WO2018034597A1 - Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека - Google Patents

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека Download PDF

Info

Publication number
WO2018034597A1
WO2018034597A1 PCT/RU2017/050070 RU2017050070W WO2018034597A1 WO 2018034597 A1 WO2018034597 A1 WO 2018034597A1 RU 2017050070 W RU2017050070 W RU 2017050070W WO 2018034597 A1 WO2018034597 A1 WO 2018034597A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
disease
fragment
binding
paragraph
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2017/050070
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Станислав Рудольфович ЕВДОКИМОВ
Андрей Борисович УЛИТИН
Валерий Владимирович СОЛОВЬЕВ
Алексей Александрович АЛЕКСАНДРОВ
Юлия Сергеевна ЧЕРНЫХ
Тимофей Александрович НЕМАНКИН
Анна Константиновна ВЛАДИМИРОВА
Олег Игоревич СМОТРОВ
Татьяна Вениаминовна ЧЕРНОВСКАЯ
Александр Александрович МОЩЕНКО
Виктория Евгеньевна НАЛОБИНА
Роман Алексеевич ИВАНОВ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biocad JSC
Original Assignee
Biocad JSC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CA3033063A priority Critical patent/CA3033063A1/en
Priority to JP2019509472A priority patent/JP7158376B2/ja
Priority to NZ750451A priority patent/NZ750451A/en
Priority to CN201780064176.5A priority patent/CN110114370B/zh
Priority to AU2017313632A priority patent/AU2017313632B2/en
Priority to US16/325,528 priority patent/US11993647B2/en
Priority to MA44917A priority patent/MA44917B1/fr
Priority to MX2019001970A priority patent/MX2019001970A/es
Priority to KR1020197007632A priority patent/KR102602564B1/ko
Application filed by Biocad JSC filed Critical Biocad JSC
Priority to EP17841757.2A priority patent/EP3502135A4/en
Priority to BR112019003307-6A priority patent/BR112019003307A2/pt
Priority to CR20190086A priority patent/CR20190086A/es
Publication of WO2018034597A1 publication Critical patent/WO2018034597A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to ZA201901042A priority patent/ZA201901042B/en
Priority to PH12019500342A priority patent/PH12019500342A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7155—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Definitions

