WO2018012517A1 - イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法 - Google Patents

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stool
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conjugate
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公良 西谷
泰史 落合
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積水メディカル株式会社
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    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing a non-specific reaction in a method for detecting a stool-derived sample using immunochromatography, and a detection kit and a sample diluent used therefor.
  • Detection methods using immunochromatography are widespread because of their high specificity and sensitivity and simplicity.
  • Samples applied to the detection method include urine, stool, saliva, blood, serum, and the like, which are suitable as clinical test samples and widely used as diagnostically useful samples.
  • Gelatin, casein, bovine serum albumin, synthetic polymers, etc. are known as general blocking agents for eliminating nonspecific reactions, and there is a method of coexisting them in the reaction system using immunochromatography.
  • Patent Document 1 Patent Document 2
  • Patent Document 2 Patent Document 2
  • Patent Document 3 has a problem in the case of using stool as a specimen, in which detection by ELISA or the like using stool as a sample is difficult to judge the result because of low sensitivity and many non-specific reactions.
  • This document discloses a method for suppressing a nonspecific reaction by using a diluent for a specimen having a pH of 9.0 to 10.0 in order to solve this problem and detect norovirus or sapovirus using immunochromatography. Has been.
  • this method has a problem in terms of handling because it is necessary to prepare a sample diluent on the alkali side which is not generally used as a sample diluent.
  • Patent Document 4 discloses a method for increasing the sensitivity of detection of an immune reaction by pretreating a biological sample with a sample pretreatment liquid containing an organic acid such as citric acid and a surfactant.
  • a sample pretreatment liquid containing an organic acid such as citric acid and a surfactant.
  • the present invention provides a method for suppressing nonspecific reactions peculiar to stool in a detection method using immunochromatography for detecting a substance to be detected in a sample by developing a sample derived from stool in an insoluble membrane. Is an issue.
  • the present inventors have suppressed the nonspecific reaction caused by the stool-derived sample by using a compound having two or more carboxy groups in the molecule, and the stool-derived sample It was found that the substance to be detected can be detected accurately.
  • nonspecific reactions that could not be suppressed by conventional methods can be suppressed by using a sample diluent containing a compound having two or more carboxy groups in the molecule of the present invention.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention has the following configuration.
  • a method for detecting a substance to be detected in a stool-derived sample using immunochromatography including the process of performing an immune reaction in presence of the compound which has a 2 or more carboxy group in a molecule
  • a method for detecting a substance to be detected in a stool-derived sample using immunochromatography comprising the steps (A) to (C).
  • a process test strip for supplying a sample diluent containing a compound having two or more carboxy groups in the molecule and a buffer solution and a stool-derived sample to a sample supply section of the following test strip; It has a membrane consisting of a porous body with at least a sample supply part, a development part, and a detection part, and a conjugate containing the first antibody labeled with a labeling substance can be eluted in a part of the development part
  • C Step ⁇ 3> of detecting a detection substance-conjugate complex in the sample in the detection unit
  • the detection method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the stool-derived sample is a sample derived from stool of an infant.
  • a non-specific reaction suppression method in a method of detecting a substance to be detected in a stool-derived sample using immunochromatography including the process of performing an immune reaction in presence of the compound which has a 2 or more carboxy group in a molecule
  • a method for suppressing a nonspecific reaction in a method for detecting a substance to be detected in a stool-derived sample using immunochromatography comprising the steps (A) to (C).
  • a process test strip for supplying a sample diluent containing a compound having two or more carboxy groups in the molecule and a buffer solution and a stool-derived sample to the sample supply section of the following test strip; It has a membrane consisting of a porous body with at least a sample supply part, a development part, and a detection part, and a conjugate containing the first antibody labeled with a labeling substance can be eluted in a part of the development part
  • C A step ⁇ 6> of detecting a complex of the detection target substance and the conjugate in the sample in the detection unit.
  • a detection kit for immunochromatography for stool-derived samples comprising the following configurations (1) and (2).
  • a membrane comprising a porous body having at least a sample supply unit, a developing unit, and a detecting unit, and a conjugate containing a first antibody labeled with a labeling substance in a part of the developing unit
  • an immunochromatographic test strip (2) having a detection part that is held so that it can be eluted and further has a detection part that is a part of the development part and is downstream of the conjugate holding part.
  • Sample diluent ⁇ 8> containing a compound having two or more carboxy groups and a buffer The detection kit according to ⁇ 7>, wherein the stool-derived sample is a sample derived from stool of an infant.
  • An infant stool-derived sample diluent for immunoassay comprising a compound having two or more carboxy groups in the molecule and a buffer.
  • Before sample for suppressing non-specific reaction in immunoassay of infant stool-derived sample comprising a step of contacting a sample diluent containing a compound having two or more carboxy groups in the molecule and a buffer with a sample derived from infant stool Processing method.
  • the non-specific reaction peculiar to the stool sample is suppressed, and the substance to be detected in the sample Can be accurately detected.
  • the substance to be detected can be accurately detected using immunochromatography.
  • test strip of this invention It is a schematic block diagram of the test strip of this invention.
  • the sample is derived from human feces.
  • Human stool is intended for both adult stool and infant stool, but the present invention particularly has the effect of suppressing non-specific reactions derived from infant stool.
  • infant as used in the present invention is used to include any of newborns, infants, and infants (under 7 years old).
  • the stool may be used as a sample as it is, or may be diluted with a sample diluent as appropriate. Moreover, you may use as a sample what was diluted and filtered suitably.
  • the sample diluent may be referred to as a specimen diluent, a sample extract, a sample developing solution, etc., and all are used synonymously.
  • the sample diluent of the present invention contains at least a compound containing two or more carboxy groups in the molecule, and preferably further contains a buffer.
  • oxalic acid ethanedioic acid
  • malonic acid propanedioic acid
  • succinic acid butanedioic acid
  • glutaric acid penentanedioic acid
  • adipine which are so-called dicarboxylic acids Acid (hexanedioic acid), fumaric acid ((E) -but-2-enedioic acid), maleic acid ((Z) -but-2-enedioic acid), L-glutamic acid, L-aspartic acid, etc.
  • Preferred examples include maleic acid, L-aspartic acid, and glutamic acid.
  • Examples of the compound containing three carboxy groups in the molecule include aconitic acid (2-carboxyprop-1-enticarboxylic acid) which is a tricarboxylic acid, citric acid, isocitric acid, tricarballylic acid, and trimesic acid. Citric acid.
  • the compound containing two or more carboxy groups in the molecule includes salts and derivatives of the compound in addition to the above compounds containing two or more carboxy groups in the molecule.
  • Examples of the salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, and calcium salt, and examples of the derivative include amide, ester, and acid anhydride.
  • the concentration range of the compound containing two or more carboxy groups in the molecule in the sample diluent of the present invention is preferably 5 mM to 300 mM. When there are two carboxy groups, 10 mM to 300 mM is more preferred, 20 mM to 300 mM is even more preferred, and 50 mM to 300 mM is even more preferred. In addition, 30 mM to 300 mM, 40 mM to 300 mM, 60 mM to 300 mM, 70 mM to 300 mM, 80 mM to 300 mM, 90 mM to 300 mM, 100 mM to 300 mM can be mentioned.
  • 10 mM to 250 mM 10 mM to 200 mM, 10 mM to 150 mM, 10 mM to 100 mM.
  • 5 mM to 250 mM is more preferred, 10 mM to 250 mM is even more preferred, and 20 mM to 250 mM is even more preferred.
