 5100, 2020)에서 보고된 레반의 입자 형태와 비교 분석하였다.
그 결과, 유효 친수성 물질이 기존의 레반(levan)과 유사한 다공성의 형태를 띄는 부분과 조각 부분이 동시에 나타나는 것을 확인하였다(도 34). 또한, 다공성 부분이 레반의 구성 성분과 유사한 원소 분포(C, H, O, N, etc.)를 갖는 것으로 레반이며, 조각 부분이 레반의 구성 성분과 다른 원소 분포(P, S, K, etc.)를 갖는 것으로 불순물임을 확인하였다(도 35 내지 도 36).
<실시예 3> 유효 친수성 물질의 함염증 효능 분석
<3-1> 산화 스트레스 분석
염증 유발 물질인 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 장 상피 세포 (CaCO-2 cell)에서 세포 내 ROS(reactive oxygen species, 활성산소) 생성을 측정하였다.
그 결과, LPS를 처리한 장 상피 세포(CaCO-2 cell)에서 세포 내 ROS 생성이 유의하게 증가된 반면, <실시예 1>의 유효 친수성 물질(이하' BJ'로 명명함) 처리시 LPS 단독군에 비해 유의하게 ROS 생성을 감소시켜, 염증 상황에서 장 상피세포의 산화 스트레스를 개선시키는 효능이 있는 것을 확인하였다(도 13).
<3-2> 질병 활성 지수 분석
장염 유발 물질인 덱스트란 황산나트륨(dextran sulfate sodium, DSS)로 유발된 장염 모델 마우스에서 질병 활성 지수(disease activity index, DAI)를 측정하였다. DAI(disease activity index, 질병활성도)는 변의 굳기, 체중 감소량 (%), 그리고 혈변 및 항문 출혈 반응을 고려하여 측정하였다.
그 결과, DSS로 유발된 장염 모델 마우스에서 DAI는 DSS 공급 4일차부터 정상군에 비해 유의하게 높은 수준으로 나타났으며, 8일차에 가장 높은 수준을 나타낸 반면, <실시예 1>의 유효 친수성 물질(BJ) 500 mg/kg 투여군에서는 4일차부터 DSS 단독군에 비해 유의하게 낮은 DAI 수준을 나타내어, DSS 유도 장염 진행을 억제하며 증상 개선 속도를 촉진시키는 것을 확인하였다(도 14).
<3-3> 대장 길이 분석
장염 유발 물질인 덱스트란 황산나트륨(dextran sulfate sodium, DSS)로 유발된 장염 모델 마우스에서 대장 길이를 측정하였다. 대장염은 7일 동안 2.5% DSS 투여에 의해 유발되었다.
그 결과, DSS로 유발된 장염 모델 마우스에서 DSS 군에서는 정상군에 비해 유의하게 길이가 감소하는 반면, <실시예 1>의 유효 친수성 물질(BJ) 500 mg/kg 투여군에서는 DSS에 인한 장 길이 감소가 유의하게 개선되는 것을 확인하였다(도 15).
<실시예 4> 유효 친수성 물질의 In Vivo 면역 증진 효능 분석
<4-1> 실험 동물의 준비
실험 동물의 조건은 다음과 같다.
(1) 구입시 주령(성별) 및 체중: Wistar rat((주)오리엔트바이오, 한국), 수컷, 5주령, 120-140 g
(2) 실험물질 투여시 주령(성별) 및 체중: Wistar rat, 수컷, 6주령, 140-177 g
(3) 검역, 순화방법 및 기간: 동물입수시 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하였으며, 실험을 실시하는데 적합하도록 1주일간의 순화기간을 거쳤다.
(4) 사육 조건: Polycarbonate 사육상자(정도비엔피㈜)에 2마리씩 수용하였고, 온도 22±2℃, 습도 50±10, 환기 10회/시간(전배기 방식), 12시간 점·소등(조명: 오전 7시 ~ 오후 7시), 조도 150~300 lux하였다.