  • the invention relates to medicine.
  • the present invention relates to the creation of antibodies or fragments thereof having the ability to specifically bind to the human interleukin-6 receptor, which would be useful as drugs for the treatment or diagnosis of diseases or to alleviate the symptoms mediated by interleukin-6.
  • the invention also relates to methods for producing these antibodies and to a method for treating human diseases using these antibodies.
  • Interleukin-6 is one of the main mediators of inflammatory reactions, produced by a wide range of antigen-presenting cells, including B and T cells.
  • IL-6 is produced by activated monocytes or macrophages, endothelial cells, fibroblasts, activated T-cells, as well as a number of cells that are not immunocytes.
  • monocytes or macrophages activated monocytes or macrophages, endothelial cells, fibroblasts, activated T-cells, as well as a number of cells that are not immunocytes.
  • cytokines it is involved in the processes of the immune response, angiogenesis, inflammation, and bone metabolism.
  • the main effect of IL-6 is associated with its participation as a cofactor in the differentiation of B-lymphocytes, their maturation and conversion into plasma cells that secrete immunoglobulins.
  • IL-6 promotes the expression of IL-6 receptor on activated immunocytes, and also induces the production of IL-2 by T cells.
  • This cytokine stimulates the proliferation of T-lymphocytes and the reaction of hematopoiesis.
  • IL-6 is one of the most active cytokines involved in the implementation of the immune response and inflammatory response. It has been shown that the imbalance between the pro and anti-inflammatory actions of IL-6 leads to various autoimmune diseases, chronic inflammation and osteoporosis, psoriasis, and excess production leads to various forms of cancer.
  • a cytokine signal into the cell is possible in 2 ways.
  • the first - to cells having a membrane-bound alpha subunit of the receptor, interleukin-6 attaches to an already assembled receptor from the alpha subunit and other 130 molecules.
  • the second - to cells that have only dr130 molecules on the membrane an interleukin-6 complex with a soluble form of the alpha subunit is attached.
  • the complete complex is assembled and the cascade of reactions in the cell is subsequently launched.
  • Blocking the action of the cytokine and, consequently, the inflammatory reaction can be achieved by interfering with the assembly of the full complex of the receptor, consisting of the alpha subunit, dr130 and interleukin 6 molecules.
  • Specific antibodies, binding to one of the molecules can interfere with the assembly of the complete complex and, accordingly, block the conduction signal inside the cell.
  • Polypeptides that specifically bind to IL-6 (see RF patent N2 2550262), IL-6R or other 130 showed a significant inhibitory effect on the functioning of IL-6.
  • Antibody-based drugs (tocilizumab) that binds to IL-6R and blocks the interaction with IL-6 are widely used in the treatment of rheumatoid arthritis and systemic juvenile idiopathic arthritis, both as monotherapy and in combination with methotrexate and / or other basic anti-inflammatory drugs.
  • the IL-6 receptor (IL-6R, IL6R, CD126) is a complex of molecules that, when activated, causes a cascade of reactions in the cell, leading to the active synthesis of proteins involved in further inflammatory response reactions.
  • the receptor is activated upon binding of IL-6 to the alpha subunit of the receptor with a mass of 80 kDa that does not transmit a signal, and two molecules of dr 130 with a mass of 130 kDa that transmit a signal into the cell (Simon A. Jones TheFASEB Journal 15 (1): 43-58).
  • the soluble form is formed as a result of proteolysis of the transmembrane part or in the process of alternative splicing of mlL-6R mRNA.
  • the soluble form of IL-6sR allows cytokine response to cells that do not have mlL-6R on the membrane surface.
  • Blocking the IL-6 signal with receptor binding polypeptides has several advantages over blocking IL-6 binding directly. So, antibodies against IL-6 bind to both the target intra-articular ligand and to circulating IL-6 in the blood. While antibodies that bind to IL-6R act on cells containing mlL-6R on the surface, and on cells containing only dr130.
  • IL-6R refers to an interleukin-6 receptor.
  • slL-6R refers to the soluble form of the interleukin-6 receptor.
  • mlL-6R refers to the membrane-bound receptor for interleukin-6.
  • antibody and “immunoglobulin” are used interchangeably and refer to a full-sized antibody in the form in which it is synthesized by cells of the immune system or other organisms modified by genetic engineering.
  • Full-sized antibodies consist of four polypeptide chains: two heavy chains (N) (approximately 50-70 kD at full length) and
  • the ⁇ -terminal (amino-terminal) part of each chain includes a variable region of approximately 100-1 10 or more amino acids, which are mainly responsible for antigen recognition.
  • the C-terminal (carboxy-terminal) part of each chain defines a constant region, mainly responsible for the function of the effector.
  • variable regions of the heavy and light chains form an antigen-binding center (or region).
  • Light chains of antibodies are classified as kappa or lambda, each of which has a specific constant region.
  • Each light chain consists of a variable portion of the ⁇ -terminal portion of the light chain (“LCVR” or “VL”) and a constant portion of the light chain consisting of one CL domain.
  • Heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta or epsilon, and they determine the isotype of an antibody, such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectively, and several of them can be further divided into subclasses (isotypes), for example lgG1 , logG2, logG3, logG4, logA1 and logA2.
  • Each type of heavy chain is characterized by a specific constant region, Fc.
  • Each heavy chain consists of a variable region of the ⁇ -terminal heavy chain (“HCVR” or “VH”) and a constant region of the heavy chain of CH.
  • the heavy chain constant region consists of three domains (CH1, CH2 and CH3) for IgG, IgD and IgA and 4 domains (CH1, CH2, CH3 and CH4) for IgM and IgE.
  • the HCVR and LCVR regions can be further divided into hypervariability regions called Rf hypervariable regions (CDRs) interspersed with more conservative regions called framework regions (FR).
  • CDRs Rf hypervariable regions
  • FR framework regions
  • Each HCVR and LCVR consists of three CDRs and four FRs, arranged in the following order from the amino terminal to the carboxy terminal: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • CDRs contain most residues that form specific interactions with the antigen.
  • variable regions of each of the light / heavy chain pairs form the antigen-binding sites of the antibody.
  • the “antigen binding portion”, or “antigen binding site”, or “antigen binding domain” or “antigen binding center” refers, interchangeably, to that part of an antibody molecule that contains amino acid residues that interact with the antigen and confer antibody specificity and affinity for the antigen. This part of the antibody includes the "frame" amino acid residues necessary to maintain the proper conformation of antigen binding residues.
  • antibody in this application does not necessarily mean a human antibody, it can be a rodent antibody, an antibody of the animal family of primates or Camelidae, preferably an antibody of a mouse, macaque, a camel or a llama antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody or a fully human antibody.
  • antibody as used herein also encompasses artificially engineered single chain antibodies having a structure similar to that of natural antibodies.
  • Antibodies referred to in this text may be glycosylated or free from polysaccharide residues.
  • An antibody of the invention may be understood to mean a monoclonal antibody.
  • monoclonal antibody is meant a homogeneous or substantially homogeneous antibody population (i.e., at least about 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, more preferably at least about 97 or 98%, or even more preferably, at least 99% of the antibodies in the population will compete in the ELISA for the same antigen or epitope, or more preferably the antibodies are identical in amino acid b sequence).
  • Monoclonal antibodies are also understood to mean antibodies having an identical or substantially identical amino acid sequence, although they may differ in post-translational modification, for example, pattern glycolization.
  • Monoclonal antibodies of the invention can be prepared using, for example, hybridoma techniques well known in the art, as well as recombinant technologies, phage display technologies, synthetic technologies, or combinations of such technologies or other technologies well known in the art.
  • the term "monoclonal antibody” is not limited to antibodies obtained using only hybridoma technology. This term may refer to an antibody derived from a single copy or clone, including, for example, any eukaryotic, prokaryotic or phage clone.
  • the numbering of amino acid residues in this text is carried out with reference to a reference antibody, which is understood to mean an antibody whose heavy chains have the sequence SEQIDNO: 10, and light chains the sequence SEQIDNO: 9.
  • a reference antibody which is understood to mean an antibody whose heavy chains have the sequence SEQIDNO: 10, and light chains the sequence SEQIDNO: 9.
  • the numbering and positioning of CDR amino acid residues within the HCVR and LCVR regions of antibodies is carried out in accordance with the nomenclature of Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) unless otherwise indicated.
  • Antibodies according to the invention can be obtained by various construction techniques, including using recombinant methods, including shuffling DNA obtained from various sources.
  • the antibodies of the present invention may be monospecific, bispecific or multispecific. Multispecific antibodies may be specific for different epitopes of the same target polypeptide or may contain antigen binding domains that are specific for one or more antigens other than IL-6R or different epitopes of IL-6R (see, for example, Tuttetal. (1991) J. Immunol. 147: 60-69).
  • the relationship between the antigen binding parts of mono-, bi- and multispecific antibodies can be different.
  • the bonds between the antigen binding parts can be chemical, or different antigen binding parts can be combined through a common polypeptide chain, or by non-covalent association of different chains with each other, or the antigen binding parts can be combined with each other via another antibody or antibody fragment.
  • aHTH-slL-6R-aHTHTeno refers to an antibody that specifically binds to the interleukin-6 receptor.
  • mll_-6R refers to a membrane-bound interleukin-6 receptor.
  • slL-6R refers to the soluble form of the interleukin-6 receptor.
  • antibody fragment any fragment of a natural and artificially engineered antibody containing three or less heavy CDRs and three or less light chain CDRs.
  • An antibody fragment may mean, in particular, a substantially full-length antibody, with a shortened heavy chain framework, an entire or full-length Fc region, a portion or antibody fragment containing an antigen-binding portion, for example, a Fab fragment, Fab' fragment, or P ( a ') a 2-fragment of an antibody, scFv, (scFv) 2, dsFv, a single-chain Fv fragment that can be obtained by linking DNA encoding LCVR and HCVR to a linker sequence (see Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994).
  • antibody fragment should not be understood as indicating the origin of a full-sized antibody.
  • Frament antibodies can be obtained completely independently of full-sized antibodies by any known method.
  • antibody fragment is also meant an artificially engineered polypeptide or product containing peptide and non-peptide moieties if it comprises the above three or less heavy chain CDRs and three or less light chain CDRs arranged so that the polypeptide or said product retains the ability of a specific or preferred binding of its target (e.g., epitope or antigen).
  • target e.g., epitope or antigen
  • the term “specifically binds” as used in this application refers to a situation in which one member of a specific binding pair does not significantly bind molecules other than its specific binding partner (s).
  • the term is also applicable when, for example, the antigen binding domain of an antibody of the invention is specific for a particular epitope that is carried by a number of antigens, in which case a specific antibody having an antigen binding domain will be capable of specific binding of various antigens bearing the epitope.
  • the antibody of the invention or its fragment specifically binds human slL-6R, while it practically does not bind to human proteins IL12, IL23, EGFR, CD3, IGFR, CTGF, FGF2, PD1, PSCK9, CD38, GCSF, interferon alpha 2b.
  • epitope refers to that part of a molecule that is capable of being recognized and bound to an antibody in one or more antigen-binding regions of an antibody. Epitopes often consist of chemically active surface groups of molecules, such as amino acids or sugar side chains, and possess specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics.
  • inhibitor epitope and / or “neutralizing epitope” is meant an epitope which, in the context of an intact antigenic molecule and when bound by an antibody specific for the epitope, results in the loss or reduction of the biological activity of the molecule or organism that contains the molecule, invivo or invitro.
  • epitope also refers to a portion of a polypeptide that has antigenic and / or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, such as a mouse or human.
  • antigenic epitope is defined as the portion of a polypeptide to which an antibody can specifically bind, as determined by any method well known in the art, for example, by conventional immunoassay. Antigenic epitopes need not be immunogenic, but may also be immunogenic.
  • An “immunogenic epitope”, as used herein, is defined as part of a polypeptide that elicits an antibody response in an animal, as determined by any method known in the art.
  • a “non-linear epitope” or “conformational epitope” contains non-contiguous polypeptides (or amino acids) within the antigenic protein to which the antibody specific for the epitope binds.
  • biological property or “biological characteristic” or the terms “activity” or “bioactivity” with respect to an antibody of the invention are used interchangeably herein and include, but are not limited to, epitope / antigenic affinity and specificity for SIL-6R, the ability to be an antagonist of IL-6, the stability of antibodies and immunogenic properties of antibodies in vivo.
  • Other biological properties or characteristics of the antibody identified by the prior art include, for example, cross-reactivity (i.e. with non-human homologs of the target peptide or with other proteins or targets, in general), and the ability to maintain high levels of expression protein in mammalian cells.
  • ELISA analysis ELISA analysis
  • competitive ELISA analysis or KINEXA surface plasmon resonance analysis
  • invitro or invivo neutralization assays without limitation, receptor binding production and / or secretion of a cytokine or growth factor, signal transduction and immunohistochemistry of tissue sections obtained from various sources, including human, primate or any nother source.
  • inhibitor or “neutralize”, as used herein, with respect to the activity of an antibody of the invention, means the ability to significantly counteract, inhibit, prevent, limit, slow down, interrupt, destroy, terminate, reduce or reverse, for example, the development or severity of what is inhibited, including but not limited to the above, biological activity (eg, IL-6 activity) or a property, disease, or condition.
  • Inhibition or neutralization of IL-6 activity by binding of an antibody of the invention to SIL-6R is preferably at least about 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% or higher.
  • patient in this application refers to a mammal, including, but not limited to, mice, monkeys, humans, mammals, farm animals, mammals, sports animals and mammals of domestic animals; preferably, the term refers to people.
  • the patient preferably a mammal, preferably a human, is further characterized by a disease or disorder or condition mediated by IL-6, which can be improved by decreasing the bioactivity of IL-6.
  • vector includes a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid with which it linked, including plasmids and viral vectors, but not limited to. Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced, while the remaining vectors can be integrated into the genome of the host cell and, thus, replicated along with the host genome. Moreover, certain vectors are capable of directing the expression of genes with which they are functionally linked. Such vectors are referred to in this application as “recombinant expression vectors” (or, simply, “expression vectors”), and illustrative vectors are well known in the art.
  • the expressions “cell”, “host cell”, “cell line” and “cell culture”, “cell line as producer” are used interchangeably and include an individual cell or cell culture that is a recipient of any isolated polynucleotide according to the invention or any recombinant vector (any recombinant vectors) that contain the sequence encoding the HCVR, LCVR or monoclonal antibody of the invention.
  • Host cells include the offspring of an individual host cell, and the offspring need not be completely identical (in morphology or complete DNA complement) to the original parent cell due to natural, accidental or intentional mutations and / or changes.
  • a host cell includes cells transformed, transduced or infected with a recombinant vector, or a monoclonal antibody that expresses the polynucleotide of the invention or its light or heavy chain.
  • a host cell that contains the recombinant vector of the invention may also be referred to as a “recombinant host cell.”
  • Preferred host cells for use in the invention are CHO cells (e.g., ATCC CRL-9096), NS0 cells, SP2 / 0 cells, COS cells (ATCC, e.g. CRL-1650, CRL-1651) and HeLa (ATCC CCL-2 )
  • Additional host cells for use in the invention include plant cells, yeast cells, other mammalian cells, and prokaryotic cells.
  • affinity refers to measuring the attraction between an antigen and a binding molecule, for example, an antibody.
  • the intrinsic ability to attract a binding molecule to an antigen is typically expressed as the equilibrium constant of binding affinity (KD) of a particular interaction of the binding molecule and antigen. It is believed that the binding molecule specifically binds to the antigen when the KD is ⁇ 1 mM, preferably ⁇ 100 nM.
  • KD affinity binding constant can be measured, for example, using surface plasmon resonance (BIAcoreTM) or biolayer interferometry, for example, using the ProteOnTM XPR36 SPR system from Bio-Rad or the OctetTM system.
  • Ka refers to the rate of association of a particular antibody-antigen interaction
  • Kd refers to the dissociation rate of a specific antibody-antigen interaction
  • KD refers to the affinity constant, which is obtained from the ratio of Kd to Ka (ie Kd / Ka), and it is expressed as a molar concentration (M). KD values for antibodies can be determined using methods well established in the art.
  • a preferred method for determining KD antibodies is a method using resonance of surface plasmons, preferably using a biosensor system such as the Biacore® system.
  • the term “high affinity” for an IgG antibody refers to an antibody having KD - E-10 - E-08 M, more preferably E-10 - E-09 M or less, and even more preferably E-10 M or less in relation to the target antigen.
  • the “high affinity” of binding may vary for other antigen isotypes.
  • IgM refers to an antibody having a KD E-10 - E-07 M or less, more preferably E-10 - E-08 M or less, even more preferably E-10 - E-09 M or less.
  • K 0 ff refers to the dissociation rate constant of a particular interaction of a binding molecule and antigen.
  • the koff + dissociation rate constant can be measured by bi-layer interferometry, for example using the Octet TM system.
  • epitope refers to a part (determinant) of an antigen that specifically binds to a binding molecule (eg, an antibody or a related molecule, such as a bispecific binding molecule).
  • a binding molecule eg, an antibody or a related molecule, such as a bispecific binding molecule.
  • Epitope determinants usually consist of molecules, such as amino acids or carbohydrates, or Sugar side chains, and, as a rule, have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific characteristics of charges.
  • the epitope can be “linear” or “conformational”. In a linear epitope, all points of interaction between a protein (eg, an antigen) and an interacting molecule (such as an antibody) occur linearly along the primary amino acid sequence of the protein.
  • a conformational epitope interaction points occur through amino acid residues on a protein that are separated from each other in the primary amino acid sequence.
  • antibodies to this epitope can be generated using techniques well known in the art.
  • the generation and characterization of antibodies or other binding molecules can shed light on information about the desired epitopes. Based on this information, binding molecules can then be competitively screened for binding to the same or similar epitopes, for example, by conducting competition studies to find binding molecules that compete for binding to antigen.
  • epitope refers to the part of the polypeptide that has antigenic and / or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, such as a mouse or human.
  • antigenic epitope is defined as the portion of a polypeptide to which an antibody can specifically bind, as determined by any method well known in the art, for example, by means of a conventional immunoassay.
  • test antibody if the test antibody is unable to bind to the target antigen at the same time, then the test antibody binds to the same epitope that overlaps the epitope or epitope that is in close proximity to the epitope associated with the binding molecule.
  • This experiment can be performed using ELISA, RIA, analysis of intermolecular interactions on BIACORETM, biolayer interferometry or flow cytometry.
  • the two-way competitive assay described above can be used, i.e., determine whether a known binding molecule blocks the test binding molecule, and vice versa.
  • Such cross-competition experiments can be performed, for example, using an IBIS MX96 SPR instrument or an OctetTM system.
  • the binder the molecule proposed in this invention is a monoclonal antibody.
  • TAB used herein refers to a monoclonal antibody, that is, an antibody that is synthesized and isolated by a separate clonal cell population.
  • a clonal population may be a clonal population of immortalized cells.
  • immortalized cells in a clonal population are hybrid cells, hybridomas that are usually obtained by fusing individual B lymphocytes from immunized animals with individual lymphocyte tumor cells. Hybridomas are a type of engineered cell and are not found in nature.
  • the class (isotype) and subclass of antibodies can be determined by any method known in the art.
  • the class and subclass of an antibody can be determined using antibodies specific to a particular class and subclass of antibodies. Such antibodies are commercially available.
  • the class and subclass can be determined using ELISA, Western blot analysis, as well as other methods.
  • the class and subclass can be determined by sequencing all or part of the constant domains of the heavy and / or light chains of antibodies, comparing their amino acid sequences with known amino acid sequences of different classes and subclasses of immunoglobulins, and determining the class and subclass of antibodies.
  • sequence identity refers to residues in two sequences that are the same when aligned for maximum match.
  • a sequence identity comparison can take place over a length of at least about nine nucleotides, typically at least about 18 nucleotides, more often at least about 24 nucleotides, typically at least about 28 nucleotides, more typically at least about 32 nucleotides, and preferably at least about 36, 48 or more nucleotides.
  • polynucleotide sequences can be compared using FASTA, Gap, or BESTFIT, which are programs in the Wisconsin Package version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin.
  • FASTA which includes, for example, the FASTA2 and FASTA3 programs, provides alignment and percent sequence identity in the areas of best coverage between the requested and the desired sequences (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63 98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71 -84 (1998)).
  • the default parameters for a particular program or algorithm are used.
  • the percent sequence identity between nucleic acid sequences can be determined using FASTA with default parameters (word size 6 and NOPAM factor for the score matrix) or using Gap with default parameters, as provided in GCG version 6.1.
  • nucleic acid sequence should be interpreted as a nucleotide sequence exhibiting at least 85%, preferably 90%, more preferably 95% and most preferably 97% sequence identity with respect to the nucleic acid sequence.
  • bispecific antibodies includes an antibody capable of selectively binding two or more epitopes.
  • Bispecific antibodies can include two different antigen-binding parts, where these antigen-binding parts specifically bind different epitopes either on different molecules (e.g., antigens), or on the same molecule (e.g., on the same antigen ) If a bispecific antibody is capable of selectively binding two different epitopes (first epitope and second epitope), the affinity of the first antigen-binding part for the first epitope will typically be at least one to two, three, or four orders of magnitude lower than the affinity of the first antigen -binding parts for the second epitope, and vice versa.
  • Epitopes recognized by a bispecific antibody can be the same or different target (for example, on the same or different protein). Bespecifically antibodies can be obtained, for example, by combining heavy chains that recognize different epitopes on the same antigen. For example, nucleic acid sequences encoding variable sequences of heavy chains that recognize different epitopes can be fused to nucleic acid sequences encoding different constant regions of the heavy chain, and such sequences can be expressed in a cell that expresses an immunoglobulin light chain.
  • a typical bispecific antibody has two heavy chains, where each has three heavy chain CDRs, followed by the (from the ⁇ -end to the C-end) CH1 domain, hinge region, CH2 domain and CH3 domain, and immunoglobulin light chain that is either not provided with antigen binding specificity, but can combine with each of the heavy chains, or can combine with each of the heavy chains and can bind one or more epitopes bounded by antigen-binding regions of the heavy chain, or can combine with each of the heavy chains and It binds either one or both heavy chains to one or both epitopes.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof, in which the ability to bind to the human interleukin-6 (IL-6) receptor is ensured by the fact that it contains an amino acid sequence of at least 75% homology the sequence of SEQ ID NO: 3.
  • IL-6 human interleukin-6
  • the present invention relates to an antibody or fragment thereof which comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the implementation of the present invention relates to an antibody or its fragment, which contain:
  • the present invention relates to an antibody or fragment thereof that contains the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1-3.
  • the binding fragment competes for binding or binds to the same epitope as the binding domain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the binder the fragment is at least 90% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the binding domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the antibody or antigen binding fragment thereof is characterized in that it is of the human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 isotype.
  • the antibody or fragment thereof has a heavy chain sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO 9.
  • the antibody or fragment thereof has a light chain sequence homologous to at least 90% of the sequence of SEQ ID NO 10.
  • the Fc constant portion of the IgG1 isotype comprises mutations E233P, L234A, L235A, E236P, L237V and / or L238A.
  • the Fc constant portion of the IgG1 isotype contains mutations that increase the pharmacokinetic parameters in an animal or human, such as ⁇ / 2
  • the Fc constant portion of the IgG1 isotype comprises M255Y, S257T, and / or T259E mutations that increase the pharmacokinetic parameters in an animal or human, such ⁇ 8 ⁇ ⁇ 1 / 2 ⁇ (hour) or Stax ( ⁇ g / ml).
  • the antibody or antigen binding fragment thereof has at least one of the following properties:
  • b) has such aggregation stability that when concentrations of more than 10 mg / ml and with increasing temperature to 37 ° C for more than 2 weeks, the content of aggregates does not increase by more than 5% of the initial content in the solution.
  • c) has such aggregation stability that, at concentrations of more than 10 mg / ml and increasing the temperature to 50 ° C for more than 24 hours, the content of aggregates does not increase by more than 5% of the initial content in the solution;
  • d) has a KD affinity constant with the human IL-6 receptor of not more than E-10 - E-09 M;
  • e has a kinetic constant of association kon (1 / Ms) with the human IL-6 receptor of at least E + 05 (1 / Ms);
  • f has a kinetic dissociation constant dis (1 / s) with the human IL-6 receptor of not more than E-04 (1 / s).
  • e demonstrates antiproliferative activity in a culture of interleukin-6 dependent DS1 cells with a calculated IC50 value of not more than 10 "8 M.
  • h shows the blocking of STAT-3 signaling in a culture of interleukin-6 dependent cells with a calculated IC50 value of not more than 10 "8 M.
  • the present invention also provides a bispecific antibody comprising an antigen binding fragment of the above antibody.
  • An example of such an antibody may be a bispecific antibody containing antigen-binding parts whose CDRs are different from each other and have a total homology higher than 95% of each other.
  • the present invention also provides DNA for the preparation of the above antibody or antigen binding fragment thereof, comprising sequences corresponding to the sequences of said CDRs.
  • Expression vector also provides an expression vector comprising one or more of the above DNAs.
  • the present invention also provides a cell line containing the above vector or the above DNA in cells.
