WO2017217753A1 - 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속 균주 및 이의 용도 Download PDF

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이철호
김경심
김명희
이상준
장동호
박두상
황정환
김용훈
최동희
노정란
이인복
최영근
서윤정
최정현
고준
박혜연
유영경
이문수
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한국생명공학연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a strain of Agatobaculum genus having a prophylactic or therapeutic effect of degenerative brain disease and its use.
  • acetylcholine degrading inhibitors only improve the decreased cognitive ability and are unable to cure the underlying cause of Alzheimer's disease.
  • the long-term administration of the drug is required, in the case of the medicines have problems such as accompanied by various side effects, including liver toxicity, vomiting, loss of appetite. Therefore, the development of new therapeutics that can prevent the progression of degenerative brain disease is an urgent task.
  • beta amyloid consists of about 40 amino acids that are believed to be the underlying cause of Alzheimer's disease.
  • gamma secretase inhibitors mainly dominated.
  • basic research on Alzheimer's disease has been conducted to some extent, but there is almost no case in developing dementia treatment itself.
  • Korean Patent No. 1476236 discloses' lactic acid bacteria having prophylactic and / or therapeutic activity of aging and dementia '
  • Korean Patent No. 1211331' new tacrolimus derivative, for neuroprotective treatment comprising the derivative A composition, an immunosuppressive composition comprising the derivative, a production method of the derivative, and a production strain of the derivative are disclosed, but as in the present invention, the genus Agatobaculorum has a prophylactic or therapeutic effect of degenerative brain disease. Strain and its use 'is not known at all.
  • the present invention has been made by the above-mentioned demands, which can effectively suppress the development and exacerbation of degenerative brain diseases such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease, which are recently increasing in modern people, and have no side effects for treating them.
  • degenerative brain diseases such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease
  • a new preventive or therapeutic agent for degenerative brain diseases using a substance that is not toxic to the human body when ingested a new agatobaculorum butyric constitutions ( Agathobaculum) is an intestinal microorganism.
  • butyriciproducens SR79 strain improves motor impairment in Parkinson's disease animal model, has an inhibitory effect on encephalopathy response, inhibits the expression of degenerative brain disease markers such as Alzheimer's disease, and improves cognitive ability and memory
  • the present invention was completed by confirming that it can be used for preventing or treating degenerative brain disease and improving brain cognitive memory.
  • the present invention provides a strain Agagobaculum sp. Having a prophylactic or therapeutic effect of degenerative brain disease.
  • the present invention is a degenerative brain disease prevention comprising at least one selected from the group consisting of a strain, the strain-derived vesicles, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture as an active ingredient. Or it provides a pharmaceutical composition for treatment.
  • the present invention is a degenerative brain disease containing at least one selected from the group consisting of the strain, the strain-derived vesicles, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture as an active ingredient. It provides a health functional food composition for prevention or improvement.
  • the present invention is a degenerative brain disease containing at least one selected from the group consisting of the strain, the strain-derived vesicles, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture as an active ingredient.
  • a feed composition for prevention or improvement is provided.
  • Intestinal microorganism Agathobaculum butyriciproducens SR79 strain of the present invention has an inhibitory effect on the encephalitis response and has motor control ability, cognitive ability and cognitive ability in animal models with degenerative brain diseases such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease. Since it shows a memory improving effect, it can be usefully used as a food, medicine or feed for the prevention or treatment of brain diseases including Alzheimer's, Parkinson's disease, mild cognitive impairment, etc., it is very useful in related industries.
  • A gas regulator
  • B gas line
  • D gas cylinder trolley
  • E pressurized anaerobic jar ( Oxoid)
  • F palladium (catalyst)
  • Figure 2 is an intestinal microorganism SR79 strain according to the present invention in the mouse (B6C3-Tg (APPswe / PSEN1dE9) 85DboJ, JAX, 004462) overexpression of APP and PSEN1 genes, which are genes related to Alzheimer's disease in the brain, develop Alzheimer's disease It is expressed as a discriminant index of the cognitive function and memory improvement effect in the novel object recognition test (NORT, A is a new object recognition time, B is a new object recognition number) by administering a.
  • B6C3-Tg APPswe / PSEN1dE9 85DboJ, JAX, 004462
  • Figure 3 is a mouse induced cognitive impairment by administering LPS, the effect of improving cognitive function and memory in a novel object recognition test (NORT) by administering the strain SR79 strain intestinal microorganism according to the present invention Is a graph.
  • the vertical axis shows the cognitive function and memory improvement effect in the new object recognition time as a discriminant index.
  • Figure 4 is a mouse induced cognitive impairment by administering LPS (lipopolysaccharide), improve the spatial perception ability and short-term memory in the Y maze test by administering the strain SR79 strain, the enteric microorganism according to the present invention
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 5 shows that in the brain, APP and PSEN1 genes related to Alzheimer's disease are overexpressed, and in the mouse (B6C3-Tg (APPswe / PSEN1dE9) 85DboJ, JAX, 004462) in which Alzheimer's disease develops, SR79 strain which is an enteric microorganism according to the present invention.
  • A and graph (B) showing the results of performing immunostaining on hyperactivated astrocytes in the brain by administering to.
  • FIG. 6 shows SR79 in which the expression of ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1), a marker for recognizing the activity of microglia, responsible for the inflammatory response in the cerebral cortex of an LPS-administered mouse model It is a graph showing the decrease by administration of the strain.
  • Iba-1 ionized calcium-binding adapter molecule 1
  • p-APP phosphorylated amyloid precursor protein
  • FIG. 9 is a 30-minute analysis of inhibition of the number of dextroamphetamine-induced rotational movements following treatment of the intestinal microorganism SR79 strain in a Parkinson's disease mouse animal model that induced dopaminergic neuron-specific cell death in the brain with 6-OHDA. It is a graph in sum.
  • the present invention is a genus Agathobaculum having a prophylactic or therapeutic effect of degenerative brain disease sp.) provide strains.
  • the agatobaculorum strain is Agatobakulum butsiprodusense ( Agathobaculum butyriciproducens ), and preferably, the agatobacoolum butyric constitutionsense may be an agatobacoolum butyric yieldsense SR79 strain having an accession number of KCTC13036BP, but is not limited thereto.
  • Agagobaculum butyriciproducens SR79 strain according to the present invention is an absolute anaerobic microorganism directly isolated from the intestine of the present inventors in healthy Korean intestines, and new genus and species different from the previously reported standard strains.
  • degenerative brain disease in the present invention is a disease that occurs in the brain among degenerative diseases that occur with age, but is not limited thereto.
  • degenerative brain diseases are known to be caused by protein aggregation due to neurodegeneration and genetic and environmental factors caused by aging, but neurons are killed, but the exact cause is not known.
  • prevention in the present invention means any action that inhibits or delays the onset of degenerative brain disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention
  • treatment means degenerative brain by the administration of the pharmaceutical composition
  • Suspicion of disease and onset of disease means any action that improves or beneficially alters the symptoms of the individual.
  • the prevention or treatment of the degenerative brain disease can be achieved by the microbial strain having an effect of inhibiting phosphorylation and inflammatory activity of amyloid precursor protein, and behaviorally, Parkinson's disease. And it can be achieved by exhibiting the effects of motor control disorders and cognitive ability and memory in animal models with degenerative brain diseases such as Alzheimer's disease.