  • Other examples include 30 mM to 250 mM, 40 mM to 250 mM, 50 mM to 250 mM, 60 mM to 250 mM, 70 mM to 250 mM, 80 mM to 250 mM, 90 mM to 250 mM, 100 mM to 250 mM.
  • the buffer solution contained in the sample diluent of the present invention include commonly used buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, and Good's buffer.
  • the sample diluent of the present invention may be any one containing the above compound and a buffer, and may be a buffer containing the above compound.
  • salts such as sodium chloride, stabilizers and preservatives such as sucrose, proclin (registered trademark) ) Etc. may also be included.
  • the salts include those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution, such as sodium hydroxide, in addition to those included for adjusting the ionic strength, such as sodium chloride.
  • the pH of the sample diluent of the present invention is preferably in the range of 6.0 to 9.0, more preferably 6.5 to 8.0, and even more preferably 7.0 to 8.0. Since the sample diluent of the present invention is a solution for diluting a sample, the sample diluent is added to the sample diluent to dissolve, extract, or disperse and dilute the sample. Thus, typically, the sample and sample diluent are mixed when the sample is supplied to the sample pad of the test strip.
  • a sample diluted directly or with a diluent other than the sample diluent of the present invention is supplied to the sample pad, and the sample diluent of the present invention is supplied to the sample pad simultaneously or with delay.
  • a case is also included in the detection method of the present invention.
  • the sample diluent of the present invention is particularly useful as a diluent for an infant fecal sample for immunoassay because it can suppress non-specific reactions of the infant fecal sample in immunoassay. Any immunoassay may be used as long as it is a detection method using an immune reaction.
  • LTIA method latex immunoagglutination
  • ELISA particle agglutination immunoassay
  • detection method using immunochromatography among which a detection method using immunochromatography is particularly desirable.
  • the sample diluent of the present invention can be used as the first reagent.
  • the present invention also provides a sample pretreatment method for suppressing a nonspecific reaction of an infant stool-derived sample, comprising the step of bringing the sample diluent of the present invention into contact with the infant stool-derived sample.
  • the substance to be detected of the present invention may be any substance as long as it is contained in feces as a sample and can be detected using an antigen-antibody reaction, and examples thereof include viruses, parasites, and proteins.
  • infectious gastroenteritis is mainly caused by viruses and parasites.
  • viruses that can be detected include norovirus, adenovirus, rotavirus, sapovirus, enterovirus, etc.
  • insects include cryptospiridium, amoeba dysentery, giardia and the like.
  • influenza virus as a virus to be detected, and proteins to be detected include human hemoglobin, hepatitis B virus antibody, hepatitis C virus antibody, human immunodeficiency virus antibody, and the like.
  • the test strip for immunochromatography of the present invention is a test strip for detecting a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample by developing a stool-derived sample in an insoluble membrane.
  • the test strip has a membrane made of a porous body including (1) a sample supply unit, (2) a development unit, and (3) a detection unit, and a part of the development unit is labeled with a labeling substance.
  • the conjugate containing the first antibody is held so that it can be eluted, and further has a detection part that is a part of the developing part and has the second antibody immobilized on the downstream side of the conjugate holding part.
  • the compound containing two or more carboxy groups in the molecule of the present invention may be impregnated into a part of the pad constituting the test strip, in addition to the embodiment contained in the sample diluent.
  • sample pads, third pads, conjugate pads, insoluble membranes, and the like may be impregnated into a part of the pad constituting the test strip.
  • sample pads, third pads, conjugate pads, insoluble membranes, and the like may also have an aspect with which a filter chip is impregnated.
  • the conjugate is an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected and is immobilized on a label.
  • the conjugate is present as a conjugate pad, a sample pad, a third pad, It may exist in a state where it is impregnated in another pad other than the insoluble membrane (type A), may exist as a conjugate part in a part of the sample pad (type B), and further, a test strip Alternatively, it may exist as a separate conjugate reagent to be mixed with the specimen (type C).
  • test strip of the type A in which the conjugate is present will be described.
  • the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are arranged in this order from upstream to downstream in the sample flow direction, and are arranged so that at least a part of the upper and lower layers overlap each other.
  • a test strip of such an arrangement is shown in FIG.
  • the composite is then passed through a porous third pad placed in contact with the bottom surface of the conjugate pad and developed into an insoluble membrane. Since an insoluble membrane is immobilized with an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected, a part of the insoluble membrane is bound and immobilized by an immune reaction. Become.
  • the immobilized complex is detected by a means for detecting absorbance, reflected light, fluorescence, magnetism and the like derived from the conjugate.
  • test strip having a conjugate type of type B will be described.
  • the difference from the type A test strip is that the sample pad and the conjugate pad are integrated, that is, the sample supply part and the conjugate part are formed in a part of the sample pad.
  • the sample supply part is a part for supplying a sample containing a substance to be detected
  • the conjugate part is a part containing a conjugate
  • the sample supply part is on the upstream side of the conjugate part.
  • a test strip having a conjugate type of type C will be described.
  • the difference from the above type A test strip is that there is no conjugate pad and the conjugate is present as a separate conjugate reagent.
  • a filter chip in which a conjugate is incorporated in a filter can be mentioned.
  • the conjugate and the substance to be detected are bonded by passing the sample diluent and the substance to be detected, thereby forming a complex (aggregate).
  • the conjugate pad and the filter chip may contain a compound containing two or more carboxy groups of the present invention in the molecule.
  • the sample pad used in the present invention is a portion that receives a sample, and includes any substance and form that can absorb a liquid sample while being molded into the pad and allow the liquid and the detection target to pass through.
  • materials suitable for the sample pad include, but are not limited to, glass fiber (glass fiber), acrylic fiber, hydrophilic polyethylene material, dry paper, paper pulp, and fabric.
  • a fiberglass pad is used.
  • the sample pad can also have the function of a conjugate pad described later.
  • the sample pad can contain a blocking reagent that is usually used for the purpose of preventing / suppressing nonspecific reaction (adsorption) in the antibody-immobilized membrane.
  • the sample pad may contain a compound containing two or more carboxy groups of the present invention in the molecule.
  • the third pad is desirably arranged as necessary depending on the properties of the sample, and any third pad may be used as long as it can permeate the complex of the substance to be detected and the conjugate in the sample.
  • the third pad is a porous member made of polysulfone or cellulose acetate for the purpose of suppressing clogging of the insoluble membrane or capturing nonspecific reaction substances derived from stool. Is desirable.
  • the average pore diameter of the porous third pad of the present invention is exemplified by 1 to 100 ⁇ m, preferably 5 to 80 ⁇ m, more preferably 10 to 60 ⁇ m, further preferably 15 to 55 ⁇ m, particularly preferably 20 to 50 ⁇ m, 25 Most preferred is ⁇ 45 ⁇ m. This is because if it is less than 1 ⁇ m, clogging is caused and the flow of the specimen itself becomes slow, and if it is more than 100 ⁇ m, it is considered that the function of capturing the non-specific reaction substance is lowered.
  • the third pad may contain a compound containing two or more carboxy groups of the present invention in the molecule.
  • the insoluble membrane used in the present invention has at least one detection unit on which an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized. Immobilization of an antibody or antigen that reacts immunologically with a substance to be detected on an insoluble membrane carrier can be carried out by a conventionally known method.
  • a lateral flow type immunochromatographic reagent it has a mechanism capable of preparing a liquid containing the above-mentioned antibody or antigen at a predetermined concentration and moving it horizontally while discharging the liquid from the nozzle at a constant speed.