  • the present invention provides a method for producing the above antibody or antigen binding fragment thereof, comprising culturing the above cell line in a culture medium under conditions sufficient to produce said antibody or antigen binding fragment, followed by isolation and purification of the resulting antibody or antigen binding fragment thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating a disease or condition associated with the action of interleukin-6 (IL-6), or to eliminate or alleviate a symptom associated with the undesirable effects of IL-6, containing an effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof paragraph 1, or according to any one of the paragraphs of paragraph 1, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients, diluents or carriers.
  • IL-6 interleukin-6
  • composition according to paragraph is a solution for parenteral administration.
  • composition according to paragraph may be lyophilized powder.
  • composition according to paragraph may be intended for use in therapy and / or in the diagnosis of a disease selected from the following group of diseases and / or disorders: rheumatoid arthritis, osteoarthritis, juvenile chronic arthritis, septic arthritis, Lyme arthritis, psoriatic arthritis, reactive arthritis, spondylarthropathy, systemic lupus erythematosus, Crohn’s disease, ulcerative colitis, inflammatory bowel disease, insulin-dependent diabetes mellitus, thyroiditis, asthma, allergic disease, psoriasis, atopic dermatitis, with Leroderma, graft versus host reaction, organ transplant rejection, acute or chronic immune disease associated with organ transplantation, sarcoidosis, Kawasaki disease, Graves disease, nephrotic syndrome, chronic fatigue syndrome, Wegener granulomatosis, Shenlein-Genoch purple, microscopic vasculitis , chronic active hepatitis, uvenitis, septic shock, toxic shock syndrome,
  • Antibodies of the invention may be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent. and / or excipient in single or multiple doses.
  • Pharmaceutical compositions for administration are designed to correspond to the chosen mode of administration, and pharmaceutically acceptable diluents, carriers and / or excipients, such as dispersing agents, buffers, surfactants, preservatives, solubilizing agents, isotonic agents, stabilizers, cryoprotectants are selected taking into account composition of the necessary dosage form.
  • compositions are developed in accordance with conventional methods described, for example, in Remington, TheScienceandPracticeof Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., MackPublishingCo., Easton, PA 1995, which describes various methods for preparing compositions generally known to those skilled in the art.
  • a pharmaceutical composition containing an antibody or fragment thereof of the invention can be administered to a patient using standard methods of administration, including oral, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, pulmonary, transdermal, intramuscular, intranasal, buccal, sublingual or suppository.
  • the pharmaceutical composition of the invention contains an effective amount of an antibody of the invention.
  • effective amount is meant an amount effective at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired therapeutic result.
  • a therapeutically effective amount of an antibody may vary depending on factors such as the condition of the disease, the age, gender and weight of the individual, and the ability of the antibody or part of the antibody to elicit the desired response in the individual.
  • An effective amount is also an amount in which the therapeutically beneficial effect of the antibody prevails over the toxic or harmful effect. If an antibody is used for prophylactic purposes, then “effective amount” is understood to mean the amount effective at dosages and over the periods of time necessary to achieve desired preventive result. Since a prophylactic dose is used for individuals before or at an early stage of the disease, typically a prophylactically effective amount may be less than a therapeutically effective amount.
  • an effective amount is at least the minimum dose, but less than the toxic dose of the active agent, necessary to provide a therapeutic or prophylactic effect in a patient.
  • an effective amount of an antibody of the invention is an amount that, in mammals, preferably humans, reduces the biological activity of IL-6.
  • the route of administration of the antibodies of the invention may be oral, parenteral, by inhalation, or topical.
  • the antibodies of the invention may be included in a pharmaceutical composition suitable for parenteral administration.
  • parenteral includes intravenous, intramuscular, subcutaneous, rectal, vaginal or intraperitoneal administration.
  • Advantageous is the introduction by intravenous or intraperitoneal, or subcutaneous injection. Suitable carriers for such injections are directly known in the art.
  • compositions must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage in a container that is provided, including, for example, a hermetically sealed vial (ampoule) or syringe. Therefore, pharmaceutical compositions can be sterile filtered after preparation, or otherwise made microbiologically suitable.
  • a typical intravenous infusion composition may have a volume of 250-1000 ml of liquid, such as sterile Ringer's solution, physiological saline, dextrose solution, and Hank's solution, and a therapeutically effective dose (e.g., 1-100 mg / ml or more) of antibody concentration. Dose may vary depending on the type and severity of the disease.
  • the dosages for any of the patients depend on many factors, including patient size, body surface area, age, specific compound to be administered, gender, time and route of administration, general health and other medications that are administered simultaneously.
  • a typical dose may be, for example, in the range of 0.001 -1000 ⁇ g; however, doses below or above this illustrative range are anticipated, especially considering the above factors.
  • the dosage regimen of daily parenteral administration may be from 0.1 ⁇ g / kg to 100 mg / kg of the total body weight, preferably from 0.3 ⁇ g / kg to 10 mg / kg and more preferably from 1 ⁇ g / kg to 1 mg / kg , even more preferably 0.5 to 10 mg / kg body weight per day.
  • the treatment process can be monitored by periodically evaluating the patient's condition. For repeated administration over several days or longer, depending on the condition of the patient, the treatment is repeated until the desired response is achieved or the symptoms of the disease are suppressed.
  • other dosage regimens that are not described in this application may also be used.
  • the desired dosage may be administered by single-pole administration, multiple bolus administrations, or by continuous infusion of an antibody, depending on the pharmacokinetic decay sample that the practitioner wants to achieve.
  • Antibodies or fragments thereof may be frozen either lyophilized and reconstituted before use in a suitable sterile vehicle. Lyophilization and recovery can lead to varying degrees of loss of antibody activity. Dosages may be adjusted to compensate for this loss. In general, pH values of the pharmaceutical composition of 6 to 8 are preferred.
  • the invention provides a finished product containing materials useful for the treatment or prophylaxis of the disorders or conditions described above.
  • the finished product contains a container containing a pharmaceutical composition with an antibody, with a designation and possibly instructions.
  • Suitable containers include, for example, vials, ampoules, syringes, and assay tubes.
  • Containers may be made of a variety of materials, such as glass or polymeric material.
  • the container contains a composition according to the invention, which is effective for treating a disease or disorder mediated by IL-6, and may have sterile access (for example, the container may be an intravenous solution bag or a vial having a plug that is permeable to the hypodermal injection needle) .
  • the active agent in the composition is an anti-L6HH antibody of the invention.
  • the designation on the container and the instructions attached to it indicate that the composition is used to treat the selected disease.
  • the finished product may further comprise a second container containing a pharmaceutically acceptable buffer, such as phosphate buffered saline, Ringer's saline and dextran solution. It may further include other materials desirable from a commercial and consumer point of view, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and package inserts with instructions for use. 10. Application
  • a pharmaceutically acceptable buffer such as phosphate buffered saline, Ringer's saline and dextran solution. It may further include other materials desirable from a commercial and consumer point of view, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and package inserts with instructions for use. 10.
  • the present invention provides the use of the above antibody or fragment thereof for the manufacture of a medicament.
  • FIG. 1 Gel electrophoresis under denaturing conditions of the accumulated and purified human SIL-6R in 12% PAGE.
  • Lanes a-d Fermentas unstained marker, IL6R-H6F culture fluid before application to the column 10 ⁇ l, IL6R-H6F culture fluid after application to the column 10 ⁇ l, IL6R-H6F elution 5 ⁇ l.
  • FIG. 2 Western blot analysis of accumulated and purified human SIL-6R. After gel electrophoresis under denaturing conditions of human SIL-6R in 12% PAGE and transfer to the membrane, binding was performed with tocilizumab, and then anti-GoatahlgGlgG HRP. Coloring was carried out using DBA. Lanes a-b: Prestained marker, IL6R-f lag-his 5 ⁇ l.
  • FIG. 3 Gel electrophoresis under denaturing conditions of the accumulated and purified human IL6-H6-EPEA (with 6 histidines and EPA sequence at the C-terminus of the protein) in 12% PAGE.
  • Lanes a-d Fermentas unstained PW marker, IL6-H6-EPEA ql before applying to a column of 5 ⁇ l, IL6-H6-EPEA ql after applying to a column of 5 ⁇ l, IL6-H6-EPEA elution from a column of 5 ⁇ l.
  • FIG. 4 Fagmida for cloning Fab phage display libraries.
  • FIG. 5 Expression plasmid for cloning and production
  • FIG. 6 Kinetics of association and dissociation of Fab fragments with the alpha subunit of human IL-6R on ForteBio.
  • FIG. 7 Gel electrophoresis under denaturing conditions of the developed and purified full-length human antibodies aHTH-IL-6sR in 12% PAGE in the presence of beta-mercaptoethanol.
  • Lanes a-f a - Fermentas unstained marker, b-f - aHTH-IL-6sR antibody.
  • FIG. 8 Denaturing gel electrophoresis of the developed and purified full-length human aHTH-IL-6sR antibodies in 12% PAGE in the presence of beta-mercaptoethanol.
  • Lanes a-f a - Fermentas unstained marker, b-f - aHTH-IL-6sR antibody.
  • FIG. 9 Cellular antibody proliferation inhibition test for DS-1 aHTH-IL-6R antibodies.
  • FIG. 10 Cell test of STAT3 pathway inhibition assay in HEK-BlueTM IL6 cell culture with BCD089 antibody (aHTH-IL-6sR) compared to Tocilizumab.
  • FIG. 1 1 - Enzyme-linked immunosorbent assay for the interaction of BCD089 antibody with human IL-6R, cynomolgus monkey, rat and dog
  • FIG. 12 Enzyme-linked immunosorbent assay for the interaction of BCD089 antibodies with human, rabbit and guinea pig IL-6R receptors.
  • FIG. 13 Kinetics of the association and dissociation of BCD089 with the alpha subunit of human IL-6R on ForteBio.
  • FIG. 14 Kinetics of the association and dissociation of BCD089 with the alpha subunit of the cynomolgus IL-6R on ForteBio.
  • FIG. 15 Kinetics of the association and dissociation of BCD089 antibody BCD 089 with human and mouse IL-6R (mouse IL-6R 250 nM-black curve, human IL-6R 50 nM-blue curve)
  • FIG. 16 Kinetics of the association and dissociation of BCD089 with the alpha subunit of guinea pig IL-6R on ForteBio.
  • FIG. 17 Gel-filtration profiles of the BCD089 molecule before (red) and after incubation for 12 hours of incubation at 50 ° C (blue).
  • FIG. 18 Evaluation of anti-inflammatory activity of the drug BCD-089 in a model of collagen-induced arthritis of primates DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • polypeptides were selected that specifically bind to the soluble form of the human interleukin-6 receptor (slL-6R), i.e., its alpha subunit.
  • phage libraries constructed on the basis of the amino acid sequences of the heavy and light chains of human immunoglobulins were used.
  • RNA molecules were isolated and purified from blood cells of more than 1000 donors, of which the genes of the heavy and light chains of donor immunoglobulins were synthesized in several steps by reverse transcription and PCR.
  • Various combinations of genes of the binding sites of the heavy and light chains were inserted into bacteriophage vectors in the correct orientation and used to create hybrid phage libraries (Fig. 4).
  • the selection of the obtained phage libraries was carried out on the human protein SIL-6R, which was produced in the transient system of CHO-T cells and purified from the culture fluid on the IMAC BIORAD sorbent.
  • Cells producing SIL-6R were obtained by reclining the alpha subunit of the human interleukin-6 receptor gene into a vector for transient production of pEE with subsequent transfection of CHO-T.
  • Producer cells were grown in an incubator for 7-10 days.
  • the protein was purified in a single step and verified that it was targeted using the Westernblot method using specific antibodies (Human IL-6sR Detection antibody PartNo. 840244 from Human IL-6sR DuoSet ELISA Development Kit Catalog Number: DY227 R&D System).
  • the selection of the obtained phage libraries was carried out in two or more stages. Phages that specifically bind to SIL-6R immobilized on plastic were selected. As a result, we received many phages that bind to slL-6R from which bacteriophage vectors were isolated. Of these vectors, the genes of polypeptides that specifically bind to the protein were amplified and transferred to expression vectors for the synthesis of protein molecules in prokaryotic E. coli cells. After transformation of the cells with the obtained plasmids and synthesis of individual polypeptides, they were screened and selected molecules that specifically bind to IL-6sR and block the binding of the ligand to the receptor.
  • the affinity constants of the obtained proteins were compared with each other and the most successful genes were inserted into the expression peF vectors for the expression of already full-sized antibodies.
  • affinity was evaluated and they were confirmed to block the signal of interleukin 6 in various functional cell tests.
  • one antibody molecule was selected that specifically binds to SIL-6R and blocks the effect of IL-6 in cell tests. Its heavy and light chain nucleotide sequences were recloned into the psX vector, using which cell lines stably producing the antibody were obtained. Subsequently, using the obtained cell line, the selected antibody was developed for which a purification scheme and storage conditions were selected. Preclinical studies of the resulting preparation were planned and started.
  • Antibodies and antigens were produced in cells of a transient cell line obtained from Chinese hamster ovary cells (CHO-K1 line), according to the protocols Suspension cultivation was carried out in flasks on an orbital shaker using serum-free media for suspension cultures manufactured by Life Technologies Corporation, according to the manufacturer's instructions.
  • cells were transfected using linear polyethyleneimine (PEI "MAX", the company "Polysciences”). The ratio of DNA / PEI was 1: 3-1: 10. 7-10 days after transfection, the culture medium was centrifuged at 2000 g for 20 minutes and filtered through a filter with a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • Target proteins were isolated from the culture fluid by affinity chromatography.
  • a recombinant SIL-6R protein containing six His amino acids at the C-terminus of the protein was isolated and purified from the culture fluid using a Profinity IMAC Ni-charged resin (Bio-Rad). Prior to purification, N 1CI2 was added to the culture fluid to a concentration of 1 mM. Next, 1 / 200-1 / 500 volumes of Profinity IMAC Ni-charged sorbent were added to the culture fluid and stirred for 1 hour at room temperature. The sorbent was transferred to a 5 or 10 ml Thermoscientific Polypropylene columns column, washed with 5 column volumes of 10 mM pH8 phosphate buffer with 5 mM imidazole and 0.3 M sodium chloride to wash the non-specific binding components.
  • the bound antigen was eluted using 0.3 M imidazole, pH 8, 0.3 M NaCl.
  • the protein was transferred to PBS (pH 7.4) using dialysis using Snake Skin Dialysis Tubing technology, filtered (0.22 ⁇ m) and transferred to tubes.
  • the tubes were stored at -70 ° C.
  • the purity of the resulting protein solution was evaluated by SDS gel electrophoresis, and identified using the Western blot method using a specific anti-11_-6Ph antibody and conjugated goat anti-human antibody antibodies ( Figures 1 and 2).
  • the anti-L6HH antibodies tested were purified on a 1 ml HiTrap rProteinA FF column (GE Healthcare).
  • the clarified culture fluid was passed through 1 ml HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare), which was equilibrated with phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4). The column was then washed with 5 column volumes of PBS to wash the non-specific binding components. Bound protein was eluted using 0.1 M glycine pH 3 buffer. The main protein elution peak was collected and adjusted to neutral pH using 1 M Tris buffer (pH 8). All stages were carried out at a flow rate of 1 ml / min. Next, the protein was transferred to PBS (pH 7.4) by dialysis using Snake Skin Dialysis Tubing technology, filtered (0.22 ⁇ m), transferred to tubes and stored at -70 ° C. The purity of the resulting protein solution was evaluated using SDS gel electrophoresis (Fig.7 and 8).
  • the recombinant ligand IL6-H6-EPEA (interleukin 6 with a peptide tail of 6 histidines and an EPA sequence at the C-terminus) was purified on a GE Healthcare C16 / 20 column with 5 ml Capture Select C-tag Affinity Matrix. All stages were carried out at a flow rate of 5 ml / min.
  • the clarified culture fluid was passed through a column that was equilibrated with phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4). The column was then washed with PBS until the signal of the spectrophotometer of the chromatographic system reached a plateau in order to wash the non-specific binding components.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Bound protein was eluted using 20mM Tris 2M MgCl2 pH7.1. The major elution protein peak was collected and transferred to PBS (pH 7.4) by dialysis using SnakeSkinDialysisTubing technology. Then it was filtered through a filter (0.22 ⁇ m) and transferred to tubes and stored at -70 ° C. The purity of the resulting protein solution was evaluated using SDS gel electrophoresis (Fig.Z).
  • SIL-6R-binding phage particles with Fab- human fragments were isolated from the MeganLib TM combinatorial phage Fab display library (BIOCAD) containing more than 10 1 1 independent clones and synthesized based on the human immunoglobulin variable domain genes ( Figure 4), according to a modified protocol (J BiolChem. 1999 Jun 25; 274 (26): 18218-30). The lymphocytes of more than a thousand donors were used to create the library. Selection was performed on recombinant human SIL-6R-H6F under conditions as previously described (NatBiotechnol. 1996 Mar; 14 (3): 309-14; J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3): 581 -97).
  • human SIL-6R-H6 or slL-6R-Fc in 50 mM carbonate buffer (pH 9.5) was adsorbed overnight at 4 ° C on the surface of EIA / RIA high binding (Greineer bio- one).
  • the tubes were washed several times with PBST (PBS pH 7.4 and 0.1% Tween 20 v / V), and then the vacant protein binding sites on the surface of the tubes were blocked with a skim milk solution (0.5% m / V in PBST pH 7.4 ) The skim milk solution was incubated in tubes for 1 h. The tubes were then washed with PBST solution.
  • the flasks were rearranged on a rocking chair and the phage developed for 3-5 hours at AIA.
  • the cell culture was centrifuged for 20-30 minutes 10 thousand rpm and the supernatant was collected in test tubes. After that, 1/6 of the volume of the solution containing 20% polyethylene glycol and 2.5 M sodium chloride was added, and stirred vigorously. The solution was incubated in ice for at least 3 hours. Then, the solution was centrifuged for 10 minutes at 8000 d; a precipitate formed containing phages was dissolved in 1 ml of TBS buffer.
  • E. coli TG1 cells were isolated phage DNA (phagemid) derived phage M13. From the phagemid, PCR genes and terminal specific primers, the genes of Fab fragments with various variable regions were amplified and transferred into the expression plasmid pI4. Replaced genes on sites Nhel, Notl. The insert was checked by sequencing of 4 random colonies.
  • Fab fragments based on the obtained genes were synthesized in E. coli BL21Gold cells.
  • Fab-fragment of Actemra (tocilizumab) was used as a positive control.
  • 96-well ELISA plates (from NunclmmunoMaxisorp) were used.
  • IL-6sR-H6 antigen was bound on the surface of the wells; for this, 50 ⁇ l of a 0.5 ⁇ g / ml solution of IL-6sR-H6 in binding carbonate buffer was added to each well. The lid was closed and incubated overnight at 4 ° C.
  • the plates with solutions of Fab fragments were incubated on a shaker for one hour at room temperature. After an hour, the wells of the plates were washed five times with PBST buffer. Then a solution of conjugated secondary goat antibody was added to the wells of the plate with peroxidase (from Pierce-ThermoScientific) in a ratio of 1: 5000 in PBST at 50 ⁇ l / well. The plates were incubated on a rotary shaker for 50 minutes at room temperature, and then washed five times with PBST buffer as described above.
  • peroxidase from Pierce-ThermoScientific
  • a colorimetric signal was obtained by adding to the wells a solution of substrate (TMB) in acetate buffer pH5.5 and ⁇ 2 ⁇ 2 0.02% (50 ⁇ l / well), incubated until the signal was saturated (on average 3-5 min), and then the reaction stopped by adding a solution of 10% sulfuric acid at 30 ⁇ l / well.
  • the signal was recorded at a wavelength of 450 nm using a Tesap-Sunrise plate reader (from Tesap). The number of Fab fragments bound to the antigen is proportional to the recorded signals. Therefore, clones were selected whose signal exceeded the background by more than 5 times.
  • the ELISA method was used to test the antagonistic ability of previously selected Fab fragments specifically binding to human IL-6R.
  • An anti-L6BPb fragment was used as a positive antagonist control.
  • the ligand IL-6-EPA was immobilized on ELISA plates (Maxisorp), adding 50 ⁇ l of a solution with a protein concentration of 1 ⁇ g / ml in carbonate buffer per well. The solution was incubated in the plate overnight at 4 ° C. All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA with minor modifications and using a high-performance automated platform based on GenetixQ-pix2xt robotic systems (from MolecularDevice) and TecanFreedomEVO 200 (from Tesap). To block nonspecific binding, 200 ⁇ l blocking buffer per well (0.5% skim milk in PBST) was added. The plates were incubated on a shaker for one hour at room temperature.
  • a colorimetric signal was obtained using a TMB solution (50 ⁇ l / well) to saturation (average 3-5 min), the reaction was stopped by adding a solution of 10% sulfuric acid (30 ⁇ l / well).
  • the color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a Tecan-Sunrise plate reader (manufactured by Tesap). The degree of binding of the secondary conjugated antibody was proportional to the color signal.
  • Fab fragments that specifically bind to the IL-6R receptor and block the interaction of the receptor with its ligand were compared with each other by receptor affinity.
  • Comparative dissociation constant screening (k ⁇ jg) for aHTH-IL-6R candidates was performed using an OctetRed 96 instrument and anti-FABCHI biosensors (Pall-ForteBio) (Fig. 6). The biosensors were rehydrated for 30 minutes in a working buffer containing 10 mM PBS pH7.2-7.4, 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA. 1/10 volume of a 10 ⁇ working buffer was added to the studied samples of E. Co // cell growth medium containing aHTH-IL-6R Fab fragments and mixed.
  • anti FABCH1 biosensors were immersed in solutions containing Fab fragments for 12 hours at 4 ° C. After 12 hours, sensors with Fab fragments immobilized on the surface were transferred to wells with a working buffer, where the baseline was recorded (60 s). The sensors were then transferred to wells with analyte solution (IL-6sR-H6F, 30 ⁇ g / ml) for association of the antigen-a-fragment fragment complex (300 s). Then the sensors were returned to the wells containing the working buffer for the subsequent stage of dissociation (300 s). After each experiment, the sensors used were regenerated by placing them three times in the regeneration buffer (Gly-HCI, pH 1, 7), after which they were used in the following experiments. The analysis of the obtained curves was performed using OctetDataAnalysis software (version 7.0) according to the standard procedure using a 1: 1 interaction model.
  • lgG1 antibodies The construction of full-length lgG1 antibodies was carried out by means of the reclamation of the genes of variable domains from expression plasmids, previously used to generate Fab fragments.
  • an In-Fusion® HD EcoDry TM CloningKit kit from Clontech was used for cloning.
  • Variable domain gene insertions were obtained by amplification in PCR with specific primers, matrix residues in PCR were removed by treatment with restriction enzyme Orp !.
  • the vector is a pEE plasmid, linearized by restriction Sail and BsiWI for the light chain and Sall / Nhel for heavy.
  • the insert gene and linearized vector were mixed in 10 ⁇ l of water and transferred to separate In-Fusion vialkistrips. Mix by pipetting.
  • Strips were incubated for 15 minutes at 37 ° C, then 15 minutes at 50 ° C, then transferred to ice. Part of the reaction volume with the resulting constructs was used in cell transformation. Plasmids were isolated from the obtained clones and the insert was checked by sequencing.
  • the growth of DS-1 cells depends on the presence of extracellular external IL6 ligand and blocking its binding to the receptor on the surface of the cells leads to inhibition of their growth.
  • the DS-1 cell culture was grown on RPMI-1640 nutrient medium, 10% inactivated fetal serum, 1 mM sodium pyruvate and 7.5 ng / ml IL6. The day before the experiment, the cells were washed 2 times in PBS from IL6 residues and plated on a 96-well plate at a rate of 10,000 cells per well in growth medium without the addition of IL6.
  • a HEK-BluelL6 cell suspension was prepared with a concentration of 1-10 ⁇ clones / ml in DM EM growth medium with 10% inactivated serum (cell growth medium). Sown in a 96-well plate at the rate of 100 ⁇ l / well (5-10 ⁇ clones / well).
  • a series of dilutions of antibodies was prepared in a cell growth medium from 200 ⁇ g / ml in increments of 3 ten points, the last control point without antibody.
  • a solution of human IL6 in a cell growth medium with a concentration of 4 ng / ml was prepared.
  • 50 ⁇ l of diluted antibodies were added to the cells and incubated for 45 minutes in a CO2 incubator.
  • 50 ⁇ l of IL6 solution was added to the antibody cells and the antibody cells and IL6 were left to incubate overnight in a CO2 incubator.
  • the absorption level was measured on a spectrophotometer at a wavelength of 630 nm (Fig. 10).
  • the analysis was performed at 30 ° C using PBS containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as the working buffer. Titration of human, cynomolgus monkey, guinea pig, dog, rabbit and mouse IL-6R was performed using a working buffer from a concentration of 126 nM to 2 nM in steps of 2.
  • BCD89 binds to the recombinant preparation of human IL-6R and macaque IL-6sR with high affinity (Fig. 13, Fig. 14).
  • the candidate interacts with guinea pig IL-6R with a constant lower by 3 orders of magnitude than with a human (FIG. 16). No antibodies were detected with the mouse receptor (FIG. 15).
  • Test samples were concentrated to 5 mg / ml using ultrafiltration in centrifuge filters AmiconUltra 10 kDa per 0.5 ml (Millipore). Protein content was determined by UV spectrophotometry at a wavelength of 280 nm. Each obtained sample was divided into several parts of 150 ⁇ l and placed in separate tubes: one tube for each composition was stored in a refrigerator at + 4 ° C, the rest were installed in a tube thermostat and thermostated at 50 ° C for a set time.
  • the flow rate was 0.7 ml / min, and the sample volume was 10 ⁇ l with a sample concentration of 5 mg / ml.
  • the detector wavelength is 220 and 280 nm, the elution time is 25 minutes. (Fig.17).
  • S1 is the peak area of the monomer
  • XS is the sum of the areas of all the peaks.
  • the introduction of the drug and placebo substances began after preliminary sensitization with collagen.
  • the articular surface was measured in animals of all groups to calculate the PPV; at the time the study was completed, metacarpophalangeal and metatarsophalangeal joints were taken to assess the severity of destructive changes. Animals were divided into 5 groups. The names of the groups are given in table 3.
  • bovine collagen type II (Sigma) three times.
  • the first introduction of collagen The total amount of collagen administered to one experimental animal was 2 mg. For this, 2 mg of collagen was dissolved in 0.7 ml of 0.1 M acetic acid. To the resulting solution was added 0.7 incomplete Freund's adjuvant.
  • the animals were kept for 28 days after the first administration of collagen.
  • the second introduction of collagen The total amount of collagen administered to one experimental animal was 3 mg. For this 3 mg collagen was dissolved in 1.0 ml of 0.1 M acetic acid. To the resulting emulsion, 1.0 ml of complete Freund's adjuvant was added.
  • the animals were kept 21 days after the second injection of collagen.
  • the third introduction of collagen The total amount of collagen administered to one experimental animal was 3 mg. For this, 3 mg of collagen was dissolved in 1.0 ml of 0.1 M acetic acid. To the resulting emulsion, 1.0 ml of Freund's incomplete adjuvant was added.
  • PS value for the longitudinal axis ⁇ value for the transverse axis x 3.14 x 0.25.
  • PPV (value for PS on the day of the experiment ⁇ 100) / (average value for PS before the induction of arthritis) (Fig. 18).
  • - a general blood test according to indicators: the number of red blood cells, the number of leukocytes, the concentration of hemoglobin, the number of lymphocytes, the number of monocytes, the number of neutrophils, the number of eosinophils, the number of basophils, the number of platelets (before administration, then once a week, starting from the first week of the experiment);
  • the BCD89 antibody was transferred to the required buffer and the concentration was adjusted to 180 mg / ml, the resulting solution was filtered (arrow filtering) and the syringes were filled.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине. Задача настоящего изобретения состоит в создании альтернативных антител или их фрагментов, обладающих способностью специфически связываться с человеческим рецептором интерлейкина-6, которые были бы применимы в качестве лекарственных средств для лечения или диагностики заболеваний или для облегчения симптомов, опосредованных интерлейкином-6.