  • the present invention is a degenerative brain disease containing at least one selected from the group consisting of the strain, the strain-derived vesicles, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture as an active ingredient.
  • a prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition is provided.
  • the composition has an inhibitory effect on movement disorder due to dopaminergic neuronal cell death, or an inhibitory effect on brain inflammatory response, or It may have a cognitive ability and memory improvement effect, but is not limited thereto.
  • dopamine in the present invention is a neurotransmitter that transmits a signal in the brain and is known to be related to exercise and movement.
  • dopaminergic neuron death in the present invention refers to the loss or degeneration of dopaminergic neurons concentrated in the substantia nigra pars compacta of the midbrain. It is known that it can be produced by injecting 6-OHDA (6-hydroxyldopamine).
  • neuroinflammation in the present invention is an important factor that causes degenerative brain disease.
  • the inflammatory cells are excessively activated in the brain, the secretion of inflammatory cytokines increases, and the activation of such brain inflammatory responses is increased. It is known that degenerative brain diseases such as brain cell loss and Parkinson's disease and Alzheimer's disease can be induced.
  • the SR79 strain provided in the present invention was confirmed to have an inhibitory effect on the brain inflammatory response. It can also improve motor control, cognitive and memory in animal models with degenerative brain diseases such as Parkinson's and Alzheimer's.
  • the cognitive impairment of the mouse according to the treatment of the microorganism strain of the present invention and the cognitive function for the new object in the Alzheimer's dementia mouse animal model (Fig. 2 and 3) and Y-shaped maze
  • the improvement of spatial perception and short-term memory was confirmed (FIG. 4).
  • the expression of the activated microglia marker Iba-1 and the GFAP marker astroglia in the cerebral cortex were significantly reduced by SR79 administration (Figs. 5 and 6), and the control cerebral In the cortex, the expression of phosphorylated amyloid precursor protein (p-APP) in Alzheimer's dementia was significantly increased by LPS, indicating that the risk of developing Alzheimer's disease was increased.
  • p-APP phosphorylated amyloid precursor protein
  • the intestinal microorganism SR79 strain has an inhibitory effect on the brain inflammatory response, and has an effect of improving motor control, cognitive ability and memory in animal models with degenerative brain diseases such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. Can be used.
  • Carriers, excipients and diluents which may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Various compounds or mixtures, including calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. .
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, in the strain or the vesicles derived from the strains. , Sucrose or lactose, gelatin and the like are mixed and prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, wherein the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention is for preventing or treating a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical prophylaxis or treatment.
  • Sufficient amount means an effective dose level means the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration of the composition of the invention used, the route of administration and the rate of excretion, The duration of treatment, factors including drugs used in combination or coincidental with the composition of the invention used, and other factors well known in the medical art can be determined.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be, for example, administered to the mammal including humans at 1.0 ⁇ 10 9 CFU for one day.
  • the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered once a day or several times in divided doses.
  • the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention provides a method for preventing degenerative brain disease, comprising administering the pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount to a subject having or likely to develop a degenerative brain disease Or provide a method of treatment.
  • the composition can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease, the composition can be used for preventing or treating degenerative brain disease.
  • the term "individual" of the present invention includes, without limitation, mammals including rats, livestock, humans, etc., which may or may not develop degenerative brain diseases.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered through a route such as oral administration, rectal administration and the like, and may also be administered by other routes depending on the purpose.
  • oral administration may denature the intestinal microbial SR79 strain by gastric acid
  • the oral composition should be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device in which the active substance may migrate to the target cell.
  • the present invention is a degenerative brain disease containing at least one selected from the group consisting of the strain, the strain-derived vesicles, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture as an active ingredient. It provides a health functional food composition for prevention or improvement.
  • the strain is as described above, and may be added to a dietary supplement for the purpose of preventing or improving degenerative brain disease.
  • the strain or its culture solution may be added as it is or used together with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the food (or nutraceutical) of the present invention may further include ingredients that are commonly added during food production and are food acceptable.
  • ingredients that are commonly added during food production and are food acceptable.
  • citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, and the like may be further included.
  • the amount that may be included as an active ingredient of the food (or health functional food) according to the present invention may be appropriately selected according to the age, sex, weight, condition, and symptoms of the disease of a person who wants to prevent or improve degenerative brain disease. Preferably it is included in about 0.01 g to 10.0 g per day of adult standards, by ingesting a food having such a content can be obtained to prevent or improve the degenerative brain disease.
  • the present invention provides a method for producing a microbial agent for preventing or treating degenerative brain disease, comprising culturing the strain.
  • the method of culturing the strain of the present invention may be cultured according to methods commonly used in the art.
  • the microbial agent for preventing or treating degenerative brain disease of the present invention is a genus Agathobaculum as an active ingredient. sp.) strains, preferably Agathobaculum butyriciproducens strains, most preferably Agatobaculum butyiciproducens strains, and most preferably Agatobaculum butyiciproducens SR79 strains having an accession number of KCTC13036BP.
  • the microbial agent for preventing or treating degenerative brain disease according to the present invention may be prepared as a solution, powder, suspension, dispersion, emulsion, oily dispersion, paste, dust, propellant or granule, but is not limited thereto.
  • the present invention is one or more selected from the group consisting of the strain, the strain-derived endoplasmic reticulum, the culture of the strain, the concentrate of the culture, the dried product of the culture and the extract of the culture. It provides a feed composition for preventing or improving degenerative brain disease.
  • the strain is as described above, and may be added to the feed composition for the purpose of preventing or improving degenerative brain disease.
  • the feed composition may include a feed additive.
  • the feed additive of the present invention corresponds to a feed supplement in the Feed Control Act.
  • feed in the present invention may refer to any natural or artificial diet, one meal, or the like or a component of the one meal for the animal to eat, ingest and digest.
  • the kind of the feed is not particularly limited, and may be used a feed commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the feed may include plant feeds such as cereals, fruits, food processing by-products, algae, fibres, pharmaceutical by-products, oils, starches, gourds or grain by-products; And animal feeds such as proteins, minerals, fats and oils, minerals, fats and oils, single cell proteins, zooplankton or foods. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the composition of the DSM 104 medium is shown in Table 1 below.
  • One Cysteine-HCl x H 2 O 0.5 Resazurin 0.001 Salt solution (see Table 2 below) 40 ml Haemin solution (see below) 10 ml Vitamin K 1 solution (see below) 0.2 ml
  • the vitamin K1, haemin solution and the cysteine are added after the medium has been boiled and cooled under CO 2 . Adjust pH 7.2 using 8N NaOH. Distribute under N 2 , and autoclave.
  • Haemin solution Dissolve 50mg of Hamin in 1ml 1N NaOH.
  • Vitamin K 1 Solution Dissolve 0.1ml Vitamin K 1 in 20ml 95% Ethanol.
  • Salt solution Composition g / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O 0.25 MgSO 4 7 H 2 O 0.5 K 2 HPO 4 One KH 2 PO 4 One NaHCO 3 10 NaCl 2
  • a total of 160 colonies were isolated from Korean female fecal samples by a single colony separation method, and molecular biological identification of these isolated strains was performed by colony PCR. The identified strains were identified as 34 different species in total.
  • One week with high butyrate production activity (> 18 mM) was selected for these 160 Korean intestinal absolute anaerobic microorganisms and named SR79.