  • the solution can be immobilized by applying the solution to the insoluble membrane carrier in a line using a device or the like and drying.
  • the concentration of antibody or antigen in the above solution is preferably 0.1 to 5 mg / mL, more preferably 0.5 to 2 mg / mL.
  • the amount of antibody or antigen immobilized on an insoluble membrane carrier can be optimized by adjusting the ejection speed from the nozzle of the above apparatus in the case of the lateral flow type, and is preferably 0.5 to 2 ⁇ L / cm. It is.
  • the measurement method using the lateral flow type immunochromatography reagent is a measurement method in which the sample is developed so as to move in a parallel direction with respect to the insoluble membrane carrier by capillary action.
  • a solution containing the antibody or antigen described above at a predetermined concentration can be prepared by adding the antibody or antigen to a buffer solution.
  • the buffer examples include normal buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, and Good's buffer.
  • the pH of the buffer is preferably in the range of 6.0 to 9.5, more preferably 6.5 to 8.5, and even more preferably 7.0 to 8.0.
  • the buffer may further contain salts such as sodium chloride, stabilizers such as sucrose, preservatives, preservatives such as Procrine (registered trademark), and the like.
  • the salts include those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution, such as sodium hydroxide, in addition to those included for adjusting the ionic strength, such as sodium chloride.
  • blocking can also be carried out by coating a region other than the region where the antibody or antigen is immobilized with a commonly used blocking agent in the form of a solution or vapor.
  • a control capture reagent conventionally used in immunochromatographic reagents may be immobilized on the insoluble membrane.
  • the control capture reagent is a reagent for ensuring the reliability of the assay, and captures the control reagent contained in the conjugate pad.
  • an anti-KLH antibody or the like corresponds to the control capture reagent.
  • the position at which the control capture reagent is immobilized can be appropriately selected to suit the design of the assay system.
  • the insoluble membrane may contain a compound containing two or more carboxy groups of the present invention in the molecule.
  • a known membrane conventionally used as an insoluble membrane carrier for an immunochromatographic reagent can be used.
  • membranes composed of fibers made of polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, ceramics, and the like are preferred.
  • glass fiber filter paper and cellulose filter paper commercially available from Sartorius, Millipore, Toyo Roshi, Whatman and the like. Of these, Sartorius and UniSart® CN140 are preferred.
  • by appropriately selecting the pore size and structure of the insoluble membrane carrier it is possible to control the speed at which the complex of the conjugate and the substance to be detected in the sample flows through the insoluble membrane carrier.
  • the immunochromatographic test strip is preferably disposed on a solid support such as a plastic adhesive sheet.
  • the solid support is composed of a material that does not interfere with the capillary flow of the sample and conjugate.
  • the immunochromatographic test strip may be fixed on a solid support with an adhesive or the like.
  • the adhesive component and the like are also composed of a substance that does not interfere with the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • the immunochromatographic test strip is stored in an appropriate container (housing) taking into account the size of the immunochromatographic test strip, the method and position of sample addition, the position where the insoluble membrane detector is formed, and the signal detection method. -It can be mounted and used, and the state stored and mounted in this way is called "device".
  • the antibody or antigen that immunologically reacts with the substance to be detected used in the present invention is an antibody or antigen that can bind to the substance to be detected.
  • the substance to be detected is a virus or an antigen
  • the antibody or the substance to be detected When is an antibody, an antigen is preferred.
  • An antibody or antigen that reacts immunologically with a substance to be detected is immobilized on a label and a detection part described later.
  • the antibody or antigen immobilized on the label and the detection unit may be the same, but it is preferable that the label and the detection unit are different.
  • Marker As the label used in the present invention, a known label conventionally used for a test strip for immunochromatography can be used.
  • colloidal metal particles such as gold colloid particles and platinum colloid particles, color latex particles, magnetic particles, and fluorescent particles are preferable, and gold colloid particles and color latex particles are particularly preferable.
  • the conjugate used in the present invention is obtained by immobilizing an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected on the label as described above.
  • the conjugate is preferably one in which an anti-rotavirus monoclonal antibody, anti-adenovirus monoclonal antibody or anti-norovirus monoclonal antibody is immobilized on colloidal gold particles.
  • Examples of a method for immobilizing an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be detected to a label include physical adsorption and chemical bonding, and are generally immobilized by physical adsorption.
  • the detection method using the immunochromatography test strip of the present invention can be used in combination with other non-specific suppression methods depending on the measurement conditions and the type of sample. By using in combination with other non-specific suppression methods, it is possible to realize a detection method in which non-specificity is more effectively suppressed for infant stool-derived samples and adult stool-derived samples.
  • other blocking agents that prevent non-specific reactions can be employed at the same time.
  • Other blocking agents may be added to the sample diluent of the present invention or may be included in the sample pad, third pad, insoluble membrane, or conjugate. Any other blocking agent may be used as long as it has a blocking effect.
  • sample diluent of the present invention exerts a non-specific reaction inhibitory effect particularly on infant stool-derived samples, other reagents that exhibit a non-specific inhibitory effect on adult stool-derived samples, and others
  • sample diluent of the present invention exerts a non-specific reaction inhibitory effect particularly on infant stool-derived samples
  • other reagents that exhibit a non-specific inhibitory effect on adult stool-derived samples and others
  • the same test item can be detected with the same type of immunochromatographic test strip regardless of the type of sample (adult or infant).
  • examples of other configurations include a third pad.
  • the detection kit using the immunochromatography of the present invention only needs to include the immunochromatographic test strip and the sample diluent.
  • the detection kit may further include a reagent necessary for detection, a test tube, a swab for collecting feces, an instruction manual, a housing for storing a test strip, and the like.
  • upstream or downstream is used to mean the upstream side or the downstream side in the direction of sample flow.
  • the test pad of the present invention is laminated so that the sample pad, conjugate pad, third pad, and insoluble membrane partially overlap from the top, the sample pad is the most upstream and the insoluble membrane is the downstream.
  • the end pad may be stacked on the downstream side of the insoluble membrane so as to overlap with each other. In this case, the end pad is the most downstream.
  • Test Material A test device including a test strip for immunochromatography using an anti-rotavirus antibody and an anti-adenovirus antibody was produced.
  • FIG. 1 shows a schematic configuration diagram of a test strip for immunochromatography of the present invention. Place the insoluble membrane (b) on the plastic adhesive sheet (a), then place and install the third pad (g), conjugate pad (d), sample pad (e) in this order, and the absorbent pad on the opposite end. (f) was placed and mounted.
  • the conjugate pad is impregnated with a conjugate of gold colloid sensitized with an anti-adenovirus monoclonal antibody and a gold colloid sensitized with an anti-rotavirus monoclonal antibody, and the insoluble membrane is impregnated with an anti-adenovirus monoclonal antibody.
  • An antibody, an anti-rotavirus monoclonal antibody and a control reagent are immobilized on the line perpendicular to the flow direction.
  • Each pad is laminated so that the upper and lower pads are in contact with a part thereof.
  • test line a line composed of the anti-adenovirus monoclonal antibody and the anti-rotavirus monoclonal antibody
  • control line a line composed of the control reagent
  • sample dilutions citrate 3Na2H 2 0, (2 one into the carboxy group molecule) of maleic acid, L- aspartic acid Na (2 one into the carboxyl group molecule) , L-glutamic acid Na (two carboxy groups in the molecule), 1-heptasulfonic acid Na (compound contained in the conventional sample diluent) or trichloroacetic acid 3Na (one carboxy group in the molecule)
  • a sample diluent was prepared by adding to a phosphate buffer (pH 7.6) so as to have the addition concentration shown in Table 1. Sample dilutions without additives were also prepared.
