WO2017195884A1 - 多孔質セルロース媒体の製造方法 - Google Patents

多孔質セルロース媒体の製造方法 Download PDF

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WO2017195884A1
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cellulose
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徹 柴田
由紀 平林
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株式会社ダイセル
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a porous cellulose medium.
  • Polysaccharides such as cellulose and their derivatives are used for various purposes.
  • these microporous bodies can themselves be adsorbents, and can be given adsorption or separation functions by performing some chemical modification on the surface.
  • chromatography a separating agent is used in which some atomic group (often called a selector) that interacts with a target substance or impurities to be removed is bound to a solid called a matrix.
  • polysaccharides are used as a matrix for that purpose.
  • polysaccharides have many hydroxyl groups in the molecule, it is possible to easily bind selectors via ether bonds or ester bonds using this as a scaffold, which is also a major factor in the heavy use of polysaccharides. .
  • a target molecule and a selector having some affinity are bound to a matrix, and the target molecule is adsorbed by some method after adsorbing the target molecule.
  • a method of releasing and recovering is used.
  • the matrix is required to have a porous structure that allows the target molecule to freely enter and exit. In other words, when the matrix is packed in a column and subjected to size exclusion chromatography, it is necessary to exhibit an exclusion limit larger than the combined size of the molecule to be purified and the ligand.
  • Such a matrix is often used by being packed in a tube called a column as particles.
  • a new form attracting attention in recent years is an integral porous body called a monolith. This can be used for the same purpose by being stored in a capillary such as a capillary or a container such as a column.
  • a relatively thin monolithic monolith can be used as a filtration membrane.
  • the physical strength of the matrix can be cited as a factor in the ease of use of such a matrix. That is, a matrix having a low elastic modulus is subjected to compressive deformation or fracture when a liquid or gas is flowed in chromatography or filtration, resulting in non-uniform flow of the liquid in the chromatography column and further clogging. This significantly reduces the separation efficiency of the column. High physical strength is an important characteristic, and in this respect, cellulose is an excellent material among polysaccharides.
  • cellulose has an alcoholic hydroxyl group on its surface as a general feature of polysaccharides, it is possible to combine various atomic groups by chemical reaction, and a large amount of high-purity materials are compared. There are advantages such as being available at a reasonable price.
  • porous cellulose media whose main purpose is separation and purification of biopolymers have been developed.
  • a method for producing this a method is known in which cellulose is dissolved by some method and then regenerated.
  • organic acid esters as starting materials are also seen. This is because it is difficult to directly dissolve cellulose itself, which requires a special solvent or the viscosity of the solution is very high, whereas the organic acid ester can be dissolved in many solvents, Cellulose organic acid ester can be supplied industrially with stable quality, with various bond ratios with various organic acids, and degree of polymerization, and it can easily break down ester bonds and regenerate cellulose Etc. are utilized.
  • Patent Document 1 discloses that a solution in which a cellulose organic acid ester is dissolved in an organic solvent such as a halogenated hydrocarbon is dispersed in an aqueous medium to form fine droplets of the ester solution. It is described that cellulose microparticles are formed by adding a hydrolysis accelerator such as an ammonium salt to hydrolyze the ester.
  • a hydrolysis accelerator such as an ammonium salt
  • Patent Document 2 cellulose fatty acid ester and cellulose fatty acid ester gelling agent are dissolved in an organic solvent to form a solution, and the solution is stirred and added to an aqueous medium to form droplets, further promoting coagulation.
  • a method for producing porous spherical particles by adding an agent to make cellulose fatty acid ester in droplets into gel particles and removing the gelling agent, coagulation accelerator and solvent from the generated particles is described.
  • Patent Document 3 cellulose is dissolved in a mixed solution of paraformaldehyde and dimethyl sulfoxide, and the dissolved solution is dispersed in a dispersion medium, and then a silicon compound is added as a coagulant to gel dispersed droplets of cellulose.
  • a method for producing a solid cellulose gel by solidification and solidification is described.
  • Non-Patent Document 1 discloses that cellulose acetate is dissolved in a water-soluble organic solvent (mixed solvent of acetone and DMSO) and dispersed in water so that the solution containing cellulose acetate comes into contact with water and solidifies. And forming porous particles.
  • a water-soluble organic solvent mixed solvent of acetone and DMSO
  • Non-Patent Document 2 describes that cellulose diacetate is dissolved in DMSO, then anhydrous sodium sulfate is added and stirred, and the mixture is put into an acid aggregation bath (hydrochloric acid) to obtain cellulose particles (beads). ing. Further, there is described a means for removing sodium sulfate by immersing the collected beads in a large amount of warm water in order to increase the porosity of the beads.
  • Non-Patent Document 3 reports that a homogeneous composition containing a solvent containing water and cellulose acetate undergoes a phase transition (liquid-gel) and gels when the temperature falls below a certain temperature.
  • Patent Documents 1 and 2 For example, in the methods of Patent Documents 1 and 2, a solvent containing a halogenated hydrocarbon is used, and in order to remove the solvent by vaporization during the production of particles, large energy and the vaporized solvent are recovered. A device to do this is required.
  • a dense cellulose fatty acid ester film is formed in a portion of the formed droplet in contact with the coagulation accelerator. This can lead to an irregular particle shape. Therefore, as described in Patent Documents 2 and 3, when gelation is performed after forming droplets, the reaction may be biased.
  • Non-Patent Document 1 describes that the formed beads are subjected to a crosslinking reaction using formaldehyde and hydrochloric acid to crosslink the beads.
  • Non-Patent Document 2 describes the use of a pore forming agent in order to provide pores in the particles.
  • both Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 include a step of treating the surface when forming the particles, and in order to obtain porous cellulose particles, the substance used for the surface treatment is used. Need to be removed.
  • the main object of the present invention is to provide a novel method capable of suitably producing a porous cellulose medium from cellulose acetate.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems.
  • the method for producing a porous cellulose medium comprising a step of preparing a cellulose acetate solution in which cellulose acetate is dissolved in a solvent, and a step of mixing the cellulose acetate solution, a deacetylating agent, and a catalyst.
  • the inventors have found that a porous cellulose medium can be preferably produced. More specifically, in the present invention, the rate of deacetylation of cellulose acetate by the deacetylating agent can be adjusted by adjusting the amount and type of the catalyst in the mixed solution containing cellulose acetate.
  • the mixed solution is gelled at a desired speed with the mixed solution dispersed by adjusting the amount and type of the catalyst. It has been found that porous cellulose particles composed of a porous cellulose medium are preferably produced.
  • a porous cellulose medium is produced in the form of a porous cellulose monolith, by adjusting the amount and type of the catalyst, the mixed solution is gelled at a speed at which a porous structure is suitably formed in the monolith. It was found that it can be made. The present invention has been completed by further studies based on these findings.
  • Item 1 Preparing a cellulose acetate solution in which cellulose acetate is dissolved in a solvent; and mixing the cellulose acetate solution, a deacetylating agent, and a catalyst to obtain a mixed solution, A method for producing a porous cellulose medium.
  • Item 2. Item 2. The method for producing a porous cellulose medium according to Item 1, wherein the catalyst is at least one selected from the group consisting of an alkoxide, an amine compound, a weakly basic inorganic compound, and an N-hydroxyamine derivative.
  • Item 3. Item 3. The method for producing a porous cellulose medium according to Item 2, wherein the amine compound is a tertiary amine and the weakly basic inorganic compound is a carbonate.
  • Item 4. The porous cellulose monolith composed of a porous cellulose medium is obtained by allowing a deacetylation reaction of the cellulose acetate to proceed while the mixed solution is allowed to stand in a molding container. The manufacturing method of the porous cellulose medium as described. Item 5. The mixed solution and a dispersion medium that is immiscible with the mixed solution are mixed, and in a state where the mixed solution is dispersed, a deacetylation reaction of the cellulose acetate is advanced to form a porous cellulose medium. Item 5. The method for producing a porous cellulose medium according to any one of Items 1 to 4, wherein a porous cellulose particle is obtained. Item 6. Item 6.
  • Item 7 A method for producing an adsorbent, comprising a step of immobilizing an affinity ligand on the porous cellulose medium obtained by the production method according to any one of Items 1 to 6.
  • Item 8. The method for producing an adsorbent according to Item 7, wherein the affinity ligand is at least one selected from the group consisting of protein A, protein G, protein L, and functional variants thereof.
  • Item 9. Item 6.
  • the adsorbent obtained by binding an affinity ligand to the porous cellulose medium obtained by the production method according to any one of Items 1 to 6 and a mixture containing a target substance are contacted, and the affinity ligand is contacted with the affinity ligand.
  • a method for purifying a target substance comprising: a first step of binding a target substance; and a second step of separating the target substance bound to the affinity ligand of the adsorbent.
  • a novel method capable of suitably producing a porous cellulose medium from cellulose acetate can be provided.
  • FIG. 2 is an image of an electron micrograph of a solid cracked surface obtained in Example 1.
  • FIG. 2 is an optical micrograph of gel beads obtained in Example 2.
  • 6 is an optical micrograph of beads obtained in Example 5.
  • 6 is an infrared absorption spectrum measured in Example 5.
  • the method for producing a porous cellulose medium of the present invention comprises a step of preparing a cellulose acetate solution in which cellulose acetate is dissolved in a solvent, and a mixed solution is obtained by mixing the cellulose acetate solution, a deacetylating agent, and a catalyst. A process is provided. Since the method for producing a porous cellulose medium of the present invention has such a configuration, a porous cellulose medium can be suitably produced from cellulose acetate. Hereafter, the manufacturing method of the porous cellulose medium of this invention is explained in full detail.
  • a cellulose acetate solution in which cellulose acetate is dissolved in a solvent, a deacetylating agent, and a catalyst are mixed to deacetylate the cellulose acetate in the mixed solution.
  • the porous cellulose medium is produced by utilizing the fact that the liquid-gel phase transition occurs.
  • the liquid-gel phase transition by deacetylation is a phenomenon in which the liquid mixed solution having fluidity loses fluidity as the deacetylation proceeds.
  • the phenomenon that the viscosity increases as the temperature decreases is observed in many solutions, but in gelation from a liquid, the fluidity is substantially completely lost, and in many cases, the resulting gel becomes cloudy.
  • the deacetylation reaction of cellulose acetate proceeds to cause gelation.
  • a cellulose acetate solution in which cellulose acetate is dissolved in a solvent is prepared.
  • Any cellulose acetate may be used as long as it causes the aforementioned phase transition by deacetylation.
  • Typical physical properties of cellulose acetate include the degree of polymerization and the degree of substitution.
  • the degree of polymerization is preferably 50 or more on a weight average in order to increase the mechanical strength of the resulting porous cellulose medium and prevent elution into a solvent during use.
  • any upper limit can be used as long as it is available.
  • the degree of substitution has a strong influence on the solubility of cellulose acetate.
  • the degree of substitution is a numerical value indicating how many of the three hydroxyl groups of one glucose residue of cellulose are substituted. In the case of acetate, it may be expressed by acetic acid content or acetyl group content, but these can be converted to each other. Generally, those having a substitution degree of about 2.8 to 2.9 are distributed as triacetate, and those having a degree of substitution of about 2.5 are distributed as diacetate. In the present invention, any substitution degree may be used as long as it causes the phase transition.