(5) 사료 및 음수 공급: 사육기간 중 식이는 일반 고형사료(Samtako, Gyunggi, Korea)를 공급하였으며, 음수는 필터링되어진 음용수를 매일 교체하였다. 각 실험군별 식이와 음수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
<4-2> 면역 저하 유도 모델의 준비
시클로포스파미드(Cyclophosphamide, Cy)(Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)사) 5 mg/kg를 투여농도로 설정하여 본 실험을 진행하였다. 본 실험에서 면역 저하 물질인 시클로포스파미드(Cyclophosphamide, Cy)는 실험물질과 동시에 경구 투여하였으며, 실험물질의 경우 각 농도별로 희석된 시료를, 시클로포스파미드(Cyclophosphamide, Cy)의 경우 체중 대비 개체당 동일량을 공급하기 위하여 증류수에 용해한 시클로포스파미드(Cyclophosphamide, Cy)(5 mg/kg)를 투여하였다.
<4-3> 실험군 설정 및 시료 투여
실험군 설정은 다음과 같다.
이하 <실시예 1>의 유효 친수성 물질을 '산화질소전달체(NOD)'로 표기하고, 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)를 'Cy'로 표기하였다.
실험군 동물 수 (마리) 시료 정보 및 투여량
정상군 (Normal) 10 -
대조군 (Control) 10 Cyclophosphamide 5 mg/kg
저농도 투여군
(NOD-125 group)		 10 Cyclophosphamide 5 mg/kg +
<실시예 1>의 물질 125 mg/kg
중농도 투여군
(NOD-625 group)		 10 Cyclophosphamide 5 mg/kg +
<실시예 1>의 물질 625 mg/kg
고농도 투여군
(NOD-1250 group)		 10 Cyclophosphamide 5 mg/kg +
<실시예 1>의 물질 1250 mg/kg
양성시료 투여군
(HemoHIM 1000 group)		 10 Cyclophosphamide 5 mg/kg +
HemoHIM 1000 mg/kg
<4-4> 주간 체중량 분석
Cy 투여로 인해 면역이 저하된 동물 모델에서 농도별 투여에 따른 산화질소 전달체의 면역 증진 효과를 확인하기 위해 먼저 주간 체중 변화를 측정하였다.
이하 모든 실험 결과는 평균±표준오차(Mean±S.E.)로 계산하였다. 각 군간 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA(one-way analysis of variance test) Duncan 사후검정 비교를 실시하여 <0.05일 때 유의한 것으로 판정하였다(SPSS V12., SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
그 결과, Cy만 투여한 대조군(Control)은 정상군(Normal)에 비해 면역저하 유발로 인하여 주간 체중이 유의하게 감소한 것으로 나타난 반면, 산화질소전달체를 투여한 실험군은 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 양성 대조군은 대조군에 비해 다소 높은 체중량을 나타내었다(도 16).
<4-5> 조직 중량 분석
산화질소 전달체가 면역 저하 동물의 면역 관련 조직에 미치는 영향을 알아보고자 비장 조직과 흉선 조직의 중량을 측정하였다.
부검시 마취는 이소플루란(Isoflurane, 99.9%, USP)을 사용하였으며, 기화기를 사용하여 마취 유도시 산소 내 흡입농도 2-2.5%로 설정하고 마취의 유지시에는 산소 내 흡입농도가 1.5-1.8%가 되도록 설정하였다. 부검은 흡입마취 후 복대정맥에서 채혈하여 혈액 분석에 사용하였으며, 비장과 흉선은 적출하여 무게를 측정하였다. 이후 흉선 조직은 폐기하였으며, 비장 조직의 경우 군별 5두는 자연살해세포 측정에 사용하였으며, 남은 개체는 조직 분석을 위해 4% formalin에 고정하였다.