  • the SR79 strain named in the present invention is a novel anaerobic microorganism which is directly classified by the present inventors into a new genus and species different from the previously reported standard strain as an absolute anaerobic microorganism isolated from healthy Korean intestine.
  • Physiological / biochemical microorganisms were identified, and their microorganisms were named Agathobaculum butyriciproducens SR79, and the SR79 strain isolated from the present invention was proposed by the present inventors. It was recognized as the standard strain for the genus and species for Agatobaculum butyriciproducens .
  • Example 3 Verification of the efficacy of SR79 strain on degenerative brain disease and brain cognitive memory
  • mice animal models B6C3-Tg (APPswe / PSEN1dE9) 85DboJ, JAX, 004462) in which Alzheimer's disease is overexpressed in the brain of mice, the genes related to Alzheimer's disease It was.
  • the mouse animal model is characterized by beta amyloid deposition in the brain from 5 months of age, characterized by Alzheimer's specific cognitive dysfunction, a sterile (Specific pathogen free (SPF)) environment maintained at 22 ⁇ 24 °C Sterilized feed and water intake freely in the breeding facility, and was maintained while maintaining a 12-hour day and night cycle.
  • SPF Specific pathogen free
  • the experimental animal group was divided into a group of non-Tg mice not overexpressing APP / PSEN1 and a group of Alzheimer's mice overexpressing APP / PSEN1.
  • the SR79 strain was divided into experimental groups administered at a concentration of 2.0 ⁇ 10 8 CFU.
  • the number of control and experimental groups in the Alzheimer's diseased mouse group overexpressing the APP / PSEN1 was performed using 12 animals each.
  • the group of mice began to be administered to 5 months of age mice, performed a novel object recognition test (NORT) for a new object after vehicle or SR79 strain administration for 9 weeks and brain of the mouse after administration for 13 weeks
  • the immunostaining was performed to determine the activity of astrocytes in the brain.
  • mice Eight weeks-old male C57BL / 6J mice were used to orally administer 25% glycerol / PBS in the control group and the new microbial SR79 strain grown in the intestine-derived DSM 104 solid medium at 2.0 ⁇ 10 8 CFU daily for 1 week orally.
  • the cognitive impairment and Alzheimer's dementia model of mice were induced by intraperitoneally administering LPS (lipopolysaccharide) to SR79 strain and control group at a concentration of 250 ⁇ g / kg daily for 1 week.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the control group 25% glycerol / PBS administration group was divided into LPS administration group and LPS non-administration group was used in the experiment, the number of mice per group was assigned to 8 mice.
  • the mice were allowed to freely consume sterilized feed and water in a breeding facility in a specific pathogen free (SPF) environment where the temperature was maintained at 22-24 ° C., and were maintained while maintaining a 12-hour day and night cycle.
  • a novel object recognition test (NORT) was performed. Specifically, the APP / PSEN1 overexpressing mouse model of Example 3-1 was administered with control and SR79 strain for 9 weeks, followed by NORT over two days. As shown in 3-2, in the case of LPS administered cognitive impairment model mouse LPS was administered for one week and NORT was performed over two days from the next day. On the first training day, the mice were placed in 41.5 cm x 20 cm x 21.5 cm white boxes and allowed to move freely for 10 minutes. After 10 minutes of adaptation as described above, they were returned to the original cage.
  • FIG. 2A Alzheimer's-onset mice overexpressing APP / PSEN1 were found to have reduced the time (FIG. 2A) and the frequency (FIG. 2B) showing interest in new objects significantly compared to normal mice. It was confirmed that the new object search time and the number of searches significantly increased (Students t -test, ** p ⁇ 0.01) (FIG. 2).
  • the LPS non-administered group was well aware of both the new square cylinder block and the familiar cylindrical cylinder block, whereas the SR79 strain untreated control group of mice treated with LPS for a week showed cognitive impairment.
  • the search time for was significantly reduced, and it was confirmed that it was not able to distinguish between a familiar object and a new object (Students t -test, ** p ⁇ 0.01) (FIG. 3).
  • interest in new objects was much higher than in the control group not administered SR79 strain for LPS administration, and it was confirmed that the distinction between familiar and new objects was clearly distinguished (Students t- test, ** p ⁇ 0.01) (FIG. 3).
  • the search time is calculated by (time of interest in new objects-time of interest in familiar objects) / (time of interest in new objects + time of interest in familiar objects + time of interest in new objects) Indicated.
  • a Y-maze test was performed. Specifically, the Y-maze test is an experiment to determine whether it helps the spatial perception and short-term memory recovery of experimental animals.
  • the Y-maze test apparatus is a transparent acrylic plate (width 10). cm, 40 cm in height and 25 cm in height) is composed of a closed maze of Y-shaped, each maze is arranged at a constant angle of 120 degrees to each other. The test was conducted for 10 minutes, and each labyrinth was designated as A, B, and C regions, and experimental experiments were started in one region to freely explore the maze.
  • FIG. 5A is a photograph showing the results of immunostaining for activated astrocytes in the brain of an Alzheimer's disease-induced mouse animal model by administration of the SR79 strain
  • FIG. 5B shows a vehicle (control) and SR79 strain (SR).
  • Iba-1 a marker for the activity of microglia responsible for the brain inflammatory response in the cerebral cortex of LPS model mice, was investigated to investigate the inhibitory effect of SR79 in the LPS-administered mouse model.
  • Western blots were performed using calcium-binding adapter molecule 1) antibodies (FIG. 6).
  • the cerebral cortical protein of the LPS-administered mouse model was isolated, and Western blot was performed for the phosphorylation of APP (Amyloid precursor protein) using pAPP antibody.
  • 6- OHDA 6- hydroxyldopamine Parkinson's disease-induced experimental group by administration
  • mice 9-week-old male C57BL / 6J mice were used. The mice were allowed to freely consume sterilized feed and water in a breeding facility in a specific pathogen free (SPF) environment where the temperature was maintained at 22-24 ° C., and were maintained while maintaining a 12-hour day and night cycle.
  • the experimental group received oral administration of 25% glycerol / PBS in the control group and the new enteric microorganism SR79 strain from the intestine daily at a concentration of 2.0 x 10 8 CFU for 1 week, followed by 6-OHDA (6-hydroxyldopamine) to the brain. Injection induced dopaminergic neuronal death.
  • the populations of the control and experimental groups were performed using 5 and 6 animals, respectively.
  • mice were anesthetized using a mixture of ketamine and rompun, and experiments were performed.
  • the dopaminergic cell loss of the black matter region of the brain which corresponds to the progression of early Parkinson's disease, was lost.
  • 25 mg / kg of desipramine was intraperitoneally administered 30 minutes prior to the administration of 6-OHDA, and a total of 6 ug of 6-OHDA was injected into the striatum of the left brain.
  • 6-OHDA was administered directly to the brain, the surgical site was sutured and disinfected, and then the body temperature of the mouse was maintained at 37 ° C. warmer.