  • Cellulose acetate is generally used as a fiber material, and so-called cellulose diacetate (among other typical products has a degree of acetyl substitution of 2.5, and the content of acetic acid) (Acetation degree around 55%) and triacetate used as a film material for photographs and liquid crystal displays (acetyl substitution degree is 2.8 to 2.9, expressed as acetic acid content) (Degree of acetylation) around 60%).
  • Those having a degree of substitution near 1 (which should be called monoacetate but are not generally established because it is not generally distributed) may be soluble in water and have a wide choice of polar solvent systems.
  • grades that are not generally distributed are, for example, solvolysis by adding a calculated amount of base to a solution of cellulose acetate having a higher degree of substitution, and the hydrous acetic acid solution by an acid catalyst such as sulfuric acid. It can be obtained by hydrolysis and stopping the reaction at an appropriate timing (neutralizing sulfuric acid). For example, it can be obtained by using diacetate (cellulose diacetate) as a starting material and allowing 1.5 equivalents of base per glucose unit to act.
  • a base hydrazine and hydroxylamine are easy to use in many organic solvents because they are neutral molecules, and quick reaction is easy to use.
  • quaternary ammonium hydroxide can be used.
  • triacetate, diacetate and monoacetate in the degree of acetylation is not clearly distinguished, but in the present invention, for convenience, 2.7 or more is triacetate, 1.5 or more and less than 2.7 is diacetate, 0 .5 or more and less than 1.5 is defined as monoacetate.
  • the solvent for dissolving cellulose acetate is not particularly limited as long as it can dissolve cellulose acetate. However, since this reaction uses a base catalyst, an acidic solvent that deactivates this, such as acetic acid, is not preferable.
  • a polar solvent having high solubility of the deacetylating agent or catalyst is preferred. Examples of such solvents are polar solvents such as tetrahydrofuran (THF), dimethyl ether (DME), ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, diethylene glycol monomethyl ether, diethylene glycol monoethyl ether, trifluoroethanol, acetamide, formamide, etc.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • sulfolane dimethyl sulfone
  • N-methylpyrrolidone N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylformamide, N, N'-dimethylimidazolidinone, hexamethylphosphorotriamide, tetramethylurea
  • aprotic polar organic solvents such as Further, as will be described later, when particles are produced by dispersing in a dispersion medium, it is necessary that the solvent and the dispersion medium are not miscible.
  • Particularly preferable solvents that satisfy these conditions and are not miscible with liquid paraffin, which is an inexpensive dispersion medium, and are generally distributed are DMSO, N-methylpyrrolidone, N, N-dimethylacetamide, And formamide.
  • DMSO is more preferable.
  • formamide having good solubility in this is preferred.
  • a solvent may be used individually by 1 type and may be used in combination of 2 or more type. Further, it may contain 20% by volume or less of the solvent other than the above as long as the required conditions are not lost.
  • the content of cellulose acetate in the cellulose acetate solution is not particularly limited, but is preferably 1% by mass to 15% by mass from the viewpoint that the obtained porous cellulose medium has a pore diameter suitable for practical use and appropriate hardness. About 3% by mass to 10% by mass, more preferably about 3% by mass.
  • a step of mixing a cellulose acetate solution, a deacetylating agent, and a catalyst to obtain a mixed solution is performed.
  • the deacetylation reaction of the cellulose acetate proceeds, and gelation of the mixed solution (liquid-gel phase transition) starts.
  • the deacetylating agent is not particularly limited as long as it can deacetylate cellulose acetate, and a known one can be used.
  • preferred specific examples of the deacetylating agent include alcohol, amine, amino alcohol, water and the like.
  • the alcohol include aliphatic monohydric alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol and 2-methylpropanol; aromatic alcohols such as benzyl alcohol ; 2 or more carbon atoms such as ethylene glycol, 1,3-propylene glycol, 1,2-propylene glycol, glycerin, butane-1,4-diol, butane-1,2,4-triol, pentaerythritol, sorbitol, xylitol, etc. No.
  • polyhydric alcohol monomethyl ether or monoethyl ether such as ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol and the like.
  • the amine include ammonia, an aliphatic primary amine having 1 to 5 carbon atoms, an aliphatic secondary amine having 1 to 5 carbon atoms, a diamine, and benzylamine.
  • Specific examples of amino alcohol include 2-aminoethanol and 3-aminopropanol.
  • alcohol is preferable, and methanol or ethanol is particularly preferable.
  • an amine compound is preferable.
  • a deacetylating agent may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more type.
  • the amount of the deacetylating agent to be used is not particularly limited as long as it does not inhibit the dissolution of cellulose acetate, but from the viewpoint of satisfactorily causing deacetylation, it is preferably 1.0 with respect to the acetyl group of cellulose acetate.
  • the molar ratio is about 30 to 30 mol times, more preferably about 1.2 to 15 mol times.
  • a porous cellulose medium having a desired form is prepared by adjusting the amount of the deacetylating agent as well as the amount of the catalyst described below to adjust the gelation rate by deacetylation. be able to.
  • the catalyst is not particularly limited as long as it can catalyze the deacetylation reaction of cellulose acetate, and preferably includes alkoxide, amine compound, weakly basic inorganic compound, N-hydroxyamine derivative and the like.
  • alkoxide include metal alkoxides of alcohols exemplified as the aforementioned deacetylating agent.
  • metal constituting the metal alkoxide include sodium, potassium, lithium, magnesium, calcium, and aluminum. Among these, sodium alkoxide is preferable, and sodium ethoxide and sodium methoxide are particularly preferable.
  • the amine compound include tertiary amines such as 4-dimethylaminopyridine and 4-pyrrolidinopyridine.
  • Examples of weakly basic inorganic compounds include carbonates, and particularly those having good solubility include potassium carbonate and cesium carbonate.
  • Examples of the N-hydroxyamine derivative include a combination of N-oxyimide such as N-oxysuccinimide, N-oxyphthalimide, N-oxybenzotriazole and an amine, or N-oxyimide and an equimolar or less alkali.
  • Examples of the catalyst include a salt of a compound having a group: N—OH such as N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, 1-hydroxybenzotriazole and the like.
  • a catalyst may be used individually by 1 type and may be used in combination of 2 or more types.
  • alkoxides are preferable when alcohol is used as the aforementioned deacetylating agent.
  • an amine compound is preferable when using an amine as the above-mentioned deacetylating agent.
  • the amount of the catalyst used can be freely selected according to the activity of the catalyst to be used, a preferable reaction rate, etc., and is a feature of the present invention, and is not particularly limited, but when it is too small, it is inactive by carbon dioxide in the air. And other side reactions (for example, formic acid due to hydrolysis of formamide, inactivation due to acetic acid due to hydrolysis of cellulose acetate, etc.) makes the reaction rate (time required for gelation) unstable. There is a possibility. From the viewpoint of satisfactorily causing deacetylation, the amount of the catalyst used is preferably about 0.01 mol to 2 mol, more preferably 0.05 mol to 0.5 mol, relative to 1 mol of the deacetylating agent.
  • the rate of deacetylation of cellulose acetate by the deacetylating agent can be adjusted by adjusting the amount and type of catalyst in the mixed solution.
  • the mixed solution is dispersed at a desired speed.
  • the mixed solution can be gelled, and porous cellulose particles composed of a porous cellulose medium can be suitably produced.
  • the mixed solution is gelled at a speed at which a porous structure is suitably formed in the monolith. It can be made.
  • Other solvents may be mixed in the mixed solution.
  • the other solvent for example, the solvent used for preparing the above-mentioned cellulose acetate solution or the above-mentioned deacetylating agent can be used as the solvent.
  • the metal alkoxide used as the above-mentioned catalyst is generally added to the mixed solution in a state of being dissolved or dispersed in the solvent, and the solvent in which the metal alkoxide is dissolved or dispersed is also used. It can be the other solvent.
  • About another solvent you may use individually by 1 type and may be used in combination of 2 or more types.
  • the temperature at which the cellulose acetate is deacetylated in the mixed solution is not particularly limited as long as the mixed solution does not boil or freeze, but is preferably about ⁇ 10 ° C. to 100 ° C., more preferably A temperature of about 0 ° C. to 80 ° C. can be mentioned.
  • Specific deacetylation reaction conditions may be appropriately set according to the solubility of each component in a solvent and the reaction rate, and cannot be uniquely determined.
  • cellulose acetate acetylate is suitable for the purpose of use. You can set it so that the group is removed.
  • the time required for deacetylation that is, the time until the mixed solution gels is, for example, about 1 minute to 48 hours, preferably about 5 minutes to 24 hours.
  • the time required for deacetylation is as short as possible, it is desirable from the viewpoint of suppressing reaggregation of dispersed particles when particles are obtained by dispersing in a dispersion medium.
  • the gelation rate is too high, problems such as non-uniform gelation occur before the deacetylating agent or catalyst is homogeneously mixed with the cellulose acetate solution, and before the dispersion operation for particle production, During the process, gelation may occur and problems such as the inability to obtain spherical particles may occur. Therefore, adjustment may be made so as to give the preferred gelation time.
  • the time required for deacetylation can be shortened by increasing the amount of the catalyst described above.
  • the amount of catalyst is too large, a porous cellulose medium having an appropriate form may not be obtained, so the amount of catalyst is adjusted as appropriate.
  • the resultant is washed with a solvent that does not adversely affect the obtained porous cellulose (for example, a solvent exemplified by a separation solvent described later), and a preservative is added as necessary.
  • a solvent that does not adversely affect the obtained porous cellulose for example, a solvent exemplified by a separation solvent described later
  • crosslinking treatment for the purpose of improving the strength and treatment with an active group called a tether for binding functional groups such as proteins are usually used. Is done. In that case, in many cases, since it is treated with a strong alkali (usually an aqueous sodium hydroxide solution), the residual acetyl group is unintentionally removed from the gel. Therefore, the gel produced from the mixed solution does not need to be completely deacetylated.
  • a strong alkali usually an aqueous sodium hydroxide solution
  • the porous cellulose medium can be produced in the form of particles (that is, porous cellulose particles) according to the shape when the mixed solution is gelled, or in the form of a monolith ( That is, it can also be produced as a porous cellulose monolith).
  • the mixed solution described above and a dispersion medium immiscible with the mixed solution are mixed, and the mixed solution is dispersed.
  • the deacetylation reaction of cellulose acetate is advanced to obtain porous cellulose particles composed of a porous cellulose medium.
  • the dispersion medium is not particularly limited as long as it is not miscible with the above-described mixed solution and can be dispersed in the dispersion medium in the form of particles by stirring together with the mixed solution.
  • the dispersion medium in order to prevent the mixed solution from aggregating when the mixed solution is dispersed, preferably has a certain degree of viscosity when the mixed solution is dispersed.
  • the viscosity of the dispersion medium is about 0.2 Pa ⁇ s to 20 Pa ⁇ s at 25 ° C.
  • the dispersion medium is preferably nonpolar so that it is not miscible with the solvent contained in the mixed solvent.
  • Specific examples include hydrocarbons having 20 or more carbon atoms such as liquid paraffin and petrolatum, and silicone oil. And fluorinated hydrocarbons. Among these, liquid paraffin is preferable in terms of cost.
  • One type of dispersion medium may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Vaseline loses its fluidity quickly when it is below a specific softening temperature. For this reason, if the dispersed particles of the mixed solution are likely to re-agglomerate and form a lump, first prepare the dispersion at a temperature above the softening temperature, then lower the temperature below the softening temperature, and the particles in the mixed solution move
  • the use of petrolatum is effective for the purpose of preventing contact and increasing the yield of the particles.
