WO2017195794A1 - 細胞観察装置及びプログラム - Google Patents

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WO2017195794A1
WO2017195794A1 PCT/JP2017/017596 JP2017017596W WO2017195794A1 WO 2017195794 A1 WO2017195794 A1 WO 2017195794A1 JP 2017017596 W JP2017017596 W JP 2017017596W WO 2017195794 A1 WO2017195794 A1 WO 2017195794A1
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WO
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cell
photograph
photographing
specifying
unit
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/017596
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
本望　修
吉川　義洋
大揮 舘山
Original Assignee
北海道公立大学法人札幌医科大学
ニプロ株式会社
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Publication date
Application filed by 北海道公立大学法人札幌医科大学, ニプロ株式会社 filed Critical 北海道公立大学法人札幌医科大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters

Definitions

  • the present invention relates to a cell observation apparatus for observing the state of cells in a medium.
  • cells are cultured for disease treatment or pharmaceutical production and evaluation.
  • the cells are cultured in an incubator installed in a sterile room with the temperature, humidity and the like kept constant.
  • an operator who performs cell culture needs to regularly observe the state of the cells in culture for the purpose of, for example, determining the timing of passage.
  • Patent Document 1 discloses a photographing unit installed in an incubator for photographing a cultured cell, and a display unit disposed on an outer surface of the incubator for displaying an image of the cultured cell photographed by the photographing unit.
  • An incubator comprising: is disclosed. Thereby, it can observe, without taking out a cultured cell from an incubator.
  • the worker observing the cultured cells determines the passage timing by, for example, determining the number of cultured cells in the petri dish, the area occupied by the cultured cells in the petri dish, and the like.
  • the incubator described in Patent Document 1 since the state of the cultured cells must be determined from the image captured by the imaging means, there is a problem that skill is required for the determination.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a cell observation apparatus capable of quantitatively evaluating the state of cultured cells.
  • a cell observation device includes an imaging unit that takes a photograph and a control unit.
  • the control unit causes the photographing unit to photograph a culture medium containing cultured cells according to a first photographing condition, and a second photographing that is different from the first photographing condition.
  • a second photographing process for acquiring a second photograph by causing the photographing unit to photograph according to a condition, and a first identifying process for identifying a cell region estimated to be a region where the cultured cells are present in the first photograph.
  • a second specifying process for specifying a cell position estimated as a position of a cell nucleus of the cultured cell, and the first specifying among the cell positions specified in the second specifying process.
  • a count process is performed in which the number of the cell positions located in the cell region specified by the process is counted as the number of cells of the cultured cells.
  • the state of the cultured cells can be quantitatively evaluated. As a result, even an operator who is not skilled in determining the state of the cultured cells can appropriately determine the passage timing, for example.
  • the control unit replaces a pixel value less than a first threshold in the first photo data indicating the first photo with a first value, and the first threshold value.
  • the area specifying process to be executed is executed.
  • the area where the cultured cells are present and the area of the culture medium can be distinguished from each other by the difference in pixel value (typically, the luminance value).
  • control unit specifies, as the cell region, a region where pixels having the first value continue for a threshold number or more.
  • the first value may be assigned to the position of the noise included in the first photo by the generation process. However, since the noise is smaller than that of the cell, the influence of the noise can be reduced by setting the area in which the first value pixels continue for the threshold number or more as the cell area.
  • the control unit extracts the specific frequency component from the second photo data indicating the second photograph, and the second frequency from which the specific frequency component is extracted.
  • a position specifying process is performed in which the pixel position at the boundary where the change in the pixel value changes from one of decrease and increase to the other is specified as the cell position.
  • the component having a higher frequency than the specific frequency component corresponds to, for example, an image of cell outline, noise due to camera thermal noise, or small dust.
  • a component having a frequency lower than the specific frequency component corresponds to, for example, an image of the cytoplasm and culture medium. Therefore, by removing these from the second photographic data, an image of the cell nucleus can be extracted, so that the number of cells can be accurately counted.
  • control unit applies a conversion process for performing FFT conversion on the second photographic data and a filter for passing the specific frequency component to the second photographic data after the conversion process. And a reverse conversion process for performing FFT reverse conversion on the second photo data after the filter process.
  • an image of a cell nucleus can be easily and accurately extracted by using FFT (Fast Fourier Transform) conversion, band pass filter, and inverse FFT conversion.
  • FFT Fast Fourier Transform
  • control unit executes a calculation process for calculating the area of the cell region specified in the first specifying process.
  • the state of the cultured cell can be further quantitatively evaluated by calculating the area of the cell region.
  • the area calculated in the calculation process may be used to evaluate the proportion of the cultured cells in the petri dish, or used to evaluate the size of the cultured cells by dividing the area by the number of cells. Also good.
  • the cell observation device further includes an output unit.
  • the control unit executes an output process for causing the output unit to output the number of cells counted in the count process.
  • the specific example of the output process is not particularly limited.
  • the number of cells may be displayed on the display unit, or the number of cells may be printed on a printer.
  • the output target is not limited to the number of cells, and the area of the cell region calculated by the calculation process may be further output.
  • the cell observation apparatus includes an irradiation unit that irradiates the medium with light.
  • the first photographing condition indicates that the first photograph is photographed with the light having the first wavelength output from the medium among the light irradiated by the irradiation unit.
  • the second imaging condition indicates that the second photograph is taken with light having a second wavelength longer than the first wavelength output from the culture medium.
  • the first wavelength is 400 nm or more and 700 nm or less.
  • the second wavelength is 700 nm or longer and is longer than the first wavelength.
  • the photographing unit includes an adjusting unit that adjusts the position of the focal point.
  • the first photographing condition indicates that the first photograph is photographed in a state where the outline of the cultured cell is focused.
  • the second photographing condition is that a third photograph is taken in a state in which the focus is closer to the photographing unit than the first photographing condition, and a focal point is located farther from the photographing unit than the first photographing condition.
  • the control unit acquires a difference between pixel values of the third photograph and the fourth photograph as the second photograph.
  • a cell observation device includes an imaging unit that takes a photograph and a control unit.
  • the control unit causes the photographing unit to photograph a culture medium containing cultured cells according to a first photographing condition, and a second photographing that is different from the first photographing condition.
  • a calculation process for calculating the area of the cell region specified in the first specifying process.
  • the program according to the present invention can be executed by a computer.
  • the program acquires photographic data indicating a first photograph obtained by photographing a medium containing cultured cells according to a first photographing condition and a second photograph obtained by photographing the medium according to a second photographing condition different from the first photographing condition.
  • a first specifying process for specifying a cell area that is estimated to be an area where the cultured cell is present, and in the second photograph, the position of the cell nucleus of the cultured cell is estimated.