Description

АНТИТЕЛО ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ, СПОСОБНЫЙ СВЯЗЫВАТЬСЯ С РЕЦЕПТОРОМ ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 ЧЕЛОВЕКА
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к медицине. Настоящее изобретение относится к созданию антител или их фрагментов, обладающих способностью специфически связываться с человеческим рецептором интерлейкина-6, которые были бы применимы в качестве лекарственных средств для лечения или диагностики заболеваний или для облегчения симптомов, опосредованных интерлейкином-6. Изобретение также относится к способам получения указанных антител и способу лечения заболеваний человека с помощью данных антител.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Интерлейкин-6 (IL-6, ИЛ-6) является одним из главных посредников воспалительных реакций, продуцируемый широким рядом антигенпрезентирующих клеток, включая В- и Т-клетки. IL-6 продуцируется активированными моноцитами или макрофагами, эндотелиальными клетками, фибробластами, активированными Т-клетками, а также рядом клеток, не являющихся иммуноцитами. Наряду со многими другими цитокинами он участвует в процессах иммунного ответа, ангиогенеза, воспаления, костного метаболизма. Основное действие IL-6 связано с его участием в качестве кофактора при дифференцировке В-лимфоцитов, их созревании и преобразовании в плазматические клетки, секретирующие иммуноглобулины. Помимо этого, IL-6 способствует экспрессии рецептора IL-6 на активированных иммуноцитах, а также индуцирует производство IL- 2 Т-клетками. Этот цитокин стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов и реакции гемопоэза. По многообразию клеточных источников продукции и мишеней биологического действия IL-6 является одним из наиболее активных цитокинов, участвующих в реализации иммунного ответа и воспалительной реакции. Было показано, что дисбаланс между про- и антивоспалительными действиями IL-6 приводит к различным аутоиммунным заболеваниям, хроническому воспалению и остеопорозу, псориазу, а избыточная продукция приводит к различным формам рака.
В этой связи, блокирование действия IL-6 является привлекательной целью для исследований и лечения перечисленных заболеваний (PeterC.HeinrichBiochem. J. (2003) 374:1 ).
Проведение сигнала цитокина внутрь клетки возможно 2 способами. Первый - к клеткам, имеющим мембрансвязанную альфа-субъединицу рецептора, присоединяется интерлейкин-6 к уже собранному рецептору из альфа-субъединицы и молекул др130. Второй - к клеткам, имеющим на мембране только молекулы др130, присоединяется комплекс интерлейкина-6 с растворимой формой альфа-субъединицы. На мембране клетки происходит сборка полного комплекса и последующий запуск каскада реакций в клетке. Блокирования действия цитокина и, следовательно, воспалительной реакции можно добиться, помешав сборке полного комплекса рецептора, состоящего из альфа-субъединицы, молекул др130 и интерлейкина 6. Специфические антитела, связываясь с одной из молекул, способны препятствовать сборке полного комплекса и, соответственно, блокируют проведение сигнала внутрь клетки.
Полипептиды, специфически связывающиеся с IL-6 (см. патент РФ N2 2550262), IL-6R или др130 показали значительное ингибирующее влияние на функционирование IL-6. А препараты на основе антитела (тоцилизумаб) связывающегося с IL-6R и блокирующего взаимодействие с IL-6 широко применяются при лечении ревматоидного артрита и системного ювенильного идиопатического артрита, как в виде монотерапии, так и в комбинации с метотрексатом и/или с другими базисными противовоспалительными препаратами.
Приведенные данные позволяют предположить, что разработка препарата на основе антитела aHTH-IL-6R позволит охватить лечением всех пациентов с данными заболеваниями.
Рецептор IL-6 (IL-6R, IL6R, CD126) является комплексом молекул, при активации вызывающий каскад реакций в клетке, приводящих к активному синтезу белков, участвующих в дальнейших реакциях воспалительного ответа. Рецептор активируется при связывании IL-6 с альфа-субъединицей рецептора массой 80 кДа, не передающей сигнала, и 2-ух молекул др130 массой 130 кДа, передающих сигнал внутрь клетки (SimonA.JonesTheFASEBJournal 15(1 ):43-58). Существуют 2 формы альфа-рецептора: связанного с мембраной (mlL-6R) и растворимого (slL- 6R 38 кДа). Растворимая форма образуется в результате протеолиза трансмембранной части или в процессе альтернативного сплайсинга мРНК mlL-6R. Растворимая форма IL-6sR позволяет давать ответ на цитокин клеткам, не имеющим mlL-6R на поверхности мембраны.
Блокирование сигнала IL-6 с помощью полипептидов, связывающихся с рецептором, имеет ряд преимуществ перед блокированием связывающихся непосредственно с IL-6. Так, антитела против IL-6 связываются как с целевым внутрисуставным лигандом, так и с циркулирующим в крови IL-6. В то время как антитела, связывающиеся с IL-6R действуют и на клетки, содержащие mlL-6R на поверхности, и на клетки, содержащие только др130.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1 . Определения
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области. Примерные способы и материалы описаны ниже, хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут также использоваться способы и материалы подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе. Все публикации и другие ссылочные материалы, упомянутые в настоящем документе, включены во всей их полноте путем отсылки. В случае противоречий настоящее описание, включая определения, будет превалировать. Хотя в настоящем документе цитируется ряд документов, такое цитирование не является признанием того, что любой из этих документов образует часть общеизвестных знаний в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в з единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
В этом описании и вариантах осуществления изобретения слова «иметь» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Если не указано иное, в настоящем тексте применяются общепринятые однобуквенные обозначения аминокислот.
Термины «интерлейкин-6», «ИЛ-6», «ИЛ6», «11_6» и «IL-б» в настоящем тексте используются взаимозаменяемо.
Термин «IL-6R», «IL6R» или CD126 обозначает рецептор интерлейкина-6.
Термин «slL-6R» обозначает растворимую форму рецептора интерлейкина-6.
Термин «mlL-6R» обозначает связанный с мембраной рецептор интерлейкина-6.
Термин «антитело» и «иммуноглобулин» являются взаимозаменяемыми и относятся к полноразмерному антителу в том виде, в каком они синтезируются клетками иммунной системы или иными организмами, модифицированными средствами генной инженерии.
Полноразмерные антитела состоят из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых цепей (Н)(приблизительно 50-70 кД при полной длине) и
двух легких цепей (L) (приблизительно 25 кД при полной длине), связанных между собой дисульфидными мостиками.
Ν-концевая (аминоконцевая) часть каждой цепи включает вариабельный участок из приблизительно 100-1 10 или более аминокислот, которые в основном отвечают за распознавание антигенов.
С-концевая (карбоксиконцевая) часть каждой цепи определяет константный участок, главным образом, отвечающий за функцию эффектора.
Вариабельные участки тяжелых и легких цепей образуют антигенсвязывающий центр (или участок).
Легкие цепи антител классифицируют как каппа или лямбда, каждая из которых имеет конкретный константный участок. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка Ν-концевой части легкой цепи («LCVR» или «VL») и константного участка легкой цепи, состоящего из одного домена CL.
Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 и lgA2. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретным константным участком, Fc. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка Ν-концевой тяжелой цепи («HCVR» или «VH») и константного участка тяжелой цепи СН. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов (СН1 , СН2 и СНЗ) для IgG, IgD и IgA и 4 доменов (СН1 , СН2, СНЗ и СН4) для IgM и IgE.
Участки HCVR и LCVR могут быть дополнительно разделены на участки гипервариабельности, называемые Rf-гипервариабельными участками (CDR), перемежающиеся с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR).
Каждый HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке от аминоконца к карбоксиконцу: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном.
Вариабельные участки каждой из пар легкая/тяжелая цепь образуют антигенсвязывающие сайты антитела. Как используется в данной заявке, «антигенсвязывающая часть», или «антигенсвязывающий участок», или «антигенсвязывающий домен» или «антигенсвязывающий центр» относятся, взаимозаменяемо, к такой части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу его специфичность и аффинность по отношению к антигену. Эта часть антитела включает «каркасные» аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков.
Под «антителом» в настоящей заявке не обязательно понимается антитело человека, это может быть антитело грызуна, антитело животного семейства приматов или Camelidae, предпочтительно антитело мыши, макаки, антитело верблюда или ламы, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.
Термин «антитело» в настоящем тексте также охватывает искусственно сконструированные одноцепочечные антитела, имеющие структуру, близкую к структуре натуральных антител.
Антитела, упоминаемые в настоящем тексте, могут быть гликолизированными или свободными от полисахаридных остатков.
Под антителом по изобретению может пониматься моноклональное антитело. Под «моноклональным антителом» понимается гомогенная или по существу гомогенная популяции антител (т.е. по крайней мере приблизительно 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96 %, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 97 или 98 % или еще более предпочтительно по крайней мере 99 % антител в популяции будут конкурировать в анализе ELISA за тот же антиген или эпитоп, или более предпочтительно антитела являются идентичными в аминокислотной б последовательности).
Также под моноклональными антителами понимаются антитела имеющие идентичную или по существу идентичную аминокислотную последовательность, хотя они могут отличаться по посттрансляционной модификации, например паттернгликолизации.
Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, гибридомных методик, хорошо известных из уровня техники, а также рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных из уровня техники.
Однако, термин «моноклональное антитело» не ограничивается антителами, полученными только с помощью гибридомной технологии. Этот термин может относиться к антителу, полученому из единой копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон.
Нумерацию аминокислотных остатков в настоящем тексте осуществляют со ссылкой на референсное антитело, под которым понимается антитело, тяжелые цепи которого имеют последовательность SEQIDNO:10, а легкие цепи - последовательность SEQIDNO:9. Во всех остальных случаях нумерацию и позиционирование CDR-аминокислотных остатков в пределах HCVR и LCVR участков антител осуществляют в соответствии с номенклатурой Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 ), если не указано иное.
Антитела согласно изобретению могут быть получены различными методиками конструирования, в том числе, с использованием рекомбинантных способов, включая шаффлинг ДНК, полученной из различных источников.
Антитела настоящего изобретения могут быть моноспецифическими, биспецифическими или мультиспецифическими. Мультиспецифические антитела могут быть специфичны по отношению к различным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антиген-связывающие домены, специфические по отношению к иному одному или нескольким антигенам, помимо IL-6R или к разным эпитопам IL-6R (см., например, Tuttetal. (1991 ) J. Immunol. 147:60-69).
Связи между антигенсвязывающими частями моно-, би- и мультиспецифичных антител могут быть различными. В частности, связи между антигенсвязывающими частями могут быть химическими, либо разные антигенсвязывающие части могут быть объединены через общую полипептидную цепь, либо путем нековалентной ассоциации разных цепей друг с другом, либо антигенсвязывающие части могут быть объединены друг с другом посредством другого антитела или фрагмента антитела.
Термин «aHTH-slL-6R-aHTHTeno», «антитело к slL-6R», «антитело, специфически связывающееся с рецептором интерлейкина-6» и т. п. являются взаимозаменяемы в контексте настоящей заявки и относятся к антителу, которое специфически связывается с рецептором IL-6. Термин «mll_-6R» обозначает связанный с мембраной рецептор интерлейкина-6.
Термин «slL-6R» обозначает растворимую форму рецептора интерлейкина-6.
Под «фрагментом антитела» понимается любой фрагмент натурального и искусственно сконструированного антитела, содержащий три или менее CDR тяжелой и три или менее CDR легкой цепи. Под фрагментом антитела может подразумеваться, в частности, по существу полноразмерное антитело, с укороченным каркасным участком тяжелой цепи, полный или полноразмерный Fc-участок, часть или фрагмент антитела, содержащий антигенсвязующую часть, например, Fab- фрагмент, Fab'-фрагмент или Р(аЬ')2-фрагмент антитела, scFv, (scFv)2, dsFv, одноцепочечный Fv-фрагмент, который может быть получен путем связывания ДНК, кодирующей LCVR и HCVR, с линкерной последовательностью (см. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994).
Термин «фрагмент антитела» не должен пониматься, как указывающий на происхождение от полноразмерного антитела. «Фрагмент антитела» может быть получен совершенно независимо от полноразмерных антител любым известным способом.
Под «фрагментом антитела» также подразумевается искусственно сконструированный полипептид или продукт, содержащий пептидные и непептидные части, если в его состав входят упомянутые три или менее CDR тяжелой и три или менее CDR легкой цепи, расположенные таким образом, что полипептид или упомянутый продукт сохраняют способность специфического или предпочтительного связывания своей мишени (например, эпитопа или антигена).
Все остальное, сказанное выше применительно к антителам, в том числе, то, что касается гликозилирования, также применимо и к фрагментам антител, если это не противоречит здравому смыслу.
Термин «специфически связывает», что используется в данной заявке, относится к той ситуации, при которой один участник пары специфического связывания не связывает в значительной степени молекулы, отличные от его партнера (партнеров) по специфическому связыванию. Термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который переносится рядом антигенов, в таком случае специфическое антитело, имеющее антигенсвязывающий домен, будет способно к специфическому связыванию различных антигенов, несущих эпитоп. Соответственно, антитело по изобретению или его фрагмент специфически связывает slL- 6R человека, в то время как оно практически не связывается с человеческими белками IL12, IL23, EGFR, CD3, IGFR, CTGF, FGF2, PD1 , PSCK9, CD38, GCSF, интерферон альфа 2Ь.
Термин «эпитоп» относится к той части молекулы, которая способна распознаваться и связываться с антителом в одном или более антигенсвязывающих участках антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими зарядовыми характеристиками. Под «ингибирующим эпитопом» и/или «нейтрализующим эпитопом» подразумевается эпитоп, который в контексте интактной антигенной молекулы и при связывании антителом, специфическим к эпитопу, приводит к утрате или к уменьшению биологической активности молекулы или организма, который содержит молекулу, invivo или invitro. Термин «эпитоп», как используется в данной заявке, кроме того, относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например мыши или человека. Термин «антигенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, определенная любым способом, хорошо известным из уровня техники, например при помощи традиционного иммунного анализа. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут также быть имуногенными. «Иммуногенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, который вызывает отклик антитела у животного, что устанавливается любым способом, известным из уровня техники. «Нелинейный эпитоп» или «конформационный эпитоп» содержат несмежные полипептиды (или аминокислоты) в пределах антигенного протеина, с которым антитело, специфическое к эпитопу, связывается.
Выражения «биологическое свойство» или «биологическая характеристика» или термины «активность» или «биоактивность» по отношению к антителу по изобретению используются в данной заявке как взаимозаменяемые и включают, но не ограничиваются приведенными, эпитоп/антигенную аффинность и специфичность к SIL-6R, способность быть антагонистом IL-6, стабильность антитела и иммуногенные свойства антитела invivo. Остальные идентифицируемые из уровня техники биологические свойства или характеристики антитела включают, например, перекрестную реактивность (т.е. с нечеловеческими гомологами пептида-мишени или с остальными протеинами или мишенями, в общем), и способность сохранять высокие уровни экспрессии протеина в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться, измеряться или оцениваться с использованием методик, признанных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь приведенными, анализ ELISA, конкурентный анализ ELISA, или анализ поверхностного плазмонного резонанса KINEXA, анализы нейтрализации invitro или invivo без ограничений, рецепторного связывания, продуцирования и/или секреции цитокина или фактора роста, сигнальную трансдукцию и иммуногистохимию срезов тканей, полученных из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник.
Термин «ингибировать» или «нейтрализовать», как используется в данной заявке, по отношению к активности антитела по изобретению, означает способность в значительной степени противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, прерывать, уничтожать, прекращать, уменьшать или обращать, например, развитие или тяжесть того, что ингибируют, включая, но не ограничиваясь вышеприведенными, биологическую активность (например, активность IL- 6) или свойство, заболевание или состояние. Ингибирование или нейтрализация активности IL-6 в результате связывания антитела по изобретению с SIL-6R составляет предпочтительно по крайней мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или выше.
Термин «пациент» в данной заявке относится к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь приведенными, мышей, обезьян, людей, млекопитающих сельскохозяйственных животных, млекопитающих спортивных животных и млекопитающих комнатных животных; предпочтительно термин относится к людям. В определенном из вариантов осуществления пациент, предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, дополнительно характеризуется заболеванием или расстройством, или состоянием, опосредованными IL-6, которые могут быть улучшены путем уменьшения биоактивности IL-6.
Термин «вектор» включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана, включая плазмиды и вирусные векторы, но не ограничиваясь ими. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке- хозяине, в которую они введены, в то время как остальные векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицированы наряду с геномом-хозяином. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы имеют в данной заявке название «векторы рекомбинантной экспрессии» (или, упрощенно, «векторы экспрессии»), а иллюстративные векторы хорошо известны из уровня техники.
Как используется в данной заявке, выражения «клетка», «клетка- хозяин», «линия клеток» и «клеточная культура», «клеточная линия как продуцент» используются как взаимозаменяемые и включают индивидуальную клетку или клеточную культуру, являющиеся реципиентом любого выделенного полинуклеотида по изобретению или любого рекомбинантного вектора (любых рекомбинантных векторов), которые содержат последовательность, кодирующую HCVR, LCVR или моноклональное антитело по изобретению. Клетки-хозяева включают потомство индивидуальной клетки-хозяина, и потомство не обязательном должно быть полностью идентичным (по морфологии или полному ДНК комплементу) оригинальной родительской клетке из-за природных, случайных или преднамеренных мутаций и/или изменений. Клетка-хозяин включает клетки, трансформированные, трансдуцированные или инфицированные рекомбинантным вектором, или моноклональное антитело, которое экспрессирует полинуклеотид по изобретению или его легкую или тяжелую цепь. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор по изобретению (как стабильно включенный в хромосом-хозяин, так и не включенный), также может называться «рекомбинантной клеткой-хозяином». Предпочтительными клетками- хозяевами для использования в изобретении являются СНО клетки (например, АТСС CRL-9096), NS0 клетки, SP2/0 клетки, COS клетки (АТСС, например, CRL-1650, CRL-1651 ) и HeLa (АТСС CCL-2). Дополнительные клетки-хозяева для использования в изобретении включают растительные клетки, дрожжевые клетки, другие клетки млекопитающих и прокариотные клетки.
Термин «аффинность» относится к измерению притяжения между антигеном и связывающей молекулой, например, антителом. Внутренняя способность к притяжению связывающей молекулы по отношению к антигену, как правило, выражается как константа равновесия аффинности связывания (KD) конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Считается, что связывающая молекула специфически связываться с антигеном, когда KD составляет < 1 мМ, предпочтительно < 100 нМ. AKD константа связывания аффинности может быть измерена, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcoreTM) или биослойной интерферометрии, например, с использованием системы ProteOnTM XPR36 SPR от Bio-Rad или системы OctetTM.
Термин «Ка», как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин «Kd» относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин «KD» в данном описании относится к константе афинности, которую получают из отношения Kd к Ка (т.е. Kd/Ka), и ее выражают в виде молярной концентрации (М). Величины KD для антител могут быть определены с использованием способов, хорошо установленных в данной области.
Предпочтительным способом определения KD антитела является способ с использованием резонанса поверхностных плазмонов, предпочтительно с использованием биосенсорной системы, такой как система Biacore®.
Как использовано в данном описании, термин «высокая аффинность» в отношении lgG-антитела относится к антителу, имеющему KD - Е-10 - Е-08 М, более предпочтительно Е-10 - Е-09 М или менее и, даже более предпочтительно, Е-10 М или менее в отношении антигена-мишени. Однако «высокая аффинность» связывания может варьироваться для других изотипов антигена. Например, «высокая аффинность» связывания для изотипа IgM относится к антителу, имеющему KD Е-10 - Е-07 М или менее, более предпочтительно Е-10 - Е-08 М или менее, даже более предпочтительно Е-10 - Е-09 М или менее.
Термин «K0ff» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff +можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.
Термин «эпитоп» при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула). Эпитопные детерминанты обычно состоят из молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи Сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным». В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном. Термин «эпитоп», как используется в данной заявке, кроме того, относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например мыши или человека. Термин «антигенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, определенная любым способом, хорошо известным из уровня техники, например, при помощи традиционного иммунного анализа.
Можно определить, связывается ли антитело или другая связывающая молекула с тем же эпитопом или перекрестно конкурирует за связывание с IL-6 связывающей молекулой по данному изобретению, используя хорошо известные в данной области техники методы. В одном варианте осуществления изобретения возможно связывание молекулы, предложенной в данном изобретении, с IL-6 в условиях насыщения с последующим измерением способности испытуемого антитела связываться с указанным антигеном-мишенью. Если испытуемое антитело способно связываться с антигеном-мишенью в одно время с референсной связывающей молекулой, то испытуемое антитело связывается с эпитопом, отличным от эпитопа референсной связывающей молекулы. Тем не менее, если испытуемое антитело не способно связываться с антигеном-мишенью одновременно, то испытуемое антитело связывается с тем же эпитопом, перекрывающимся эпитопом или эпитопом, который находится в непосредственной близости от эпитопа, связанного с связывающей молекулой. Этот эксперимент может быть выполнен с использованием ИФА, РИА, анализа межмолекулярных взаимодействий на BIACORETM, биослойной интерферометрии или проточной цитометрии. Для того, чтобы проверить, кросс конкурирует ли связывающая молекула по данному изобретению с другой связывающей молекулой, можно использовать описанный выше способ конкурентного анализа в двух направлениях, то есть определить, блокирует ли известная связывающая молекула испытуемую связывающую молекулу, и наоборот. Такие эксперименты по перекрестной конкуренции могут быть выполнены, например, с помощью прибора IBIS МХ96 SPR или системы OctetTM.