  • the softening temperature of petrolatum differs depending on the type and can be selected as appropriate.
  • the mixed solution can be gelled at a desired rate in a state where the mixed solution is dispersed by adjusting the amount and type of the catalyst described above. For this reason, in the manufacturing method of this invention, if the quantity and kind of a catalyst are adjusted, it is not necessary to suppress re-aggregation etc. of a mixed solution using petrolatum etc.
  • the mixed solution containing cellulose acetate needs to be maintained in a dispersed state until it is gelled by the progress of the deacetylation reaction after being dispersed in the dispersion medium. . Therefore, if necessary, an appropriate dispersion stabilizer may be added to the dispersion medium.
  • the dispersion stabilizer may be any as long as it has an effect of increasing the stability of the dispersion state of the mixed solution and delaying the rate at which the particles of the mixed solution aggregate.
  • examples of such dispersion stabilizers include esters of polyhydric alcohols such as glycerin, sorbitan, polyglycerin and sucrose and higher carboxylic acids, modified silicones containing a small amount of polar groups, and other commercially available products. Dispersion stabilizers can also be used.
  • Examples of a method for dispersing the mixed solution containing cellulose acetate in a dispersion medium include various methods, such as a method for giving a wide range of particle size distribution and a method for giving a monodispersed particle size. is there. For example, using a so-called microreactor and injecting a mixed solvent gelled from a thinner nozzle while flowing a liquid dispersion medium at an appropriate speed, a method with a uniform particle size is used. Suitable for making.
  • a method of extruding a mixed solution from a membrane with a constant pore diameter into a dispersion medium, putting a fluid mixed solution into an inner cylinder having a hole with a fixed size, rotating it in the dispersion medium, and gelling A method of extruding the mixed solution by centrifugal force, a method of feeding a dispersion medium containing a dispersion stabilizer and a fluid mixed solution into a column packed with beads of a certain size, if necessary, Various methods such as a method of injecting a mixed solution into a dispersion medium through a vibration nozzle, a method using (ultra) sonic waves, and the like can be used.
  • a method by stirring is exemplified. This is because, after adding the mixed solution to the dispersion medium, a strong shearing force is applied to generate substantially spherical particles composed of the mixed solution, and deacetylation of the mixed solution that has become dispersed droplets is performed. This is a method for causing gelation.
  • the stirring and mixing conditions may be appropriately selected according to the target average particle size.
  • the stirring method is the simplest method that gives a mixture of various particle sizes but does not require special equipment.
  • the mixed solution dispersed in the dispersion medium is allowed to stand for, for example, about 1 minute to 48 hours, preferably about 5 minutes to 24 hours, and the deacetylation reaction proceeds in the particles composed of the mixed solution.
  • a separation solvent for separating the porous cellulose particles dispersed in the dispersion medium is mixed with the dispersion medium on which the porous cellulose particles are formed, and the A step of separating the porous cellulose particles may be further performed.
  • cellulose is not dissolved among the components contained in the gel of the mixed solution that is not miscible with the above-mentioned dispersion medium, but other components (other than the above-mentioned solvent, catalyst, deacetylating agent, and cellulose). What is miscible with the reaction product or the like is preferred. Thereby, it can isolate
  • Such a separation solvent examples include water, methanol, ethanol, 2-propanol, acetamide, formamide, or a mixture thereof. Among these, it is preferable to use water because of easy handling.
  • porous cellulose particles dispersed in the dispersion medium can be filtered directly, generally, since the dispersion medium has a high viscosity, pressure is applied during filtration, and there is a high risk of deformation or destruction of the porous cellulose particles. Become. It is also possible to reduce the pressure during filtration by adding a low viscosity liquid that is miscible with the dispersion medium.
  • the obtained porous cellulose particles are washed by an appropriate method using water, alcohol such as methanol or ethanol, and are usually stored in a wet state. When drying, add appropriate amounts of sugars, glycerin and the like. Add preservatives such as alcohol and sodium azide to prevent spoilage when stored for long periods in water and humidity. Moreover, it can also dry in the state which added glycerol, saccharides, urea, etc. When used, the column is packed by a conventional method.
  • porous cellulose particles obtained by the production method of the present invention
  • a substantially spherical to spherical shape having a particle size (maximum diameter) of about 10 ⁇ m to 300 ⁇ m is obtained by known appropriate classification. It is possible to select what it has and use it as a packing material for chromatography. Chromatography can include size exclusion chromatography.
  • the fact that it can be used for size exclusion chromatography means that it can also be used for chromatographic separation in various modes other than size exclusion by binding an appropriate ligand. These include modes such as ion exchange, hydrophobicity, and affinity.
  • a matrix having a pore size sufficient to allow these substances to enter is preferable. That is, when gel filtration chromatography is performed using a column packed with porous cellulose particles and water as a mobile phase, fractionation can be achieved in some molecular weight region in the range of approximately 10 3 to 10 7 in terms of the molecular weight of polyethylene glycol. It is desirable to get up.
  • the pore size of the porous cellulose medium depends on the concentration of cellulose acetate, the amount and type of solvent, catalyst, deacetylating agent used to dissolve the cellulose acetate, and the gelation conditions (particularly temperature) of the mixed solution. Can be adjusted.
  • the porous cellulose medium when the porous cellulose medium is produced in the form of a monolith, the cellulose acetate is deacetylated in a state where the mixed solution is allowed to stand in a molded container having an arbitrary shape.
  • a porous cellulose monolith composed of a porous cellulose medium is obtained.
  • Monolith is an integral lump of porous material.
  • the developing solution also passes through the fine pores of the particles, but most of the developing solution passes through the interparticle gaps.
  • the monolith the developing solution passes through the fine pores of the integral porous body. For this reason, it is preferable to reduce the resistance to the flow of the developing solution, and a condition that gives a structure suitable for it is selected, and the solid content is generally set lower than in the case of the particulate filler.
  • the essential separation mechanism is the same as in the case of the particulate filler, except when used as a filtering material.
  • the generated porous structure is uniform in the direction perpendicular to the flow of the developing liquid and that there is no gap between the monolith and the container where the liquid can easily flow. It is. Preparation of a porous body uniform in the perpendicular direction described here cannot be performed by contact with a gelling agent (precipitating agent) or evaporation of a solvent which is a known technique.
  • the mixed solution can be gelled at a speed at which a porous structure is suitably formed in the monolith. It is suitable for manufacturing.
  • the mixed solution is put into a molding container of an arbitrary shape and then left for about 1 minute to 48 hours, preferably about 4 minutes to 24 hours, so that the cellulose acetate Causes a deacetylation reaction.
  • the monolith can be used as a separating agent or the like by forming a gel of the mixed solution and washing the obtained gel as it is or after taking it out of the container with an appropriate solvent.
  • drying is preferably avoided because it may cause deformation of the shape of the monolith or lose the microporous structure, but it can be achieved if an appropriate non-volatile additive coexists.
  • Suitable non-volatile additives are sugars such as glycerin, sucrose, trehalose and syrup, sugar alcohols, various amides, and polar compounds such as DMSO.
  • the porous cellulose monolith In order to evaluate the characteristics of the porous cellulose monolith, as described above, it is necessary to put it in an appropriate container so that there are no gaps and local consolidation. Any known method may be used for this purpose. Usually, when a porous cellulose monolith is produced by gelation, some shrinkage occurs, and a gap is often formed between the container and the container. In such a case, modify the container wall surface to a chemical structure that has a strong affinity for cellulosic materials (for example, to bind cellulose to the surface) to prevent gaps, or use shrinkage and swelling due to changes in the gel environment. However, the container can be accommodated without any gaps, for example, by adapting the size of the container.
  • an adsorbent can be produced by immobilizing an affinity ligand on the porous cellulose medium obtained by the production method described above. That is, in the method for producing the porous cellulose medium of the present invention, an adsorbent to which the affinity ligand is bound can be produced by further including a step of immobilizing the affinity ligand. This adsorbent can also be used as a separation agent for affinity chromatography.
  • the porous cellulose medium of the present invention can be used as a separation agent or adsorbent for affinity chromatography by binding an affinity ligand, for example, in any form of porous cellulose monolith and porous cellulose particles. Can do.
  • a protein can be used as the affinity ligand.
  • the protein that can be used in the present invention includes a substance having a molecular weight of 3 to 300 kDa, preferably 30 to 150 kDa, and having affinity for a protein such as an antibody to be separated.
  • protein A, protein G, protein L, and functional mutants thereof as affinity ligands are preferred because of their high selectivity when used to separate antibody proteins.
  • the functional variant refers to a protein having at least one modification in the native amino acid sequence and still maintaining at least one function associated with the native sequence.
  • Natural sequences include amino acid sequences that naturally occur in nature. Amino acid changes can include substitution of one or more amino acids for another amino acid, deletion of one or more amino acids, and / or addition of one or more amino acids, or any combination thereof. Embodiments such as combinations of additions, deletions and substitutions made to the native sequence are also included.
  • a functional variant can also include a fragment or domain of a protein.
  • the amino acid sequence of the functional variant is at least 70% identical, at least 75% identical, at least 80% identical, at least 85% identical, at least 90% identical, at least 95% identical, at least 98% identical to the natural amino acid sequence Well, it still retains at least one function associated with the native sequence.
  • the amount of protein supported on the porous cellulose medium is preferably about 1.0 to 25 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the porous cellulose medium. Further, it is preferably about 1 mg to 50 mg per 1 ml of the volume of the porous cellulose medium.
  • the crosslinking agent is not particularly limited, and examples thereof include halohydrins such as epichlorohydrin, epibromohydrin, dichlorohydrin, bisoxiranes, and polyoxiranes.
  • the crosslinked porous cellulose medium may be activated after crosslinking the porous cellulose medium and before reacting with the affinity ligand.
  • a crosslinked porous cellulose medium can be activated by introducing a known reactive functional group.
  • the functional group can be changed to a functional group that can be easily reacted with the compound to be immobilized as a ligand.
  • an adsorbent can be produced through a step of immobilizing the ligand and the porous cellulose medium by reacting with a compound to be immobilized as a ligand.
  • a system having a porous cellulose medium and a compound to be immobilized as a ligand has a condensing reagent such as carbodiimide, or a molecule having a plurality of functional groups such as glutaraldehyde.
  • a condensing reagent such as carbodiimide
  • a molecule having a plurality of functional groups such as glutaraldehyde.
  • Examples include a method of immobilizing a porous cellulose medium and a ligand to obtain an adsorbent by adding a reagent to condense and crosslink.
  • a formyl group is introduced into the porous cellulose medium and the formyl group and a protein amino group are reacted.
  • the reaction for introducing a formyl group include a method in which a polysaccharide having a vicinal hydroxyl group is oxidized by a periodate oxidation method to form a formyl group on a sugar chain.
  • a method of introducing a formyl group through various spacers obtained by a method of allowing periodate to act on a glyceryl group obtained by ring opening of an epoxy group can be mentioned.
  • an amino sugar such as glucosamine can be used as the spacer.
  • a method for binding a formyl group of a porous cellulose medium and a protein such as protein A a known method can be used, for example, a porous material in which an amino sugar such as glucosamine is introduced as a spacer.
  • An embodiment in which a cellulose medium and a solution containing protein A are reacted can be given. Examples of such a method include the method described in JP-A-2008-279366.
  • Various target molecules can be purified by using an adsorbent obtained by binding an affinity ligand to the porous cellulose medium produced by the production method of the present invention described above.