  • the number of cultured cells or Calculation processing for calculating the area of the cell region is executed by the computer.
  • the state of the cultured cells can be quantitatively evaluated by counting the number of cultured cells.
  • FIG. 1 is a functional block diagram of a cell observation device 10 according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart of the cell observation process according to the present embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the first photograph and the second photograph taken in steps S11 and S12.
  • FIG. 4 is an example of the binary image generated in step S14.
  • FIG. 5 is an example of a binary image from which the noise 34 has been removed in step S15.
  • FIG. 6 is an example of a second image in which the cell nucleus 31 and the noise 34 are extracted in steps S17 to S19.
  • FIG. 7 is a diagram schematically showing changes in luminance values of pixels arranged in a line in the second photograph after the FFT conversion.
  • FIG. 8 is an example of the second image in which the plot 50 is set in step S20.
  • FIG. 9 is an example of an image obtained by superimposing the plot 50 on the binary image shown in FIG.
  • the cell observation device 10 includes an irradiation unit 11, a first polarizing plate 12 ⁇ / b> A, and a second polarizing plate 12 ⁇ / b> B (these are collectively referred to as “polarizing plate 12”).
  • the image capturing unit 13, the control unit 14, and the display unit 15 are mainly provided.
  • an optical system such as a collimator lens and an imaging lens (not shown) is appropriately disposed on the optical path from the irradiation unit 11 through the polarizing plate 12 to the photographing unit 13.
  • a dashed arrow indicates the traveling direction of light
  • a solid arrow indicates the traveling direction of the signal.
  • the irradiation unit 11 outputs white light including at least light having a first wavelength and a second wavelength longer than the first wavelength.
  • the specific example of the irradiation part 11 is not specifically limited, For example, LED (Light Emitting Diode) etc. can be used.
  • the first wavelength is selected from, for example, 400 nm or more and 700 nm or less.
  • the first wavelength is selected from 500 nm or more and 550 nm or less.
  • the second wavelength for example, a wavelength of 700 nm or longer and longer than the first wavelength is selected.
  • the second wavelength is selected from 700 nm to 900 nm.
  • the first polarizing plate 12A allows only the first wavelength light of the white light irradiated from the irradiation unit 11 to pass therethrough and blocks the light of other wavelengths.
  • the second polarizing plate 12 ⁇ / b> B allows only the second wavelength light of the white light emitted from the irradiation unit 11 to pass therethrough and blocks light of other wavelengths.
  • the specific structure of the polarizing plate 12 is not particularly limited, for example, a general polarizing film in which iodine compound molecules are adsorbed and oriented mainly in polyvinyl alcohol can be used.
  • the imaging unit 13 captures a photograph with the light irradiated from the irradiation unit 11 and passed through the polarizing plate 12. More specifically, the photographing unit 13 receives light that has passed through the polarizing plate 12 and generates photographic data by photoelectric conversion. Then, the photographing unit 13 outputs the generated photograph data to the control unit 14.
  • photography part 13 is not specifically limited, For example, it is a camera provided with imaging elements, such as CCD (Charge Coupled Device), and the lens unit (an example of an adjustment means) which adjusts the position of a focus. Further, it is assumed that the photographing unit 13 according to the present embodiment can take a color photograph.
  • the control unit 14 controls the operations of the irradiation unit 11, the polarizing plate 12, the imaging unit 13, and the display unit 15, and executes image processing on the photographic data acquired from the imaging unit 13.
  • the operation of the control unit 14 will be described later with reference to FIG.
  • the control unit 14 includes, for example, a storage unit that stores a program, and a CPU (Central Processing Unit) that reads and executes the program from the storage unit.
  • a storage unit that stores a program
  • a CPU Central Processing Unit
  • the display unit 15 displays information according to the control of the control unit 14.
  • the specific configuration of the display unit 15 is not particularly limited, for example, a liquid crystal display (abbreviation of Liquid Crystal Display), an organic EL display (abbreviation of Organic Electro-Luminescence Display), or the like can be employed.
  • the display unit 15 is an example of an output unit.
  • Cell observation processing The cell observation process will be described with reference to FIGS.
  • Each of the following processes may be realized by a program executed by the CPU, may be realized by a hardware circuit mounted on the control unit 14, or may be realized by combining these.
  • a petri dish 20 including a medium 21 for culturing cells is arranged on the optical path from the irradiation unit 11 to the imaging unit 13 of the cell observation device 10. Thereby, part of the light emitted from the irradiation unit 11 passes through the culture medium 21 and reaches the imaging unit 13.
  • the petri dish 20 may be set in the cell observation device 10 by an operator. Or the irradiation part 11 and the imaging
  • the control unit 14 causes the irradiating unit 11 to irradiate white light, and causes the photographing unit 13 to photograph the first photograph (S11).
  • the first photograph is a photograph taken by the photographing unit 13 with the light having the first wavelength that has passed through the first polarizing plate 12 ⁇ / b> A among the light transmitted through the culture medium 21. That is, in step S11, the first polarizing plate 12A is disposed on the optical path from the irradiation unit 11 to the photographing unit 13. And the control part 14 acquires the 1st photograph data which show the said 1st photograph from the imaging
  • FIG. Step S11 is an example of a first shooting process and an acquisition process. Further, the wavelength of the light incident on the imaging unit 13 in step S11 is an example of the first imaging condition.
  • the control unit 14 causes the irradiation unit 11 to irradiate white light, and causes the photographing unit 13 to take a second photograph (S12).
  • the second photograph is a photograph taken by the photographing unit 13 with the light having the second wavelength that has passed through the second polarizing plate 12B among the light that has passed through the culture medium 21. That is, in step S12, the second polarizing plate 12B is disposed on the optical path from the irradiation unit 11 to the photographing unit 13. And the control part 14 acquires the 2nd photograph data which show the said 2nd photograph from the imaging
  • FIG. Step S12 is an example of a second imaging process and an acquisition process. Further, the wavelength of the light incident on the imaging unit 13 in step S12 is an example of the second imaging condition.
  • FIG. 3 is an example of the first photograph and the second photograph taken in steps S11 and S12.
  • the first photo and the second photo have the same shooting conditions such as the field of view, the angle of view, and the magnification, and the wavelengths of light reaching the shooting unit 13 during shooting are different.
  • the first photograph and the second photograph show the cells 30 cultured in the culture medium 21.
  • the cell 30 includes a cell nucleus 31, a cytoplasm 32 surrounding the cell nucleus 31, and a cell wall 33 that forms the outline of the cell 30.
  • the noise 34 is contained in the 1st photograph and the 2nd photograph.