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Abstract

본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 장내 미생물 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79 균주는 뇌염증 반응에 대한 억제 효과를 지니고 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환을 지닌 동물 모델에서 운동조절 능력, 인지 능력 및 기억력 개선효과를 나타내므로, 알츠하이머, 파킨슨병, 경도 인지장애 등을 포함하는 뇌질환의 예방이나 치료를 위한 식품, 의약품 또는 사료로 유용하게 사용될 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속 균주 및 이의 용도
본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
현대인에게 기억력은 급변하는 생활에서 그 중요성이 증대되고 있으며, 사회적으로 학습량이 많은 청소년에서부터 노년에 이르기까지 주요 관심 대상이 되고 있다. 퇴행성 뇌질환은 기억력 감퇴를 가져오는 것으로 알려져 있으며, 뇌염증 반응이 알츠하이머 증후군, 파킨슨 증후군, 헌팅턴 증후군과 같은 중추신경계의 퇴행성 뇌질환의 중요한 요인으로 밝혀졌다(Jin DQ et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 331: 1264-1269, 2005; Lim CS et al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29: 1212-1216, 2006).
최근 노인 인구의 증가 등에 따라 치매와 같은 퇴행성 뇌질환 환자가 급증하여, 치매 등으로 인해 저하된 인지기능 및 학습기능을 개선시키고 향상시키는 다양한 치료전략을 수립하고 효과적인 약물을 개발하고자 하는 노력이 시도되고 있다. 현재까지 개발된 기억력 개선 약물들에는 아세틸콜린 전구체(acetylcholine precursor), 수용체 활성제(Receptor agonist), 아세틸콜린 분해 억제제(Acetylcholine esterase inhibitor) 등이 있다. 그러나 아직까지 퇴행성 뇌질환의 근본적인 발병 원인을 치료할 수 있는 치료제는 개발되어 있지 않으며, 일반적인 치료제로서 사용 가능한 것으로는 아세틸콜린 분해 억제제인 화이자사의 아리셉트(Aricept), 노바티스사의 엑셀론(Exelon), 그리고 얀센사의 레미닐(Reminyl)과 최근에 미국 FDA로부터 허가를 받은 NMDA 수용체(N-methyl-D-aspartate receptor)의 길항제 기전의 룬드벡사의 에빅사(Ebixa: Memantine)가 있다. 그러나 아세틸콜린 분해 억제제의 경우는 감퇴된 인지 능력을 개선해 줄 뿐, 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인을 치료하지는 못하는 한계가 있다. 또한, 단지 일부 환자의 경우에서 일시적인 증세 완화 효과를 보이며, 그 약효가 오래 지속되지 못하므로 근본적인 치료 효과를 기대하기는 어려운 것으로 알려져 있다. 이 외에도 퇴행성 뇌질환의 특성상 약물의 장기 복용을 요하게 되는데, 상기 의약품들의 경우 간 독성, 구토, 식욕감퇴를 비롯한 여러 가지 부작용을 수반하는 등의 문제점이 있다. 따라서 퇴행성 뇌질환의 진행 과정을 막아 줄 수 있는 새로운 치료제의 개발이 시급한 과제가 되고 있다. 이를 위해서 많은 다국적 제약회사들이 이 분야에 대한 연구 개발에 막대한 투자를 하고 있으며, 특히 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인으로 추정되고 있는 40여 개의 아미노산으로 구성된 베타 아밀로이드(β-amyloid)의 생성량을 감소시키는 베타 또는 감마 시크리테아제(secretase) 저해제의 개발이 그 주종을 이루고 있다. 국내의 경우 알츠하이머 질환에 대한 기초 연구는 어느 정도 이루어지고 있으나 치매 치료제 개발 그 자체의 경우는 거의 전무한 실정이라고 여겨진다.
최근 연구 결과들은 장내 미생물이 사람의 장 건강 및 장 질환은 물론이고 뇌기능 조절 및 뇌질환의 발병에 적극적으로 영향을 주는 것이 밝혀지고 있다. 그러나 장내 미생물인 신규한 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79 균주에 의한 뇌질환 예방 또는 치료효과 및 뇌인지 기억력에 대한 영향은 알려진 바 없다.
한편, 한국등록특허 제1476236호에서는 '노화 및 치매의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 유산균'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1261131호에서는 '신규 타크롤리무스 유도체, 상기 유도체를 포함하는 신경 보호용 조성물, 상기 유도체를 포함하는 면역 억제용 조성물, 상기 유도체의 생산 방법 및 상기 유도체의 생산 균주'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 최근 현대인들에게서 발병이 높아지고 있는, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환의 발병 및 악화를 효과적으로 억제할 수 있고, 이를 치료하기 위한 부작용이 없는 안전한 약물로서, 섭취 시에도 인체에 독성을 나타내지 않는 물질을 이용한 새로운 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 장내 미생물인 신규한 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79 균주가 파킨슨병 동물모델에서 운동장애를 개선하고, 뇌염증 반응에 대한 억제 효과를 지니며, 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환 마커의 발현을 억제하고 인지 능력 및 기억력 개선 효과가 있음을 밝혀냄으로써, 이를 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 용도 및 뇌인지 기억력 개선 용도로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속(Agathobaculum sp.) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 장내 미생물 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79 균주는 뇌염증 반응에 대한 억제 효과를 지니고 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환을 지닌 동물 모델에서 운동조절 능력, 인지 능력 및 기억력 개선효과를 나타내므로, 알츠하이머, 파킨슨병, 경도 인지장애 등을 포함하는 뇌질환의 예방이나 치료를 위한 식품, 의약품 또는 사료로 유용하게 사용될 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명에서 사용된 건강한 한국인 임산부 분변 시료로부터 채취한 임상시료의 절대혐기적 보관 및 운반을 위한 모바일 시료 채취장비를 나타낸다. A: 가스 조절기, B: 가스 라인, C: 알루미늄 가스 실린더 (혼합가스 N2:H2:CO2=86:7:7), D: 가스 실린더 트롤리, E: 가압형 혐기 자(jar) (Oxoid), F: 팔라디움(촉매제)
도 2는 뇌에서 알츠하이머병과 관련된 유전자인 APP와 PSEN1 유전자가 과발현되어, 알츠하이머병이 발병되는 마우스(B6C3-Tg(APPswe/PSEN1dE9)85DboJ, JAX, 004462)에서, 본 발명에 따른 장내 미생물인 SR79 균주를 투여하여 새로운 사물에 대한 인지테스트(novel object recognition test; NORT, A는 새로운 물체 인지 시간, B는 새로운 물체 인지 횟수)에서의 인지 기능 및 기억력 개선 효과를 변별도 지수(discrimination index)로 나타낸 것이다.
도 3은 LPS를 투여하여 인지기능 손상을 유발시킨 마우스에서, 본 발명에 따른 장내 미생물인 SR79 균주를 투여하여 새로운 사물에 대한 인지테스트(novel object recognition test; NORT)에서의 인지 기능 및 기억력 개선 효과를 나타낸 그래프이다. 세로축은 새로운 물체 인지 시간에서의 인지 기능 및 기억력 개선 효과를 변별도 지수(discrimination index)로 나타낸 것이다.
도 4는 LPS(lipopolysaccharide)를 투여하여 인지기능 손상을 유발시킨 마우스에서, 본 발명에 따른 장내 미생물인 SR79 균주를 투여하여 Y-미로 테스트(Y maze test)에서의 공간지각능력 및 단기 기억력 저하 개선 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 뇌에서 알츠하이머병과 관련된 유전자인 APP와 PSEN1 유전자가 과발현되어, 알츠하이머병이 발병되는 마우스(B6C3-Tg(APPswe/PSEN1dE9)85DboJ, JAX, 004462)에서, 본 발명에 따른 장내 미생물인 SR79 균주를 투여하여 뇌에서 과활성화된 성상 신경교세포 (astrocyte)에 대한 면역염색을 수행한 결과를 나타내는 사진(A) 및 그래프 (B)이다.