  • target molecules include proteins such as immunoglobulins.
  • immunoglobulins include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and functional fragments thereof.
  • the purification method of the present invention includes the following steps.
  • Examples of the method for separating the target substance bound to the affinity ligand of the adsorbent include changing the pH and changing the salt concentration between the first step and the second step.
  • the pH of the first step is set to neutral such as 6 to 8, and the pH is set to less than 6 in the second step.
  • the salt concentration is less than 0.1 M in the first step, 0.1 M or more in the second step, or 0.1 M or more in the first step. It can be mentioned to be less than 1M.
  • the purification of immunoglobulins has been described as an example.
  • ion exchange groups for example, CIBA Chronblue
  • dyes for example, CIBA Chronblue
  • ligands to purify enzymes, plasma proteins, vaccines, etc. It can be used for various applications such as adsorption removal of saccharides.
  • Example 1 Preparation of porous cellulose monolith> 0.40 g of cellulose diacetate (acetylation degree 55% substitution degree 2.5) was dissolved in 4.65 g of DMSO. When 1.00 mL of methanol was added thereto, a precipitate once formed, but when stirred well, it became a homogeneous solution (cellulose diacetate solution) again, and this was allowed to stand on ice. On the other hand, 0.50 mL each of DMSO and methanol was mixed, and 1.04 mg of 20% sodium ethoxide / ethanol solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was mixed and ice-cooled.
  • 20% sodium ethoxide / ethanol solution manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • this solution and the cellulose diacetate solution were quickly mixed and poured into a 1 cm square columnar cell, followed by ice cooling.
  • the liquid in the columnar cell solidified in about 2 hours.
  • a rectangular columnar porous cellulose monolith was taken out from the columnar cell and repeatedly washed with water.
  • the obtained porous cellulose monolith was a 7.0 mm square columnar shape.
  • FIG. 1 shows an image of an electron micrograph of the solid cracked surface (naturally cracked in liquid nitrogen). As can be seen from the image in FIG. 1, a network-like porous structure was observed on the cracked surface.
  • Example 2 Preparation of porous cellulose particles> 10 mL of methanol was added to 51.6 g of a DMSO solution (cellulose diacetate: 7.88% by mass) of cellulose diacetate (acetic acid content 55%) and stirred well to obtain a uniform transparent solution, which was ice-cooled (solution 1 ).
  • a DMSO / methanol 46.5: 15 (v / v) mixed solution (about 50 ml) was brought into contact with about 1000 mL of liquid paraffin for 1 day, and then the latter was separated and removed to saturate DMSO / methanol.
  • Example 3 Preparation of porous cellulose monolith> A solution was prepared by dissolving 16.03 g of cellulose diacetate in 129.42 g of DMSO. 7.6 mL of methanol was slowly mixed with 3.04 g of this solution to obtain a transparent solution, which was ice-cooled. On the other hand, a solution in which 0.117 g of a 10% methanol solution of lithium methoxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was diluted with 1.94 g of methanol and 2.77 g of DMSO was prepared and cooled on ice.
  • Example 4 Preparation of porous cellulose monolith> When 7.22 g of cellulose diacetate (acetic acid content 55%) was dispersed in 112.21 g of formamide and heated to 125 ° C. for about 30 minutes with stirring, a clear solution was formed, which was cooled to room temperature. On the next day, 8.68 g of this soft gel-like solution was collected and mixed with 1.58 g of methanol to finally become a fluid solution. On the other hand, 120 mg of potassium carbonate was dissolved in 2 mL of formamide, and both solutions were ice-cooled. Add 1.00 mL of the potassium carbonate solution to the solution to which the above methanol has been added, and keep it at 0 ° C. for 3 minutes while stirring well.
  • Example 5 As in Example 2, 384 mg of TSG-10 manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd. was added to 790 mL of liquid paraffin that had been contacted with a 1: 4 v / v mixture of formamide and methanol in advance and saturated, and heated to 60 ° C. The latter was dissolved and kept at 20 ° C. (solution 5). On the other hand, 19.3 g of methanol was mixed with 109.2 g of the formamide solution of cellulose diacetate used in Example 4 to obtain a fluid solution, which was kept at 20 ° C. (solution 4). A solution (solution 6) obtained by dissolving 620 mg of potassium carbonate in 12.9 g of formamide was added to the solution 4 and mixed.
  • FIG. 4 shows an infrared absorption spectrum of the obtained particles, which was washed successively with methanol and 2-propanol, dried, and measured by the KBr disk method.

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Abstract

セルロースアセテートから多孔質セルロース媒体を好適に製造することができる新規な方法を提供する。セルロースアセテートが溶媒に溶解したセルロースアセテート溶液を準備する工程、及び、前記セルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合して混合溶液を得る工程、を備える、多孔質セルロース媒体の製造方法。

Description

多孔質セルロース媒体の製造方法
　本発明は、多孔質セルロース媒体の製造方法に関する。
　セルロースを代表とする多糖およびその誘導体は、さまざまな用途に利用されている。例えば、これらの微多孔質体は、それ自体が吸着剤となりうるし、またその表面に何らかの化学修飾を行うことにより、吸着や分離の機能が付与できる。
　近年、酵素利用の普及、バイオ医薬の開発などにより、タンパク質を始めとする生体高分子の分離精製は、重要な技術的課題の一つとなっている。これを解決するための重要な手段がクロマトグラフィーである。クロマトグラフィーでは、目的物あるいは除去対象となる不純物と相互作用する何らかの原子団（しばしばこれをセレクタと呼ぶ）をマトリクスと呼ばれる固体に結合した分離剤が用いられる。
　タンパク質の非特異吸着がないことは、生体高分子を分離するための材料として極めて重要な特性であり、そのために多糖類がマトリクスとして重用されている。また、多糖類は分子内に水酸基を多く持つため、これを足場としてエーテル結合やエステル結合を介して容易にセレクタを結合することが出来、これも多糖類が重用される大きな要因となっている。
　また、生体高分子を分離精製するためには、一般的に、マトリクスに目的とする分子と何らかの親和性をもつセレクタを結合し、目的分子を吸着させた後に、何らかの方法で吸着させた目的分子を遊離させて回収する方法を用いる。多量の目的分子を得るためには、多量のセレクタを結合することができることが求められる。さらに、そのセレクタと分子量の大きい生体高分子を効率よく相互作用させるために、マトリクスが、目的分子が自由に出入りできるような多孔質構造を備えていることが求められる。言い換えれば、該マトリクスをカラムに充填してサイズ排除クロマトグラフィーを行ったときに、精製したい分子とリガンドを併せたサイズよりも大きい排除限界を示すことが必要である。