  • the cause of the noise 34 is not particularly limited, for example, noise due to thermal noise of the photographing unit 13, noise due to small dust adhering to the lens of the photographing unit 13, and the like are conceivable.
  • the control unit 14 converts the color first photographic data and the second photographic data (hereinafter collectively referred to as “photo data”) into gray scale photographic data.
  • photo data the color first photographic data and the second photographic data
  • the photographic data generated in step S13 is not limited to gray scale as long as each pixel represents a luminance value.
  • a luminance image obtained by converting photographic data from an RGB color space to a YUV color space and extracting only a luminance signal may be used.
  • Step S13 when the photographing unit 13 generates grayscale photo data, Step S13 can be omitted.
  • the control unit 14 generates binary image data from the first photo data of gray scale (S14). Specifically, the control unit 14 replaces a pixel value less than the first threshold value in the first grayscale photo data with a first value (for example, “0”) 41, and a pixel value greater than or equal to the first threshold value. Is replaced with a second value (for example, “1”) 42 to generate binary image data.
  • the process of step S14 is an example of a generation process.
  • FIG. 4 is an example of a binary image indicated by the binary image data generated in step S14.
  • the pixel value corresponding to the position of the cell 30 and noise 34 in the first photograph becomes the first value (white area in FIG. 4) 41, and the pixel value corresponding to the position of the culture medium 21. Becomes the second value (black region in FIG. 4). That is, in the binary image shown in FIG. 4, the culture medium 21 and the cell 30 are distinguished, and the cell nucleus 31, the cytoplasm 32, and the cell wall 33 are not distinguished.
  • the control unit 14 replaces the pixel value equal to or higher than the first threshold value with the first value and the pixel value lower than the first threshold value with the second value in step S14. That's fine.
  • control unit 14 removes the noise 34 from the binary image data generated in step S14 (S15). Specifically, the control unit 14 changes the pixel value of the pixel from the first value 41 to the second value 42 when the number of continuous first value pixels is less than the threshold number. In other words, the control unit 14 replaces a cluster of pixels having the first value 41 that is sufficiently smaller than the general size of the cell 30 with pixels having the second value 42.
  • FIG. 5 is an example of a binary image in which the second value 42 is set for the pixel corresponding to the noise 34.
  • the binary image shown in FIG. 5 is different from the binary image shown in FIG. 4 in that the second value 42 is set in the pixel at the position of the noise 34.
  • the control part 14 describes the area
  • the process of step S15 is an example of an area specifying process.
  • Steps S14 and S15 are an example of a first specifying process.
  • control unit 14 calculates the area of the pixel having the first value 41 in the binary image shown in FIG. 5 (S16). Specifically, the control unit 14 counts the number of pixels having the first value 41 included in the binary image, and calculates the area of the pixels having the first value 41 by multiplying the number of pixels by the area of one pixel. To do.
  • the area calculated in step S16 corresponds to the area of the cell region included in the first photograph.
  • the process of step S16 is an example of a calculation process.
  • control unit 14 performs FFT (Fast Fourier Transform) conversion on the second grayscale photo data (S17). That is, the control unit 14 converts the second photographic data in the spatial domain into the second photographic data in the frequency domain.
  • FFT Fast Fourier Transform
  • the process of step S17 is an example of a conversion process.
  • the specific example of the process applied to the second photo data in step S17 is not limited to FFT, and may be, for example, discrete cosine transform (Discrete Cosine Transform) or the like.
  • the control unit 14 applies a band pass filter to the second photo data subjected to the FFT conversion (S18).
  • the bandpass filter passes the specific frequency component among the frequency components of the second photographic data after the conversion process, and the frequency component higher than the specific frequency component (hereinafter, referred to as “high frequency component”) and the specific frequency component. It is a filter that blocks (attenuates) lower frequency components (hereinafter referred to as “low frequency components”).
  • the process of step S18 is an example of a filter process.
  • the specific frequency component is, for example, a frequency in a predetermined range corresponding to the complexity of the image representing the cell nucleus 31.
  • the high frequency component corresponds to the complexity of the image representing the outline of the cell 30 (that is, the cell wall 33) and the noise 34, for example.
  • the low-frequency component corresponds to, for example, the complexity of the image representing luminance unevenness due to the bias of the light emitted from the culture medium 21, the cytoplasm 32, and the irradiation unit 11.
  • control unit 14 performs inverse FFT on the second photo data to which the bandpass filter is applied (S19). That is, the control unit 14 converts the second photographic data in the frequency domain into the second photographic data in the spatial domain.
  • the second photo data is subjected to discrete cosine transform in step S17
  • the second photo data is subjected to discrete cosine inverse transform in step S19.
  • the process of step S19 is an example of an inverse conversion process.
  • the processing in steps S17 to S19 is an example of extraction processing for extracting a specific frequency component from the second photograph data.
  • FIG. 6 is an example of the second photograph shown by the second photograph data after the extraction process.
  • the second photograph shown in FIG. 6 corresponds to an image showing a part of the culture medium 21, cytoplasm 32, cell wall 33, and noise 34 removed from the second photograph shown in FIG.
  • part of the noise 34 is still included in the second photograph shown in FIG.
  • the pixel value at the position of the cell nucleus 31 and the noise 34 has a smaller pixel value than the pixels at other positions.
  • An extreme value pixel refers to a pixel at a boundary where a change in luminance value decreases from one to the other when the pixel of the second photograph is scanned in the horizontal direction (or vertical direction), for example.
  • an extreme pixel in the case where the pixel value at the cell nucleus 31 and the noise 34 is smaller than the pixel at the other position is a pixel at the boundary where the change in luminance value starts from decreasing (increase) That is, it refers to a minimal pixel having a minimal pixel value.
  • an extreme value pixel when the pixel value at the cell nucleus 31 and the noise 34 is larger than the pixel value at the other position is a pixel at the boundary where the change in luminance value changes from increase to decrease (that is, the pixel value is maximum). The maximum pixel).
  • FIG. 7 is a diagram schematically showing changes in luminance values of pixels arranged in a line in the second photograph after the FFT conversion.
  • the control unit 14 sets only pixels (solid line portions) having a luminance value less than the second threshold among the pixels illustrated in FIG. 7 as scanning targets. Then, the control unit 14 sets the plot 50 at the pixel position of the minimal pixel A1 having the minimum luminance value in the continuous scanning target pixel row A.
  • the control unit 14 determines the pixel position of the minimum pixel B2 having the minimum luminance value on one side in the scanning direction from the maximum pixel B1, and the maximum pixel B1.
  • the plot 50 is set at the pixel position of the minimal pixel B3 having the minimum luminance value on the other side in the scanning direction.
  • FIG. 8 is an example of the second photograph in which the plot 50 is set.