도 6은 LPS 투여 마우스 모델의 대뇌피질에서 뇌염증 반응을 담당하고 있는 미세교세포 (microglia)의 활성을 알아볼 수 있는 마커인 Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1)의 발현이 장내 미생물인 SR79 균주의 투여에 의해 감소됨을 나타낸 그래프이다.
도 7은 LPS 투여 마우스 모델의 대뇌 피질에서는 알츠하이머성 치매에서 증가되는 인산화된 p-APP(amyloid precursor protein)의 발현이 현저히 증가하는데 LPS와 SR79 균주를 함께 투여한 그룹의 경우 p-APP가 증가되지 않은 것을 나타내는 그래프이다.
도 8은 6-OHDA로 뇌의 도파민성 신경세포 특이 세포사멸을 유발한 파킨슨병 마우스 동물 모델에서, 장내 미생물 SR79 균주의 처리에 따른, 덱스트로 암페타민 유도 회전 운동 횟수가 억제되는 것을 5분 단위로 나타낸 그래프이다.
도 9는 6-OHDA로 뇌의 도파민성 신경세포 특이 세포사를 유발한 파킨슨병 마우스 동물 모델에서, 장내 미생물 SR79 균주의 처리에 따른, 덱스트로 암페타민 유도 회전 운동 횟수가 억제되는 것을 30분 동안 분석한 합으로 나타낸 그래프이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속(Agathobaculum sp.) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 아가토바쿨룸 속 균주는 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens)일 수 있고, 바람직하게는 상기 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스는 기탁번호가 KCTC13036BP인 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스 SR79 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79 균주는 본 발명자가 건강한 한국인 장내에서 직접 분리한 절대혐기성 미생물로서 기존에 보고된 표준균주와는 다른 새로운 속(Genus) 및 종(Species)으로 분류되는 신규 미생물임을 분자생물학적, 생리/생화학적 미생물 동정방법으로 확인하였고, 이의 미생물명을 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79로 제안하였는데, 본 발명에서 분리한 SR79 균주에 대해서는 본 발명자가 제안한 새로운 학명인 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens)에 대한 속 및 종에 대한 표준균주로 국제저널 (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)에서 수락하였다.
이들 신규 분리 미생물 균주인 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79 균주는 퇴행성 뇌질환 관련 질환 등의 예방 또는 치료의 용도에 대해 개시된 바는 없으며, 본 발명자들에 의해 최초로 알츠하이머, 파킨슨병 등을 포함하는 퇴행성 뇌질환 관련 질환의 예방 또는 치료 및 뇌인지 기억력 개선의 용도가 있음이 규명되었다. 기존의 논문 보고(Pharmacology & Therapeutics 2016. 158: 52-62)에 의하면 알츠하이머나 파킨슨 등의 치매환자의 장내 미생물이 건강인의 장내 미생물과 다르다는 보고는 있었으나, 건강인의 장내 절대혐기성 미생물에 의해 알츠하이머, 파킨슨 등의 치매에 예방 또는 치료효과를 실질적으로 입증한 특허나 논문은 본 발명이 전세계적으로 처음 보고하는 것으로 이는 인체 공생미생물에 의한 치매 예방 또는 치료제로서의 개발 가능성을 세계최초로 밝힌 것이다.
본 발명에서의 용어 "퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)"이란, 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중 뇌에서 발생하는 질환으로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병, 경도 인지장애, 뇌막염, 중풍, 치매, 헌팅턴병 또는 크로이츠펠트-야콥병 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 말한다. 퇴행성 뇌질환은 노화에 따른 신경 퇴화와 유전적, 환경적 요인들로 인해 단백질이 응집돼 신경세포가 사멸해 야기되는 것으로 알려져 있지만, 아직 정확한 원인은 밝혀져 있지 않은 질환이다.
본 발명에서의 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 뇌질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 상기 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료는 상기 미생물 균주에 의해, 아밀로이드 전구 단백질 (amyoid precursor protein)의 인산화 억제와 뇌염증작용 억제 효과를 가지는 것에 의해 달성될 수 있으며, 행동학적으로, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환을 지닌 동물 모델에서 운동조절장애와 인지 능력 및 기억력 개선 효과를 나타내는 것에 의해 달성되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 조성물은 도파민성 신경세포 사멸에 의한 운동장애의 억제 효과를 가지거나, 뇌 염증반응에 대한 억제 효과를 가지거나, 또는 인지 능력 및 기억력 개선 효과를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 용어 "도파민(dopamine)"이란, 뇌 속에서 신호를 전달하는 신경전달 물질로, 운동 및 움직임과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서의 용어 "도파민성 신경세포사"란, 중뇌부의 흑색질 치밀부(substantia nigra pars compacta)에 밀집된 도파민성 신경세포의 소실 또는 변성을 의미하며, 도파민성 신경세포사가 유도된 파킨슨병 동물 모델은 6-OHDA(6-hydroxyldopamine)을 주입함으로써 제작할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서의 용어 "뇌 염증반응 (neuroinflammation)"이란, 퇴행성 뇌질환을 일으키는 중요한 요인으로서, 뇌에서 염증세포가 과하게 활성화되면 염증 유발성 사이토카인의 분비가 많아지고 이러한 뇌 염증반응의 과활성화에 의해 뇌세포 소실 및 파킨슨병, 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환이 유발될 수 있는 것으로 알려져 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 SR79 균주는 뇌 염증반응에 대한 억제 효과를 지님을 확인하였다. 또한, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환을 지닌 동물 모델에서 운동조절 능력, 인지 능력 및 기억력을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 미생물 균주의 처리에 따른, 마우스의 인지 손상 및 알츠하이머성 치매 마우스 동물 모델에서 새로운 물체에 대한 인지기능 개선(도 2 및 도 3)과 Y자 미로에 대한 공간지각능력 및 단기 기억력의 개선을 확인하였다(도 4). 또한, 대뇌 피질에서 활성화된 미세 신경교세포 마커인 Iba-1의 발현과 성상 신경교세포의 마커인 GFAP 발현이 SR79 투여에 의해 현저히 감소된 것을 확인하였으며(도 5 및 도 6), 아울러, 대조군의 대뇌 피질에서는 알츠하이머성 치매에서 증가되는 인산화된 amyloid precursor protein (p-APP)의 발현이 LPS 투여에 의해 현저히 증가하여 알츠하이머 발병 위험성이 높아지는 것으로 나타난 반면, LPS와 SR79 균주를 함께 투여한 그룹의 경우 p-APP가 증가되지 않은 것으로 관찰하였다(도 7). 6-OHDA로 뇌의 도파민성 신경세포 특이 세포사멸을 유발한 파킨슨병 마우스 동물 모델에서의 덱스트로 암페타민 유도 회전 행동을 분석한 결과, 상기 미생물 균주에 의해 회전 행동이 현저히 감소됨을 확인하였다(도 8과 도 9).