　このようなマトリクスは、多くの場合、粒子としてカラムと呼ばれる管の中に充填して用いられる。一方、近年注目されている新たな形態は、モノリスと呼ばれる一体の多孔質体である。これはキャピラーと呼ばれる細管や、カラムなどの容器に納めることにより、同じ用途に用いられる。比較的薄く面積の大きいモノリスは、ろ過膜として使うことも出来る。
　このようなマトリクスの使いやすさの要因として、分離対象に対する選択性に加えて、その物理強度の高さが挙げられる。すなわち、弾性率の低いマトリクスは、クロマトグラフィーやろ過において液体や気体を流したときに、圧縮変形や破断を被り、その結果クロマトグラフィーカラム内の液の流れが不均一になり、さらには閉塞することにより、カラムの分離効率を著しく低下させる。物理的強度の高さは重要な特性であり、この点において、セルロースは、多糖類の中でも優れた材料となっている。
　他にも、セルロースは、多糖の一般的な特徴としてその表面にアルコール性水酸基を持つため、化学反応によって多様な原子団を結合することが可能であること、純度の高い素材が多量に、比較的安価に入手できることなどの利点がある。
　以上の理由から、生体高分子の分離精製を主目的とする多孔質セルロース媒体が開発されている。これを製造するための方法としては、セルロースを何らかの方法で溶かした後、再生する方法が知られている。一方、有機酸エステルを出発原料にする方法もいくつか見られる。これは、セルロースそのものを直接溶解することは、特殊な溶媒を必要としたり、溶液の粘度が非常に高いなどの難しさがあるのに対し、有機酸エステルは多くの溶媒に溶かすことができること、セルロースの有機酸エステルが、さまざまな有機酸とのさまざまな結合率、また重合度で、安定した品質の下、工業的に供給されること、また容易にエステル結合を分解し、セルロースを再生できることなどの利点を利用したものである。
　多孔質セルロース媒体の製造方法として、例えば特許文献１には、セルロース有機酸エステルをハロゲン化炭化水素のような有機溶媒に溶解させた溶液を、水性媒体中に分散してエステル溶液の微小液滴を形成させ、そこにアンモニウム塩などの加水分解促進剤を添加して該エステルの加水分解を行って、セルロース微小粒子を形成することが記載されている。
　また、特許文献２には、セルロース脂肪酸エステルと、セルロース脂肪酸エステルのゲル化剤とを有機溶媒に溶解して溶液として、その溶液を水性媒体に撹拌添加して液滴を形成させ、さらに凝固促進剤を加えて液滴中のセルロース脂肪酸エステルをゲル粒子とし、生成した粒子からゲル化剤、凝固促進剤及び溶媒を除去することで、多孔球状粒子を製造する方法が記載されている。
　特許文献３には、セルロースを、パラホルムアルデヒドと、ジメチルスルホキシドの混合液に溶解し、その溶解液を分散媒体に分散させた後、凝固剤としてケイ素化合物を投入してセルロースの分散液滴をゲル化凝固して、粒状セルロースゲルを作製する方法が記載されている。
　非特許文献１には、セルロースアセテートを水溶解性の有機溶媒（アセトンとＤＭＳＯの混合溶媒）に溶解させ、これを水に分散させることで、セルロールアセテートを含む溶液が水に接触して凝固し、多孔質の粒子を形成することが記載されている。
　非特許文献２には、セルロースジアセテートを、ＤＭＳＯに溶解させ、その後無水硫酸ナトリウムを加えて撹拌し、混合物を酸凝集浴槽（塩酸）に投入してセルロース粒子（ビーズ）を得ることが記載されている。また、ビーズの多孔性を高めるために、採取後のビーズを多量の温水に浸漬して硫酸ナトリウムを除去する手段が記載されている。また、非特許文献３には、水を含む溶媒とセルロースアセテートを含む均一組成物が、ある温度以下になると相転移（液状－ゲル状）を起こし、ゲル化することが報告されている。
特開昭６２－２７７４０１号公報 特開昭６３－９５２３７号公報 特開昭５７－１５９８０１号公報
Chen, L. F.; Tsao, G. T. Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, 1507 Bai, Y.-X.; Li, Y.-F. Carbohydr. Polym. 2006, 64, 402 A. J. Reuvers他, J. Polym. Sci., 1986, 24, 793
　例えば、特許文献１，２の方法では、ハロゲン化炭化水素を含む溶媒を用いており、粒子の作製の際にその溶媒の除去を気化で行うために、大きなエネルギーと、気化させた溶媒を回収するための装置が必要になる。また、特許文献２や３に記載のような凝固促進剤や凝固剤を用いた方法では、形成された液滴の中で凝固促進剤等と接触した部分で緻密なセルロース脂肪酸エステルの膜が形成されることで、いびつな粒子形になることがある。このことから、特許文献２や３に記載のように、液滴を形成させた後にゲル化を行わせる場合には、反応に偏りが生じる可能性がある。
　また、非特許文献１では、形成させたビーズをホルムアルデヒドと塩酸を用いて架橋反応を起こさせてビーズを架橋させることが記載されている。また、非特許文献２では、粒子に細孔を設けるために細孔形成剤を用いることが記されている。しかしながら、非特許文献１及び非特許文献２のいずれも、粒子の形成の際にその表面を処理する工程を含ませており、多孔質セルロース粒子を得るためには、表面処理に用いた物質を除去する必要がある。
　このように、多孔質セルロース媒体を製造する方法については、種々知られているが、セルロースアセテートから多孔質セルロース媒体を好適に製造できる新規な方法がさらに求められている。
　このような状況下、本発明は、セルロースアセテートから多孔質セルロース媒体を好適に製造することができる新規な方法を提供することを主な目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、セルロースアセテートが溶媒に溶解したセルロースアセテート溶液を準備する工程、及び当該セルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合する工程を備える、多孔質セルロース媒体の製造方法によれば、好適に多孔質セルロース媒体を製造できることを見出した。より具体的には、本発明においては、セルロースアセテートを含む混合溶液中の触媒の量や種類を調整することによって、脱アセチル化剤によるセルロースアセテートの脱アセチル化速度を調整することができる。これにより、例えば多孔質セルロース媒体を多孔質セルロース粒子の形態で製造する場合には、触媒の量や種類を調整することによって、前記混合溶液が分散した状態で所望の速度で混合溶液をゲル化させることができ、多孔質セルロース媒体により構成された多孔質セルロース粒子が好適に製造されることを見出した。また、例えば多孔質セルロース媒体を多孔質セルロースモノリスの形態で製造する場合には、触媒の量や種類を調整することによって、モノリス中に好適に多孔質構造が形成される速度で混合溶液をゲル化させることができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
項１．　セルロースアセテートが溶媒に溶解したセルロースアセテート溶液を準備する工程、及び
　前記セルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合して混合溶液を得る工程、
を備える、多孔質セルロース媒体の製造方法。
項２．　前記触媒が、アルコキシド、アミン化合物、弱塩基性無機化合物、及びＮ－ヒドロキシアミン誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
項３．　前記アミン化合物が第３級アミンであり、前記弱塩基性無機化合物が炭酸塩である、項２に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
項４．　前記混合溶液を成形容器内で静置した状態で、前記セルロースアセテートの脱アセチル化反応を進行させて、多孔質セルロース媒体により構成された多孔質セルロースモノリスを得る、項１～３のいずれかに記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
項５．　前記混合溶液と、前記混合溶液とは混和しない分散媒体とを混合し、前記混合溶液が分散した状態で、前記セルロースアセテートの脱アセチル化反応を進行させて、多孔質セルロース媒体により構成された多孔質セルロース粒子を得る、項１～４のいずれかに記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
項６．　前記分散媒体が流動パラフィンである、項５に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
項７．　項１～６のいずれかに記載の製造方法により得られた多孔質セルロース媒体に、アフィニティーリガンドを固定化する工程を備える、吸着体の製造方法。
項８．　前記アフィニティーリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、及びこれらの機能性変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項７に記載の吸着体の製造方法。
項９．　項１～６のいずれかに記載の製造方法により得られた多孔質セルロース媒体にアフィニティーリガンドを結合させて得られた吸着体と、標的物質を含む混合物とを接触させて、前記アフィニティーリガンドに前記標的物質を結合させる第一の工程、及び
　前記吸着体の前記アフィニティーリガンドに結合した前記標的物質を分離する第二の工程
を含む、標的物質の精製方法。
　本発明によれば、セルロースアセテートから多孔質セルロース媒体を好適に製造することができる新規な方法を提供することができる。
実施例１で得られた固体の割れた面の電子顕微鏡写真の画像である。 実施例２で得られたゲルビーズの光学顕微鏡写真である。 実施例５で得られたビーズの光学顕微鏡写真である。 実施例５で測定した赤外吸収スペクトルである。
　本発明の多孔質セルロース媒体の製造方法は、セルロースアセテートが溶媒に溶解したセルロースアセテート溶液を準備する工程、及び当該セルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合して混合溶液を得る工程を備えることを特徴とする。本発明の多孔質セルロース媒体の製造方法は、このような構成を備えていることにより、セルロースアセテートから多孔質セルロース媒体を好適に製造することができる。以下、本発明の多孔質セルロース媒体の製造方法について詳述する。
　本発明の多孔質セルロース媒体の製造方法においては、セルロースアセテートが溶媒に溶解したセルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合することにより、混合溶液中において、セルロースアセテートの脱アセチル化が進行し、液体－ゲルの相転移が生じることを利用して、多孔質セルロース媒体を製造する。
　なお、本発明において、脱アセチル化による液体－ゲルの相転移とは、流動性を持つ液状の前記混合溶液が、脱アセチル反応が進むに従い流動性を失う現象である。例えば、温度が下がると粘度が高くなる現象は、多くの溶液に認められるが、液体からのゲル化においては、流動性が実質的に完全に無くなり、多くの場合、得られるゲルは白濁する。本発明では、セルロースアセテートが溶媒に溶解したセルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合することにより、セルロースアセテートの脱アセチル反応を進行させて、ゲル化を起こさせる。
　本発明の製造方法においては、まず、セルロースアセテートが溶媒に溶解したセルロースアセテート溶液を準備する。セルロースアセテートは、脱アセチル化によって前述の相転移を起こすものであれば、いかなるものであってもよい。セルロースアセテートの代表的物性として、重合度と置換度を挙げることができる。セルロースアセテートの重合度や置換度を適宜調整することで、液体－ゲルの相転移が起こる脱アセチル化が起きる条件を調整することができる。
　重合度については、得られる多孔質セルロース媒体の機械的強度を高め、使用時の溶媒等への溶出を防ぐために重量平均で５０以上であることが好ましい。一方、上限については入手可能なものであれば、いかなるものも使用できる。
　置換度は、セルロースアセテートの溶解性に強い影響を与える。置換度とは、セルロースのグルコース残基１個が有する３個の水酸基のうち、何個が置換されているかを示す数値である。アセテートの場合には、酢酸含量やアセチル基含量で表現される場合もあるが、これらは互いに換算することが出来る。一般的には、置換度が２．８～２．９付近のものがトリアセテート、２．５付近のものがジアセテートとして流通している。本発明においては、前記相転移を起こすものであれば、いかなる置換度のものであってもよい。