  • Test Method 120 ⁇ L of a sample was dropped onto a test device, and the color intensity of the test line was evaluated after 10 minutes, 20 minutes, and 30 minutes using a color sample called “color chart”.
  • the color intensity of the color chart is quantified in increments of 0.25 from 0 to 4, and for extremely weak non-specific reactions less than 0.25, the criteria are SS (very weak) and S (weak). Evaluated. From the evaluation result of the color intensity, the strength of the non-specific reaction was evaluated.
  • Each evaluation standard is shown below Table 1. Evaluation was performed in the same manner in the examples described later. In Tables 1 to 6, “Rota”, “Adeno”, and “noro” indicate cases in which rotavirus, adenovirus, and norovirus are detected items, respectively.
  • Example 2 Examination of concentration of compound containing two or more carboxy groups in sample dilution to sample diluent ⁇ In the case of rotavirus and adenovirus measurement reagents> 1. Test material (1) Test device Same as Example 1.
  • Sample diluent citrate 3Na2H 2 0 Sample dilutions were prepared by adding a phosphate buffer (pH 7.6) so that the additive concentration shown in Table 2. Sample diluent containing no citric acid 3Na2H 2 0 was also prepared.
  • Test results The results are shown in Table 2. According to Table 2, by suppressing non-specific reactions than the doping concentration 5mM sample dilutions of citrate 3Na2H 2 0 to no addition in the range of up to 250 mM, it could be detected rotavirus, adenovirus . In particular, in the detection of adenovirus, non-specific reactions were observed in all specimens, and these non-specific reactions could be completely suppressed by using the sample diluent of the present invention.
  • Test Material A test device including an immunochromatographic test strip using an anti-norovirus antibody was produced. Place the insoluble membrane (b) on the plastic adhesive sheet (a), then place and install the third pad (g), conjugate pad (d), sample pad (e) in this order, and the absorbent pad on the opposite end. (f) was placed and mounted.
  • the conjugate pad is impregnated with a gold colloid sensitized conjugate of anti-norovirus monoclonal antibody, and the insoluble membrane is immobilized on the line with anti-norovirus monoclonal antibody and control reagent perpendicular to the flow direction.
  • Each pad is laminated so that the upper and lower pads are in contact with a part thereof.
  • the line consisting of the anti-norovirus monoclonal antibody is called the test line (c1), and the line consisting of the control reagent is called the control line (c3).
  • Test method The same as in Example 1 except that the timing for evaluating the color intensity of the test line was changed to “after 10, 15, 30 minutes”.
  • Example 4 Examination of concentration of compound containing two or more carboxy groups in a sample diluted solution ⁇ Norovirus measurement reagent> 1. Test Material (1) Test Device The same test device as in Example 3 was manufactured.
  • Sample diluent citrate 3Na2H 2 0 Sample dilutions were prepared by adding a phosphate buffer (pH 7.6) so that the additive concentration shown in Table 4. Sample diluent containing no citric acid 3Na2H 2 0 was also prepared.
  • Example 5 Examination of addition of a compound containing two or more carboxy groups in a molecule to a sample diluent ⁇ Norovirus measurement reagent, infant sample> Examples 1 to 4 described above are tests using feces of infants (newborns) as specimens, and it was confirmed whether or not the nonspecific reaction inhibitory effect of the present invention was also observed in infant specimens. 1. Test material (1) Test device Same as Example 3.
  • Sample Diluted Solution A sample diluted solution was prepared by adding citrate 3Na 2 H 2 0 to a phosphate buffer (pH 7.6) so as to have an addition concentration shown in Table 5. Sample diluent containing no citric acid 3Na2H 2 0 was also prepared.
  • Test method The same as in Example 1 except that the timing for evaluating the color intensity of the test line was only “after 15 minutes”.
  • Sample diluent citrate 3Na2H 2 0 Sample dilutions were prepared by adding a phosphate buffer (pH 7.6) so that the additive concentration shown in Table 6. Sample diluent containing no citric acid 3Na2H 2 0 was also prepared.
  • Test method The same as in Example 1 except that the timing for evaluating the color intensity of the test line was changed to “after 10, 15, 30 minutes”.
  • a substance to be detected in a sample derived from stool can be accurately detected while suppressing a non-specific reaction peculiar to the stool.
  • it has the effect of suppressing non-specific reactions in stool samples derived from infants, and it has become possible to accurately detect a substance to be detected in the sample using immunochromatography.

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Abstract

本発明は、糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法において、糞便に特有の非特異反応を抑制する方法を提供することを課題とする。　カルボキシ基を分子内に２以上有する化合物を利用することにより、糞便由来サンプルに起因する非特異反応を抑制し、糞便由来サンプル中の検出対象物質を正確に検出できることを見出した。特に、乳幼児の糞便由来サンプルについて、従来の方法では抑制できなかった非特異反応を本発明のカルボキシ基を分子内に２以上有する化合物を含むサンプル希釈液を利用することで抑制することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