따라서, 상기 장내 미생물 SR79 균주는 뇌 염증반응에 대한 억제 효과를 지님을 확인하였으며, 파킨슨병 및 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환을 지닌 동물 모델에서 운동조절 능력, 인지 능력 및 기억력 개선효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 상기 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 균주 또는 상기 균주 유래 소포체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1.0×109 CFU로 투여하는 것이 좋다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 퇴행성 뇌질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 상기 장내 미생물 SR79 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있으므로, 상기 조성물은 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란 퇴행성 뇌질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 퇴행성 뇌질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 경구 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여할 수 있으며 경우에 따라 목적에 따라 다른 경로로도 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 장내 미생물 SR79 균주가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같으며, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가할 수 있다.
상기에서 언급한 본 발명의 상기 균주 또는 이의 배양액 등을 건강기능식품 조성물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 식품(또는 건강기능식품)은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 식품(또는 건강기능식품)의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 식품을 섭취함으로써 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.
본 발명의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 미생물 제제는 유효성분으로서 아가토바쿨룸 속(Agathobaculum sp.) 균주, 바람직하게는 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) 균주, 가장 바람직하게는 기탁번호가 KCTC13036BP인 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스 SR79 균주를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 분사제 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같으며, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선을 목적으로 사료 조성물로 첨가할 수 있다. 상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.
본 발명에서 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 건강한 한국인 임산부 분변 시료 채취
충남대병원 내분비과에 정기검진을 받기 위해 내원한 건강한 한국인의 동의를 받아 이들의 분변 시료를 채취하였다. 분변을 채취한 후 살균된 50 mL 튜브에 넣고 뚜껑을 닫지 않은 채로 바로 가압형 혐기 자(jar) (3.5 L HP0011A, Oxoid, UK) 안에 넣고 혐기 자(jar)의 뚜껑을 닫았다. 그리고 질소:수소:이산화탄소 86:7:7의 비율로 섞인 혼합가스를 20분간 주입하여 혐기 자(jar) 내의 공기를 산소가 포함되지 않은 혼합가스로 대체하였다. 혐기 자(jar) 내에 남아 있는 미량의 산소는 혐기 자(jar) 내의 팔라디움 촉매와 수소가 반응하여 물로 환원되어 제거하였다. 이와 같은 장비의 구성은 도 1에 나타내었으며, 이는 본 발명자의 연구실에서 자체 제작하였고, 이를 채취한 임상시료의 절대혐기적 보관 및 운반을 위한 모바일 시료 채취장비라 명명하였다(도 1).
실시예 2. 건강한 한국인 여성 분변 시료에서 절대혐기성 미생물 분리
상기 실시예 1에서 설명한 방법으로 채취한 시료는 시료 채취 직후 바로 한국생명공학연구원 실험실로 전달되어 시료가 들어있는 혐기 자(jar)를 혼합가스 (질소:수소:이산화탄소 = 86:7:7)로 채워져 있는 절대혐기챔버 (Coy Laboratory Product, USA) 안에 넣고 미리 준비한 절대혐기적으로 제조된 DSM 104 아가 플레이트 (1.5% w/v) 상에 DSM 104 배지로 희석한 분변 시료를 도말하여 37℃에서 48시간 배양 후 형성된 콜로니를 선발였다. DSM 104 배지의 조성은 아래 표 1과 같다.
Composition g/L
Trypticase peptone 5
Peptone 5
Yeast extract 10
Beef extract 5
Glucose 5
K2HPO4 2
Tween 80 1
Cysteine-HCl x H2O 0.5
Resazurin 0.001
Salt solution (하기 표 2 참고) 40 ml
Haemin solution (하기 참고) 10 ml
Vitamin K1 solution (하기 참고) 0.2 ml
The vitamin K1, haemin solution and the cysteine are added after the medium has been boiled and cooled under CO2. Adjust pH7.2 using 8N NaOH. Distribute under N2, and autoclave.
해민(Haemin) 용액 : 1ml 1N NaOH에 50㎎ 해민을 녹임
비타민 K1 용액 : 20ml 95% 에탄올에 0.1ml 비타민 K1을 녹임
염 용액
Composition g/L
CaCl2·2H2O 0.25
MgSO4·7H2O 0.5
K2HPO4 1
KH2PO4 1
NaHCO3 10
NaCl 2
총 160 개의 콜로니를 한국인 여성 분변시료로부터 단일 콜로니 분리 방법을 통해 순수 분리하였으며, 콜로니 PCR을 통해 이들 분리된 균주의 분자생물학적 동정을 실시하였다. 동정된 균주는 총 34종의 서로 다른 종으로 확인되었다. 이들 분리된 160주의 한국인 장내 절대혐기성 미생물에 대하여 낙산(butyrate) 생산 활성 (>18 mM)이 높은 1주를 선정하고 이를 SR79라 명명하였다.
상기 본 발명에서 명명한 SR79 균주는 본 발명자가 건강한 한국인 장내에서 직접 분리한 절대혐기성 미생물로서 기존에 보고된 표준 균주와는 다른 새로운 속(Genus) 및 종(Species)으로 분류되는 신규 미생물임을 분자생물학적, 생리/생화학적 미생물 동정방법으로 확인하였고, 이들의 미생물명을 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79로 제안하였고, 본 발명에서 분리한 SR79 균주에 대해서는 본 발명자가 제안한 새로운 학명인 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens)에 대한 속 및 종에 대한 표준 균주로 인정받았다.
또한, 상기 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens) SR79 균주를 한국생명공학연구원에 2016년 6월 7일자로 기탁하였다.
실시예 3. 퇴행성 뇌질환 및 뇌인지 기억력에 대한 SR79 균주의 효능 검증
퇴행성 뇌질환과 뇌인지 기억력에 대한 SR79 균주의 효능을 검증하기 위하여, 파킨슨병 유도 동물 모델 및 알츠하이머병 발병 마우스 동물 모델을 이용하여 SR79 균주의 효능을 검증하고자 하였다.
3-1. APPswe 및 PSEN1 과발현 알츠하이머병 발병 마우스 동물 모델 실험 그룹 분석
마우스의 뇌에서 알츠하이머병과 관련된 유전자인 APPswe 및 PSEN1 유전자가 과발현되어, 알츠하이머병이 발병되는 마우스 동물 모델(B6C3-Tg(APPswe/PSEN1dE9) 85DboJ, JAX, 004462)을 대상으로 SR79 균주의 치료효과를 조사하였다. 상기 마우스 동물 모델은 생후 5개월부터 뇌에서 베타아밀로이드 침착 현상이 눈에 띄게 관찰되며, 알츠하이머 특이 인지기능장애를 나타내는 특징이 있으며, 22~24℃로 유지되는 무균 상태(Specific pathogen free; SPF) 환경의 사육시설에서 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취하게 하고, 12시간 주야 사이클을 유지하면서 사육하였다. 실험 동물 그룹은 APP/PSEN1을 과발현하지 않는 정상군(Non-Tg) 마우스 그룹과 APP/PSEN1을 과발현하는 알츠하이머 발병 마우스 그룹으로 분류하고, 상기 각 그룹을 매일 25% 글리세롤/PBS 투여 대조군과 신규 미생물 SR79 균주를 2.0×108 CFU 농도로 투여한 실험군으로 나누어 테스트하였다. 상기 APP/PSEN1을 과발현하는 알츠하이머 발병 마우스 그룹의 대조군과 실험군의 개체수는 각각 12마리를 사용하여 수행하였다. 이때, 상기 마우스 그룹은 5개월령의 마우스에 투여를 시작하였으며 9주 동안 비히클 또는 SR79 균주 투여 후에 새로운 사물에 대한 인지 기억력 테스트(novel object recognition test; NORT)를 수행하였으며 13주 동안 투여 후에 마우스의 뇌를 적출하여 뇌에서 성상 신경교세포 (astrocyte)의 활성을 알아보기 위한 면역염색을 진행하였다.