그 결과, Cy만 투여한 대조군(Control)은 정상군(Normal)에 비해 비장 조직 및 흉선 조직의 중량이 유의하게 감소한 것으로 나타난 반면, 산화질소전달체를 투여한 실험군 및 양성대조군은 모두 대조군에 비해 상대 중량이 증가된 것으로 나타났다(도 17 및 도 18).
<4-6> 일반 혈액학적 분석(CBC 분석)
산화질소 전달체가 면역 저하 동물의 혈중 면역세포 함량에 미치는 영향을 알아보고자 일반 혈액학적 분석을 수행하였다.
채혈한 혈액은 EDTA tube와 conical tube에 나눠 분석에 사용하였다. 먼저, EDTA tube (DB Caribe, Ltd., USA)에 채혈한 혈액은 roll mixer에 약 5~10분간 회전시킨 다음 혈액분석기(Hemaver 950Fs, Drew scientific inc., TX, USA)를 이용하여 백혈구(White blood cell, WBC)와 과립구(Granulocyte, GRA), 임파구(Lymphocyte, LYM), 중간구(Mid size cell, MID)를 측정하였다.
그 결과, Cy만 투여한 대조군(Control)은 정상군(Normal)에 비해 혈중 백혈구 함량, 혈중 과립구 함량, 혈중 림프구 함량 및 혈중 중간구 함량이 현저하게 감소된 반면, 산화질소전달체를 투여한 실험군 및 양성대조군은 모두 대조군에 비해 혈중 함량이 현저하게 증가된 것으로 나타났다(도 19 내지 도 22).
<4-7> 혈중 사이토카인(cytokine) 함량 분석
산화질소 전달체가 면역 저하 동물의 혈중 사이토카인 농도에 미치는 영향을 알아보고자 4주간 시료 투여 후 각 실험군별 혈중 사이토카인 함량 분석을 수행하였다.
conical tube에 채혈한 혈액은 상온에서 응고시킨 후 3000 rpm에서 3분간 원심 분리하여 혈청을 회수하였다. 회수한 혈청은 Tumor necrosis factor- alpha (TNF-α; R&D Systems, Minneapolis,. MI, USA), Interleukin-2 (IL-2; Mybiosource, San Diego, CA, USA), Interferon-gamma (IFN-γ; R&D Systems, Minneapolis,. MI, USA) 측정에 사용하였다.
그 결과, Cy만 투여한 대조군(Control)은 정상군(Normal)에 비해 혈중 tumor necrosis factor α (TNF-α) 함량, 혈중 IFN-γ 함량 및 혈중 IL-2 함량이 현저하게 감소된 반면, 산화질소전달체를 투여한 실험군 및 양성대조군은 모두 대조군에 비해 혈중 함량이 현저하게 증가된 것으로 나타났다(도 23 내지 도 25).
<4-8> 조직학적 분석
산화질소 전달체의 면역 증진 효과를 확인하기 위해, 4주간 시료 투여 후 각 실험군별 비장을 적출하여 조직학적 분석을 수행하였다.
적출한 비장은 10% formalin 액에서 고정시킨 검체를 절취하여(trimming) 다시 10% formalin 액으로 후 고정시켰다. 고정 후에는 각 조직을 파라핀에 포매 후 3 μm의 두께로 절편하여 세절한 다음 hematoxylin-eosin으로 염색하여 조직 프레파라트를 제작하였다. 조직프레파라트는 Motic EasyScan One(Hong Kong, Moitc)을 이용하여 스캔 후 Motic DS Assistant(X86) 프로그램을 이용하여 촬영하였다.
비장 조직 병변을 현미경으로 관찰한 결과, Cy만 투여한 대조군(Control)은 정상군(Normal)에 비해 비장 내 백색속질의 위축 및 림프액 고갈이 관찰되는 반면, 산화질소전달체를 투여한 실험군 및 양성대조군은 백색조직의 붕괴 및 응축이 나타나지 않고 선명하여 대조군에 비해 현저히 호전된 것으로 나타났다(도 26 및 도 27).