Description

イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法
　本発明は、イムノクロマトグラフィーを利用して、糞便由来サンプルを検出する方法において、非特異反応を抑制する方法、及びこれに用いられる検出キットならびにサンプル希釈液に関する。
　イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法は、特異性や感度が高い上に簡便であることから広く普及している。当該検出方法に適用される試料としては、尿、糞便、唾液、血液、血清などが挙げられ、これらは臨床検査試料として好適であり、診断上有用な試料として広く利用されている。
　特に、糞便を試料として、これに含まれる被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出するためには、イムノクロマトグラフィーによる試料の展開そのものの妨げになるような物質や、被検出物質が存在しないにも関わらず、あたかも存在するかのような反応、いわゆる非特異反応の原因となるような物質の影響を極力排除することが必要となる。
　非特異的反応を排除するための一般的なブロッキング剤として、ゼラチン、カゼイン、ウシ血清アルブミン、合成高分子などが知られており、これらをイムノクロマトグラフィーを利用した反応の系内に共存させる方法が知られている（特許文献１、特許文献２）。
　しかし、これらが実際に糞便由来サンプルに起因する非特異反応の抑制に対しても効果があるかどうかについては不明である。
　ところで、特許文献３には、糞便を試料としたＥＬＩＳＡ等による検出では、感度が低く、非特異反応が多いことから結果の判定に苦慮していたという、糞便を検体とする場合の問題点が挙げられている。本文献には、これを解決してノロウイルス又はサポウイルスをイムノクロマトグラフィーを利用して検出するに際し、ｐＨ９．０～１０．０の検体用希釈液を使うことで非特異反応を抑制する方法が開示されている。しかし、当該方法ではサンプル希釈液として一般的とはいえないアルカリ側にサンプル希釈液を調製する必要があるため、取扱いの点において問題があった。
　また、特許文献４には、クエン酸などの有機酸と、界面活性剤を含む検体前処理液で、生体試料を前処理することで免疫反応の検出感度を高める方法について開示されている。
生体試料として多数列挙されている中に糞便も含まれているものの、実施例で確認されているのはインフルエンザ患者の鼻汁または咽頭拭い液であり、検出方法もイムノクロマトグラフィーを利用したものではない。
　このように、糞便由来サンプル中の検出対象物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法において、糞便由来サンプルに起因する非特異反応を抑制する方法についての技術は未だ確立されていない。
特開２００３－３４４４０６号公報 特開２００２－１４８２６６号公報 特開２００４－３０１６８４号公報 国際公開ＷＯ０２／０１０７４４号パンフレット
　本発明は、糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることによりサンプル中の被検出物質を検出するイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法において、糞便に特有の非特異反応を抑制する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、カルボキシ基を分子内に２以上有する化合物を利用することにより、糞便由来サンプルに起因する非特異反応を抑制し、糞便由来サンプル中の検出対象物質を正確に検出できることを見出した。
　特に、乳幼児の糞便由来サンプルについて、従来の方法では抑制できなかった非特異反応を本発明の分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物を含むサンプル希釈液を利用することで抑制することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
糞便由来サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法であって、
分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物の存在下で免疫反応を行う工程を含む、前記検出方法。
＜２＞
糞便由来サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法であって、（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む検出方法。
（Ａ）下記テストストリップのサンプル供給部に、分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物および緩衝液を含むサンプル希釈液ならびに糞便由来サンプルを供給する工程
テストストリップ；
少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二の抗体が固定化されている検出部を有する
（Ｂ）サンプル中の検出対象物質をコンジュゲートと接触させる工程
（Ｃ）サンプル中の検出対象物質とコンジュゲートの複合体を検出部において検出する工程
＜３＞
糞便由来サンプルが、乳幼児の糞便由来サンプルである＜１＞又は＜２＞に記載の検出方法。
＜４＞
糞便由来サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法における非特異反応抑制方法であって、
分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物の存在下で免疫反応を行う工程を含む、前記方法。
＜５＞
糞便由来サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法における非特異反応抑制方法であって、（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む方法。
（Ａ）下記テストストリップのサンプル供給部に、分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物及び緩衝液を含むサンプル希釈液ならびに糞便由来サンプルを供給する工程
テストストリップ；
少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二の抗体が固定化されている検出部を有する
（Ｂ）サンプル中の検出対象物質をコンジュゲートと接触させる工程
（Ｃ）サンプル中の検出対象物質とコンジュゲートの複合体を検出部において検出する工程
＜６＞
糞便由来サンプルが、乳幼児の糞便由来サンプルである＜４＞又は＜５＞に記載の方法。
＜７＞
以下の構成（１）および（２）を含む、糞便由来サンプル用イムノクロマトグラフィー用検出キット。
（１）少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であって前記コンジュゲート保持部分より下流側に、第二の抗体が固定化されている検出部を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップ
（２）分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物及び緩衝液を含むサンプル希釈液
＜８＞
糞便由来サンプルが、乳幼児の糞便由来サンプルである＜７＞に記載の検出キット。
＜９＞
分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物および緩衝液を含む免疫測定用の乳幼児糞便由来サンプル希釈液。
＜１０＞
分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物および緩衝液を含むサンプル希釈液と、乳幼児糞便由来サンプルを接触させる工程を含む、乳幼児糞便由来サンプルの免疫測定における非特異反応を抑制するためのサンプル前処理方法。
　本発明の、カルボキシ基を分子内に２以上有する化合物を利用することにより、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法において、糞便サンプルに起因する特有の非特異反応を抑制して、サンプル中の被検出物質を正確に検出することができる。
　本発明は、乳幼児の糞便由来サンプルについて、従来の方法では抑制できなかった特有の非特異反応を抑制することが可能であるから、成人サンプルだけでなく、乳幼児サンプルも対象となるような検出項目において、いずれの糞便サンプルであってもイムノクロマトグラフィーを利用して、被検出物質を正確に検出することが可能となった。
本発明のテストストリップの模式構成図である。
（サンプル）
　本発明において、サンプルとしてはヒトの糞便由来のものが対象となる。ヒトの糞便は、成人の糞便および乳幼児の糞便のいずれも対象となるが、本発明は特に、乳幼児の糞便に由来する非特異反応を抑制する効果を奏する。本発明でいう乳幼児とは、新生児、乳児、幼児（７歳未満）のいずれも含む意味で用いる。糞便は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜サンプル希釈液によって希釈してサンプルとしてもよい。また、適宜希釈し濾過したものをサンプルとして用いてもよい。なお、サンプル希釈液は、他では検体希釈液、サンプル抽出液、サンプル展開液などと呼ばれることもあり、いずれも同義で用いられる。
(サンプル希釈液）
　本発明のサンプル希釈液は、カルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物を少なくとも含み、好ましくはさらに緩衝液を含む。カルボキシ基を分子内に２個含む化合物として、いわゆるジカルボン酸であるシュウ酸（エタン二酸）、マロン酸（プロパン二酸）、コハク酸（ブタン二酸）、グルタル酸（ペンタン二酸）、アジピン酸（ヘキサン二酸）、フマル酸（(E)-ブタ-2-エン二酸）、マレイン酸（(Z)-ブタ-2-エン二酸）、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、等が挙げられ、好ましくは、マレイン酸、L-アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられる。
　カルボキシ基を分子内に３個含む化合物としては、トリカルボン酸であるアコニット酸（2-カルボキシプロパ-1-エントリカルボン酸）、クエン酸、イソクエン酸、トリカルバリル酸、トリメシン酸が挙げられ、好ましくは、クエン酸が挙げられる。
　また、本発明において、カルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物としては、カルボキシ基を分子内に２個以上含む上記のような化合物それ自体のほかに、当該化合物の塩や誘導体も含まれる。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシム塩などの金属塩が挙げられ、誘導体としては、アミド、エステル、酸無水物、などが挙げられる。
　本発明のサンプル希釈液中のカルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物の濃度範囲は、５ｍＭ～３００ｍＭが好ましい。
　カルボキシ基が２個の場合には、１０ｍＭ～３００ｍＭがさらに好ましく、２０ｍＭ～３００ｍＭがよりいっそう好ましく、５０ｍＭ～３００ｍＭがさらにいっそう好ましい。また、このほかにも、３０ｍＭ～３００ｍＭ、４０ｍＭ～３００ｍＭ、６０ｍＭ～３００ｍＭ、７０ｍＭ～３００ｍＭ、８０ｍＭ～３００ｍＭ、９０ｍＭ～３００ｍＭ、１００ｍＭ～３００ｍＭが挙げられる。また、１０ｍＭ～２５０ｍＭ、１０ｍＭ～２００ｍＭ、１０ｍＭ～１５０ｍＭ、１０ｍＭ～１００ｍＭも挙げられる。