3-2. LPS ( lipopolysaccharide ) 투여에 의한 알츠하이머병 유도 실험 그룹 제작
8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하여 대조군에는 25% 글리세롤/PBS를, 실험군에는 장 유래 DSM 104 고체 배지에서 자란 신규 미생물 SR79 균주를 2.0×108 CFU 농도로 1주일 동안 매일 경구로 투여한 다음, SR79 균주 투여군과 대조군에 LPS(lipopolysaccharide)를 250 ㎍/kg의 농도로 추가적으로 1주일 동안 매일 복강투여하여 마우스의 인지기능 손상 및 알츠하이머성 치매 모델을 유도하였다. 이때, 대조군인 25% 글리세롤/PBS 투여 그룹은 다시 LPS 투여 그룹과 LPS 미투여 그룹으로 나누어 실험에 사용하였으며, 그룹 당 마우스 수는 8마리를 배정하였다. 상기 마우스는 온도가 22~24℃로 유지되는 무균 상태(Specific pathogen free; SPF) 환경의 사육시설에서 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취하게 했으며, 12시간 주야 사이클을 유지하면서 사육하였다.
3-3. 인지 기억력 분석
3-3-1. 새로운 사물에 대한 인지 테스트(novel object recognition test; NORT)
알츠하이머성 인지장애에 대한 본 발명에서 분리한 SR79 균주의 인지능력 및 기억력 증진 효과를 확인하기 위하여, 새로운 사물에 대한 인지 테스트(novel object recognition test; NORT)를 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1의 APP/PSEN1 과발현 마우스 모델은 대조군과 SR79 균주를 9주 동안 투여하고 이틀에 걸쳐 NORT를 실시하였으며 3-2에 나타낸 바와 같이, LPS 투여 인지장애 모델 마우스의 경우 일주일 동안 LPS를 투여하고 다음날부터 이틀에 걸쳐 NORT를 실시하였다. 첫날 트레이닝 데이(training day)에는 마우스를 41.5㎝×20㎝×21.5㎝의 하얀색 상자에 넣고 10분간 자유롭게 이동하도록 하여 적응시켰다. 상기와 같이 10분간 적응 기간을 둔 후, 원래 케이지로 돌려보냈으며, 2일째에는 동일한 원통 모양의 나무 블럭 두 개를 상자의 양쪽에 놓아 준 후, 마우스가 이들을 탐색할 수 있도록 10분간 노출시켰다. 이로부터 24시간 후, 원래 보았던 원통 블록(익숙한 물체)과 함께 사각기둥 모양의 새로운 블록(새로운 물체)을 함께 상자에 놓아 준 후 마우스의 움직임을 관찰하였다. 이때 블록을 만지거나, 코를 킁킁거리거나, 블록 쪽으로 향해 움직임을 보이는 시간(sniffing time)을 측정하였다. 두 가지 블록에 대해 전체 측정된 횟수에서 원통 블록(익숙한 물체)에 관심을 가지는 시간과 사각기둥블록(새로운 물체)에 관심을 가지는 탐색 시간 또는 탐색 횟수를 측정하였다(도 2 및 3).
실험결과, APP/PSEN1을 과발현하는 알츠하이머 발병 마우스는 정상마우스에 비해 현저히 새로운 물체에 관심을 보이는 시간(도 2A) 및 횟수(도 2B)가 감소된 것을 확인할 수 있었으며 9주 동안의 SR79 균주가 이러한 새로운 물체 탐색 시간과 탐색횟수를 유의미하게 증가시키는 것을 확인하였다(Students t-test, **p<0.01)(도 2).
LPS 미투여 그룹의 경우, 새로운 물체인 사각기둥블록과 익숙한 물체인 원통 블록 둘 다에 대해 인식을 잘하는 반면, LPS를 일주일간 투여한 마우스 그룹의 SR79 균주 미처리 대조군의 경우, 인지 장애를 나타내어 새로운 물체에 대한 탐색 시간이 현저히 감소되고, 익숙한 물체와 새로운 물체에 대한 구분을 잘 하지 못하는 것으로 확인되었다(Students t-test, **p<0.01)(도 3). 한편, LPS와 함께 SR79 균주 투여 실험군의 경우, LPS 투여에 SR79 균주 미투여 대조군에 비해, 새로운 물체에 대한 관심이 훨씬 더 높았으며, 익숙한 물체와 새로운 물체에 대한 구분을 확실히 잘하는 것으로 확인되었다(Students t-test, ** p<0.01)(도 3). 상기 탐색 시간은 (새로운 물체에 관심을 보이는 시간 - 익숙한 물체에 관심을 보이는 시간)/(새로운 물체에 관심을 보이는 시간 + 익숙한 물체에 관심을 보이는 시간 + 새로운 물체에 관심을 보이는 시간)으로 산출하여 나타내었다. 상기 결과를 통해, SR79 균주가 알츠하이머 질환의 치료에 효과가 있음을 알 수 있었으며, 아울러, LPS 투여만 이루어진 그룹에 비해 SR79 균주를 함께 투여한 그룹에서 새로운 물체 인지 시간이 증가되는 것을 확인함으로써, SR79 균주가 인지 기능 및 기억력 개선 효과 또한 지님을 알 수 있었다.
3-3-2. Y-미로 테스트(Y maze test)
알츠하이머성 질환에 의해 유발되는 공간지각능력 및 기억 능력의 상실에 대한 본 발명에서 분리한 SR79 균주의 공간지각능력 및 기억력 증진 효과를 확인하기 위하여, Y-미로 테스트(Y maze test)를 수행하였다. 구체적으로, Y-미로 테스트는 실험동물의 공간지각능력 및 단기 기억능력의 회복(short-term memory recovery)에 도움을 주는지를 알아보기 위한 실험으로, Y-미로 실험 장치는 투명 아크릴 판(가로 10 cm, 세로 40 cm, 높이 25 cm)으로 제작한 Y자 모양의 사방이 막힌 미로로 구성되어 있으며, 각 미로는 서로 120도의 일정한 각도로 배치되어 있다. 테스트는 10분간 진행하였으며, 각각의 미로를 A, B, C 영역으로 정한 후 하나의 영역에 실험동물을 두고 실험을 시작하여 미로를 자유롭게 탐색하도록 하였다. 이때, 각 미로에 들어간 횟수 및 순서를 측정하여 변경행동력(spontaneous alteration, %)을 평가하였다. 세 곳의 다른 영역에 순차적으로 들어간 경우 1점(실제변경 : actual alteration, ABC, BCA, CAB 등의 순서)으로 인정하였고, 연속되게 들어가지 않은 경우는 점수로 인정하지 않았다. 상기 변경행동력(spontaneous alteration, %)은 총 변경행동(alteration) 수/(총 입장 회수 - 2) × 100으로 산출하여 나타내었다.