В одном варианте осуществления изобретения связывающая молекула, предложенная в данном изобретении, представляет собой моноклональное антитело. Используемое в данном документе сокращение «тАЬ» ОТНОСИТСЯ К моноклональному антителу, то есть антителу, которые синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.
Класс (изотип) и подкласс антител может быть определен любым способом, известным в данной области техники. В целом, класс и подкласс антитела может быть определен с помощью антител, специфичных к конкретному классу и подклассу антител. Такие антитела коммерчески доступны. Класс и подкласс может быть определен с помощью ИФА, вестерн-блот анализа, а также другими методами. В другом варианте класс и подкласс может быть определен посредством секвенирования всех или части константных доменов тяжелой и/или легкой цепей антител, сравнения их аминокислотных последовательностей с известными аминокислотными последовательностями различных классов и подклассов иммуноглобулинов и определения класса и подкласса антител.
Термин «идентичность» или «гомологичность» в контексте последовательностей нуклеиновых кислот, относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнение идентичности последовательности может проходить на участке длиной по меньшей мере около девяти нуклеотидов, обычно по меньшей мере около 18 нуклеотидов, чаще по меньшей мере около 24 нуклеотида, типично по меньшей мере около 28 нуклеотидов, более типично по меньшей мере около 32 нуклеотидов, и предпочтительно по меньшей мере около 36, 48 или более нуклеотидов. Существует целый ряд различных алгоритмов, известных в данной области, которые могут быть использованы для измерения идентичности нуклеотидной последовательности. Например, полинуклеотидные последовательности можно сравнить с использованием FASTA, Gap или BESTFIT, которые являются программами в Wisconsin Package версии 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Мэдисон, штат Висконсин. FASTA, которая включает, например, программы FASTA2 и FASTA3, обеспечивает выравнивание и процентную идентичность последовательности в областях наилучшего покрытия между запрашиваемой и искомой последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 183:63 98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71 -84 (1998)). Если не указано иное, используются параметры по умолчанию для конкретной программы или алгоритма. Например, процент идентичности последовательности между последовательностями нуклеиновых кислот может быть определен с использованием FASTA с параметрами по умолчанию (размер слова 6 и фактора NOPAM для балльной матрицы) или с использованием Gap с параметрами по умолчанию, как это предусмотрено в GCG версии 6.1.
Термин «гомологичный», что касается полипептидной последовательности антитела, следует толковать как антитело, проявляющее по крайней мере, 70%-ную, предпочтительно 80%-ную, более предпочтительно 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность последовательности относительно полипептидной последовательности. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует толковать как последовательность нуклеотидов, проявляющих, по крайней мере, 85%-ную, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную и наиболее предпочтительно 97%-ную идентичность последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты.
Выражение «биспецифическое антитело» или «мультиспецифическое антитело» включает антитело, способное селективно связывать два или более эпитопа. Биспецифические антитела, например, могут включать две различных антиген-связывающих части, где указанные антиген-связывающие части специфически связывают разные эпитопы или на различных молекулах (например, антигенах), или на одной и той же молекуле (например, на одном и том же антигене). Если биспецифическое антитело способно селективно связывать два различных эпитопа (первый эпитоп и второй эпитоп), аффинность первой антиген-связывающих части для первого эпитопа, как правило будет по меньшей мере от одного до двух, или трех, или четырех порядков ниже, чем аффинность первой антиген-связывающих части для второго эпитопа, и наоборот. Эпитопы, распознаваемые биспецифическим антителом, могут представлять собой одну и ту же или различную мишень (например, на одном и том же или различном белке). Биспецифические антитела можно получать, например, комбинированием тяжелых цепей, которые распознают различные эпитопы на одном и том же антигене. Например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные последовательности тяжелых цепей, которые распознают различные эпитопы, могут быть слиты с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими различные константные области тяжелой цепи, и такие последовательности можно экспрессировать в клетке, которая экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина. Типичное биспецифическое антитело имеет две тяжелые цепи, где каждая имеет три CDR тяжелой цепи, с последующим (от Ν-конца до С-конца) доменом СН1 , шарнирной областью, доменом СН2 и доменом СНЗ, и легкой цепью иммуноглобулина, которая или не наделена антигенсвязывающей специфичностью, но может объединяться с каждой из тяжелой цепей, или может объединяться с каждой из тяжелых цепей и может связывать один или несколько эпитопов, ограниченных антигенсвязывающими областями тяжелой цепи, или может объединяться с каждой из тяжелых цепей и способствует связыванию или одной или обеих тяжелых цепей с одним или обоими эпитопами. 2. Задача
Задача настоящего изобретения состоит в создании антител или их фрагментов, обладающих способностью специфически связываться с человеческим рецептором интерлейкина-6, которые были бы применимы в качестве лекарственных средств для лечения или диагностики заболеваний или для облегчения симптомов, опосредованных интерлейкином-6.
3. Антитела по изобретению и их фрагменты
В соответствии с настоящим изобретением предлагается антитело или его антиген-связывающий фрагмент, в которых способность связываться с рецептором интерлейкина-6 (IL-6) человека обеспечивается за счет того, что оно содержит в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относиться к антителу или его фрагменту, которые содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относиться к антителу или его фрагменту, которые содержат в себе:
- последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO:9, и
- последовательность вариабельного домена легкой цепи, по меньшей мере на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 10.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относиться к антителу или его фрагменту, которые содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 -3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий фрагмент конкурирует за связывание или связывается с тем же эпитопом, что связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающий фрагмент по меньшей мере на 90% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления настоящее изобретение связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуюется тем, что оно относится к изотипу lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4 человека.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент имеет последовательность тяжелой цепи, гомологичную не менее чем на 90% последовательности SEQ ID NO 9.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент имеет последовательность легкой цепи, гомологичную не менее чем на 90% последовательности SEQ ID NO 10.
В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc константная часть lgG1 изотипа содержит мутации Е233Р, L234A, L235A, Е236Р, L237V и/или L238A.
В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc константная часть lgG1 изотипа содержит мутации, увеличивающие значение фармакинетических параметров в животном или человеке, такие как ίι/2
(Час) ИЛИ Стаж (МКГ/МЛ).
В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc константная часть lgG1 изотипа содержит мутации M255Y, S257T и/или Т259Е, увеличивающие значение фармакокинетических параметров в животном или человеке, такие Κ8κ ί1/2β (час) или Стах (мкг/мл).
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют по меньшей мере одно из следующих свойств:
a) имеет такую агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и хранении при Т = 4 ° С в течение более чем 6 месяцев содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5 % от исходного содержания в растворе;
b) имеет такую агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и при повышении температуры до 37° С в течение более чем 2 недель содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5 % от исходного содержания в растворе.
c) имеет такую агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и повышении температуры до 50° С в течение более чем 24 часов содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5 % от исходного содержания в растворе;
d) имеет константу аффиности KD с рецептором IL-6 человека не более Е- 10 - Е-09 М;
e) имеет кинетическую константу ассоциации kon(1/Ms)c рецептором IL-6 человека не менее Е+05 (1/Мс);
f) имеет кинетическую константу диссоциации dis (1/s) с рецептором IL-6 человека не более Е-04 (1/с).
д) демонстрирует антипролиферативную активность на культуре интерлейкин-6 зависимых клеток DS1 с расчетной величиной IC50 не более 10"8 М.
h) демонстрирует блокирование STAT-3 сигналинга на культуре интерлейкин-6 зависимых клеток с расчетной величиной IC50 не более 10"8 М.
3. Биспецифические антитела по изобретению
В соответствии с настоящим изобретением также предлагается биспецифическое антитело, содержащее антигенсвязывающий фрагмент вышеописанного антитела.
Примером такого антитела может быть биспецифическое антитело, содержащее антигенсвязывающие части, CDR которых отличаются друг от друга и имеют суммарную гомологию выше 95 % друг к другу.
4. ДНК
В соответствии с настоящим изобретением также предлагается ДНК, предназначенная для получения вышеописанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающая последовательности, соответствующие последовательностям упомянутых CDR.
5. Экспрессионный вектор В соответствии с настоящим изобретением также предлагается экспрессионныи вектор, содержащий одну или несколько вышеописанных ДНК.
Для экспрессии могут быть использованы системы, описанные в разделе 6.2 «НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ» международной публикации WO 2010/148223 (см. аналог - патент РФ 2567639).
6. Клеточная линия
В соответствии с настоящим изобретением также предлагается клеточная линия, содержащая в клетках вышеописанный вектор или вышеописанную ДНК.
7. Способ получения антитела
В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ получения вышеописанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование вышеописанной клеточной линии в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, с последующим выделением и очисткой полученного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
8. Фармацевтическая композиция
В соответствии с настоящим изобретением предлагается фармацевтическая композиция для терапии заболевания или состояния, связанного с действием интерлейкина-6 (IL-6), или для устранения или облегчения симптома, связанного с нежелательным воздействием IL-6, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по пункту 1 или по любому из пунктов, подчиненных пункту 1 , в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями.
Предпочтительно, когда композиция по пункту представляет собой раствор для парентерального введения.
Альтернативно, композиция по пункту может представлять собой лиофилизированный порошок.
Композиция по пункту может быть предназначена для использования в терапии и/или в диагностике заболевания выбранного из следующего группы заболеваний и/или расстройств: ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный хронический артрит, септический артрит, артрит Лайма, псориатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатия, системная красная волчанка, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, инсулинзависимый сахарный диабет, тиреоидит, астма, аллергическое заболевание, псориаз, атопический дерматит, склеродермия, реакция«трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата органа, острое или хроническое иммунное заболевание, связанное с трансплантацией органа, саркоидоз, болезнь Кавасаки, болезнь Грэйвса, нефротический синдром, синдром хронической усталости, гранулематоз Вегенера, пурпура Шенлейна-Геноха, микроскопический васкулит почек, хронический активный гепатит, увенит, септический шок, синдром токсического шока, септический синдром, кахексия, синдром приобретенного иммунодефицита, острый поперечный миелит, хорея Гентингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, инсульт, первичный билиарный цирроз, гемолитическая анемия, взрослый (острый) респираторный дистресс-синдром, алопеция, очаговая алопеция, серонегативнаяартропатия, артропатия, болезни Рейтера, псориатическаяартропатия, связанная с язвенным колитом артропатии, атопическая аллергия, аутоиммунное буллезное заболевание, пемфигус обыкновенный, листовидный пемфигус, пемфигоид, болезнь линейных IgA, аутоиммунная гемолитическая анемия, Кумбс-положительная гемолитическая анемия, приобретенная пернициозная анемия, ювенильная пернициозная анемия, артериит, первичный склерозирующий гепатит, криптогенный аутоиммунный гепатит, фиброзное заболевание легких, криптогенный фиброзный альвеолит, пост-воспалительное интерстициальное заболевание легких, интерстициальный пневмонит, хроническая эозинофильная пневмония, постинфекционное интерстициальное заболевание легких, подагрический артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный гепатит I типа (классический аутоиммунный или люпоидный гепатит), аутоиммунный гепатит II типа, остеоартроз, первичный склерозирующий холангит, псориаз I типа, псориаз II типа, идиопатическая лейкопения, аутоиммунная нейтропения, NOS-болезнь почек, гломерулонефрит, микроскопический васкулит почек, дискоидная красная волчанка, идиопатическая или NOS-мужского бесплодия, аутоиммунитет к сперматозоидам, рассеянныйсклероз (все подтипы), симпатическая офтальмия, легочная гипертензия, вторичная для болезни соединительной ткани, синдром Гудпасчера, легочное проявление узелкового полиартериита, острая ревматическая атака, ревматоидный спондилит, болезнь Стилла, системная склеродермия, синдром Шенгрена, болезнь/артериит Такаясу, аутоиммунная тромбоцитопения, идиопатическая тромбоцитопения, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, гипертиреоидизм, зобный аутоиммунный гипотиреоз (болезнь Хашимото), атрофический аутоиммунный гипотиреоз, первичная микседема, факогенноыйувеит, первичный васкулит, витилиго, острое заболевание печени, хроническоезаболевание печени, аллергия и астма, психическое расстройство (включая депрессию и шизофрению), опосредуемое типом Тп2 и типом Th1 заболеваний, конъюнктивита, аллергический контактный дерматит, аллергический ринит, дефицит альфа-1 -антитрипсина, боковой амиотрофический склероз, анемия, кистозный фиброз, нарушения, связанные с цитокиновой терапией, демиелинизирующие заболевания, дерматит, иридоциклит, увеит, оптический неврит, повреждения при ишемии-реперфузии, ишемический инсульт, ювенильный ревматоидный артрит аутоиммунная энтеропатия, аутоиммунная потеря слуха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунный миокардит, аутоиммунное преждевременное угасание функции яичников и блефарит.
Антитела по изобретению могут быть введены отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или наполнителем в однократных или многократных дозах. Фармацевтические композиции для введения разработаны таким образом, чтобы соответствовать выбранному режиму введения, а фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или наполнители, такие как диспергирующие агенты, буферы, поверхностноактивные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, изотонические агенты, стабилизаторы, криопротекторы выбраны с учетом придания композиции необходимой лекарственной формы. Указанные композиции разработаны в соответствии с традиционными методами, приведенными в, например, Remington, TheScienceandPracticeof Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., MackPublishingCo., Easton, PA 1995, где описаны различные методы получения композиций, в общем известных специалистам.
Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент по изобретению, может быть введена пациенту с использованием стандартных методов введения, включая пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, буккальное, сублингвальное или при помощи суппозиториев.
Фармацевтическая композиция по изобретению содержит эффективное количество антитела по изобретению. Под «эффективным количеством» понимается количество, эффективное при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума, и способности антитела или части антитела вызывать желательную реакцию у индивидуума. Эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически полезный эффект антитела преобладает над токсическим или вредным эффектом. Если антитело используют в профилактических целях, то под «эффективным количеством» понимается количество, эффективное при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желательного профилактического результата. Поскольку профилактическую дозу используют для индивидуумов до или на ранней стадии заболевания, то, типично, профилактически эффективное количество может быть меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
Эффективное количество представляет собой, по крайней мере, минимальную дозу, но меньшую, чем токсическая доза активного агента, необходимую для обеспечения терапевтического или профилактического эффекта у пациента. С другой стороны, эффективное количество антитела по изобретению представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно людей, снижает биологическую активность IL-6.
Путь введения антитела по изобретению может быть пероральным, парентеральным, путем ингаляции или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Термин «парентеральный» включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Преимущественным является введение путем внутривенной или интраперитонеальной, или подкожной инъекции. Подходящие носители для таких инъекций непосредственно известны из уровня техники.
Фармацевтическая композиция, как указано в соответствующих руководствах, должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в контейнере, который обеспечивается, включая, например, герметично закрытый флакон (ампула) или шприц. Поэтому фармацевтические композиции могут быть стерильно профильтрованными после получения состава либо сделаны микробиологически пригодными иным образом. Типичная композиция для внутривенной инфузии может иметь объем в 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенка, и терапевтически эффективную дозу (например, 1 -100 мг/мл или более) концентрации антитела. Доза может варьировать в зависимости от вида и тяжести заболевания. Как хорошо известно из уровня техники в области медицины, дозировки для любого из пациентов зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, предназначенное для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарства, которые вводят одновременно. Типичная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001 -1000 мкг; однако, предвидятся дозы, находящиеся ниже или выше этого иллюстративного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Режим дозировок ежедневного парентерального введения может составлять от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг от общей массы тела, предпочтительно от 0,3 мкг/кг до 10 мг/кг и более предпочтительно от 1 мкг/кг до 1 мг/кг, даже более предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день. Процесс лечения можно контролировать путем периодической оценки состояния пациента. Для повторного введения в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния пациента лечение повторяют до достижения желаемого ответа или подавления симптомов болезни. Однако также могут применяться другие режимы дозировок, которые не описаны в данной заявке. Желаемая дозировка может быть введена путем одноболюсного введения, множественных болюсных введений или путем непрерывного инфузионного введения антитела в зависимости от образца фармакокинетического распада, которого хочет достигнуть практикующий специалист.
Эти предположительные количества антитела в сильной степени зависят от решения терапевта. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и режима является желаемый результат. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место введения антитела, конкретный вид антитела, способ введения, режим введения и остальные факторы, известные практикующим специалистам-медикам.
Антитела или их фрагменты могут быть заморожены либо лиофилизированы и восстановлены перед применением в подходящем стерильном носителе. Лиофилизирование и восстановление могут приводить к различным степеням потери активности антитела. Дозировки могут быть скореектированы для компенсации этой потери. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 6 до 8.
9. Готовые изделия
В другом из вариантов осуществления по изобретению обеспечивается готовое изделие, содержащее материалы, полезные для лечения или профилактики расстройств или состояний, описанных выше.
Готовое изделие содержит контейнер, содержащий фармацевтическую композицию с антителом, с обозначением и возможно инструкцию. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы, шприцы и аналитические пробирки. Контейнеры могут быть сделаны из ряда материалов, таких как стекло или полимерный материал. Контейнер содержит композицию согласно изобретению, которая является эффективной для лечения заболевания или нарушения, опосредованного IL-6, и может иметь выход со стерильным доступом (например, контейнер может быть пакетом для внутривенного раствора или флаконом, имеющим пробку, проницаемую для гиподермальной иглы для инъекций). Активный агент в композиции является анти-1Ь6ГН-антителом согласно изобретению. Обозначение на контейнере и инструкция, присоединенная к нему, указывает на то, что композицию применяют для лечения выбранного заболевания. Готовое изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрана. Он может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению. 10. Применение
В соответствии с настоящим изобретением предлагается применение вышеописанного антитела или его фрагмента для изготовления лекарственного средства.
Предпочтительно, когда упомянутое лекарственное средство предназначено для использования в терапии и/или в диагностике заболеваний, перечисленных выше в качестве назначения фармацевтической композиции.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 — Гель-электрофорез в денатурирующих условиях наработанного и очищенного SIL-6R человека в 12 % PAGE.
Дорожки a-d: Fermentas unstained marker, IL6R-H6F культуральная жидкость до нанесения на колонку 10 мкл, IL6R-H6F культуральная жидкость после нанесения на колонку 10 мкл, IL6R-H6F элюция 5 мкл.
Фиг. 2— Вестернблот анализ наработанного и очищенного SIL-6R человека. После проведения гель электрофореза в денатурирующих условиях SIL-6R человека в 12 % PAGE и переноса на мембрану, провели связывание с тоцилизумабом, а далее анти-GoatahlgGlgG HRP. Окраску провели с помощью ДАБ. Дорожки a-b: Prestained marker, IL6R-f lag-his 5 мкл.
Фиг. 3 — Гель-электрофорез в денатурирующих условиях наработанного и очищенного IL6-H6-EPEA человека (с 6 гистидинами и ЕРЕА последовательностью на С-конце белка) в 12 % PAGE.
Дорожки a-d: Fermentas unstained PW marker, IL6-H6-EPEA кж до нанесения на колонку 5 мкл, IL6-H6-EPEA кж после нанесения на колонку 5 мкл, IL6-H6-EPEA элюция с колонки 5 мкл.
Фиг. 4 — Фагмида для клонирования Fab фаговых дисплейных библиотек.
Фиг. 5— Экспрессионнаяплазмида для клонирования и наработки
Fab.
Фиг. 6— Кинетики ассоциации и диссоциации Fab-фрагментов с альфа-субъединицей IL-6R человека на ForteBio. Фиг. 7 — Гель-электрофорез в денатурирующих условиях наработанных и очищенных полноразмерных антител aHTH-IL-6sR человека в 12 % PAGE в присутствии бета-меркаптоэтанола.