<실시예 5> 유효 친수성 물질의 In Vitro 면역 증진 효능 분석
<5-1> 실험 세포주의 준비
실험에 사용한 splenocytes (비장세포)는 Wistar rat의 비장을 적출 후 핀셋과 메쉬를 이용하여 단일세포 부유액을 제조하였다. 단일세포 부유액을 RPMI-1640 배양액으로 3회 원심 침전(×1,000 g, 5 min, 4℃)하여 세척한 다음, Red blood cell lysing buffer (Sigma, CA, USA)를 3분간 처리하여 적혈구를 제거 후 실험에 사용하였다. AR42J 세포는 한국 세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양에 필요한 시약은 Gibco(USA)에서 구입하였으며, 배지는 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% antibiotics-antimycotic을 첨가하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 2~3일에 한 번씩 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
<5-2> 세포 생존률 분석
산화질소 전달체의 농도별 처리에 따른 세포 독성을 확인하기 위하여 비장세포의 생존율을 분석하였다.
분리된 비장세포는 1×106 cells/90 μl/well로, AR42J 세포는 2×104 cells/90μl/well로 농도별 시료와 함께 처리하여 37℃, 5% CO2에서 각 24시간 동안 배양 하였다. 이 후 세포 배양액 100 μl에 WST-1 용액을 10 μl씩 첨가하고 1시간 동안 배양하여 Multi Detection Reader(Infinite 200, TECAN Group Ltd, Switzerland)를 이용하여 흡광도 값을 측정하였다. 대조군은 시료를 처리하지 않 고 시료를 용해한 용매만을 고농도 실험군과 동일 농도로 처리한 실험군으로 설정하였다.
그 결과, 시료 농도 10~500 μg/mL까지는 세포 생존률이 대조군(control)과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않았으나, 시료 농도 1000 μg/mL에서 97.07±0.62%로 다소 떨어지는 경향을 보였다(도 28).
<5-3> Cy를 처리한 비장세포의 생존률 분석
산화질소 전달체가 Cy를 처리한 비장세포에 대한 생존률에 미치는 영향을 확인하였다.
분리한 비장세포를 96 well plate에 1 × 106 cells/80 μ l/well로 분주하고 Cy 0.8 mg/ml와 농도별 추출물을 처리하여 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양한 뒤 WST-1 시약을 이용하여 세포 생존률을 분석하였다.
그 결과, Cy만 투여한 군은 무처리 대조군에 비해 생존률이 현저히 감소한 반면, 산화질소전달체를 투여한 실험군 및 양성대조군은 비장세포 생존률이 현저히 증가하였다(도 29).
<5-4> 자연살해세포(Natural killer cell, NK cell) 활성능 분석
산화질소 전달체가 자연 살해 세포 활성에 미치는 영향을 확인하였다.
우선, 자연살해세포 분석을 위해 사용되는 췌장선세포주 AR42J에 대한 산화질소 전달체의 세포 독성을 확인하였다. 산화질소 전달체의 모든 시료 농도 10~500 μg/mL에서 대조군과 비교하여 세포 생존율의 유의적인 변화를 보이지 않았다(도 30).
비장세포는 96 well plate에 4ⅹ105 cells/ml로 농도별 시료와 함께 처리 후, AR42J 세포(Target cell)를 이용하여 effector cell과 target cell의 비율별(20:1)로 첨가한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후의 LDH 측정은 CytoTox detection kit(Takara)를 사용하여 측정하였으며, 반응액 내에 NAD의 산화로 의해 형성된 formazan을 490 nm(Reference wavelength 600 nm)에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교 조사하였다.
그 결과, 무처리 대조군에 비해 산화질소전달체를 투여한 실험군 및 양성대조군은 자연 살해 세포 활성능이 유의하게 증가된 것을 확인하였다(도 31).