　カルボキシ基が3個の場合には、５ｍＭ～２５０ｍＭがさらに好ましく、１０ｍＭ～２５０ｍＭがよりいっそう好ましく、２０ｍＭ～２５０ｍＭがさらにいっそう好ましい。また、このほかにも３０ｍＭ～２５０ｍＭ、４０ｍＭ～２５０ｍＭ、５０ｍＭ～２５０ｍＭ、６０ｍＭ～２５０ｍＭ、７０ｍＭ～２５０ｍＭ、８０ｍＭ～２５０ｍＭ、９０ｍＭ～２５０ｍＭ、１００ｍＭ～２５０ｍＭが挙げられる。また、５ｍＭ～２００ｍＭ、５ｍＭ～１５０ｍＭ、５ｍＭ～１００ｍＭも挙げられる。
　本発明のサンプル希釈液に含まれる緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。本発明のサンプル希釈液は、上記化合物と緩衝液を含むものであればよく、上記化合物を含む緩衝液でもよく、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。本発明のサンプル希釈液のｐＨは、６．０～９．０の範囲が好ましく、６．５～８．０がより好ましく、７．０～８．０がよりいっそう好ましい。
　本発明のサンプル希釈液は、サンプルを希釈するための液であるから、糞便サンプルをサンプル希釈液に添加して、サンプルを溶解、抽出、あるいは分散して希釈する役割を担っている。したがって、典型的には、テストストリップのサンプルパッドにサンプルを供給する時点でサンプルとサンプル希釈液は混合されている。しかし、このほかに、サンプルを直接あるいは他の本発明のサンプル希釈液以外の希釈液で希釈したものをサンプルパッドに供給し、同時にあるいは遅れて本発明のサンプル希釈液を前記サンプルパッドに供給する場合も本発明の検出方法に含まれる。
　本発明のサンプル希釈液は、免疫測定における乳幼児糞便由来サンプルの非特異反応を抑制することができることから、免疫測定用の乳幼児糞便由来サンプル用の希釈液として特に有用である。
　免疫測定法としては、免疫反応を利用する検出方法であればいずれでもよく、例えば、粒子凝集イムノアッセイ法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法という）、代表的な標識イムノアッセイ法であるＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法等が挙げられるが、このうちでも特にイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法が望ましい。免疫測定法として前記ＬＴＩＡ法において本発明のサンプル希釈液を使う場合は、糞便由来サンプルを本発明のサンプル希釈液で希釈した後、ラテックス試薬と混合することで免疫凝集反応を検出することができる。ラテックス試薬が、緩衝液を含む第一試薬とラテックス試薬を含む第二試薬からなる場合は、第一試薬として本発明の検体希釈液を使用することができる。
　また、本発明は、本発明のサンプル希釈液と、乳幼児糞便由来サンプルとを接触させる工程を含む、乳幼児糞便由来サンプルの非特異反応を抑制するためのサンプル前処理方法も提供する。
（被検出物質）
　本発明の被検出物質としては、サンプルである糞便中に含まれ、抗原抗体反応を利用して検出し得るものであればいずれでもよく、ウイルス、寄生虫、タンパク質などが挙げられる。
　例えば感染性胃腸炎は、ウイルスおよび寄生虫が主な原因であり、被検出物質となるウイルスとしては、ノロウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、エンテロウイルス等があげられ、被検出物質となる寄生虫としてはクリプトスピリジウム、アメーバ赤痢、ジアルジア等があげられる。
　このほかにも、被検出物質となるウイルスとしてインフルエンザウイルス、被検出物質となるタンパク質としては、ヒトヘモグロビン、Ｂ型肝炎ウイルス抗体、Ｃ型肝炎ウイルス抗体、ヒト免疫不全ウイルス抗体等が挙げられる。
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップ）
　本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、糞便由来のサンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するテストストリップである。当該テストストリップは、（１）サンプル供給部（２）展開部（３）検出部、とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二の抗体が固定化されている検出部を有する。
　本発明のカルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物は、前記サンプル希釈液に含まれている態様のほか、テストストリップを構成するパッドの一部に含浸させる態様もあり得る。例えば、サンプルパッド、サードパッド、コンジュゲートパッド、不溶性メンブレンなどである。また、本発明のカルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物は、フィルターチップに含浸される態様もあり得る。
　コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドとして、サンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレン以外の別のパッドに含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部にコンジュゲート部として存在してもよいし（タイプＢ）、さらには、テストストリップとは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
　以下、コンジュゲートの存在様式が上記タイプＡのテストストリップについて説明する。
　サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順で配置され、それぞれ上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図１に示す。
　このようなテストストリップのサンプルパッドに、被検出物質を含有するサンプルが供給されると、被検出物質はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、被検出物質とコンジュゲートが接触して複合体（凝集体）を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
　不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されているため、該複合体がここで免疫反応により結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等を検出する手段により検出される。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＢのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、サンプルパッドとコンジュゲートパッドが一体になった点であり、つまり、サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている点である。
　上記サンプル供給部は、被検出物質を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＣのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、サンプル希釈液及び被検出物質を通過させることでコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体（凝集体）を形成する。これをコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記テストストリップに供給することで、被検出物質を検出することができる。
　コンジュゲートパッドやフィルターチップには、このほかに、本発明のカルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物を含ませることもできる。
（サンプルパッド）
　本発明に用いられるサンプルパッドとは、サンプルを受け入れる部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、抗体固定化メンブレンにおける非特異的反応（吸着）を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング試薬を含ませることができる。
　サプルパッドには、このほかに、本発明のカルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物を含ませることもできる。
（サードパッド）
　サードパッドは、試料の性状等により必要に応じて配置されることが望ましく、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよい。本発明では、不溶性メンブレンの目詰まりを抑制するため、あるいは糞便由来の非特異反応物質を捕捉することを目的とするため、サードパッドは、ポリスルホンまたはセルロースアセテートからなる多孔質性の部材であることが望ましい。
　また、本発明の多孔質性サードパッドの平均孔径は、１～１００μｍが例示され、５～８０μｍが好ましく、１０～６０μｍがより好ましく、１５～５５μｍがさらに好ましく、２０～５０μｍが特に好ましく、２５～４５μｍが最も好ましい。
　１μｍ未満では詰まりの原因となり、検体の流れ自体が遅くなるからであり１００μｍより大きいと前記非特異反応物質を捕捉する機能が低下するためと思われるからである。
　サードパッドには、このほかに、本発明のカルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物を含ませることもできる。
（不溶性メンブレン）
　本発明に用いられる不溶性メンブレンは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化された少なくとも１つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。上記液の抗体または抗原の濃度は０．１～５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５～２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体または抗原の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、０．５～２μＬ／ｃｍが好適である。
　なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬を用いた測定方法は、サンプルが毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
　また、上記の抗体または抗原を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体または抗原を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０～９．５の範囲が好ましく、６．５～８．５がより好ましく、７．０～８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
　不溶性メンブレンに抗体または抗原を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体または抗原を固定化した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