Дорожки a-f: а - Fermentas unstained marker, b-f - aHTH-IL-6sR антитела.
Фиг. 8 — Гель-электрофорез в денатурирующих условиях наработанных и очищенных полноразмерных антител aHTH-IL-6sR человека в 12 % PAGE в присутствии бета-меркаптоэтанола.
Дорожки a-f: а - Fermentas unstained marker, b-f - aHTH-IL-6sR антитела.
Фиг. 9— Клеточный тест ингибирования пролиферации клеток DS-1 aHTH-IL-6R антителами.
Фиг. 10— Клеточный тест анализа ингибирования STAT3 пути в культуре клеток HEK-BlueTM IL6 антителом BCD089 (aHTH-IL-6sR) в сравнении с Тоцилизумабом.
Фиг. 1 1 — Иммуноферментный анализ взаимодействия антитела BCD089 с IL-6R человека, яванской макаки, крысы и собаки.
Фиг. 12 — Иммуноферментный анализ взаимодействия антитела BCD089 с рецепторами IL-6R человека, кролика и морской свинки.
Фиг. 13— Кинетики ассоциации и диссоциации BCD089 с альфа- субъединицей IL-6R человека на ForteBio.
Фиг. 14— Кинетики ассоциации и диссоциации BCD089 с альфа- субъединицей IL-6R яванской макаки на ForteBio.
Фиг. 15— Кинетики ассоциации и диссоциации BCD089 антитела BCD 089 с IL-6R человека и мыши (IL-6R мыши 250 нМ -черная кривая, IL- 6R человека 50 нМ-синяя кривая)
Фиг. 16— Кинетики ассоциации и диссоциации BCD089 с альфа- субъединицей IL-6R морской свинки на ForteBio.
Фиг. 17 — Гель-фильтрационные профили молекулы BCD089 до (красный) и после инкубации 12 ч инкубации при 50°С (синий).
Фиг. 18 — Оценка противовоспалительной активности препарата BCD-089 на модели коллаген-индуцированного артрита приматов ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общее описание способа получения и испытания
антител по изобретению
На первом этапе отбирали полипетиды, специфически связывающиеся с растворимой формой рецептора интерлейкина-6 человека (slL-6R), то есть с его альфа-субъединицей. Для этого использовали фаговые библиотеки, сконструированные на основе аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека. Для построения фаговой библиотеки выделяли и очищали молекулы РНК из клеток крови более 1000 доноров, из которых (молекул) методом обратной транскрипции и ПЦР в несколько шагов синтезировали гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов доноров. Различные комбинации генов связывающихся участков тяжелых и легких цепей встраивали в бактериофаговые векторы в правильной ориентации и использовали для создания гибридных фаговых библиотек (фиг. 4).
Селекцию полученных фаговых библиотек проводили на человеческом белке SIL-6R, который нарабатывали в транзиентной системе клеток СНО-Т и очищали из культуральной жидкости на сорбенте IMAC BIORAD.
Клетки, продуцирующие SIL-6R получали реклонированием гена альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-6 человека в вектор для транзиентной наработки рЕЕ с последующей трансфекцией СНО-Т.
Клетки-продуценты выращивали в инкубаторе в течение 7-10 суток.
Белок очищали в одну стадию и удостоверялись в том, что он является целевым с помощью метода Westernblot используя специфические антитела (Human IL-6sR Detection antibody PartNo. 840244 from Human IL-6sR DuoSet ELISA Development Kit Catalog Number:DY227 R&D System).
Селекцию полученных фаговых библиотек проводили в два или более этапов. Отбирали фаги, специфически связывающиеся с иммобилизованным на пластике SIL-6R. В результате получили множество фагов, связывающихся с slL-6R, из которых выделили бактериофаговые векторы. Из этих векторов гены полипептидов, специфически связывающихся с белком амплифицировали и реклонировали в экспрессионные вектора для синтеза белковых молекул в прокариотических клетках E.coli. После трансформации клеток полученными плазмидами и синтеза индивидуальных полипетидов провели скрининг и отобрали молекулы, специфически связывающиеся с IL-6sR и блокирующие связывание лиганда с рецептором. Сравнили константы аффинности полученных белков между собой и гены наиболее успешных встраивали в экспрессионные вектора рЕЕ для экспрессии уже полноразмерных антител. После наработки антител в суспензионной культуре клеток яичников китайских хомячков (Chinese Hamster Ovaries, СНО) и их очистки, оценили их аффинность и убедились в блокировании сигнала интерлейкина 6 в различных функциональных клеточных тестах. В результате проведенных исследований и анализа была отобрана одна молекула антитела, специфически связывающаяся с SIL-6R и блокирующая действие IL-6 в клеточных тестах. Ее нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепей реклонировали в вектор psX, с помощью которых получили клеточные линии, стабильно продуцирующие антитело. В дальнейшем с помощью полученной клеточной линии нарабатывали выбранное антитело, для которого подобрали схему очистки и условия хранения. Спланировали и начали проведение доклинических исследований полученного препарата.
Пример 1.
Продукция рекомбинантных антигенов и антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих.
Антитела и антигены продуцировали в клетках транзиентной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия СНО-К1 ), согласно протоколам Суспензионное культивирование осуществляли в колбах на орбитальном шейкере, с использованием бессывороточных сред для суспензионных культур производства компании Life Technologies Corporation, согласно инструкциям производителя. Для транзиентной экспрессии клетки трансфецировали с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ «МАХ», компания «Polysciences»). Соотношение ДНК/ПЭИ составляло 1 :3-1 :10. Через 7-10 дней после трансфекции культуральную среду центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии.
Пример 2.
Очистка антигенов и антител из суспензионной культуры клеток млекопитающих.
Рекомбинантный белок SIL-6R, содержащий шесть аминокислот His на С-конце белка, выделяли и очищали из культуральной жидкости, используя смолу Profinity IMAC Ni-charged (компании Bio-Rad). До очистки в культуральную жидкость добавляли N 1CI2 до концентрации 1 мМ. Далее добавляли в культуральную жидкость 1/200-1/500 объема сорбента Profinity IMAC Ni-charged и перемешивали на качалке 1 час при комнатной температуре. Переносили сорбент на колонку Thermoscientific Polypropylene columns объемом 5 или 10 мл, промывали 5 колоночными объемами 10 мМ фосфатного буфера рН8 с 5 мМ имидазолом и 0,3 М хлоридом натрия, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связанный антиген элюировали, используя 0,3 М имидазол, рН 8, 0,3 М NaCI. Далее белок переводили в PBS (рН 7,4) с помощью диализа, используя технологию Snake Skin Dialysis Tubing, фильтровали (0,22 мкм) и переносили в пробирки. Пробирки хранили при -70°С. Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель- электрофореза, а идентифицировали с помощью метода вестернблот, используя специфическое антитело анти-11_-6Рч и коньюгированные козлиные анти-человеческое антитело антитела (Фиг.1 и 2). Исследуемые антитела анти-1Ь6ГН очищали на колонке HiTrap rProteinA FF объемом 1 мл (GE Healthcare). Осветленную культуральную жидкость пропускали через HiTrap rProtein A FF объемом 1 мл (GE Healthcare), которая была уравновешена фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,4). Затем колонку промыли 5 колоночными объемами PBS, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связавшийся белок элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер рН 3. Главный протеиновый пик элюции собрали и довели его рН до нейтрального с помощью 1 М буфера Tris (рН 8). Все стадии проводили при скорости потока 1 мл/мин. Далее белок перевели в PBS (рН 7,4) с помощью диализа, используя технологию Snake Skin Dialysis Tubing, профильтровали (0,22 мкм), перенесли в пробирки и хранили при -70°С. Чистоту полученного раствора белка оценили с помощью SDS-гель-электрофореза (Фиг.7 и 8).
Рекомбинантный лиганд IL6-H6-EPEA (интерлейкин 6 с «пептидным хвостом» из 6 гистидинов и последовательностью ЕРЕА на С-конце) очищали на колонке GE Healthcare С16/20 с 5 мл Capture Select C-tag Affinity Matrix. Все стадии проводили при скорости потока 5 мл/мин. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку, которая была уравновешена фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,4). Затем колонку промыли PBS до выхода сигнала спектрофотометра хроматографической системы на плато, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связавшийся белок элюировали, используя 20mM Tris 2М MgCl2 рН7,1. Главный протеиновый пик элюции собрали и перевели в PBS (рН 7,4) с помощью диализа, используя технологию SnakeSkinDialysisTubing. Затем профильтровали через фильтр (0,22 мкм) и перенесли в пробирки и хранили при -70°С. Чистоту полученного раствора белка оценили с помощью SDS-гель-электрофореза (фиг.З).
Пример 3.
Селекция Fab-библиотек фаговых антител человека.
Специфически связывающиеся с SIL-6R фаговые частицы с Fab- фрагментами человека выделяли из комбинаторной фаговой Fab- дисплейной библиотеки MeganLib™ (БИОКАД), содержащей более 101 1 независимых клонов и синтезированной на основе генов вариабельных доменов иммуноглобулинов человека (Фиг.4), согласно модифицированному протоколу (J BiolChem. 1999 Jun 25; 274(26): 18218- 30). Для создания библиотеки использовали лимфоциты более чем тысячи доноров. Селекцию проводили на рекомбинантном SIL-6R-H6F человека при условиях, как описано ранее (NatBiotechnol. 1996 Mar;14(3):309-14; J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3): 581 -97). Для осуществления селекции методом пэннинга, SIL-6R-H6 или slL-6R-Fc человека в 50 мМ карбонатном буфере (рН 9,5) адсорбировали в течение ночи при 4°С на поверхности сорбирующих пробирок EIA/RIA high binding (Greineer bio-one). Пробирки промывали несколько раз PBST (PBS рН 7,4 и 0,1 % Твина 20 v/V), а затем блокировали вакантные центры связывания белка на поверхности пробирок раствором обезжиренного молока (0,5% m/V в PBST рН 7,4). Инкубировали раствор обезжиренного молока в пробирках в течение 1 ч. Далее отмывали пробирки раствором PBST. Затем развели фаговые библиотеки MeganLib™ в 2-4 мл раствора PBST с 0,5% обезжиренным молоком до конечной концентрации Ю^фаговых частиц на мл. Добавляли подготовленные библиотеки в пробирки со связанным на поверхности антигеном и инкубировали в течение 1 ч при перемешивании. Несвязавшиеся фаги удаляли в ходе серий отмывок пробирок раствором PBST. Количество отмывок увеличивали от первого раунда к треьему раунду: 20-30-40 раз, соответственно. Оставшиеся связанными фаговые частицы элюировали с пластиковой пробирки 0,1 М раствором Gly-HCI (рН 2,2) в течении 15 мин при перемешивании. Затем переносили раствор в чистые пластиковые пробирки и нейтрализовали 1 М Tris-HCI (рН 8) 5:1 . Бактерии штамма Е. coli TG1 инфицировали полученными фагами, фаги амплифицировали и использовали в следующем цикле селекции. Пример 4.
Амплификация бактериофагов.
Бактериофаг после селекции культивировали, используя штамм E.coli TG1. Амплификацию провели посредством заражения фагами культуры штамма-хозяина и последующим ростом в течение 12-15 часов. Раствор фагов после селекции смешивали с культурой подращенных клеток E.coli TG1 (Ongoo=0,3-0,4) и инкубировали 1 ,5 часа при 37С. Затем клетки осаждали на 3000-4000 об/мин в течение 10-15 минут, ресуспендировали в 1 мл среды 2TY и растирали на чашки Петри с антибиотиком для селекции (ампициллин). Наращивали колонии в течении ночи в термостате на ЗОС. Спустя 12-15 часов подсчитывали количество колоний и смывали клетки с чашек 5-10 мл среды 2TY. Для этого 100 мкл клеточной суспензии добавили к 20 мл среды 2TY с антибиотиком (ампициллин) и нарастили до на шейкере до ОП6оо=0,35-0,5 на 37С. Добавили фаг-хэлпер К07 из расчета 1 мкл на 10 мл культуры (1010 частиц на мл) и инкубировали на 37С 1 ,5 часа при слабом перемешивании. Затем к клеточной культуре добавили равный объем среды с однократным ампициллином (100 мкг/мл) и двукратным канамицином (60 мкг/мл) и двукратным IPTG (0,2мМ). Переставили колбы на качалку и нарабатывали фаг 3-5 часов при ЗОС. Культуру клеток центрифугировали 20-30 минут 10 тыс. об/мин и отобрали супернатант в пробирки. После этого добавили 1/6 объёма раствора, содержащего 20% полиэтиленгликоля и 2,5М хлорида натрия, интенсивно перемешали. Инкубировали раствор во льду не менее 3 часов. Затем раствор центрифугировали 10 минут при 8000 д, образовавшийся осадок, содержащий фаги растворили в 1 мл буфера TBS.
Пример 5.
Реклонирование генов Fab-фрагментов с разнообразными вариабельными участками в экспессионнуюплазмиду.
Из клеток E.coli TG1 после третьего раунда селекции выделили фаговую ДНК (фагмиду) производного фага М13. С фагмиды с помощью ПЦР и концевых специфических праймеров гены Fab-фрагментов с разнообразными вариабельными участками амплифицировали и реклонировали в экспессионнуюплазмиду рИ4. Реклонировали гены по сайтам Nhel, Notl. Проверили вставку секвенированием 4 случайных колоний.
Пример 6.
Наращивание Fab-фрагментов в клетках E.coli BL21Gold с экспрессией белков в клеточную среду роста.
Fab-фрагменты на основе полученных генов синтехировали в клетках E.coli BL21Gold. Экспрессионный вектор pl_L4 с реклонированными в него генами Fab-фрагментов, из фагмид после 2 или 3 раунда селекций, трансформировали (электропорировали по стандартному протоколу) в экспрессионный штамм E.coli BL21 Gold. Высеяли на агаризованную среду 2TY (чашки Петри) с селективными антибиотиками (канамицин 30 мкг/мл, ампициллин 100 мкг/мл и глюкоза 0.2%). Высевали таким образом, чтобы титр клеток подходил для отбора индивидуальных клонов и нарастили колонии 14-16 часов в термостате при ЗОС. Отдельные колонии перекололи в стерильные 96-ти луночные плашки (U-shape) со 100 мкл среды 2TY (канамицин 30 мкг/мл, ампициллин 100 мкг/мл и глюкоза 0,4%) на лунку и наращивали на шейкере 800 rpm, 16-18 часов при комнатной температуре. 96-ти канальным репликатором пересеваем клеточные культуры на стерильные 96-ти луночный плашки (V-shape) со 100 мкл среды 2TY (канамицин 30 мкг/мл, ампициллинЮО мкг/мл, глюкоза 0,1 %, ТХ100 0,01 % и IPTG 0,5 тМ) и наращиваем на шейкере при 800 rpm, в течение ночи при комнатной температуре. Центрифугировали плашки на 3500 об/мин 20 мин и отобрали среду с Fab-фрагментами для ИФА в чистые 96-ти луночные плашки (U-shape), хранили плашки на -70С. Пример 7.
Анализ специфического связывания Fab с IL-6sR-H6 человека.
Для отбора специфически связывающихся с IL-6sR-H6 человека Fab- фрагментов использовали стандартный ИФА (ELISA). В качестве позитивного контроля использовали воспроизведенный [US201 10245473 seqid 15 и US201 10245473 seqid 16] Fab-фрагмент Актемра (тоцилизумаб). Для анализа специфического связывания использовали 96-луночные планшеты ELISA (от NunclmmunoMaxisorp). На поверхности лунок связывали антиген IL-6sR-H6, для этого в каждую лунку добавили по 50 мкл 0,5 мкг/мл раствора IL-6sR-H6 в связывающем карбонатном буфере. Закрывали крышкой и инкубировали в течении ночи при 4°С. Все последующие этапы проводили по стандартной методике ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем GenetixQ-pix2xt (от MolecularDevice) и TecanFreedom EVO 200 (от Тесап). На следующий день лунки планшетов пять раз промыли буфером PBST. Для блокирования неспецифического связывания в планшеты добавили блокирующий буфер (200 мкл на лунку, 0,5% обезжиренного молока в PBST). Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре. После отмывок PBST в лунки добавили по 50 мкл смеси 1 к 1 тестируемого клеточного супернатанта, содержащие исследуемые Fab-фрагменты, и блокирующего буфера. Инкубировали планшеты с растворами Fab- фрагментов на шейкере в течение часа при комнатной температуре. Спустя час, лунки планшетов пять раз промыли буфером PBST. Затем добавили в лунки планшета раствор конъюгированного вторичного козьего антитела
Figure imgf000040_0001
с пероксидазой (от Pierce- ThermoScientific) в соотношении 1 :5000 в PBST по 50 мкл/лунку. Инкубировали планшеты на ротационном шейкере 50 минут при комнатной температуре, а затем промыли пять раз буфером PBST, как описано выше. Колориметрический сигнал получили добавив в лунки раствор субстрата (ТМБ) в ацетатном буфере рН5.5 и Н2О2 0,02% (50 мкл/лунку), инкубировали до насыщения сигнала (в среднем 3-5 мин), а затем реакцию остановили добавлением раствора 10% серной кислоты по 30 мкл/лунку. Сигнал регистрировали на длине волны 450 нм, используя планшетный ридерТесап-Sunrise (от Тесап). Количество связавшихся с антигеном Fab- фрагментов пропорционально регистрируемым сигналам. Поэтому отбирали клоны, сигнал которых превышал фоновый более чем в 5 раз. Затем отобранные Fab-фрагменты проверили в конкурентном ИФА для выявления антагонистических Fab-фрагментов, блокирующих взаимодействие IL-6 и его рецептора. Клеточные суспензии E.coli BL21 Gold с максимальными сигналами переносим в чистые плашки и храним в 15% глицерине на -70С.
Пример 8.
Конкурентный ИФА блокирование Fab-фрагментами взаимодействия IL6 лиганда и IL-6R рецептора
Метод ИФА (ELISA) был использован для проверки антагонистической способности отобранных ранее Fab-фрагментов специфически связывающихся с IL-6R человека. В качестве позитивного контроля антагониста использовали анти-1Ь6ВРаЬ-фрагмент. Лиганд IL-6- ЕРЕА иммобилизовали на планшетах ELISA (Maxisorp), добавив на лунку по 50 мкл раствора с концентрацией белка 1 мкг/мл в карбонатном буфере. Инкубировали раствор в планшете в течение ночи при 4 °С. Все последующие этапы проводили по стандартной методике ИФА с небольшими изменениями и использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем GenetixQ-pix2xt (от MolecularDevice) и TecanFreedomEVO 200 (от Тесап). Для блокирования неспецифического связывания добавили по 200 мкл блокирующего буфера на лунку (0,5% обезжиренного молока в PBST). Планшеты инкубировали на шейкере в течение часа при комнатной температуре.
Параллельно в каждые 50 мкл тестируемого клеточного супернатанта, содержащие исследуемые Fab-фрагменты aHTH-IL-6R, смешали с 50 мкл раствора рецептора IL-6sR-H6F с концентрацией 0,4 мкг/мл в 1 % обезжиренном молоке на PBST в несвязывающем 96- луночном планшете. Инкубировали 1 час при 37 °С на шейкере при 500 об/мин.
После отмывок планшетов с иммобилизированнымлигандом IL6 от блокирующего буфера, переносили в эти планшеты описанную выше реакционную смесь Fab-фрагментов aHTH-IL-6R и рецептора IL-6sR. Планшеты снова инкубировали на шекере 45 мин при комнатной температуре, а затем отмыли планшеты пять раз буфером PBST. Добавили по 50 мкл/лунку мышиного антитела анти-FLAG (FLAG пептид - это С-концевой пептид на белке IL-6sR-H6F) в PBST и инкубировали 45 минут при тех же условиях. Отмыли планшеты пять раз буфером PBST и добавили разведенные в PBST конъюгированные пероксидазой козлиные антитела анти-мышиные антитела (от Pierce) в разведении 1 :5000. Планшеты, как и ранее, инкубировали на шекере 45 мин при комнатной температуре, а затем отмыли пять раз буфером PBST. Колориметрический сигнал получили с помощью раствора ТМВ (50 мкл/лунку) до насыщения (в среднем 3-5 мин), реакцию останавливали добавлением раствора 10 % серной кислоты (30 мкл/лунку). Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя планшетный ридер Tecan-Sunrise (производства Тесап). Степень связывания вторичного коньюгированного антитела была пропорциональна цветовому сигналу.
Отбирали клоны, показавшие блокирование сигнала на уровне контрольного Fab-фрагмента aHTH-IL-6R, которые и использовали в дальнейших анализах. Гены вариабельных доменов отобранных после данной стадии клонов были секвенированы, согласно стандартным протоколам на аппарате AppliedBiosystems 3730GeneticAnalyzer {AppliedBiosystems) и проанализированы. Пример 9.
Сравнительный скрининг Fab-фрагментов анти-IL-eR по кинетической константе диссоциации koff (kdis)
Fab-фрагменты, специфически связывающиеся с рецептором IL-6R, и блокирующие взаимодействие рецептора с его лигандом, сравнили друг с другом по аффинности к рецептору. Сравнительный скрининг по константе диссоциации (k^jg) для aHTH-IL-6R кандидатов проводили с использованием прибора OctetRed 96 и анти-FABCHI биосенсоров (Pall- ForteBio) (фиг.6). Биосенсоры в течение 30 минут регидратировали в рабочем буфере, содержащем 10 мМ PBS рН7.2-7.4, 0.1 % Твин-20 и 0,1 % БСА. В исследуемые образцы среды роста клеток Е. Со//,содержащих aHTH-IL-6R Fab-фрагменты, добавляли 1/10 объема 10х-рабочего буфера и перемешали. Затем анти FABCH1 биосенсоры погружали в растворы, содержащие Fab-фрагменты, на 12 часов при 4 °С. Спустя 12 часов сенсоры с иммобилизованными на поверхности Fab- фрагментами переносили в лунки с рабочим буфером, где прописывалась базовая линия (60 с). Далее сенсоры переносили в лунки с раствором аналита (IL- 6sR-H6F, 30 мкг/мл) для ассоциации комплекса антиген^аЬ-фрагмент (300 с). Затем сенсоры возвращали в лунки, содержащие рабочий буфер, для последующей стадии диссоциации (300 с). После каждого эксперимента использованные сенсоры регенерировали путем трехкратного помещения их в буфер для регенерации (Gly-HCI, рН 1 ,7) после чего они использовались в следующих экспериментах. Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения OctetDataAnalysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1 :1.
Результаты koff-скрининга aHTH-IL-6R кандидатов представлены в таблице 1. Продемонстрировано специфическое связывание всех Fab- фрагментов с IL-6R человека, кандидаты с минимальными значениями были реклонированы для получения полноразмерных антител. Таблица 1. Проверка kdis связывания aHTM-IL-6R Fab- фрагментов с альфа-субъединицей человеческого интерлейкина 6 на ForteBio
Figure imgf000044_0001
Пример 10.
Конструирование полноразмерных антител lgG1 путем реклонирования вариабельных доменов из Fab-фрагментов.
Конструирование полноразмерных антител lgG1 провели с помощью реклонирования генов вариабельных доменов из экспрессионных плазмид, используемых ранее для наработки Fab-фрагментов. Для реклонирования использовали набор In-Fusion® HD EcoDry™ CloningKit от фирмы Clontech. Наработали вставки генов вариабельных доменов путем амплификации в ПЦР со специфичнымипраймерами, остатки матрицы в ПЦР удаляли обработкой рестриктазойОрп!. Вектор - рЕЕ-плазмиду, линеаризовали рестрикцией Sail и BsiWI для легкой цепи и Sall/Nhel для тяжелой. Смешивали ген-вставку и линеаризованный вектор в 10 мкл воды и перенесли в отдельные виалкистрипы системы In-Fusion. Перемешать пипетированием. Инкубировали стрипы 15 минут при 37 °С, затем 15 минут при 50 °С, далее перенесли в лёд. Часть объема реакции с полученными конструкциями использовали в трансформации клеток. Из полученных клонов выделили плазмиды и проверили вставку с помощью сиквенса.
Пример 11.
Клеточный тест ингибирования пролиферации клеток DS-1 aHTM-IL-6R антителами.
Рост клеток DS-1 зависит от присутствия внеклеточного внешнего IL6 лиганда и блокирование его связывания с рецептором на поверхности клеток приводит к ингибированию их роста. Культуру клеток DS-1 подрастили на питательной среде RPMI-1640, 10 % инактивированной эмбриональной сыворотки, 1 мМ пирувата натрия и 7,5 нг/мл IL6. За сутки до эксперимента клетки отмыли 2 раза в PBS от остатков IL6 и посеяли на 96-луночный планшет в расчете по 10000 клеток на лунку в среде роста без добавления IL6. На следующий день приготовили ряд разведений антител от 20 мкг/мл с шагом в 3 в полной среде роста с добавлением 5 нг/мл IL6. Затем добавили к клеткам равный объем подготовленных растворов антител, конечная концентрация IL6 в лунках равнялась 2,5 нг/мл, антитела в первой точке 10 мкг/мл. Клетки инкубировали при температуре 37 °С, 5 % СО2 в течение 3-х суток. Затем измеряли количество живых пролиферирующих клеток с помощью витального красителя AlamarBlue на приборе FluoroskanAscent FL 2.5 (фиг.9). По результатам исследования отобрали одно антитело антиЧЬбР- максимально ингибирующее пролиферацию клеток DS-1 , следовательно, оно связывается с мембранным рецептором интерлейкина 6 и блокирует связывание лиганда с рецептором. Пример 12.
Анализ ингибирования STAT3 в культуре клеток HEK-BlueTM IL6
Приготовили суспензию клеток HEK-BluelL6 с концентрацией 1 -10^ клонов/мл в питательной среде ДМ ЕМ с 10 % инактивированной сыворотки (среда роста клеток). Посеяли в 96-луночный планшет из расчета 100 мкл/лунку (5- 10^ клонов/лунку).
Приготовили ряд разведений антител в среде роста клеток от 200 мкг/мл с шагом 3 десять точек, последняя точка контрольная без антитела. Приготовили раствор человеческого IL6 в среде роста клеток с концентрацией 4 нг/мл. Далее к клеткам добавили по 50 мкл разведенных антител и инкубировали 45 минут в СО2 инкубаторе. К клеткам с антителами добавили по 50 мкл раствора IL6 и оставили инкубироваться клетки с антителами и IL6 ночь в СО2 инкубаторе.