  • a plot 50 is set at the position of the cell nucleus 31 and the noise 34 included in the second photograph shown in FIG.
  • the cell nucleus 31 and the noise 34 are not shown.
  • the process of step S20 is an example of a position specifying process.
  • the processes in steps S17 to S20 are an example of a second specifying process for specifying the position estimated as the position of the cell nucleus 31 (hereinafter referred to as “cell position”). That is, the position of the plot 50 corresponds to the cell position.
  • the control unit 14 superimposes the plot 50 shown in FIG. 8 on the first photograph shown in FIG. Then, the control unit 14 counts the number of plots 50 that overlap the region of the first value 41 in the image shown in FIG. 9 as the number of cells 30 (hereinafter referred to as “cell number”) (S21). ). That is, in the image shown in FIG. 9, the control unit 14 indicates that the plot 50 that overlaps the area of the first value 41 indicates the position of the cell nucleus 31, and the plot 50 that overlaps the area of the second value 42 indicates the position of the noise 34.
  • Step S21 is an example of a count process.
  • control unit 14 causes the display unit 15 to display the area of the cell region calculated in step S16 and the number of cells counted in step S21 (S22). Further, the control unit 14 may further cause the display unit 15 to display an average value of the areas of the cells 30 obtained by dividing the area of the cell region by the number of cells.
  • the process of step S22 is an example of an output process.
  • the area of the cell region is calculated and the number of cells 30 is counted by performing image processing on the first and second photographs taken using two lights having different wavelengths. Can do.
  • the state of the cell 30 can be quantitatively evaluated even without being a skilled worker, for example, passage timing and doubling time of the medium can be appropriately determined.
  • an example in which both the area calculation and the cell count are executed has been described, but only one of them may be executed. When counting the number of cells is omitted, the processing of steps S17 to S21 is omitted.
  • passage timing and doubling time may be executed by the control unit 14 instead of by the operator.
  • passage is performed when the number of cells reaches a predetermined number.
  • the doubling time tends to increase as the cell area increases, and the doubling time tends to decrease as the cell area decreases. Therefore, the control unit 14 can plan the culture schedule by providing the control unit 14 with the number of cells at the time of passage, the relationship between the cell area and the doubling time, etc. as a database. it can. Then, the planned schedule may be displayed on the display unit 15 in step S22.
  • the culture medium 21 and the cell 30 are distinguished by the difference in the pixel value in the first photograph (S14), and the cell 30 and the noise 34 are determined by the size of the pixel block having the first value 41. Are distinguished (S15). Thereby, the cell area
  • a specific frequency component that is, an image showing the cell nucleus 31
  • the bandpass filter S17 to S19
  • the noise 34 is generated by superimposing it on the binary image. It is removed (S21).
  • the cell observation processing according to the above-described embodiment may be executed for each of a plurality of locations on the petri dish 20. More specifically, the control unit 14 may execute the processes of steps S11 to S21 for different shooting ranges on the petri dish 20. In step S22, the control unit 14 displays the total value (or average value) of the areas calculated in step S16 and the total value (or average value) of the number of cells counted in step S21. You may display on the part 15.
  • the specific configuration of the cell observation device 10 shown in FIG. 1 is not limited to the above-described example.
  • the irradiation unit 11 may selectively output the monochromatic light having the first wavelength and the monochromatic light having the second wavelength under the control of the control unit 14.
  • the polarizing plate 12 can be omitted.
  • the light reaching the imaging unit 13 from the irradiation unit 11 via the culture medium 21 is not limited to transmitting through the culture medium 21 and may be reflected by the culture medium 21.
  • a specific example of the output unit is not limited to the display unit 15 and may be a printer or the like that records information on a sheet.
  • the imaging conditions in steps S11 and S12 are not limited to the different wavelengths of light incident on the imaging unit 13, but may be different focal positions.
  • the position of the focal point is changed by operating the lens unit.
  • the lens unit may be manually operated by an operator of the cell observation device 10 or may be operated by an actuator (not shown) controlled by the control unit 14.
  • imaging conditions in which both the wavelength of light and the position of the focus are different may be employed in steps S11 and S12. Note that the processing after step S13 is common to the above-described example.
  • control unit 14 may cause the photographing unit 13 to photograph the first photograph in a state where the outline of the cell 30 is focused in step S11.
  • the focus position at this time (hereinafter referred to as “first focus position”) is an example of the first imaging condition.
  • the first photograph in this case is a photograph in which the outline of the cell 30 is clearly visible.
  • step S ⁇ b> 12 the control unit 14 causes the imaging unit 13 to perform the third focusing on a position closer to the imaging unit 13 than the first focal position (hereinafter referred to as “second focal position”).
  • the photographer 13 is caused to take a fourth photograph in a state in which the photograph is taken and the focus is set to a position away from the photographer 13 from the first focus position (hereinafter referred to as “third focus position”). May be.
  • the position of the focus at this time is an example of the second imaging condition. That is, the first focal position is located between the second focal position and the third focal position.
  • the distance between the first focal position and the second focal position, and the distance between the first focal position and the third focal position are, for example, 10 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the control unit 14 may acquire the difference between the pixel values of the third photograph and the fourth photograph as the second photograph in Step S12. More specifically, the control unit 14 sets the difference between the pixel values at the same position (for example, the left end) in the third photograph and the fourth photograph as the pixel value at the position (for example, the left end) in the second photograph. Good.
  • the second photograph in this case is a photograph in which the cell nucleus 31 is clearly shown.
  • the cell observation device 10 is not limited to one in which all the components shown in FIG. 1 are integrated.
  • an imaging device including the irradiation unit 11, the polarizing plate 12, and the imaging unit 13 and an image processing device including the control unit 14 and the display unit 15 may be connected via a communication network.
  • the image processing apparatus in this case may be a general PC (Personal Computer), for example.
  • step S12 may be executed between steps S16 and S17.