<5-5> 비장세포의 사이토카인(Cytokine) 생성량 분석
산화질소 전달체가 Cy를 처리한 비장세포의 사이토카인 생성량에 미치는 영향을 확인하였다.
비장세포를 48 well plate 에 4ⅹ106 cells/400 μl/well 이 되도록 분주하고 Cy(cyclophosphamide) 0.8 mg/ml와 농도별 추출물을 처리하여 37℃, 5% CO2에 서 24시간 동안 배양한 뒤 배양 상층액을 취하여 Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α; R&D Systems, Minneapolis,. MI, USA), Interleukin-2(IL-2; Mybiosource, San Diego, CA, USA), Interferon-gamma(IFN-γ; R&D Systems, Minneapolis,. MI, USA)를 측정하였다.
그 결과, 사이토카인 TNF-α는 Cy 단독 처리군에서 무처리 대조군에 비해 유의한 감소를 나타낸 반면, Cy와 산화전달체를 처리한 실험군 및 양성대조군은 TNF-α의 생성량이 현저히 증가한 것으로 나타났다(도 32).
<실시예 6> 유효 친수성 물질의 In Vivo 혈관이완 효능 분석
<6-1> 실험 동물의 준비
실험동물은 24주령의 암컷 선천성 고혈압쥐(Spontaneously Hypertensive Rat; SHR)를 사용하였다. 실험동물 사육실 환경은 온도 23±2℃, 상대습도 50±10 %이었으며, 명암주기는 12시간 단위(조명시간 08:00-20:00)로 조절되었다. 모든 동물실험은 제주대학교 동물실험 윤리위원회의 승인 하에 수행되었다(승인번호: 2018-0053).
반복 투여시 실험군은 다음과 같았다.
Group 1: SHR (drinking water, ad libitum)
Group 2: SHR + 유효 친수성 물질 (30 ml/day)
<6-2> 1회 경구 투여 후 혈압변화 측정
시료 당 SHR 1마리에 대하여 1회 경구투여 후 24시간 혈압의 변화를 관찰하였다. 실험군은 다음과 같았다.
Group 1: SHR + D.W. (0.6 ml/rat, p.o.)
Group 2: SHR + 유효 친수성 물질 (0.6 ml/rat, p.o.)
Group 3: SHR + betanin (50 mg/kg, p.o.)
혈압은 CODA non-invasive blood pressure system (Kent Scientific, Torrington, CT)을 사용하여 측정하였다. 혈압측정 전 실험동물의 꼬리 온도를 32-35℃로 유지하였으며, 안정화를 취한 상태에서 혈압을 측정하였다. SHR의 평균혈압은 177 ~182 mmHg 이었다.
그 결과, 유효 친수성 물질의 경우, 투여 후 4시간까지 점진적인 혈압 하강 효과가 관찰되었다. 반면, betanin 투여 시에는 대조군과 차이가 없었다.
<6-3> 반복 경구 투여 후 혈압변화 측정
실험동물은 Group 1: 대조군(SHR), Group 2: 유효 친수성 물질 투여군(30 ml/day), Group 3: betanin 투여군으로 분류하였으며, 각 군마다 4마리씩 배치하여 3주간 실험하였다. 시료는 30분 이내에 경구로 투여되었으며, 이후 음수와 사료는 자유 급여하였다. 실험군은 다음과 같았다.
Group 1: SHR+ D.W. (0.6 ml/rat, p.o.)
Group 2: SHR + 유효 친수성 물질 (0.6 ml/rat, p.o.)
Group 3: SHR + betanin (50 mg/kg, p.o.)
혈압은 CODA non-invasive blood pressure system (Kent Scientific, Torrington, CT)을 사용하여 측정하였다. 혈압측정 전 실험동물의 꼬리 온도를 32-35℃로 유지하였으며, 안정화를 취한 상태에서 혈압을 측정하였다.
그 결과, 유효 친수성 물질 투여군은 2일 이후 지속적인 혈압의 증가 경향을 나타내었고, 투여용량과 비례하여 혈압 강하 효과를 나타내었다.