На следующий день приготовили среду для детекцииОиАЫТ!- BlueTM: растворили 1 пакетик сухой среды в 50 мл очищенной воды, прогрели на водяной бане при 37 °С в течение 10 минут и пропустили раствор через фильтр 0,22 мкм.
Для каждой лунки к 180 мкл среды для детекции добавили по 20 мклкультуральной жидкости и оставили в СО2 инкубаторе на 2-3 часа.
Измерили уровень поглощения на спектофотометре при длине волны 630 нм (фиг.10).
Пример 13.
Определение константы аффинности связывания антитела BCD89 с рецептором интерлейкина 6 человека и его ортогологов.
Взаимодействие отобранного антитела aHTH-IL6R с рецепторами интерлейкина 6 яванской макаки, морской свинки, собаки определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (фиг. 1 1 , 12). Константы аффинности связывания антитела BCD89 к альфа субъединице IL-6sR человека, яванской макаки, морской свинки, собаки и крысы получили с помощью прибора OctetRed 96 (от ForteBio). BCD89 был неспецифически иммобилизован на поверхность аминореактивных сенсоров второго поколения (от AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ был произведен при 30°С с использованием PBS, содержащим 0,1 % Твин- 20 и 0,1 % БСА в качестве рабочего буфера. Титрование IL-6R человека, яванской макаки, морской свинки, собаки, кролика и мыши производили с использованием рабочего буфера от концентрации 126 нМ до 2 нМ с шагом 2.
Кривые связывания с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы OctetDataAnalysis (версия 7.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1 :1. Результаты приведены на табл.2.
Как видно, BCD89 связывается с рекомбинантным препаратом IL-6R человека и IL-6sR макаки высокой аффинностью (фиг.13, фиг.14). Кроме того, кандидат взаимодействует с IL-6R морской свинки с константой, меньшей на 3 порядка, чем с человеческим (фиг.16). С рецептором мыши взаимодействия антитела не зарегистрировали (фиг.15).
Таблица 2. Анализ взаимодействий кандидатов BCD89 с рецепторами IL-6sR человека и разных организмов на приборе Octet RED
Figure imgf000047_0001
Пример 14.
Определение агрегационной стабильности BCD89 в условиях термостресса.
Исследуемые образцы концентрировали до 5 мг/мл с помощью ультрафильтрации в центрифужных фильтрах AmiconUltra 10 кДа на 0.5 мл (Millipore). Определение содержания белка проводили методом УФ- спектрофотометрии при длине волны 280 нм. Каждый полученный образец разделяли на несколько частей по 150 мкл и помещали в отдельные пробирки: по одной пробирке на каждый состав откладывали в холодильник на хранение при +4°С, остальные устанавливали в термостат для пробирок и термостатировали при 50°С в течение установленного времени.
После окончания прогрева пробирки убирали из термостата, давали остыть до комнатной температуры осветляли, центрифугируя растворы при 13 000д 10 минут, и передавали супернатанты на гель-фильтрацию с УФ-детектором. Анализировали пики на хроматограммах полноразмерного белка до и после прогрева, хроматографию провели на хроматографе Agilent USA1 100 seriesM. Использовали колонку Tosoh TSK- Gel G3000SWXL 7.8 mm ID Ч 30 cm и предколонку TosohTSK- GelGuardSWXL 6 mmlD 4 4 cm, 7 mcm. Скорость потока составила 0,7 мл/мин, а объем пробы - 10 мкл с концентрацией образца 5 мг/мл. Длина волны детектора - 220 и 280 нм, время элюирования 25 мин. (фиг.17).
Расчет проводили методом внутренней нормализации. Содержание мономера в п оцентах (X) рассчитывали по формуле:
Figure imgf000048_0001
где S1 - площадь пика мономера;
XS - сумма площадей всех пиков.
При расчете не учитывали пики, которые присутствуют на хроматограммах подвижной фазы и рецептурного буферного раствора.
Пример 15.
Оценка противовоспалительной активности препарата BCD-089 на модели коллаген-индуцированного артрита приматов.
Исследование проведено на самцах яванских мак (Масаса fascicularis) с использованием модели коллаген-индуцированного артрита. Общее количество животных в эксперименте составило 20 голов, каждая группа животных включала 4 обезьяны. В эксперименте были использованы четыре дозы препарата: 1 ,0 мг/кг; 4,0 мг/кг; 10,0 мг/кг; 20,0 мг/кг, животные контрольной группы получали препарат плацебо. Введение препарата и вещества плацебо начинали после предварительной сенсибилизации коллагеном. При проведении эксперимента у животных всех групп измеряли суставную поверхность для вычисления ППВ, на момент окончания исследования забирали пястно- фаланговые и плюсне-фаланговые суставы для оценки выраженности деструктивных изменений. Животные были поделены на 5 групп. Наименование групп приведено в таблице 3.
Таблица 3. Распределение животных по группам в эксперименте по определению противовоспалительной активности
Figure imgf000049_0001
Для индукции артрита животным трижды вводили эмульсию бычьего коллагена II типа (Sigma).
Первое введение коллагена. Общее количество вводимого одному экспериментальному животному коллагена составило 2 мг. Для этого 2 мг коллагена растворяли в 0,7 мл 0,1 М уксусной кислоты. К полученному раствору добавляли 0,7 неполного адъюванта Фрейнда.
Выдерживали животных 28 суток после первого введения коллагена.
Второе введение коллагена. Общее количество вводимого одному экспериментальному животному коллагена составило 3 мг. Для этого 3 мг коллагена растворяли в 1 ,0 мл 0,1 М уксусной кислоты. К полученной эмульсии добавляли 1 ,0 мл полного адъюванта Фрейнда.
Выдерживали животных 21 сутки после второго введения коллагена.
Третье введение коллагена. Общее количество вводимого одному экспериментальному животному коллагена составило 3 мг. Для этогоЗ мгколлагена растворяли в 1 ,0 мл 0,1 М уксусной кислоты. К полученной эмульсии добавляли 1 ,0 мл неполного адъюванта Фрейнда.
Измерение размера суставов проводили циркулем-измерителем в следующих временных точках:
- до первого введения коллагена;
- на момент второго введения коллагена;
- еженедельно с момента второго введения коллагена непосредственно перед введением коллагена в течение 7 недель.
В процессе измерения оценивали величину продольной и поперечной оси суставов, процедуру осуществляли для всех пястно- фаланговых и плюснефаланговых суставов за исключением большого пальца. Расчет площади проводили по формуле:
ПС = значение для продольной оси χ значение для поперечной оси х 3,14 х 0,25.
Данные для 16 суставов каждого животного использовали для расчета значения процента площади воспаления (ППВ). Расчет проводили по следующей формуле:
ППВ = (значение для ПС на день эксперимента χ 100)/(среднее значение для ПС до индукции артрита) (Фиг.18) .
Пример 16.
Исследование токсичности и фармакокинетики (токсикокинетики) препарата BCD-089 при однократном подкожном введении макакам резус.
Исследование проведено на 12 самцах макак резус. Животные были распределены на 4 группы. Наименование групп приведено в таблице 4. Таблица 4. Распределение животных по группам в эксперименте по токсикокинетике.
Figure imgf000051_0001
В ходе проведения исследования оценивали следующие параметры:
- результаты клинического осмотра;
- вес животных (до введения, на 8, 15, 22, 29, 36, 43 сутки эксперимента);
- температуру тела (до введения, через 1 , 2, 4, 6, 24 часа после введения, на 8, 15, 22, 29, 36, 43 сутки эксперимента);
- общий анализ мочи (до введения, на 8, 15, 22, 29, 36, 43 сутки эксперимента);
- общий анализ крови по показателям: количество эритроцитов, количество лейкоцитов, концентрация гемоглобина (до введения, на 8, 15, 22, 29, 36, 43 сутки эксперимента);
- биохимический анализ сыворотки крови по показателям: лактатдегидрогеназа, билирубин общий, общий белок, глюкоза, аспартатаминотрансфераза, аланин-аминотрансфераза (до введения, на 8, 15, 22, 29, 36, 43 сутки эксперимента);
- исследование концентрации препарата в сыворотке крови приматов (до введения, через 0,5, 1 , 3, 6, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 192, 264, 408, 504, 720, 912 и 1032 часов после введения). Пример 17.
Оценка токсичности при многократном подкожном введении яванским макакам в течение одного месяца с последующим периодом свободным от введения в течение двух недель.
Исследование токсичности при многократном подкожном введении в течение 1 месяца с последующим периодом восстановления в течение двух недель проводили на релевантном виде животных - яванских макаках. В эксперименте использовали три уровня доз. Схема экспериментальных групп представлена в таблице 5.
Таблица 5. Распределение животных по группам в эксперименте по оценке токсичности при многократном введении
Figure imgf000052_0001
В ходе проведения исследования оценивали следующие параметры:
- результаты клинического осмотра;
- вес животных (до введения далее еженедельно); - температуру тела (до введения далее еженедельно до окончания эксперимента);
- влияние на сердечно-сосудистую систему, для чего оценивали биоэлектрическую активность сердца с использованием кардиографа «Поли-Спектр», оценку проводили до введения препарата и далее на 3, 5, 7 неделях эксперимента;
- общий анализ мочи (до введения, на 3, 5, 7 неделях эксперимента);
- общий анализ крови по показателям: количество эритроцитов, количество лейкоцитов, концентрация гемоглобина, количество лимфоцитов, количество моноцитов, количество нейтрофилов, количество эозинофилов, количество базофилов, количество тромбоцитов (до введения, затем один раз в неделю, начиная с первой недели эксперимента);
- оценка влияния на свертывающую систему крови по показателям: активированное частичное тромбопластиновое время, концентрация фибриногена, протромбиновое время проводилась до введения препарата далее на 3, 5, 7 неделях эксперимента;
- биохимический анализ сыворотки крови по показателям: натрий, калий, креатинин, мочевина, щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа, билирубин общий, общий белок, глюкоза, триглицериды, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза холестерин общий (до введения, на 3, 5, 7 неделях эксперимента);
- на момент окончания периода введения проводили эвтаназию и последующее патоморфологическое исследование животных сателлитной группы максимальной дозы, на момент окончания исследования животных максимальной дозы и контрольной группы;
- в рамках проведения исследования токсичности оценивали также местно-раздражающее действие препаратов для чего выделяли и проводили гистологическое исследование мягких тканей в месте введения препарата. Пример 18.
Исследование иммуногенности при многократном подкожном введении препарата BCD-089 в течение 4-х недель яванским макакам.
Исследование иммуногенности при многократном подкожном введении в течение 1 месяца с последующим двухнедельным периодом восстановления проводили на релевантном виде животных - яванских макаках. В эксперименте использовали три уровня доз. Схема экспериментальных групп представлена в таблице ниже.
Таблица 6. Распределение животных по группам в эксперименте по определению иммуногенности.
Figure imgf000054_0001
Оценку иммуногенности проводили по уровню связывающих антител, для чего отбирали кровь и отделяли сыворотку до введения препарата и далее на 3, 5, 7 неделях эксперимента.
Пример 19.
Исследование фармакокинетики при многократном подкожном введении препарата BCD-089 яванским макакам в течение одного месяца.
Исследование фармакокинетики при многократном подкожном введении в течение 1 месяца с последующим двухнедельным периодом восстановления проводили на релевантном виде животных - яванских макаках. В эксперименте использовали три уровня доз. Схема экспериментальных групп представлена в таблице 7.
Таблица 7. Распределение животных по группам в эксперименте по оценке фармакокинетики при многократном введении
Figure imgf000055_0001
Для оценки динамики уровня препарата в сыворотке крови приматов проводили забор до начала эксперимента и далее на 1 , 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 29, 36, и 43 сутки эксперимента.
Пример 20.
Исследование иммунотоксического действия препарата BCD- 089 при многократном подкожном введении в течение одного месяца с последующим периодом восстановления в течение 2 недель.
Исследование иммунотоксического действия при многократном подкожном введении в течение 1 месяца с последующим двухнедельным периодом восстановления проводили на релевантном виде животных - яванских макаках. В эксперименте использовали три уровня доз. Схема экспериментальных групп представлена в таблице 8.
Таблица 8. Распределение животных по группам в эксперименте по оценке иммунотоксичности
Figure imgf000056_0001
В ходе проведения исследования оценивали следующие параметры:
- субпопуляционный состав лимфоцитов, оценивали до введения препарата затем на 2, 4, 6 неделях эксперимента;
- соотношение классов иммуноглобулинов, оценивали до введения на 2, 4, 6 неделях эксперимента;
- влияние на фагоцитоз оценивали до введения и далее на 2, 4, 6 неделях эксперимента. Пример 21.
Получение фармацевтической композиции.
Антитело BCD89 переводили в необходимый буфер и довели концентрацию до 180 мг/мл, фильтровали полученный раствор (стрелизизующая фильтрация) и наполняли шприцы.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающее способностью связываться с рецептором интерлейкина-6 (IL-6) человека, которые содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO: 3.
Антитело или его фрагмент по пункту 1 , отличающиеся тем, что связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
Антитело или его фрагмент по любому из пунктов 1 , отличающиеся тем, что связывающий домен содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 -3.
Антитело или его фрагмент по п.1 , отличающиеся тем, что связывающий домен идентичен по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.
Антитело или его фрагмент по п.1 , отличающиеся тем, что связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
Антитело или его фрагмент по п.1 , отличающиеся тем, что связывающий домен конкурирует за связывание или связывается с тем же эпитопом, что связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
Антитело или его фрагмент по п. 1 , отличающийся тем, что содержит последовательность тяжелой цепи, гомологичную не менее чем на 90% последовательности SEQ ID NO 9.
Антитело или его фрагмент по п. 1 , отличающийся тем, что содержит последовательность легкой цепи, гомологичную не менее чем на 90% последовательности SEQ ID NO 10.
Антитело или его фрагмент по пункту 1 , отличающийся тем, что содержит в себе: - последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO:9, и - последовательность вариабельного домена легкой цепи, по меньшей мере на 75% гомологичную последовательности SEQ ID NO:10.
ю . Антитело или его фрагмент по пункту 1 , характеризующееся тем, что оно относится к изотипу lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4 человека.
11 . Антитело или его фрагмент по пункту 1 , характеризующееся тем, что Fc константная часть lgG1 изотипа содержит мутации Е233Р, L234A, L235A, Е236Р, L237V и/или L238A.
12 . Антитело или его фрагмент по пункту 1 , характеризующееся тем, что Fc константная часть lgG1 изотипа содержит мутации, увеличивающие значение фармакинетических параметров в животном или человеке, такие как ti^ (4ac) или Стаж (мкг/мл).
13 . Антитело или его фрагмент по пункту 1 , характеризующееся тем, что Fc константная часть lgG1 изотипа содержит мутации M255Y, S257T и/или Т259Е, увеличивающие значение фармакокинетических параметров в животном или человеке, такие как U/2?, (час) или Стаж (мкг/мл).
14 . Антитело или его фрагмент по пункту 1 , характеризующееся тем, что оно имеет по меньшей мере одно из следующих свойств:
a) имеет такую агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и хранении при Т = 4 ° С в течение более чем 6 месяцев содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5 % от исходного содержания в растворе;
b) имеет такую агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и при повышении температуры до 37° С в течение более чем 2 недель содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5 % от исходного содержания в растворе;
c) имеет такую агрегационную стабильность, что при концентрациях более 10 мг/мл и повышении температуры до 50° С в течение более чем 24 часов содержание агрегатов не увеличивается более чем на 5 % от исходного содержания в растворе;
d) имеет константу диссоциации KD С рецептором IL-6 человека не более 10"9 (М); e) имеет кинетическую константу ассоциации kon(1/Mc) с рецептором IL- 6 человека не менее 105 (1/Мс);
f) имеет кинетическую константу диссоциации dis(1/s) с рецептором IL- 6 человека не более 10 4 (1/с);
g) демонстрирует антипролиферативную активность на культуре интерлейкин-6 зависимых клеток DS1 с расчетной величиной IC50 не более 10"8 М;
h) демонстрирует блокирование STAT-3 сигналинга на культуре интерлейкин-6 зависимых клеток с расчетной величиной IC50 не более 10"8 М.
15 . Биспецифическое антитело, содержащее антигенсвязывающий фрагмент антитела по пункту 1 или по любому из пунктов, подчиненных пункту 1.
1 6 . Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1 -14.
17 . Экспрессионный вектор, содержащий одну или несколько выделенных молекул нуклеиновой кислоты по пункту 166.
1 8 . Клеточная линия, содержащая в клетках вектор по пункту 17 или выделенная молекула нуклеиновой кислоты по пункту 16.
1 9 . Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пунктов по пункту 1 или по любому из пунктов, подчиненных пункту 1 , включающий культивирование клеточной линии по пункту 18, в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, с последующим выделением и очисткой полученного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
2 0 . Фармацевтическая композиция для терапии заболевания или состояния, связанного с действием интерлейкина-6 (IL-6), или для устранения или облегчения симптома, связанного с нежелательным воздействием IL-6, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по пункту 1 или по любому из пунктов, подчиненных пункту 1 , в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями.
Композиция по пункту 20, характеризующаяся тем, что представляет собой раствор для парентерального введения.
Композиция по пункту 20, характеризующаяся тем, что представляет собой лиофилизированный порошок.
Композиция по пункту 20, характеризующаяся тем, что она предназначена для использования в терапии и/или в диагностике заболевания выбранного из следующего группы заболеваний и/или расстройств: ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный хронический артрит, септический артрит, артрит Лайма, псориатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатия, системная красная волчанка, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, инсулинзависимый сахарный диабет, тиреоидит, астма, аллергическое заболевание, псориаз, атопическийдерматит, склеродермия, реакция "трансплантат против хозяина", отторжение трансплантата органа, острое или хроническое иммунное заболевание, связанное с трансплантацией органа, саркоидоз, болезнь Кавасаки, болезнь Грэйвса, нефротический синдром, синдром хронической усталости, гранулематозВегенера, пурпура Шенлейна-Геноха, микроскопический васкулит почек, хронический активный гепатит, увенит, септический шок, синдром токсического шока, септический синдром, кахексия, синдром приобретенного иммунодефицита, острый поперечный миелит, хорея Гентингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, инсульт, первичный билиарный цирроз, гемолитическая анемия, взрослый (острый) респираторный дистресс- синдром, алопеция, очаговая алопеция, серонегативнаяартропатия, артропатия, болезни Рейтера, псориатическаяартропатия, связанная с язвенным колитом артропатии, атопическая аллергия, аутоиммунное буллезное заболевание, пемфигус обыкновенный, листовидный пемфигус, пемфигоид, болезнь линейных IgA, аутоиммунная гемолитическая анемия, Кумбс-положительная гемолитическая анемия, приобретенная пернициозная анемия, ювенильная пернициозная анемия, артериит, первичный склерозирующий гепатит, криптогенный аутоиммунный гепатит, фиброзное заболевание легких, криптогенныйфиброзный альвеолит, пост-воспалительное интерстициальное заболевание легких, интерстициальный пневмонит, хроническая эозинофильная пневмония, постинфекционное интерстициальное заболевание легких, подагрический артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный гепатит I типа (классический аутоиммунный или люпоидный гепатит), аутоиммунный гепатит II типа, остеоартроз, первичный склерозирующий холангит, псориаз I типа, псориаз II типа, идиопатическая лейкопения, аутоиммунная нейтропения, NOS- болезнь почек, гломерулонефрит, микроскопический васкулит почек, дискоидная красная волчанка, идиопатическая или NOS-мужского бесплодия, аутоиммунитетк сперматозоидам, рассеянный склероз (все подтипы), симпатическая офтальмия, легочная гипертензия, вторичная для болезни соединительной ткани, синдром Гудпасчера, легочное проявление узелкового полиартериита, острая ревматическая атака, ревматоидный спондилит, болезнь Стилла, системная склеродермия, синдром Шенгрена, болезнь/артериит Такаясу, аутоиммунная тромбоцитопения, идиопатическая тромбоцитопения, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, гипертиреоидизм, зобный аутоиммунный гипотиреоз (болезнь Хашимото), атрофический аутоиммунный гипотиреоз, первичная микседема, факогенноыйувеит, первичный васкулит, витилиго, остроезаболевание печени, хроническое заболевание печени, аллергия и астма, психическое расстройство (включая депрессию и шизофрению), опосредуемое типом Th2 и типом Th1 заболеваний, конъюнктивита, аллергический контактный дерматит, аллергический ринит, дефицит альфа-1 -антитрипсина, боковой амиотрофический склероз, анемия, кистозный фиброз, нарушения, связанные с цитокиновой терапией, демиелинизирующие заболевания, дерматит, иридоциклит, увеит, оптический неврит, повреждения при ишемии- реперфузии, ишемический инсульт, ювенильный ревматоидный артрит аутоиммунная энтеропатия, аутоиммунная потеря слуха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунный миокардит, аутоиммунное преждевременное угасание функции яичников и блефарит.
Применение антитела или его фрагмента по любому из пунктов 1 -14 для изготовления лекарственного средства.
Применение по пункту 244, характеризующееся тем, что лекарственное средство предназначено для использования в терапии и/или в диагностике заболеваний, перечисленных в пункте 23.
PCT/RU2017/050070 2016-08-17 2017-08-03 Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека Ceased WO2018034597A1 (ru)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020197007632A KR102602564B1 (ko) 2016-08-17 2017-08-03 인터루킨-6의 인간 수용체에 결합가능한 항체 또는 항원 결합성 단편
NZ750451A NZ750451A (en) 2016-08-17 2017-08-03 Antibody or an antigen-binding fragment thereof capable of binding to a human receptor of interleukin-6
CN201780064176.5A CN110114370B (zh) 2016-08-17 2017-08-03 能够与人白细胞介素-6受体结合的抗体或其抗原结合片段
AU2017313632A AU2017313632B2 (en) 2016-08-17 2017-08-03 Antibody or an antigen-binding fragment thereof capable of binding to a human receptor of interleukin-6
US16/325,528 US11993647B2 (en) 2016-08-17 2017-08-03 Antibody or an antigen-binding fragment thereof capable of binding to a human receptor of interleukin-6
MA44917A MA44917B1 (fr) 2016-08-17 2017-08-03 Anticorps ou son fragment de liaison d’antigènes apte a se lier au récepteur d'interleukine-6 de l'humain.
MX2019001970A MX2019001970A (es) 2016-08-17 2017-08-03 Anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo, capaz de unirse a un receptor humano de interleucina-6.
CA3033063A CA3033063A1 (en) 2016-08-17 2017-08-03 Antibody or an antigen-binding fragment thereof capable of binding to a human receptor of interleukin-6
EP17841757.2A EP3502135A4 (en) 2016-08-17 2017-08-03 ANTIBODY OR ANTI-BINDING FRAGMENT THEREFOR OF BINDING TO A HUMAN RECEPTOR OF INTERLEUKIN-6
JP2019509472A JP7158376B2 (ja) 2016-08-17 2017-08-03 インターロイキン－６のヒト受容体に結合することができる抗体またはその抗原結合フラグメント
BR112019003307-6A BR112019003307A2 (pt) 2016-08-17 2017-08-03 anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, capaz de se conectar a um receptor humano de interleucina-6
CR20190086A CR20190086A (es) 2016-08-17 2017-08-03 Anticuerpo o un fragmento de union a antígeno del mismo, capaz de unirsea un receptor humano de interleucina-6
ZA201901042A ZA201901042B (en) 2016-08-17 2019-02-18 Antibody or an antigen-binding fragment thereof capable of binding to a human receptor of interleukin-6
PH12019500342A PH12019500342A1 (en) 2016-08-17 2019-02-18 Antibody or an antigen-binding fragment thereof capable of binding to a human receptor of interleukin-6