　なお、不溶性メンブレンには、従来からイムノクロマト試薬で用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたスカシ貝由来ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）をコントロール試薬として含む場合には、抗ＫＬＨ抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
　不溶性メンブレンには、このほかに、本発明のカルボキシ基を分子内に２個以上含む化合物を含ませることもできる。
　本発明で用いられる不溶性メンブレンを構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマト試薬の不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などが挙げられる。中でも、ザルトリウス社、UniSart CN140が好ましい。また、この不溶性メンブレン担体の孔径と構造を適宜選択することにより、コンジュゲートとサンプル中の被検出物質との複合体が不溶性メンブレン担体中を流れる速度を制御することが可能である。
　上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定化してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレンの検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
（被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原）
　本発明で用いられる被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、被検出物質に結合可能な抗体または抗原であり、被検出物質がウイルスや抗原の場合は抗体、被検出物質が抗体の場合は抗原が好ましい。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原は、後述する標識体および検出部に固定化される。標識体および検出部に固定化される抗体または抗原は同一であってもよいが、標識体と検出部とで別のものであることが好ましい。
（標識体）
　本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子、蛍光粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子、カラーラテックス粒子が好ましい。
（コンジュゲート）
　本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が固定化されたものである。コンジュゲートは、被検出物質がロタウイルス、アデノウイルスまたはノロウイルスを検出する場合、金コロイド粒子に抗ロタウイルスモノクローナル抗体、抗アデノウイルスモノクローナル抗体または抗ノロウイルスモノクローナル抗体が固定化されたものが好ましい。
　被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。
（他の非特異抑制方法との併用）
　本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを利用した検出方法は、さらに測定条件、サンプルの種類に応じて他の非特異抑制方法との併用も可能である。
　他の非特異抑制方法との併用により、乳幼児の糞便由来サンプルと成人の糞便由来サンプルに対してより効果的に非特異が抑制された検出方法が実現可能となる。例えば、非特異反応を防止する他のブロッキング剤を同時に採用することも可能である。他のブロッキング剤は、本発明のサンプル希釈液に添加する場合や、サンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレン、コンジュゲートに含ませる場合などがある。
　他のブロッキング剤としては、ブロッキング効果のあるものであればよい。
　また、本発明のサンプル希釈液は、特に乳幼児の糞便由来サンプルに対して非特異反応抑制効果を発揮するため、成人の糞便由来サンプルに対して非特異抑制効果を発揮する他の試薬や、他の構成と組み合わせることで、同じ検査項目について、サンプルの種類（成人か乳幼児か）によらずに同種類のイムノクロマトグラフィーテストストリップにて検出が可能である。
　他の構成としては、例えば、サードパッド等が挙げられる。
（キット）
　本発明のイムノクロマトグラフィーを利用した検出キットは、前記イムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびサンプル希釈液を含むものであればよい。本検出キットは、他に検出に必要な試薬、試験用チューブ、便採取用の綿棒、取扱い説明書、テストストリップ格納用のハウジングなどを含んでもよい。
(その他)
　本明細書中、上流または下流という意味は、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のテストストリップで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
〔実施例１〕サンプル希釈液への陰イオン性物質の添加検討＜ロタウイルスおよびアデノウイルス測定試薬の場合＞
　非特異反応を抑制できる物質の探索のため、陰イオン性物質について検討を行った。
１．試験材料
（１）テストデバイス
抗ロタウイルス抗体及び抗アデノウイルス抗体を使用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むテストデバイスを製造した。　
　図１に、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
　プラスチック製粘着シート（a）に不溶性メンブレン（b）を貼り、次いで、サードパッド(g)、コンジュゲートパッド（d)、サンプルパッド（e）を順に配置装着し、反対側の端には吸収パッド(ｆ)を配置装着した。コンジュゲートパッドには、金コロイドに抗アデノウイルスモノクローナル抗体を感作したコンジュゲート及び金コロイドに抗ロタウイルスモノクローナル抗体を感作したコンジュゲートが含浸されており、不溶性メンブレンには、抗アデノウイルスモノクローナル抗体、抗ロタウイルスモノクローナル抗体およびコントロール試薬が流れ方向に対して垂直にライン上に固定化されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗アデノウイルスモノクローナル抗体および抗ロタウイルスモノクローナル抗体からなるラインをテストライン（ｃ１、ｃ２）、コントロール試薬からなるラインをコントロールライン（ｃ３）という。
　このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。テストストリップを専用のプラスチック製ハウジングに格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイス（図示せず）の形態にした。
（２）サンプル希釈液
　クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０（カルボキシ基が分子内に３つ）、マレイン酸（カルボキシ基が分子内に２つ）、Ｌ－アスパラギン酸Ｎａ（カルボキシ基が分子内に２つ）、Ｌ－グルタミン酸Ｎａ（カルボキシ基が分子内に２つ）、１－ヘプタスルホン酸Ｎａ（従来のサンプル希釈液に含まれていた化合物）またはトリクロロ酢酸３Ｎａ（カルボキシ基が分子内に１つ）を表１に示す添加濃度となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に添加してサンプル希釈液を調整した。添加剤を含まないサンプル希釈液も調製した。
（３）サンプル
　ロタウイルス及びアデノウイルス陰性の乳幼児（生後４０日未満、３名）の糞便を検体として用いた。各検体０．１ｍｇを上記（２）で調製したサンプル希釈液１．０ｍＬに懸濁し、その上清をサンプルとした。
２．試験方法
　テストデバイスにサンプル１２０μＬを滴下し、１０分、２０分、３０分後にテストラインの発色強度を「カラーチャート」という色見本を用いて評価した。
　カラーチャートによる発色強度は０～４まで０．２５刻みの値で数値化されており、０．２５未満の極めて弱い非特異反応についてはさらに、ＳＳ（非常に弱い）、Ｓ（弱い）という基準にて評価した。発色強度の評価結果から、非特異反応の強さの評価を行った。
各評価基準は、表１の下に示した。評価は後述する実施例でも同様に行った。
表１～表６中、「Ｒｏｔａ」、「Ａｄｅｎｏ」、「ｎｏｒｏ」は、それぞれロタウイルス、アデノウイルス、ノロウイルスを検出項目とした場合を示す。
３．試験結果
　結果を表１に示す。表１によれば、クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０（カルボキシ基が分子内に３つ）、マレイン酸（カルボキシ基が分子内に２つ）、Ｌ－アスパラギン酸Ｎａ（カルボキシ基が分子内に２つ）、Ｌ－グルタミン酸Ｎａ（カルボキシ基が分子内に２つ）を添加したサンプル希釈液を使用して乳幼児糞便中のロタウイルス及びアデノウイルスを検出した場合は、いずれかの添加濃度あるいはすべての濃度で、非特異反応抑制効果がみられた。
　一方、トリクロロ酢酸３Ｎａ（カルボキシ基が分子内に１つ）を添加したサンプル希釈液を使用した場合は、いずれの添加濃度においても非特異反応抑制効果がみられなかった。また、従来のサンプル希釈液である１－ヘプタスルホン酸Ｎａを含むサンプル希釈液を使用した場合にも非特異反応抑制効果がみられなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔実施例２〕カルボキシ基を分子内に２以上含む化合物のサンプル希釈液への添加濃度の検討＜ロタウイルスおよびアデノウイルス測定試薬の場合＞
１．試験材料
（１）テストデバイス
　実施例１に同じ。
（２）サンプル希釈液
　クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０を表２に示す添加濃度となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に添加してサンプル希釈液を調整した。クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０を含まないサンプル希釈液も調製した。
（３）サンプル
　実施例１に同じ。
２．試験方法
　実施例１に同じ。
３．試験結果
　結果を表２に示す。表２によれば、クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０のサンプル希釈液の添加濃度５ｍＭから２５０ｍＭまでの範囲で無添加に比べて非特異反応を抑制して、ロタウイルス、アデノウイルスを検出することができた。特に、アデノウイルスの検出において、すべての検体において非特異反応がみられたところ、本発明のサンプル希釈液を用いることでこれらの非特異反応を完全に抑制することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔実施例３〕分子内にカルボキシ基を２以上含む化合物のサンプル希釈液への添加検討＜ノロウイルス測定試薬の場合＞
１．試験材料
（１）テストデバイス
　抗ノロウイルス抗体を使用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むテストデバイスを製造した。