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Abstract

【課題】培養細胞の状態を定量的に評価することが可能な細胞観察装置を提供する。 【解決手段】細胞観察装置は、第１撮影条件に従って培地を撮影した第１写真を取得する第１撮影処理（Ｓ１１）と、第２撮影条件に従って培地を撮影した第２写真を取得する第２撮影処理（Ｓ１２）と、第１写真内において培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理（Ｓ１４、Ｓ１５）と、第２写真内において培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理（Ｓ１７～Ｓ２０）と、第２特定処理で特定された細胞位置のうち、第１特定処理で特定された細胞領域内に位置する細胞位置の数を、培養細胞の細胞数としてカウントするカウント処理（Ｓ２１）とを実行する。

Description

細胞観察装置及びプログラム
　本発明は、培地内の細胞の状態を観察する細胞観察装置に関する。
　従来より、病気の治療或いは医薬品の生産や評価のために、細胞の培養が行われている。細胞の培養は、無菌室内に設置されたインキュベータ内において、温度及び湿度等を一定に保った状態で行われる。また、細胞の培養を行う作業者は、例えば継代のタイミングを見極めること等を目的として、培養中の細胞の状態を定期的に観察する必要がある。
　ここで、培養細胞の状態を観察する度にインキュベータからシャーレを取り出さなければならないとすると、培養細胞にダメージを与える可能性がある。そこで、例えば特許文献１には、培養細胞を撮影するためにインキュベータ内に設置された撮影手段と、撮影手段で撮影された培養細胞の画像を表示するためにインキュベータの外面に設置された表示手段とを備えるインキュベータが開示されている。これにより、インキュベータから培養細胞を取り出さずに観察することができる。
特開２００５－６５５６７号公報
　培養細胞を観察する作業者は、例えば、シャーレ内における培養細胞の数、シャーレ内において培養細胞が占める面積等を割り出すことによって、継代のタイミングを判断する。しかしながら、特許文献１に記載のインキュベータでは、撮影手段で撮影された画像から培養細胞の状態を判断しなければならないので、その判断には熟練を要するという課題がある。
　本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、培養細胞の状態を定量的に評価することが可能な細胞観察装置を提供することにある。
　(1)　本発明の一形態に係る細胞観察装置は、写真を撮影する撮影部と、制御部とを備える。上記制御部は、培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第１写真を取得する第１撮影処理と、上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第２写真を取得する第２撮影処理と、上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、上記第２写真内において、上記培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理と、上記第２特定処理で特定された上記細胞位置のうち、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域内に位置する上記細胞位置の数を、上記培養細胞の細胞数としてカウントするカウント処理とを実行する。
　上記構成のように、培養細胞の細胞数をカウントすることによって、当該培養細胞の状態を定量的に評価することができる。その結果、培養細胞の状態の判断に熟練していない作業者であっても、例えば、継代のタイミングを適切に判断することができる。
　(2)　好ましくは、上記制御部は、上記第１特定処理において、上記第１写真を示す第１写真データのうち、第１閾値未満の画素値を第１値に置換し、上記第１閾値以上の画素値を第２値に置換した二値画像データを生成する生成処理と、上記二値画像データで示される二値画像のうち、上記第１値の画素の領域を上記細胞領域として特定する領域特定処理とを実行する。
　上記構成によれば、画素値（典型的には、輝度値）の違いによって、培養細胞が存在する領域と、培地の領域とを区別することができる。
　(3)　好ましくは、上記制御部は、上記領域特定処理において、上記第１値の画素が閾値数以上連続する領域を上記細胞領域として特定する。
　生成処理によって、第１写真に含まれるノイズの位置に第１値が割り当てられる可能性がある。しかしながら、ノイズは細胞と比較して小さいので、第１値の画素が閾値数以上連続する領域を細胞領域とすることによって、ノイズの影響を低減することができる。
　(4)　好ましくは、上記制御部は、上記第２特定処理において、上記第２写真を示す第２写真データから特定周波数成分を抽出する抽出処理と、上記特定周波数成分が抽出された上記第２写真の画素値を走査したときに、画素値の変化が減少及び増加の一方から他方に転じる境界の画素位置を上記細胞位置として特定する位置特定処理とを実行する。
　特定周波数成分より周波数の高い成分は、例えば、細胞の輪郭、カメラの熱雑音によるノイズ、或いは小さなゴミ等の画像に対応する。一方、特定周波数成分より周波数の低い成分は、例えば、細胞質及び培地の領域の画像に対応する。そこで、これらを第２写真データから除去することによって、細胞核の画像を抽出することができるので、細胞数を正確にカウントすることができる。
　(5)　好ましくは、上記制御部は、上記抽出処理において、上記第２写真データをＦＦＴ変換する変換処理と、上記変換処理後の上記第２写真データに上記特定周波数成分を通過させるフィルタを適用するフィルタ処理と、上記フィルタ処理後の上記第２写真データをＦＦＴ逆変換する逆変換処理とを実行する。
　上記構成のように、ＦＦＴ（Ｆａｓｔ　Ｆｏｕｒｉｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）変換、バンドパスフィルタ、及びＦＦＴ逆変換を用いることにより、細胞核の画像を簡単且つ正確に抽出することができる。
　(6)　好ましくは、上記制御部は、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域の面積を算出する算出処理を実行する。
　上記構成のように、細胞領域の面積を算出することによって、培養細胞の状態をさらに定量的に評価することができる。なお、算出処理で算出された面積は、シャーレ内において培養細胞が占める割合を評価するために用いてもよいし、当該面積を細胞数で除すことによって培養細胞の大きさの評価に用いてもよい。
　(7)　好ましくは、該細胞観察装置は、出力部をさらに備える。上記制御部は、上記カウント処理でカウントされた細胞数を上記出力部に出力させる出力処理を実行する。
　出力処理の具体例は特に限定されないが、例えば、細胞数を表示部に表示させてもよいし、細胞数をプリンタに印字させてもよい。また、出力対象は細胞数のみに限定されず、算出処理で算出される細胞領域の面積がさらに出力されてもよい。