　セルロースアセテートについて、一般に流通しているものには、繊維材料などとして汎用的に用いられる、いわゆるセルロースジアセテート（中でも典型的な製品はアセチル置換度が２．５のものであり、酢酸の含量として表すと（酢化度）５５％付近のもの）と、写真や液晶表示用のフィルム材料として用いられるトリアセテート（アセチル置換度が２．８～２．９のものであり、酢酸の含量として表すと（酢化度）６０％付近のもの）がある。置換度が１付近のもの（モノアセテートと呼ばれるべきものであるが、一般に流通していないため、通称として確立されていない）は、水にも溶ける場合があり、極性溶媒系の選択肢が広い。このように、一般に流通していないグレードは、例えば、それより置換度の高いセルロースアセテートの溶液に計算量の塩基を加えて加溶媒分解することや、その含水酢酸溶液を硫酸などの酸触媒によって加水分解し、適当なタイミングで反応を停止する（硫酸を中和する）ことなどによって得ることができる。例えば、ジアセテート（二酢酸セルロース）を出発物質とし、グルコース単位当り１．５当量の塩基を作用させて得ることができる。塩基としては、中性分子であるため多くの有機溶媒にも混和しやすく、かつ反応が速やかなヒドラジン、ヒドロキシルアミンが使いやすいが、要は原料溶液と混和する塩基であれば、水酸化物、例えば第四級アンモニウム水酸化物なども利用できる。
　アセチル化の程度におけるトリアセテート、ジアセテート、モノアセテートの境界は、明確に区別されていないが、本発明においては、便宜上２．７以上をトリアセテート、１．５以上２．７未満をジアセテート、０．５以上１．５未満をモノアセテートとする。
　セルロースアセテートを溶解させる溶媒としては、セルロースアセテートを溶解できるものであれば、特に制限されないが、本反応が塩基触媒を用いるものであるため、これを失活させる酸性溶媒、たとえば酢酸などは好ましくなく、脱アセチル化剤や触媒の溶解性の高い極性溶媒が好ましい。このような溶媒の例としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルエーテル（ＤＭＥ）、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、トリフルオロエタノール、アセトアミド、ホルムアミドなどの極性溶媒；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン、ジメチルスルホン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎ’－ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミド、テトラメチルウレアなどの非プロトン性極性有機溶媒が例示される。また、後述するように分散媒中に分散させて粒子を作る場合には、溶媒と分散媒とが混和しないことが必要である。これらの条件を満たし、かつ、例えば安価な分散媒である流動パラフィンと混和せず、一般的に流通している溶媒として特に好ましいものは、ＤＭＳＯ、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、ホルムアミドなどが挙げられ、これらの中でもＤＭＳＯがさらに好ましい。また、後述の触媒として弱塩基性無機化合物を用いる場合には、これに対する溶解性のよいホルムアミドが好ましい。溶媒は、１種類単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。また、求められる条件を失わない範囲で、２０体積％以下の上記以外の溶媒を含んでもよい。
　セルロースアセテート溶液中におけるセルロースアセテートの含有量としては、特に制限されないが、得られる多孔質セルロース媒体が実用に適した細孔径と適度な硬さを有する観点から、好ましくは１質量％～１５質量％程度、より好ましくは３質量％～１０質量％程度が挙げられる。
　次に、本発明の製造方法においては、セルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合して混合溶液を得る工程を行う。当該工程において、セルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合することにより、セルロースアセテートの脱アセチル化反応が進行し、混合溶液のゲル化（液体－ゲルの相転移）が開始する。
　脱アセチル化剤としては、セルロースアセテートを脱アセチル化できるものであれば、特に制限されず、公知のものが使用できる。本発明において、脱アセチル化剤の好ましい具体例としては、アルコール、アミン、アミノアルコール、水などが挙げられる。また、アルコールの具体例としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－メチルプロパノールなどの炭素数１～４の脂肪族１価アルコール；ベンジルアルコールなどの芳香族アルコール；エチレングリコール、１，３－プロピレングリコール、１，２－プロピレングリコール、グリセリン、ブタン－１，４－ジオール、ブタン－１，２，４－トリオール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、キシリトールなどの炭素数２～６の多価アルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールなどのモノメチルあるいはモノエチルエーテルが挙げられる。また、アミンとしては、アンモニア、炭素数１～５の脂肪族１級アミン、炭素数１～５の脂肪族２級アミン、ジアミン、ベンジルアミンなどが挙げられる。アミノアルコールの具体例としては、２－アミノエタノール、３－アミノプロパノールなどが挙げられる。これらの中でも、後述の触媒としてアルコキシドを用いる場合には、アルコールが好ましく、メタノールまたはエタノールが特に好ましい。また、後述の触媒としてアミン化合物を用いる場合には、アミンが好ましい。脱アセチル化剤は、１種類単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　脱アセチル化剤の使用量としては、セルロースアセテートの溶解を阻害しない範囲で特に制限されないが、脱アセチル化を良好に起させる観点からは、セルロースアセテートのアセチル基に対して、好ましくは１．０モル倍～３０モル倍程度、より好ましくは１．２モル倍～１５モル倍程度が挙げられる。なお、本発明においては、後述の触媒の使用量と共に脱アセチル化剤の使用量についても調整して、脱アセチル化によるゲル化速度を調整し、所望の形態を有する多孔質セルロース媒体を製造することができる。
　触媒としては、セルロースアセテートの脱アセチル化反応を触媒できるものであれば、特に制限されないが、好ましくはアルコキシド、アミン化合物、弱塩基性無機化合物、Ｎ－ヒドロキシアミン誘導体などが挙げられる。アルコキシドとしては、前述の脱アセチル化剤として例示したアルコールの金属アルコキシドが挙げられる。金属アルコキシドを構成している金属としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムなどが挙げられる。これらの中でも、ナトリウムアルコキシドが好ましく、ナトリウムエトキシド、ナトリウムメトキシドが特に好ましい。また、アミン化合物としては、４－ジメチルアミノピリジン、４－ピロリジノピリジンなどの３級アミンが挙げられる。弱塩基性無機化合物としては炭酸塩、とくに溶解性の良いものとして炭酸カリウム、炭酸セシウムが挙げられる。Ｎ－ヒドロキシアミン誘導体としては、Ｎ－オキシスクシンイミド、Ｎ－オキシフタルイミド、Ｎ－オキシベンゾトリアゾール等のＮ－オキシイミドとアミン、あるいはＮ－オキシイミドと等モル以下のアルカリとの組み合わせなどが挙げられる。また、触媒としては、たとえば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの基：Ｎ－ＯＨを有する化合物の塩なども挙げられる。触媒は、１種類単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　触媒としては、これらの中でも、前述の脱アセチル化剤としてアルコールを用いる場合には、アルコキシドが好ましい。また、前述の脱アセチル化剤としてアミンを用いる場合には、アミン化合物が好ましい。
　触媒の使用量としては、用いる触媒の活性、好ましい反応速度などに応じて自由に選択できることが、本発明の特徴であり、特に制限されないが、あまり少ない場合には空気中の二酸化炭素による不活性化、その他の副反応（考えられる例としては、ホルムアミドの加水分解によるギ酸、セルロースアセテートの加水分解による酢酸が原因となる不活性化など）により反応速度（ゲル化に要する時間）が不安定になる可能性がある。脱アセチル化を良好に起させる観点からは、触媒の使用量は、脱アセチル化剤１モルに対して、好ましくは０．０１モル～２モル程度、より好ましくは０．０５モル～０．５モル程度が挙げられる。本発明においては、混合溶液中の触媒の量や種類を調整することによって、脱アセチル化剤によるセルロースアセテートの脱アセチル化速度を調整することができる。これにより、後述のように、例えば多孔質セルロース媒体を多孔質セルロース粒子の形態で製造する場合には、触媒の量や種類を調整することによって、前記混合溶液が分散した状態で所望の速度で混合溶液をゲル化させることができ、多孔質セルロース媒体により構成された多孔質セルロース粒子を好適に製造することができる。また、例えば多孔質セルロース媒体を多孔質セルロースモノリスの形態で製造する場合には、触媒の量や種類を調整することによって、モノリス中に好適に多孔質構造が形成される速度で混合溶液をゲル化させることができる。
　混合溶液には、他の溶媒を混合してもよい。他の溶媒としては、例えば、前述のセルロースアセテート溶液を調製するために用いた溶媒や、前述の脱アセチル化剤を溶媒として使用することもできる。また、例えば、前述の触媒として用いられる金属アルコキシドなどは、溶媒中に溶解または分散した状態で混合溶液中に加えられることが一般的であり、金属アルコキシドが溶解または分散している溶媒についても、当該他の溶媒となり得る。他の溶媒についても、１種類単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　混合溶液中において、セルロースアセテートの脱アセチル化反応を起こさせる温度としては、混合溶液が沸騰したり氷結固化しない範囲であれば特に制限されないが、好ましくは－１０℃～１００℃程度、より好ましくは０℃～８０℃程度が挙げられる。
　具体的な脱アセチル化反応の条件については、各成分の溶媒に対する溶解性、反応速度に応じて適宜設定すればよく、一義的に定めることはできないが、利用目的にふさわしい程度にセルロースアセテートのアセチル基が除かれるよう設定すればよい。例えば、脱アセチル化に要する時間、すなわち混合溶液がゲル化するまでの時間としては、例えば１分間～４８時間程度、好ましくは５分間～２４時間程度が挙げられる。脱アセチル化に要する時間はできるだけ短い方が、分散媒体に分散させて粒子を得る場合、分散した粒子の再凝集を抑制する観点から望ましい。他方、ゲル化速度が大きすぎると、セルロースアセテート溶液に対して脱アセチル化剤または触媒が均一に混和する前に不均一なゲル化が起こる問題、粒子作製のために分散の操作をする前や最中にゲル化が起こり、球状粒子が得られないなどの問題が起きる場合があるため、上記の好ましいゲル化時間を与えるように調節すればよい。本発明においては、例えば、前述の触媒量を増やすことにより、脱アセチル化に要する時間を短くすることができる。ただし、触媒量が多すぎると、適切な形態の多孔質セルロース媒体が得られない場合があるため、触媒量は適宜調整する。
　本発明において、脱アセチル化反応の終了後は、得られた多孔質セルロースに悪影響を及ぼさない溶媒（例えば、後述の分離溶媒で例示する溶媒）で洗浄し、必要に応じて防腐剤を加える。
　なお、従来の方法、例えば特許文献１では、ゲル化を行った後に脱アセチル化を行っていたが、本発明では、セルロースアセテートの脱アセチル化と共に、これを含む混合溶液のゲル化が進行する。ただし、ゲル化して粒子やモノリスの形状が固定された後でも多少の未反応アセチル基が残存する場合がある。このことが、目的とする機能に悪影響を及ぼさない場合には、ゲルをそのまま所望の用途に利用すればよい。また、未反応アセチル基が残存することによる問題を完全に除きたい場合には、水やアルコール中において、希薄な水酸化アルカリ（一般的には水酸化ナトリウム）、アンモニア、ヒドラジンなどで処理すればよい。ただし、得られた粒子やモノリスを分離精製の実用に供するためには、通常、強度向上を目的とした架橋処理や、タンパクなどの官能基を結合するためのテザーと呼ばれる活性基で修飾する処理が行われる。その際、多くの場合には、強アルカリ（通常は、水酸化ナトリウム水溶液）で処理されるため、残存アセチル基は、意図せずともゲルから除去される。従って、混合溶液から生成したゲルは、完全に脱アセチル化されている必要はない。
　本発明の製造方法においては、混合溶液をゲル化させる際の形状に応じて、多孔質セルロース媒体を、粒子の形態（すなわち、多孔質セルロース粒子）として製造することもできるし、モノリスの形態（すなわち、多孔質セルロースモノリス）として製造することもできる。
　本発明の製造方法において、例えば、多孔質セルロース媒体を粒子の形態として製造する場合には、前述の混合溶液と、当該混合溶液とは混和しない分散媒体とを混合し、当該混合溶液が分散した状態で、セルロースアセテートの脱アセチル化反応を進行させることにより、多孔質セルロース媒体により構成された多孔質セルロース粒子を得る。
　分散媒体としては、前述の混合溶液とは混和せず、当該混合溶液と共に攪拌することによって、混合溶液を分散媒体中に粒子状に分散させることができるものであれば、特に制限されない。例えば、前記混合溶液を分散させた際に、当該混合溶液が凝集することを防ぐために、分散媒体は、混合溶液分散時にある程度の粘度を有していることが好ましい。分散媒体の粘度としては、２５℃において、０．２Ｐａ・ｓ～２０Ｐａ・ｓ程度が挙げられる。