　プラスチック製粘着シート（a）に不溶性メンブレン（b）を貼り、次いで、サードパッド(g)、コンジュゲートパッド（d)、サンプルパッド（e）を順に配置装着し、反対側の端には吸収パッド(ｆ)を配置装着した。コンジュゲートパッドには、金コロイドに抗ノロウイルスモノクローナル抗体を感作したコンジュゲートが含浸されており、不溶性メンブレンには、抗ノロウイルスモノクローナル抗体およびコントロール試薬が流れ方向に対して垂直にライン上に固定化されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗ノロウイルスモノクローナル抗体からなるラインをテストライン（ｃ１）、コントロール試薬からなるラインをコントロールライン（ｃ３）という。
　このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。テストストリップを専用のプラスチック製ハウジングに格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイス（図示せず）の形態にした。
（２）サンプル希釈液
　クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０（カルボキシ基が分子内に３つ）、マレイン酸（カルボキシ基が分子内に２つ）、Ｌ－アスパラギン酸Ｎａ（カルボキシ基が分子内に２つ）、Ｌ－グルタミン酸Ｎａ（カルボキシ基が分子内に２つ）を表３に示す添加濃度となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に添加してサンプル希釈液を調整した。添加剤を含まないサンプル希釈液も調製した。
（３）サンプル
　ノロウイルス陰性の乳幼児（生後４０日未満、３名）の糞便を検体として用いた。各検体０．１ｍｇをサンプル希釈液１．０ｍＬに懸濁し、その上清をサンプルとした。
２．試験方法
　テストラインの発色強度を評価するタイミングを「１０、１５、３０分後」とした以外は実施例１に同じ。
３．試験結果
　結果を表３に示す。表３によれば、クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０（カルボキシ基が分子内に３つ）、マレイン酸（カルボキシ基が分子内に２つ）、Ｌ－アスパラギン酸Ｎａ（カルボキシ基が分子内に２つ）、Ｌ－グルタミン酸Ｎａ（カルボキシ基が分子内に２つ）を添加したサンプル希釈液を使用して乳幼児糞便中のノロウイルスを検出した場合は、いずれかの添加濃度あるいはすべての濃度で、非特異反応抑制効果がみられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例４〕カルボキシ基を分子内に２以上含む化合物のサンプル希釈液への添加濃度の検討＜ノロウイルス測定試薬の場合＞
１．試験材料
（１）テストデバイス
　実施例３と同じテストデバイスを製造した。
（２）サンプル希釈液
　クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０を表４に示す添加濃度となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に添加してサンプル希釈液を調整した。クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０を含まないサンプル希釈液も調製した。
（３）サンプル
　ノロウイルス陰性の乳幼児（生後４０日未満、３名）の糞便を検体として用いた。各検体０．１ｍｇをサンプル希釈液１．０ｍＬに懸濁し、その上清をサンプルとした。
２．試験方法
　実施例３に同じ。
３．試験結果
　結果を表４に示す。表４によれば、クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０のサンプル希釈液の添加濃度５ｍＭから２５０ｍＭまでの範囲で無添加に比べて非特異反応効果が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔実施例５〕分子内にカルボキシ基を２以上含む化合物のサンプル希釈液への添加検討＜ノロウイルス測定試薬、幼児検体の場合＞
　上記実施例１～４は乳児（新生児）の糞便を検体とした試験であるが、幼児の検体についても本発明の非特異反応抑制効果が見られるかどうか確認した。
１．試験材料
（１）テストデバイス
　実施例３と同じ。
（２）サンプル希釈液
　クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０を表５に示す添加濃度となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に添加してサンプル希釈液を調整した。クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０を含まないサンプル希釈液も調製した。
（３）サンプル
　ノロウイルス陰性の幼児（２歳、２名）の糞便を検体として用いた。各検体0.1mgをサンプル希釈液１．０ｍＬに懸濁し、その上清をサンプルとした。
２．試験方法
　テストラインの発色強度を評価するタイミングを「１５分後」のみとした以外は実施例１に同じ。
３．試験結果
　結果を表５に示す。表５によれば、幼児検体においても、本発明の検体希釈液を用いることにより非特異反応を抑制できることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
〔参考例〕分子内にカルボキシ基を２以上含む化合物のサンプル希釈液への添加検討＜ノロウイルス測定試薬、成人検体の場合＞
　上記実施例１～５は、乳幼児の糞便を検体とし、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法における本発明の希釈液の非特異抑制効果を確認した。そこで、この非特異抑制効果が、成人検体でも同様に奏されるかどうかを調べた。
１．試験材料
（１）テストデバイス
　実施例３と同じ。
（２）サンプル希釈液
　クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０を表６に示す添加濃度となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）に添加してサンプル希釈液を調整した。クエン酸３Ｎａ２Ｈ２０を含まないサンプル希釈液も調製した。
（３）サンプル
　ノロウイルス陰性の成人２名の糞便を検体として用いた。各検体０．１ｍｇをサンプル希釈液１．０ｍＬに懸濁し、その上清をサンプルとした。
２．試験方法
　テストラインの発色強度を評価するタイミングを「１０、１５、３０分後」とした以外は実施例１に同じ。
３．試験結果
　結果を表６に示す。本結果より、成人検体では、強い非特異反応がみられ、本発明のサンプル希釈液による非特異反応抑制効果はみられなかった。したがって、本発明のカルボン酸を含むサンプル希釈液による非特異反応抑制効果は、乳幼児検体に由来する非特異反応を特異的に抑制する効果であると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明によれば、イムノクロマトグラフィーを用いた検出方法において糞便由来のサンプル中の被検出物質を当該糞便に特有の非特異反応を抑制して正確に検出することができる。特に、乳幼児の糞便由来サンプルにおける非特異反応を抑制する効果があり、当該サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して、正確に検出することが可能となった。
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）不溶性メンブレン
（ｃ１）テストライン
（ｃ２）テストライン
（ｃ３）コントロールライン
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）サードパッド 

Claims (10)

  1. 糞便由来サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法であって、
    分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物の存在下で免疫反応を行う工程を含む、前記検出方法。
  2. 糞便由来サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法であって、（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む方法。
    （Ａ）下記テストストリップのサンプル供給部に、分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物および緩衝液を含むサンプル希釈液ならびに糞便由来サンプルを供給する工程
    テストストリップ；
    少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二の抗体が固定化されている検出部を有する
    （Ｂ）サンプル中の検出対象物質をコンジュゲートと接触させる工程
    （Ｃ）サンプル中の検出対象物質とコンジュゲートの複合体を検出部において検出する工程
  3. 糞便由来サンプルが、乳幼児の糞便由来サンプルである請求項１又は２に記載の検出方法。
  4. 糞便由来サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法における非特異反応抑制方法であって、
    分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物の存在下で免疫反応を行う工程を含む、前記方法。
  5. 糞便由来サンプル中の被検出物質をイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法における非特異反応抑制方法であって、（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む方法。
    （Ａ）下記テストストリップのサンプル供給部に、分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物及び緩衝液を含むサンプル希釈液ならびに糞便由来サンプルを供給する工程
    テストストリップ；
    少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二の抗体が固定化されている検出部を有する
    （Ｂ）サンプル中の検出対象物質をコンジュゲートと接触させる工程
    （Ｃ）サンプル中の検出対象物質とコンジュゲートの複合体を検出部において検出する工程
  6. 糞便由来サンプルが、乳幼児の糞便由来サンプルである請求項４又は５に記載の方法。
  7. 以下の構成（１）および（２）を含む、糞便由来サンプル用イムノクロマトグラフィー用検出キット。
    （１）少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であって前記コンジュゲート保持部分より下流側に、第二の抗体が固定化されている検出部を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップ
    （２）分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物及び緩衝液を含むサンプル希釈液
  8. 糞便由来サンプルが、乳幼児の糞便由来サンプルである請求項７に記載の検出キット。
  9. 分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物および緩衝液を含む免疫測定用の乳幼児糞便由来サンプル希釈液。
  10. 分子内に２以上のカルボキシ基を有する化合物および緩衝液を含むサンプル希釈液と、乳幼児糞便由来サンプルを接触させる工程を含む、乳幼児糞便由来サンプルの免疫測定における非特異反応を抑制するためのサンプル前処理方法。
     
     
     
     
      
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