　(8)　一例として、該細胞観察装置は、上記培地へ光を照射する照射部を備える。上記第１撮影条件は、上記照射部によって照射された光のうち、上記培地から出力された第１波長の光で上記第１写真を撮影することを示す。上記第２撮影条件は、上記培地から出力された上記第１波長より長い第２波長の光で上記第２写真を撮影することを示す。
　(9)　例えば、上記第１波長は、４００ｎｍ以上で７００ｎｍ以下である。また、上記第２波長は、７００ｎｍ以上であり、且つ上記第１波長より長い。
　(10)　他の例として、上記撮影部は、焦点の位置を調整する調整手段を備える。上記第１撮影条件は、上記培養細胞の輪郭に焦点を合わせた状態で上記第１写真を撮影することを示す。上記第２撮影条件は、上記第１撮影条件より上記撮影部に近い位置に焦点を合わせた状態で第３写真を撮影し、且つ上記第１撮影条件より上記撮影部から離れた位置に焦点を合わせた状態で第４写真を撮影することを示す。そして、上記制御部は、上記第２撮影処理において、上記第３写真及び上記第４写真の画素値の差を、上記第２写真として取得する。
　(11)　本発明の他の形態に係る細胞観察装置は、写真を撮影する撮影部と、制御部とを備える。上記制御部は、培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第１写真を取得する第１撮影処理と、上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第２写真を取得する第２撮影処理と、上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域の面積を算出する算出処理とを実行する。
　(12)　本発明に係るプログラムは、コンピュータによって実行可能である。該プログラムは、培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って撮影した第１写真、及び上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って撮影した第２写真を示す写真データを取得する取得処理と、上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、上記第２写真内において、上記培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理と、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域及び上記第２特定処理で特定された上記細胞位置の少なくとも一方に基づいて、上記培養細胞の細胞数或いは上記細胞領域の面積を算出する算出処理とを上記コンピュータに実行させる。
　本発明によれば、培養細胞の細胞数をカウントすることによって、当該培養細胞の状態を定量的に評価することができる。
図１は、本実施形態に係る細胞観察装置１０の機能ブロック図である。 図２は、本実施形態に係る細胞観察処理のフローチャートである。 図３は、ステップＳ１１、Ｓ１２で撮影された第１写真及び第２写真の一例を示す図である。 図４は、ステップＳ１４で生成された二値画像の一例である。 図５は、ステップＳ１５でノイズ３４が除去された二値画像の一例である。 図６は、ステップＳ１７～Ｓ１９で細胞核３１及びノイズ３４が抽出された第２画像の一例である。 図７は、ＦＦＴ変換後の第２写真内において一列に並んだ画素の輝度値の変化を模式的に表した図である。 図８は、ステップＳ２０でプロット５０が設定された第２画像の一例である。 図９は、図５に示される二値画像にプロット５０を重ねた画像の一例である。
　以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。
　本実施形態に係る細胞観察装置１０は、図１に示されるように、照射部１１と、第１偏光板１２Ａ及び第２偏光板１２Ｂ（これらを総称して、「偏光板１２」と表記することがある。）と、撮影部１３と、制御部１４と、表示部１５とを主に備える。また、照射部１１から偏光板１２を経て撮影部１３に至る光路上には、図示しないコリメートレンズや結像レンズ等の光学系が適宜配置される。図１において、破線の矢印は光の進行方向を示し、実線の矢印は信号の進行方向を示す。
　照射部１１は、第１波長及び第１波長より長い第２波長の光を少なくとも含む白色光を出力する。照射部１１の具体例は特に限定されないが、例えば、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ　Ｅｍｉｔｔｉｎｇ　Ｄｉｏｄｅ）等を用いることができる。第１波長は、例えば、４００ｎｍ以上で７００ｎｍ以下の中から選択される。望ましくは、第１波長は、５００ｎｍ以上で５５０ｎｍ以下の中から選択される。第２波長は、例えば、７００ｎｍ以上で且つ第１波長より長い波長が選択される。望ましくは、第２波長は、７００ｎｍ以上で９００ｎｍ以下の中から選択される。
　第１偏光板１２Ａは、照射部１１から照射された白色光のうちの第１波長の光のみを通過させ、その他の波長の光を遮断する。第２偏光板１２Ｂは、照射部１１から照射された白色光のうちの第２波長の光のみを通過させ、その他の波長の光を遮断する。偏光板１２の具体的な構造は特に限定されないが、例えば、ポリビニルアルコール主体にヨウ素化合物分子を吸着配向させた一般的な偏光フィルムを用いることができる。
　撮影部１３は、照射部１１から照射され且つ偏光板１２を通過した光で写真を撮影する。より詳細には、撮影部１３は、偏光板１２を通過した光を受光し、光電変換によって写真データを生成する。そして、撮影部１３は、生成した写真データを制御部１４に出力する。撮影部１３の具体例は特に限定されないが、例えば、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｄｅｖｉｃｅ）等の撮像素子と、焦点の位置を調整するレンズユニット（調整手段の一例）とを備えるカメラである。また、本実施形態に係る撮影部１３は、カラーの写真を撮影することができるものとする。
　制御部１４は、照射部１１、偏光板１２、撮影部１３、及び表示部１５の動作を制御すると共に、撮影部１３から取得した写真データに対する画像処理を実行する。制御部１４の動作は、図２を参照して後述される。制御部１４は、例えば、プログラムを記憶する記憶部と、記憶部からプログラムを読み出して実行するＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）とで構成される。
　表示部１５は、制御部１４の制御に従って情報を表示する。表示部１５の具体的な構成は特に限定されないが、例えば、液晶ディスプレイ（Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙの略）、有機ＥＬディスプレイ（Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｅｌｅｃｔｒｏ－Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｉｓｐｌａｙの略）等を採用することができる。表示部１５は、出力部の一例である。
［細胞観察処理］
　図２～図８を参照して、細胞観察処理を説明する。なお、以下の各処理は、ＣＰＵが実行するプログラムによって実現されてもよいし、制御部１４に搭載されたハードウェア回路によって実現されてもよいし、これらを組み合わせて実現されてもよい。