　分散媒体は、前記混合溶媒に含まれる溶媒などと混和しないように、非極性のものであることが好ましく、具体例としては、流動パラフィンやワセリンのような炭素数２０以上の炭化水素、シリコーンオイル、フッ素化炭化水素を挙げることができる。これらの中でも、コスト的には流動パラフィンが好ましい。分散媒体は、１種類単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　ワセリンは特定の軟化温度以下にすると速やかに流動性を失う。このため、分散させた混合溶液の粒子が再凝集して塊を作りやすい場合には、まず軟化温度以上で分散液を調製し、これをまず軟化温度以下に下げ、混合溶液の粒子同士が移動、接触できなくし、粒子の収率を上げる目的に、ワセリンの使用は有効である。ワセリンの軟化温度は、その種類によって異なり、適宜選択することができる。ただし、本発明の製造方法においては、前述の触媒の量や種類を調整することによって、前記混合溶液が分散した状態で所望の速度で混合溶液をゲル化させることができる。このため、本発明の製造方法において、触媒の量や種類を調整すれば、ワセリンなどを用いて混合溶液の再凝集などを抑制する必要が無い。
　多孔質セルロース媒体を粒子状とする場合、セルロースアセテートを含む混合溶液は、分散媒体に分散させた後、脱アセチル化反応の進行によってゲル化するまでの間、分散状態が維持される必要がある。そのために、必要に応じて、分散媒体に適当な分散安定剤を加えてもよい。
　分散安定剤は、前記混合溶液の分散状態の安定性を高め、混合溶液らなる粒子が凝集する速度を遅らせる効果があればいかなるものであってもよい。そのような分散安定剤として、グリセリン、ソルビタン、ポリグリセリン、ショ糖などの多価アルコールと高級カルボン酸とのエステル、極性基を少量含む変性シリコーンなどを挙げることができ、それ以外の市販されている分散安定剤も使用することができる。
　セルロースアセテートを含む前記混合溶液を、分散媒体に分散させる方法としては、種々の方法を挙げることができ、広い範囲の粒子径分布を与える方法から、単分散の粒子径を与える方法など、様々である。例えば、一般的にマイクロリアクターと称されるものを用い、液状の分散媒体を適当な速度で流す中に、より細いノズルからゲル化した混合溶媒を注入する方法は、粒子径がそろったものを作るのに適している。
　また、孔径の一定な膜から混合溶液を分散媒体中に押し出す方法、一定の大きさの孔を開けた内筒に、流動性の混合溶液を入れ、これを分散媒体中で回転させ、ゲル化した混合溶液を遠心力で押し出す方法、一定の大きさのビーズを充填したカラムの中に、必要に応じて分散安定剤を含む分散媒体と流動性の混合溶液を送液する方法、流動性の混合溶液を、振動ノズルを通して分散媒体中に注入する方法、（超）音波を用いる方法など、さまざまな方法を用いることができる。
　後述の実施例においては、撹拌による方法を例示する。これは、前記混合溶液を前記分散媒体に添加した後、強い剪断力を加えて前記混合溶液から構成される概ね球状の粒子を生成させるとともに、分散液滴となった混合溶液の脱アセチル化を起こさせ、ゲル化させる方法である。撹拌混合の条件は、目的とする平均粒子径に応じて適宜選べばよい。攪拌による方法は、さまざまな粒子径の混合物を与えるが、特別な装置を必要としない最も簡単な方法である。
　分散媒体中で分散させた混合溶液は、例えば１分間～４８時間程度、好ましくは５分間～２４時間程度放置して、混合溶液から構成される粒子中で脱アセチル反応を進行させることが好ましい。
　また、多孔質セルロース媒体を粒子状とする場合、分散媒体中に分散した多孔質セルロース粒子を分離するための分離溶媒を、多孔質セルロース粒子が形成された分散媒体と混合して、分離溶媒中に多孔質セルロース粒子を分離する工程をさらに行ってもよい。
　分離溶媒としては、前述の分散媒体とは混和せず、混合溶液のゲルに含まれる成分のうち、セルロースは溶解しないが、他の成分（前述の溶媒、触媒、脱アセチル化剤、セルロース以外の反応生成物など）とは混和するものがよい。これにより、混合溶液のゲルに含まれる成分のうち、生成したセルロース粒子がふたたび溶解したり、外力により変形することを防ぎながら、分散媒などの成分から分離することが出来る。
　このような分離溶媒としては、水、メタノール、エタノール、２－プロパノール、アセトアミド、ホルムアミド、またはこれらの混合物を挙げることができる。これらの中でも、取扱いの容易さから、水を用いることが好ましい。
　分散媒体中に分散した状態の多孔質セルロース粒子を直接ろ別することも出来るが、一般に分散媒体は粘度が高いため、ろ過において圧力がかかり、多孔質セルロース粒子を変形あるいは破壊する危険性が高くなる。分散媒体にこれと混和する低粘度の液体を加えることによってろ過時の圧力を下げることも可能である。
　得られた多孔質セルロース粒子は、水、メタノールやエタノールなどのアルコールを用いた適当な方法で洗浄し、通常水湿の状態で保存する。乾燥させる場合には、糖類、グリセリンなどを適量加える。水湿で長期保存する場合には、腐敗を防ぐためにアルコールやアジ化ナトリウムなどの防腐剤を加える。また、グリセリンや糖類、尿素などを加えた状態で乾燥することもできる。使用するときには、常法によってカラムに充填して用いる。
　本発明の製造方法により得られた多孔質セルロース粒子（粒子状の多孔質セルロース媒体）のうち、公知の適当な分級により、粒径（最大径）１０μｍ～３００μｍ程度の略球状～球状の形状を有するものを選別して、それをクロマトグラフィー用の充填剤として用いることができる。クロマトグラフィーとしては、サイズ排除クロマトグラフィーを挙げることができる。
　サイズ排除クロマトグラフィーに利用できることは、とりもなおさず、適当なリガンドを結合することによって、サイズ排除以外のさまざまのモードによるクロマトグラフィー分離にも利用できることを示す。これらには、イオン交換、疎水性、アフィニティーなどのモードが含まれる。
　一般に、バイオテクノロジーで製造するような高分子、例えばホルモン、酵素、抗体医薬などを分離精製するには、それらの物質が十分進入できるような大きさの細孔を持つマトリクスが好ましい。すなわち、多孔質セルロース粒子を充填したカラムを用い、水を移動相としてゲルろ過クロマトグラフィーを行うと、ポリエチレングリコールの分子量に換算して概ね１０3～１０7の範囲の何らかの分子量領域で分画が起きることが望ましい。
　多孔質セルロース媒体の細孔の大きさは、セルロースアセテートの濃度、当該セルロースアセテートを溶解させる溶媒、触媒、脱アセチル化剤の量や種類、さらに混合溶液のゲル化の条件（特に温度）によって、調整することができる。
　一方、本発明の製造方法において、例えば、多孔質セルロース媒体をモノリスの形態として製造する場合には、混合溶液を任意形状の成形容器内で静置した状態で、セルロースアセテートの脱アセチル化反応を進行させることにより、多孔質セルロース媒体により構成された多孔質セルロースモノリスを得る。
　モノリスは、多孔質素材を一体の塊としたものである。前述の粒子状充填剤を用いたクロマトグラフィーにおいて、展開液は粒子の微細孔も通過するが、展開液の多くは、粒子間間隙を通過する。これに対して、モノリスにおいては、一体の多孔質体の微細孔を展開液が通過する。そのため、展開液の流れに対する抵抗を減らすことが好ましく、それに適した構造を与える条件を選択し、また一般的に粒子状充填剤の場合に比べて固形分含量を低めに設定する。しかし、ろ過材料として用いる場合を除けば、本質的な分離のメカニズムは、粒子状充填剤の場合と変わりがない。
　液体クロマトグラフィーにおいては、分離剤の中のどの部分においても同様な速さで展開液が移動し、いわゆるピストン流を作ることが極めて重要である。充填剤においては、個々の粒子の特性のばらつきが混合によって平均化されるため、多少の粒子間の性質の違いは許容され、しかし液の流れの大きい部分を担う粒子間空隙の均一性が重要となる。これには、充填剤をカラムと呼ばれる容器に充填する際の技術が重要となる。
　これに対してモノリスにおいては、生成する多孔質構造が、展開液の流れに対して直角の方向において均一であることと、モノリスと容器の間に液が流れやすい隙間ができないことが、きわめて重要である。ここで述べた直角方向において均一な多孔質体の調製は、ゲル化剤（沈殿剤）との接触や、公知技術である溶媒の蒸発によって行うことはできない。
　本発明の製造方法においては、前述の触媒の量や種類を調整することによって、モノリス中に好適に多孔質構造が形成される速度で混合溶液をゲル化させることができるため、多孔質セルロースモノリスを製造するには好適である。
　多孔質セルロースモノリスを作製する際には、前記混合溶液を、任意形状の成形容器に投入し、その後、１分間～４８時間程度、好ましくは４分～２４時間程度放置することで、セルロースアセテートの脱アセチル反応を起こさせる。これにより、混合溶液のゲルを形成させ、得られたゲルをそのまま、あるいは容器から取り出した後に、適切な溶媒によって洗浄することにより、モノリスを分離剤等として利用することができる。一般に乾燥は、モノリスの形状の変形を起こしたり、微細孔構造を失わせる場合があるため、避けることが好ましいが、適切な不揮発性添加剤を共存させれば可能となる。不揮発性添加剤としては、グリセリン、蔗糖、トレハロース、水あめなどの糖や糖アルコール、各種アミド、ＤＭＳＯなどの極性化合物が適している。
　多孔質セルロースモノリスの特性を評価するには、すでに述べたように、適切な容器に隙間や局部的な圧密化がないように納める必要がある。このための方法は、公知のどのようなものであってもよい。通常、ゲル化によって多孔質セルロースモノリスが生成するときには、多少の収縮が起こり、容器との間に隙間ができることが多い。そのような場合、容器壁面をセルロース系物質と親和性の強い化学構造に修飾し（例えば表面にセルロースを結合する）、隙間ができないようにするか、あるいはゲルの環境変化による収縮・膨潤を利用し、あるいは容器のサイズを適合可能にすることなどによって、隙間なく納めることが可能になる。
　本発明においては、前述の製造方法により得られた多孔質セルロース媒体に、アフィニティーリガンドを固定化することにより、吸着体を製造することができる。すなわち、本発明の多孔質セルロース媒体を製造する方法において、アフィニティーリガンドを固定化する工程をさらに含ませることで、アフィニティーリガンドが結合した吸着体を製造することができる。この吸着体は、アフィニティークロマトグラフィー用の分離剤としても利用することができる。本発明の多孔質セルロース媒体は、例えば多孔質セルロースモノリス及び多孔質セルロース粒子のいずれの形態であっても、アフィニティーリガンドを結合させることで、アフィニティークロマトグラフィー用の分離剤や吸着体として利用することができる。
　以下、本発明において、アフィニティーのモードで用いる吸着体を製造する方法について詳述する。アフィニティーリガンドとしては、タンパク質を用いることができる。本発明で用いることのできるタンパク質は、分子量３～３００ｋＤａ、好ましくは３０～１５０ｋＤａであって、分離対象とする例えば抗体のようなタンパク質に対して親和性のある物質が挙げられる。これらの中でも、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びこれらの機能性変異体が抗体のタンパク質の分離に用いる際の選択率が高く好ましい。
　抗体の分離を主目的とする場合、リガンドとしては、免疫グロブリンの一部と特異的に結合可能なものが好ましい。上記機能性変異体は、天然アミノ酸配列において少なくとも１つの変性を有し、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持しているタンパク質を指す。天然配列には、本来自然に発生するアミノ酸配列が含まれる。アミノ酸の変化としては、１つ以上のアミノ酸の別のアミノ酸への置換、１つ以上のアミノ酸の削除および／または１つ以上のアミノ酸の追加またはこれらのいずれかの組合せを挙げることができる。天然配列に対して行われる追加、削除および置換の組合せのような態様も挙げられる。機能性変異体は、タンパク質の断片またはドメインを含むこともできる。機能性変異体のアミノ酸配列は、天然アミノ酸配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一であってもよく、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持している。
　上記多孔質セルロース媒体に対するタンパク質の担持量は、多孔質セルロース媒体１００質量部に対して１．０質量部～２５質量部程度であることが好ましい。また、多孔質セルロース媒体の体積１ｍｌあたり、１ｍｇ～５０ｍｇ程度であることが好ましい。
　多孔質セルロース媒体に、アフィニティーリガンドを固定化する具体的な方法としては、例えば、架橋剤を用いる方法が挙げられる。架橋剤としては、特に制限されることはなく、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンやビスオキシランやポリオキシランなどが挙げられる。
　架橋剤を用いる場合、多孔質セルロース媒体を架橋した後、アフィニティーリガンドと反応させる前に、架橋した多孔質セルロース媒体を活性化させてもよい。例えば、公知の反応性官能基を導入することにより、架橋させた多孔質セルロース媒体を活性化することができる。例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ,Ｎ’－ジスクシンイミジル炭酸エステル（ＤＳＣ）、エポキシド及び活性化カルボン酸（ＮＨＳエステル）などで活性化することで、多孔質セルロース媒体が元々持っている官能基よりも、リガンドとして固定化する化合物が反応しやすい官能基に変えることができる。そして、その後、リガンドとして固定化する化合物と反応させて、リガンドと多孔質セルロース媒体を固定化する工程を経て、吸着体を製造することができる。