Y-미로 실험을 수행한 결과, LPS 투여와 SR79 균주를 함께 투여한 마우스에 투여한 실험군의 경우, LPS 투여만 이루어진 마우스에 비해, 변경행동력이 통계적으로 유의미하게 증가됨을 확인할 수 있었다(Student’s t-test, *p<0.05)(도 4). 상기 결과를 통해, SR79 균주가 알츠하이머 질환에 의한 공간지각능력과 단기 기억력 저하에 대한 개선 효과를 지님을 확인함으로써, 기억력 개선에 효과가 있음을 알 수 있었다.
3-4. 뇌 염증 마커 분석
APP/PSEN1을 과발현하는 알츠하이머 발병 마우스에서 SR79의 뇌 염증반응 효과를 알아보기 위해 대뇌 피질에서 성상 신경교세포 (astrocyte) 특이적으로 결합할 수 있는 GFAP(Glial fibrillary acidic protein) 항체를 사용하여 면역염색을 수행하고, 대조군 마우스과 실험군 마우스의 대뇌피질에서 활성화된 성상 신경교세포의 수준을 측정한 후, 이를 비교하였다(도 5). 도 5A는 SR79 균주의 투여에 의한 알츠하이머병 발병 마우스 동물모델의 뇌에서 활성화된 성상 신경교세포에 대한 면역염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이고, 도 5B는 비히클 (대조군) 및 SR79 균주(SR)가 투여된 알츠하이머병 발병 마우스 동물 모델의 뇌에서 활성화된 성상 신경교세포에 대한 면역염색 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 대뇌 피질에서 활성화된 성상 신경교세포의 수준이 SR79 균주 투여에 의해 현저히 감소됨을 확인하였다 (Students t-test, *p<0.05).
또한, LPS 투여 마우스 모델에서 SR79의 뇌 염증반응 억제 효과를 알아보기 위해 LPS 모델 마우스의 대뇌피질에서 뇌 염증반응을 담당하고 있는 미세교세포 (microglia)의 활성을 알아볼 수 있는 마커인 Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 6).
실험 결과, 대뇌 피질에서 활성화된 미세 신경교세포 마커인 Iba-1의 발현이 LPS 투여에 의해 증가하는데 이는 SR79 균주를 함께 투여한 그룹에서 현저히 감소된 것을 확인하였다(Students t-test, *p<0.05)(도 6). 따라서, 이러한 결과를 바탕으로 SR79 균주가 뇌염증 반응의 억제 효과를 지님을 개체 수준에서도 확인하였다.
3-5. APP( Amyloid precursor protein)의 인산화 분석
SR79의 알츠하이머 위험인자에 대한 억제 효과를 알아보기 위해 위의 LPS 투여 마우스 모델의 대뇌피질의 단백질을 분리하여 APP(Amyloid precursor protein)의 인산화 정도를 pAPP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
실험 결과, 대뇌 피질에서 pAPP의 발현이 LPS 투여에 의해 현저히 증가하는 반면, SR79 균주를 함께 투여한 그룹에서는 p-APP가 증가되지 않은 것으로 관찰되어 (Student’s t-test, NS; not significant), 알츠하이머 발병의 위험성이 감소된다는 것을 확인할 수 있었다(도 7). 따라서, 이러한 결과를 바탕으로 SR79 균주가 알츠하이머 질환의 예방 효과를 지님을 확인하였다.
3-6. 6- OHDA (6- hydroxyldopamine ) 투여에 의한 파킨슨병 유도 실험 그룹 제작
실험동물로서, 9주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. 상기 마우스는 온도가 22~24℃로 유지되는 무균 상태(Specific pathogen free; SPF) 환경의 사육시설에서 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취하게 했으며, 12시간 주야 사이클을 유지하면서 사육하였다. 실험동물 그룹은 대조군에는 25% 글리세롤/PBS를, 실험군에는 장 유래 신규 미생물 SR79 균주를 2.0 x 108 CFU 농도로 1주일 동안 매일 경구로 투여한 다음, 6-OHDA(6-hydroxyldopamine)을 뇌에 주입하여 도파민성 신경세포사를 유도하였다. 대조군과 실험군의 개체수는 각각 5마리 및 6마리를 사용하여 수행하였다. 상기 마우스에 케타민(ketamine)과 럼푼(rompun)이 혼합된 약물을 이용하여 마취하고, 실험을 시행하였으며, 초기 파킨슨병의 진행 정도에 해당하는 70~80% 뇌의 흑색질 부위의 도파민성 세포 소실을 만들기 위해 6-OHDA을 뇌에 직접 주사하는 수술방법을 사용하였다. 노르아드레날린성(noradrenergic) 신경세포가 파괴되지 않도록 6-OHDA 투여 30분 전에 25 mg/kg의 데시프라민(desipramine)을 복강 투여하였고, 총 6ug의 6-OHDA을 좌뇌의 선조체(striatum) 내에 주입하였다(뇌 미세주입 좌표: 앞뒤 +1.3, 좌우 -1.8, 깊이 -3.6). 상기와 같이, 6-OHDA을 뇌에 직접 투여한 후, 수술 부위를 봉합하고 소독하였으며, 그 후 37℃ 워머(warmer)에서 마우스의 체온을 유지시켰다.
상기와 같은 수술 방법을 통해 파킨슨병을 유도한 이후, 덱스트로 암페타민 유도 회전검사(d-amphetamine-induced rotational test)와 같은 행동학적 검사를 수행할 때까지, 대조군 그룹과 실험군 그룹에 각각 25% 글리세롤/PBS 및 SR79 균주 2.0 x 108 CFU를 매일 투여하였다.
3-7. 파킨슨병 유도 동물 모델을 이용한 행동학적 평가
6-OHDA에 의한 도파민성 세포사가 많을수록, 한쪽 뇌의 병변이 심해져, 실험동물 모델에서 행동학적으로 회전 횟수가 증가하는 것으로 알려져 있다. 이에, 6-OHDA 투여 6일 후, 도파민성 세포사에 의한 운동조절능력 이상의 심한 정도를 평가하기 위해, 마우스에 5 mg/kg의 덱스트로 암페타민(d-amphetamine)을 복강으로 주사한 후 비대칭적 회전 행동을 관찰하였다. 구체적으로, 상기 덱스트로 암페타민 약물 투여 후, 마우스를 지름 20 cm의 원통에 넣고 30분 동안 반시계 방향으로 회전하는 횟수를 측정하여 회전 행동을 평가하였다. 실험 결과, 25% 글리세롤/PBS를 섭취한 대조군 그룹에 비해, SR79 균주를 섭취한 실험군 그룹에서 통계적으로 유의미하게 실험동물의 회전 행동이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9). 상기 결과를 통해, SR79 균주가 파킨슨병의 운동장애의 예방 및 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13036BP
수탁일자 : 20160607

Claims (10)

  1. 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 아가토바쿨룸 속(Agathobaculum sp.) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아가토바쿨룸 속 균주는 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스(Agathobaculum butyriciproducens)인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스는 기탁번호가 KCTC13036BP인 아가토바쿨룸 부트리시프로두센스 SR79 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 경도 인지장애, 뇌막염, 중풍, 치매, 헌팅턴병 또는 크로이츠펠트-야콥병인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 도파민성 신경세포 사멸에 의한 운동장애의 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 뇌 염증반응에 대한 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 인지 능력 및 기억력 개선 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주 유래 소포체, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 사료 조성물.
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