　まず、細胞観察装置１０の照射部１１から撮影部１３に至る光路上に、細胞を培養するための培地２１を含むシャーレ２０が配置される。これにより、照射部１１から照射された光の一部は、培地２１を透過して撮影部１３に到達する。なお、シャーレ２０は、作業者によって細胞観察装置１０にセットされてもよい。または、インキュベータに組み込まれた細胞観察装置１０の照射部１１及び撮影部１３が、シャーレ２０の載置部を挟んで対向配置されていてもよい。
　制御部１４は、照射部１１に白色光を照射させ、撮影部１３に第１写真を撮影させる（Ｓ１１）。第１写真は、培地２１を透過した光のうち、第１偏光板１２Ａを通過した第１波長の光で撮影部１３が撮影した写真である。すなわち、ステップＳ１１において、照射部１１から撮影部１３に至る光路上には、第１偏光板１２Ａが配置される。そして、制御部１４は、当該第１写真を示す第１写真データを撮影部１３から取得する。ステップＳ１１は、第１撮影処理及び取得処理の一例である。また、ステップＳ１１において撮影部１３に入射させる光の波長は、第１撮影条件の一例である。
　次に、制御部１４は、照射部１１に白色光を照射させ、撮影部１３に第２写真を撮影させる（Ｓ１２）。第２写真は、培地２１を透過した光のうち、第２偏光板１２Ｂを通過した第２波長の光で撮影部１３が撮影した写真である。すなわち、ステップＳ１２において、照射部１１から撮影部１３に至る光路上には、第２偏光板１２Ｂが配置される。そして、制御部１４は、当該第２写真を示す第２写真データを撮影部１３から取得する。ステップＳ１２は、第２撮影処理及び取得処理の一例である。また、ステップＳ１２において撮影部１３に入射させる光の波長は、第２撮影条件の一例である。
　図３は、ステップＳ１１、Ｓ１２で撮影された第１写真及び第２写真の一例である。第１写真及び第２写真は、視野、画角、及び倍率等の撮影条件は同一であり、撮影時に撮影部１３に到達する光の波長が異なる。第１写真及び第２写真には、培地２１内で培養された細胞３０が写っている。細胞３０は、細胞核３１と、細胞核３１の周りを囲む細胞質３２と、細胞３０の輪郭を形成する細胞壁３３とで構成される。また、第１写真及び第２写真には、ノイズ３４が含まれている。ノイズ３４の原因は特に限定されないが、例えば、撮影部１３の熱雑音によるノイズ、撮影部１３のレンズ等に付着した小さなゴミによるノイズ等が考えられる。
　次に、制御部１４は、カラーの第１写真データ及び第２写真データ（以下、これらを総称して、「写真データ」と表記することがある。）を、グレースケールの写真データに変換する（Ｓ１３）。なお、ステップＳ１３で生成される写真データは、各画素が輝度値の大小を表すものであればグレースケールに限定されない。例えば、写真データをＲＧＢ色空間からＹＵＶ色空間に変換し、輝度信号のみを抽出した輝度画像であってもよい。また、ステップＳ１１、Ｓ１２において、撮影部１３がグレースケールの写真データを生成する場合、ステップＳ１３は省略することができる。
　次に、制御部１４は、グレースケールの第１写真データから二値画像データを生成する（Ｓ１４）。具体的には、制御部１４は、グレースケールの第１写真データのうち、第１閾値未満の画素値を第１値（例えば、“０”）４１に置換し、第１閾値以上の画素値を第２値（例えば、“１”）４２に置換することによって、二値画像データを生成する。ステップＳ１４の処理は、生成処理の一例である。
　図４は、ステップＳ１４で生成される二値画像データで示される二値画像の一例である。図４に示される二値画像は、第１写真の細胞３０及びノイズ３４の位置に対応する画素値が第１値（図４における白色の領域）４１となり、培地２１の位置に対応する画素値が第２値（図４における黒色の領域）４２となる。すなわち、図４に示される二値画像では、培地２１及び細胞３０が区別され、細胞核３１、細胞質３２、及び細胞壁３３が区別されない。
　なお、本実施形態では、細胞３０及びノイズ３４の画素が培地２１の画素より画素値が小さいことを前提としている。しかしながら、この画素値の関係が逆転する場合、制御部１４は、ステップＳ１４において、第１閾値以上の画素値を第１値に置換し、第１閾値未満の画素値を第２値に置換すればよい。
　次に、制御部１４は、ステップＳ１４で生成された二値画像データからノイズ３４を除去する（Ｓ１５）。具体的には、制御部１４は、連続する第１値の画素が閾値数未満であることに応じて、当該画素の画素値を第１値４１から第２値４２に変更する。換言すれば、制御部１４は、細胞３０の一般的な大きさより充分に小さい第１値４１の画素の塊を第２値４２の画素に置換する。
　図５は、ノイズ３４に対応する画素に第２値４２が設定された二値画像の一例である。図５に示される二値画像は、ノイズ３４の位置の画素に第２値４２が設定されている点において、図４に示される二値画像と相違する。そして、制御部１４は、図５に示される二値画像のうち、第１値４１が設定された画素の領域を、細胞３０が存在すると推定される領域（以下、「細胞領域」と表記する。）として特定する。ステップＳ１５の処理は、領域特定処理の一例である。ステップＳ１４、Ｓ１５は、第１特定処理の一例である。
　次に、制御部１４は、図５に示される二値画像のうち、第１値４１の画素の面積を算出する（Ｓ１６）。具体的には、制御部１４は、二値画像に含まれる第１値４１の画素数をカウントし、当該画素数に１画素の面積を乗じることによって、第１値４１の画素の面積を算出する。ステップＳ１６で算出された面積は、第１写真に含まれる細胞領域の面積に相当する。ステップＳ１６の処理は、算出処理の一例である。
　次に、制御部１４は、グレースケールの第２写真データをＦＦＴ（Ｆａｓｔ　Ｆｏｕｒｉｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）変換する（Ｓ１７）。すなわち、制御部１４は、空間領域の第２写真データを、周波数領域の第２写真データに変換する。ステップＳ１７の処理は、変換処理の一例である。なお、ステップＳ１７で第２写真データに適用される処理の具体例はＦＦＴに限定されず、例えば、離散コサイン変換（Ｄｉｓｃｒｅｔｅ　Ｃｏｓｉｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）等であってもよい。
　次に、制御部１４は、ＦＦＴ変換された第２写真データにバンドパスフィルタを適用する（Ｓ１８）。バンドパスフィルタは、変換処理後の第２写真データの周波数成分のうち、特定周波数成分を通過させ、特定周波数成分より高い周波数成分（以下、「高周波数成分」と表記する。）及び特定周波数成分より低い周波数成分（以下、「低周波数成分」と表記する。）を遮断（減衰）するフィルタである。ステップＳ１８の処理は、フィルタ処理の一例である。
　なお、特定周波数成分とは、例えば、細胞核３１を表す画像の複雑さに対応する予め定められた範囲の周波数である。また、高周波成分は、例えば、細胞３０の輪郭（すなわち、細胞壁３３）及びノイズ３４等を表す画像の複雑さに対応する。さらに、低周波成分は、例えば、培地２１、細胞質３２、及び照射部１１から照射される光の偏りによる輝度ムラ等を表す画像の複雑さに対応する。
　次に、制御部１４は、バンドパスフィルタが適用された第２写真データをＦＦＴ逆変換する（Ｓ１９）。すなわち、制御部１４は、周波数領域の第２写真データを、空間領域の第２写真データに変換する。但し、ステップＳ１７で第２写真データが離散コサイン変換された場合、ステップＳ１９で第２写真データが離散コサイン逆変換される。ステップＳ１９の処理は、逆変換処理の一例である。ステップＳ１７～Ｓ１９の処理は、第２写真データから特定周波数成分を抽出する抽出処理の一例である。