　また、他の吸着体の製造方法として、多孔質セルロース媒体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することで、多孔質セルロース媒体とリガンドを固定化し、吸着体を得る方法が挙げられる。
　多孔質セルロース媒体とアフィニティーリガンドとを結合させる別の態様として、多孔質セルロース媒体にホルミル基を導入して、そのホルミル基とタンパク質のアミノ基とを反応させる態様を挙げることができる。ホルミル基を導入する反応については、例えば、ビシナルの水酸基を持つ多糖類を、過ヨウ素酸酸化法によって酸化し、糖鎖上にホルミル基を生成させる方法を挙げることができる。
　また、エポキシ基の開環により得られるグリセリル基に、過ヨウ素酸塩を作用させる方法等により得られる各種スペーサーを介して、ホルミル基を導入する方法が挙げられる。例えば、スペーサーとしてグルコサミン等のようなアミノ糖を用いることができる。
　そして、多孔質セルロース媒体のホルミル基と、プロテインＡのようなタンパク質を結合させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、グルコサミン等のようなアミノ糖をスペーサーとして導入された多孔質セルロース媒体と、プロテインＡを含有する溶液とを反応させる態様を挙げることができる。そのような方法として例えば、特開２００８－２７９３６６号公報に記載の方法を挙げることができる。
　上記で説明した、本発明の製造方法により作製された多孔質セルロース媒体に、アフィニティーリガンドを結合させて得られた吸着体を用いることで、様々な標的分子を精製することが可能となる。
　標的分子としては、例えば免疫グロブリンのようなタンパク質を挙げることができる。免疫グロブリンとしては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびその機能的断片を挙げることができる。
　本発明の精製法は、以下のような工程を含む。本発明の製造方法により製造された多孔質セルロース媒体にアフィニティーリガンドを結合させて得られた吸着体と、標的物質を含む混合物とを接触させて、アフィニティーリガンドに標的物質を結合させる第一の工程と、吸着体のアフィニティーリガンドに結合した標的物質を分離する第二の工程を含む。
　吸着体のアフィニティーリガンドに結合した標的物質を分離する方法としては、第一の工程と第二の工程との間で、ｐＨを変化させることや、塩濃度を変化させることが挙げられる。具体的には、第一の工程のｐＨを６～８のような中性に設定し、第二の工程の６未満のような酸性に設定することが挙げられる。また、塩濃度については、第一の工程で０．１Ｍ未満とし、第二の工程では０．１Ｍ以上としたり、第一の工程で０．１Ｍ以上としていたものを、第二の工程で０．１Ｍ未満にすることを挙げることができる。以上、免疫グロブリンの精製を例にとって説明してきたが、そのほかにも、イオン交換基、シクロデキストリン、色素（たとえばＣＩＢＡ　Ｃｈｒｏｎｂｌｕｅ）などをリガンドとして結合し、酵素、血漿タンパク、ワクチンなどの精製、リポポリサッカリドの吸着除去など、さまざまな用途に利用することができる。
　以下に、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は、実施例に限定されない。
＜実施例１：多孔質セルロースモノリスの調製＞
　セルロースジアセテート（酢化度５５％　置換度２．５）０．４０ｇをＤＭＳＯ４．６５ｇに溶解した。ここに１．００ｍＬのメタノールを加えると、いったん沈殿が生成したが、よくかき混ぜると再び均一な溶液（セルロースジアセテート溶液）となり、これを氷冷静置した。一方、ＤＭＳＯとメタノールをそれぞれ０．５０ｍＬずつ混和し、これに２０％ナトリウムエトキシド／エタノール溶液（和光純薬社製）１．０４ｍｇを混ぜ、氷冷した。次に、この溶液と、セルロースジアセテート溶液とを手早く混ぜ、１ｃｍ角の柱状セルに流し込み、引き続き氷冷した。柱状セル内の液は、約２時間で固化した。更に２時間氷冷後、一夜室温に置いた後、柱状セルから四角柱状の多孔質セルロースモノリスを取り出し、繰り返し水洗した。得られた多孔質セルロースモノリスは、７．０ｍｍ角の柱状であった。
　次に、得られた多孔質セルロースモノリスの一部を切り取って小片を得た（約５ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍ）。次に、得られた小片を乾燥した後、ＫＢｒ法で赤外吸収スペクトルを測定したところ、１７４０ｃｍ-1に痕跡のＣ＝Ｏ伸縮振動を示したが、多孔質セルロースモノリスは実質的にセルロースであると推定された。次に、この小片の表面に付着した水を吸いとった後、秤量した。さらに、８０℃で恒量化した後、秤量して多孔質セルロースモノリス中のセルロース成分率を測定したところ、１１．０質量％であった。この小片をメタノールに浸漬した後、切片を液体窒素中に投入すると、液体窒素中で自然に割れた。次に、液体窒素中の断片を超臨界二酸化炭素で乾燥したところ、薄くかすんだ固体が残った。この固体の比重を、重量と外形から求めると、約０．２５であった。セルロースの比重は、通常、１．５付近であるとされているため、この固体は明らかにエアロゲルである。この固体の割れた面（液体窒素中で自然に割れた）の電子顕微鏡写真の画像を図１に示す。図１の画像から分かる通り、割れた面には網目状多孔質構造が観察された。
＜実施例２：多孔質セルロース粒子の調製＞
　セルロースジアセテート（酢酸含量５５％）のＤＭＳＯ溶液（セルロースジアセテート：７．８８質量％）５１．６ｇにメタノール１０ｍＬを加え、よく攪拌して均一な透明溶液とし、これを氷冷した（溶液１）。一方、流動パラフィン約１０００ｍＬにＤＭＳＯ／メタノール４６．５：１５（ｖ／ｖ）の混合溶液（約５０ｍｌ）を１日接触させた後、後者を分液除去することにより、ＤＭＳＯ／メタノールを飽和させた流動パラフィン（関東化学（株）製、比重０．８９－０．９１）８００ｍｌを得た。これを１Ｌ容器中にいれて、氷冷した（溶液２）。また、ＤＭＳＯ５．０ｍＬ、メタノール５．０ｍＬ、２０％ナトリウムエトキシド／エタノール溶液（和光純薬社製）１８７ｍｇを混合し、氷冷した（溶液３）。次に、溶液１と溶液３を混合して、良く攪拌した後、溶液２に投入し、直径２ｃｍの攪拌羽を用い、７４０ｒｐｍ、５分間の条件で攪拌した。攪拌後、４時間静置氷冷した後、室温で一夜放置した。次に、水を約２００ｍＬ加え、穏やかに攪拌した後、下層（水相）を別の容器に吸い上げた。水を加えて下層を吸い上げる操作を合計３回繰り返して、セルロース成分を抽出した。次に、得られた水相を静置し、上澄みを傾瀉して、２００ｍＬほどにまで濃縮した後、１ｇのＮａＯＨを加えて更に一夜静置し、多孔質セルロース粒子を得た。得られたゲル粒子の光学顕微鏡写真を図２に示す。光学顕微鏡写真から、多孔質セルロース粒子の直径は、約５０μｍ以下程度の球状粒子が主であることが確認された。
＜実施例３：多孔質セルロースモノリスの調製＞
　セルロースジアセテート１６．０３ｇをＤＭＳＯ１２９．４２ｇに溶かし、溶液を調製した。本溶液３．０４ｇにメタノール７．６ｍＬをゆっくり混和し、透明な溶液を得、氷冷した。一方でリチウムメトキシドの１０％メタノール溶液（和光純薬（株）製）０．１１７ｇをメタノール１．９４ｇ、ＤＭＳＯ２．７７ｇに希釈した液を調製し、氷冷した。このリチウムメトキシドの希釈液の１．００ｍＬを前記のセルローシジアセテート溶液に混和し、手早く混ぜた後、二つの１ｃｍ角柱型のセルに分注した。セルの一方は氷冷したところ、約３時間後に流動性を失い、一方は約２０度の水に浸漬したところ、３０分後に流動性を失い、いずれも白色半透明のゲル状固体を与えた。
＜実施例４：多孔質セルロースモノリスの調製＞
　セルロースジアセテート（酢酸含量５５％）７．２２gをホルムアミド１１２．２１ｇに分散し、攪拌しながら約３０分１２５℃に加熱すると、透明な溶液になり、これを室温に冷却した。翌日、やわらかいゲル状となったこの溶液の８．６８ｇを採取し、メタノール１．５８ｇを混和すると、最終的に流動性の溶液となった。一方で、炭酸カリウム１２０ｍｇをホルムアミド２ｍＬに溶解し、両液を氷冷した。炭酸カリウム溶液の溶液１．００ｍＬを、前記のメタノールを添加した溶液に加え、よく攪拌しながら、３分間０℃に保ったのち、１辺が１．００ｃｍの四角柱状のプラスチックセル２本に注いだ。１本は０℃に保つと、２時間後に流動性を失った。もう１本は室温、２３℃に静置すると、２３分で流動性を失った。一昼夜放置した後、少し収縮して容器から離れたゲル状固体を、純水中で、水を入れ替えながら２日間、良く洗浄した。得られたゲルは、いずれも不透明白色固体であった。ゲルの一部を切り取り、表面に付着した水をろ紙で吸い取った後に秤量し、更に８０℃、常圧で３時間、ついで８０℃、減圧（約１Ｔｏｒｒ）で３時間乾燥し、収縮して小さく透明になったものを秤量し、元のゲルの含水率を調べた。０℃でゲル化したものは１６３．２ｍｇであり、乾燥後に１１．８gとなったため、含水率は９２．８％であ
った。また、２３℃でゲル化したもの１３３．５ｍｇが乾燥後に９．５ｍｇとなったため、含水率は９２．９％であった。
＜実施例５＞
　実施例２と同様に事前にホルムアミドとメタノールの１：４ｖ／ｖ混合液と接触させ、これらを飽和させた流動パラフィン７９０ｍLに、日本エマルジョン社製ＴＳＧ－１０　３８４ｍｇを加えて６０℃に加温して後者を溶解させた後、２０℃に保温した（溶液５）。一方、実施例４で用いたセルロースジアセテートのホルムアミド溶液１０９．２gに、メタノール１９．３ｇを混和し、流動性の溶液とし、２０℃に保温した（溶液４）。溶液４に、炭酸カリウム６２０ｍｇをホルムアミド１２．９ｇに溶解した液（溶液６）を投入、混和した。混和後、速やかに混合液を溶液５中に投入、攪拌翼を用いて約４００ｒｐｍで８分間攪拌した。一昼夜静置した後、水１５０ｍＬを加え、容器を回転して生成した白色粉末状のビーズを水に抽出、分液した。同じ操作を更にもう２回繰り返し、水抽出液を併せた。水中での沈降、上澄みの傾寫を繰り返し、沈降体積７０ｍＬのビーズを得た。この光学顕微鏡写真を図３に示す。また、得られた粒子をメタノールと２－プロパノールで逐次洗浄後、乾燥、ＫＢｒディスク法で測定した赤外吸収スペクトルを図４に示す。赤外吸収スペクトルにおいて、１７３５ｃｍ-1付近にアセチル基のカルボニル基と思われる吸収を示すが、２９２０ｃｍ-1付近の本来弱い吸収より更に弱く、実質的にセルロースであると見做せる。

Claims (9)

  1. 　セルロースアセテートが溶媒に溶解したセルロースアセテート溶液を準備する工程、及び
    　前記セルロースアセテート溶液と、脱アセチル化剤と、触媒とを混合して混合溶液を得る工程、
    を備える、多孔質セルロース媒体の製造方法。
  2. 　前記触媒が、アルコキシド、アミン化合物、弱塩基性無機化合物、及びＮ－ヒドロキシアミン誘導体からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
  3. 　前記アミン化合物が第３級アミンであり、前記弱塩基性無機化合物が炭酸塩である、請求項２に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
  4. 　前記混合溶液を成形容器内で静置した状態で、前記セルロースアセテートの脱アセチル化反応を進行させて、多孔質セルロース媒体により構成された多孔質セルロースモノリスを得る、請求項１～３のいずれかに記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
  5. 　前記混合溶液と、前記混合溶液とは混和しない分散媒体とを混合し、前記混合溶液が分散した状態で、前記セルロースアセテートの脱アセチル化反応を進行させて、多孔質セルロース媒体により構成された多孔質セルロース粒子を得る、請求項１～４のいずれかに記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
  6. 　前記分散媒体が流動パラフィンである、請求項５に記載の多孔質セルロース媒体の製造方法。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の製造方法により得られた多孔質セルロース媒体に、アフィニティーリガンドを固定化する工程を備える、吸着体の製造方法。
  8. 　前記アフィニティーリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、及びこれらの機能性変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項７に記載の吸着体の製造方法。
  9. 　請求項１～６のいずれかに記載の製造方法により得られた多孔質セルロース媒体にアフィニティーリガンドを結合させて得られた吸着体と、標的物質を含む混合物とを接触させて、前記アフィニティーリガンドに前記標的物質を結合させる第一の工程、及び
    　前記吸着体の前記アフィニティーリガンドに結合した前記標的物質を分離する第二の工程、
    を含む、標的物質の精製方法。
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