<6-4> 적출 혈관의 이완 반응성 측정
혈관의 이완성을 조사하기 위해 흉대동맥을 적출하여 3 - 5 mm의 환상절편(aortic ring)을 만들고 Krebs solution(in mM, NaCl 120, KCl 4.75, Glucose 6.4, NaHCO3 25, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, CaCl2 1.7)으로 채운 organ bath에 현수 하였다. 실험이 진행되는 동안 온도는 37℃, 용액의 pH는 carbogen (95% O2, 5% CO2)을 공급해 7.4로 유지시켰다. aortic ring의 resting tension은 1.5 g으로 조정한 후 20분마다 용액을 교체하며 1시간 동안 안정시켰다. 혈관의 수축이완 반응은 고정된 aortic ring의 다른 한쪽을 isometric force-displacement transducer (FT03, Grass, AD instruments, U.S.A.)에 연결시켜 physiograph recorder (PowerLab/400, AD instruments, U.S.A.)로 기록하고, Chart8 program으로 분석하였다. 내피세포 의존성 이완 실험은 내피세포가 건재한 혈관에 10-6 M의 phenylephrine (PE)를 처리하여 혈관을 전 수축시킨 후 acetylcholine (Ach)을 농도(10-9 ~ 10-4 M) 누적 적용하여 이완반응을 관찰하고, pD2 (-Log EC50)를 계산하였다.
그 결과, 정상 혈압군의 경우에 비하여 SHR은 Ach에 반응성 즉, 이완효과가 감소되었고, EC50상 군간 유의한 차이는 없었지만 유효 친수성 물질 투여 군의 경우 다른 군에 비하여 혈관 이완효과가 증가하였다.
<6-5> 장기의 중량변화 측정
실험 최종일 모든 실험동물을 CO2 gas로 희생시키고, 복대정맥으로 혈액을 채취한 후 심장, 간, 신장, 뇌 등을 적출하였다. 장기의 중량변화를 보기 위하여 각각의 장기를 적출하여 무게를 측정하고 실험동물의 체중으로 나눈 값을 각각 비교하였다.
장기무게지표(organ weight index) = 장기무게(organ weight) ÷ 체중(body weight) x 100 (%)
그 결과, 시료 투여에 의한 체중변화는 군 간의 차이가 없었다. 체중에 대한 장기 무게는 유효 친수성 물질투여군과 대조군 간의 차이가 관찰되지 않았다.

Claims (18)

  1. 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 산화질소 전달체(Nitric Oxide Transpoter, NOT)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 비트즙, 당근즙 및 사과즙으로 구성된 혼합 주스의 발효물로부터 추출된 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. i) 비트즙, 당근즙 및 사과즙을 혼합한 혼합 주스의 발효물을 제조하는 단계;
    ii) 상기 혼합 주스의 발효물에 증류수를 첨가한 후 원심분리하여 상층액을 분리하여 수득하는 단계;
    iii) 상기 상층액을 농축 후 건조시킨 다음, 알코올류 용매를 첨가하여 분산시킨 후 원심분리하여 상층액을 제거하여 침전물을 수득하는 단계; 및
    iv) 상기 침전물에 증류수를 첨가한 후 분산시킨 다음, 동결 건조하여 유효 친수성 성분을 수득하는 단계;를 포함하는,
    분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학적 조성물.
  9. 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관이완용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관이완용 약학적 조성물.
  11. 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증진용 약학적 조성물.
  13. 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 건강식품.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증용 건강식품.
  15. 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관이완용 건강식품.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관이완용 건강식품.
  17. 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan)을 포함하는 조성물을 유효성분으로 함유하는 면역증진용 건강식품.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 분자량(Mw) 156 ~ 2100의 레반(Levan), 베타닌(betanin), 다당류(polysaccharide), 단당류(monosaccharide) 및 이당류(disaccharide)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증진용 건강식품.
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