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016133720A RU2656160C2 (ru) 2016-08-17 2016-08-17 Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека
RU2016133720 2016-08-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018034597A1 true WO2018034597A1 (ru) 2018-02-22

Family

ID=61196928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/050070 Ceased WO2018034597A1 (ru) 2016-08-17 2017-08-03 Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека

Country Status (18)

Country Link
US (1) US11993647B2 (ru)
EP (1) EP3502135A4 (ru)
JP (1) JP7158376B2 (ru)
KR (1) KR102602564B1 (ru)
CN (1) CN110114370B (ru)
AU (1) AU2017313632B2 (ru)
BR (1) BR112019003307A2 (ru)
CA (1) CA3033063A1 (ru)
CL (1) CL2019000426A1 (ru)
CR (1) CR20190086A (ru)
MA (1) MA44917B1 (ru)
MX (1) MX2019001970A (ru)
NI (1) NI201900016A (ru)
NZ (1) NZ750451A (ru)
PH (1) PH12019500342A1 (ru)
RU (1) RU2656160C2 (ru)
WO (1) WO2018034597A1 (ru)
ZA (1) ZA201901042B (ru)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2656160C2 (ru) 2016-08-17 2018-05-31 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека
US20230167182A1 (en) * 2020-05-18 2023-06-01 Biosion Inc. Antibodies binding il6r and uses thereof
RU2745814C1 (ru) * 2020-06-05 2021-04-01 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Водная фармацевтическая композиция левилимаба и ее применение
WO2024079310A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Ebbil, Ltd. Sil-6r and ctgf binding proteins and methods of use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070280945A1 (en) * 2006-06-02 2007-12-06 Sean Stevens High affinity antibodies to human IL-6 receptor
US20110177074A1 (en) * 2008-03-27 2011-07-21 Sivakumar Pallavur V Compositions and methods for inhibiting pdgfrbeta and vegf-a
US8673306B2 (en) * 2006-01-13 2014-03-18 Novartis Ag Compositions and methods of use for antibodies of dickkopf-1
WO2015065987A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that neutralize both tnf-alpha and il-6: novel therapeutic agent for autoimmune disease

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1162922A (zh) * 1994-10-07 1997-10-22 中外制药株式会社 以il-6拮抗剂作为有效成分治疗慢性类风湿性关节炎
GB2401040A (en) * 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US8080248B2 (en) * 2006-06-02 2011-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody
CN101939425B (zh) 2007-09-26 2014-05-14 中外制药株式会社 抗il-6受体抗体
BRPI1012321A8 (pt) 2009-06-17 2016-09-27 Abbott Biotherapeutics Corp Anticorpos anti-vegf e seus usos
JP6097702B2 (ja) 2011-03-03 2017-03-15 アペクシジェン， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−６受容体抗体およびその使用方法
RU2550262C1 (ru) 2014-02-28 2015-05-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства Моноклональное антитело против интерлейкина-6 человека и гибридома, продуцирующая данное моноклональное антитело
CN105037548B (zh) * 2014-04-21 2018-08-03 上海市免疫学研究所 抗人白介素-6受体β链单克隆抗体、其制备方法和用途
RU2656160C2 (ru) 2016-08-17 2018-05-31 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8673306B2 (en) * 2006-01-13 2014-03-18 Novartis Ag Compositions and methods of use for antibodies of dickkopf-1
US20070280945A1 (en) * 2006-06-02 2007-12-06 Sean Stevens High affinity antibodies to human IL-6 receptor
US20110177074A1 (en) * 2008-03-27 2011-07-21 Sivakumar Pallavur V Compositions and methods for inhibiting pdgfrbeta and vegf-a
WO2015065987A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that neutralize both tnf-alpha and il-6: novel therapeutic agent for autoimmune disease

Also Published As

Publication number Publication date
CA3033063A1 (en) 2018-02-22
AU2017313632A2 (en) 2019-03-21
JP7158376B2 (ja) 2022-10-21
US11993647B2 (en) 2024-05-28
ZA201901042B (en) 2019-10-30
PH12019500342A1 (en) 2020-01-20
BR112019003307A2 (pt) 2019-10-15
MX2019001970A (es) 2019-08-14
US20190194313A1 (en) 2019-06-27
CN110114370A (zh) 2019-08-09
JP2019531063A (ja) 2019-10-31
NZ750451A (en) 2023-05-26
RU2656160C2 (ru) 2018-05-31
MA44917B1 (fr) 2020-06-30
KR20190067771A (ko) 2019-06-17
EP3502135A4 (en) 2020-04-22
AU2017313632A1 (en) 2019-03-07
MA44917A1 (fr) 2020-02-28
CN110114370B (zh) 2023-11-03
CL2019000426A1 (es) 2019-07-12
RU2016133720A (ru) 2018-02-22
KR102602564B1 (ko) 2023-11-16
EP3502135A1 (en) 2019-06-26
NI201900016A (es) 2019-10-31
CR20190086A (es) 2019-07-04
AU2017313632B2 (en) 2024-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7610302B2 (ja) Ｃｃｒ８抗体及びその用途
JP7317272B2 (ja) Ｔｉｇｉｔ抗体、その抗原結合断片及びその医療用途 本願は、２０１９年９月２９日に出願された出願番号ｃｎ２０１７１０９０８５６５．３に基づいたものであり、その優先権を主張する。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
KR102482710B1 (ko) 항-pd-1 항체, 이의 생산 방법 및 사용 방법
EP3199550A1 (en) High affinity and aggregatively stable antibodies on the basis of variable domains vl and a derivative vhh
WO2015137843A1 (ru) Анти-il-17-антитела, способ их получения и способ применения
KR20120075457A (ko) 톨-유사 수용체 2에 대한 인간화 항체 및 이의 용도
EA039946B1 (ru) Антитела-антагонисты к интерферону альфа и интерферону омега
KR20260008771A (ko) 항-cd40l 항체와 인간 자가면역 질환 치료에서의 그 용도
RU2656160C2 (ru) Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека
CN108178798B (zh) pH工程化的NGF抗体及其医药用途
TW202328197A (zh) 抗cd40抗體及其用途
US20230242677A1 (en) Multi-specific antibodies
JP2022540859A (ja) 新規ｂｓｓｌ抗体
TW202130365A (zh) 對人類il-13及il-17具有結合特異性之多重特異性抗體
CN115335402B (zh) 特异性抗原结合分子,其制备方法及医药用途
WO2023178645A1 (zh) 靶向cd3的抗体及其应用
CN120554509A (zh) 靶向CD3e/g的抗体或其抗原结合片段、其制备和应用
JP6529602B2 (ja) 抗ｃｄ２０／抗ｂａｆｆ二重特異性抗体
US12545732B2 (en) PD-1 antigen-binding protein and use thereof
HK40012919A (en) Antibody or an antigen-binding fragment thereof capable of binding to a human receptor of interleukin-6
OA19502A (en) Antibody Or An Antigen-Binding Fragment Thereof Capable Of Binding To A Human Receptor Of Interleukin-6.
HK40012919B (zh) 能够与人白细胞介素-6受体结合的抗体或其抗原结合片段
WO2025247306A1 (zh) Ox40l结合分子及其用途
OA19651A (en) Anti-Pd-1 antibodies, method for producing same and method for using same.
OA19281A (en) Trispecific antibodies against II-17A, II-17F and another proinflammatory molecule.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17841757

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3033063

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019509472

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: CR2019-000086

Country of ref document: CR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112019003307

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017313632

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20170803

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: DZP2019000110

Country of ref document: DZ

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20197007632

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017841757

Country of ref document: EP

Effective date: 20190318

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: CR2019-000086

Country of ref document: CR

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112019003307

Country of ref document: BR

Free format text: COM BASE NA RESOLUCAO 187 DE 27/04/2017, SOLICITA-SE QUE SEJA APRESENTADO, EM ATE 60 (SESSENTA) DIAS, NOVO CONTEUDO DE LISTAGEM DE SEQUENCIA POIS O CONTEUDO APRESENTADO NAS PETICOES NO 870190016518 DE 18/02/2019 NAO ESTA EM LINGUA VERNACULA.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112019003307

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20190218