　図６は、抽出処理後の第２写真データで示される第２写真の一例である。図６に示される第２写真は、培地２１、細胞質３２、細胞壁３３、及びノイズ３４の一部を示す画像を、図３に示される第２写真から除去したものに相当する。但し、図６に示される第２写真には、ノイズ３４の一部が未だ含まれている可能性がある。また、図６に示される第２写真において、細胞核３１及びノイズ３４の位置の画素は、その他の位置の画素より画素値が小さい。
　次に、制御部１４は、ＦＦＴ逆変換後の第２写真内において、極値画素の画素位置にプロット５０を設定する（Ｓ２０）。極値画素は、例えば、第２写真の画素を左右方向（或いは、上下方向）に走査したときに、輝度値の変化が減少及び増加の一方から他方に転じる境界の画素を指す。例えば図７に示されるように、細胞核３１及びノイズ３４の位置の画素がその他の位置の画素より画素値が小さい場合の極値画素は、輝度値の変化が減少から増加に転じる境界の画素（すなわち、画素値が極小となる極小画素）を指す。一方、細胞核３１及びノイズ３４の位置の画素がその他の位置の画素より画素値が大きい場合の極値画素は、輝度値の変化が増加から減少に転じる境界の画素（すなわち、画素値が極大となる極大画素）を指す。
　図７は、ＦＦＴ変換後の第２写真内において一列に並んだ画素の輝度値の変化を模式的に表した図である。制御部１４は、ステップＳ２０において、図７に示される画素のうちの輝度値が第２閾値未満の画素（実線部分）のみを走査対象にする。そして、制御部１４は、連続する走査対象画素列Ａのうちの輝度値が最小になる極小画素Ａ１の画素位置にプロット５０を設定する。また、制御部１４は、連続する走査対象画素列Ｂに極大画素Ｂ１が存在する場合、極大画素Ｂ１より走査方向の一方側において輝度値が最小となる極小画素Ｂ２の画素位置と、極大画素Ｂ１より走査方向の他方側において輝度値が最小となる極小画素Ｂ３の画素位置とに、プロット５０を設定する。
　図８は、プロット５０が設定された第２写真の一例である。図８に示される第２写真には、図６に示される第２写真に含まれる細胞核３１及びノイズ３４の位置に、プロット５０が設定される。また、図８では、細胞核３１及びノイズ３４の図示は省略されている。ステップＳ２０の処理は、位置特定処理の一例である。ステップＳ１７～Ｓ２０の処理は、細胞核３１の位置と推定される位置（以下、「細胞位置」と表記する。）を特定する第２特定処理の一例である。すなわち、プロット５０の位置が細胞位置に相当する。
　次に、制御部１４は、図９に示されるように、図４に示される第１写真に図８に示されるプロット５０を重ねる。そして、制御部１４は、図９に示される画像において、第１値４１の領域に重なるプロット５０の数を、細胞３０の数（以下、「細胞数」と表記する。）としてカウントする（Ｓ２１）。すなわち、制御部１４は、図９に示される画像において、第１値４１の領域に重なるプロット５０は細胞核３１の位置を示し、第２値４２の領域に重なるプロット５０はノイズ３４の位置を示していると判断する。ステップＳ２１は、カウント処理の一例である。
　次に、制御部１４は、ステップＳ１６で算出した細胞領域の面積と、ステップＳ２１でカウントした細胞数とを表示部１５に表示させる（Ｓ２２）。また、制御部１４は、細胞領域の面積を細胞数で除した細胞３０の面積の平均値を、表示部１５にさらに表示させてもよい。ステップＳ２２の処理は、出力処理の一例である。
［本実施形態の作用効果］
　上記の実施形態のように、波長が異なる２つ光を用いて撮影した第１写真及び第２写真を画像処理することによって、細胞領域の面積を算出し、細胞３０の細胞数をカウントすることができる。その結果、熟練した作業者でなくても当該細胞３０の状態を定量的に評価することができるので、例えば、継代のタイミングや当該培地の倍加時間を適切に判断することができる。なお、上記の実施形態では、面積の算出及び細胞数のカウントの両方を実行する例を説明したが、いずれか一方のみが実行されてもよい。細胞数のカウントを省略する場合、ステップＳ１７～Ｓ２１の処理が省略される。
　なお、継代のタイミングや倍加時間の判断は、作業者にではなく、制御部１４に実行させてもよい。一般的に、細胞の数が所定の数に達したことによって継代が行われる。また、細胞の面積が大きいほど倍加時間が長くなり、細胞の面積が小さいほど倍加時間が短くなる傾向がある。そこで、継代を実行するときの細胞の数や、細胞の面積と倍加時間との関係等をデータベースとして制御部１４に予め与えておくことによって、培養のスケジュールを制御部１４に立案させることができる。そして、立案されたスケジュールは、ステップＳ２２において、表示部１５に表示されてもよい。
　また、上記の実施形態によれば、第１写真内における画素値の違いによって培地２１と細胞３０とが区別され（Ｓ１４）、第１値４１の画素の塊の大きさによって細胞３０とノイズ３４とが区別される（Ｓ１５）。これにより、第１写真内における細胞領域を適切に特定することができる。
　また、上記の実施形態によれば、バンドパスフィルタによって第１写真から特定周波数成分（すなわち、細胞核３１を示す画像）が抽出され（Ｓ１７～Ｓ１９）、二値画像と重ね合わせることによってノイズ３４が除去される（Ｓ２１）。これにより、第２写真内における細胞位置を適切に特定することができる。
　なお、上記の実施形態に係る細胞観察処理は、シャーレ２０上の複数の箇所それぞれに対して実行されてもよい。より詳細には、制御部１４は、シャーレ２０上の互いに異なる撮影範囲に対してステップＳ１１～Ｓ２１の処理を実行してもよい。そして、制御部１４は、ステップＳ２２において、ステップＳ１６で算出された面積の合計値（或いは、平均値）と、ステップＳ２１でカウントされた細胞数の合計値（或いは、平均値）とを、表示部１５に表示させてもよい。
　また、図１に示される細胞観察装置１０の具体的な構成は、前述の例に限定されない。例えば、照射部１１は、制御部１４の制御に従って、第１波長の単色光と、第２波長の単色光とを選択的に出力してもよい。この場合、偏光板１２は省略することができる。また、照射部１１から培地２１を経由して撮影部１３に到達する光は、培地２１を透過することに限定されず、培地２１で反射されたものであってもよい。また、出力部の具体例は表示部１５に限定されず、情報をシートに記録するプリンタ等であってもよい。
　また、ステップＳ１１、Ｓ１２における撮影条件は、撮影部１３に入射させる光の波長が異なることに限定されず、焦点の位置が異なることであってもよい。焦点の位置は、レンズユニットを操作することによって変更される。レンズユニットは、細胞観察装置１０の作業者によって手動で操作されてもよいし、制御部１４によって制御される不図示のアクチュエータによって操作されてもよい。さらに他の例として、ステップＳ１１、Ｓ１２において、光の波長及び焦点の位置の両方が異なる撮影条件を採用してもよい。なお、ステップＳ１３以降の処理は、前述の例と共通する。
　より詳細には、制御部１４は、ステップＳ１１において、細胞３０の輪郭に焦点を合わせた状態で、撮影部１３に第１写真を撮影させてもよい。このときの焦点の位置（以下、「第１焦点位置」と表記する。）は、第１撮影条件の一例である。この場合の第１写真は、細胞３０の輪郭が鮮明に写った写真となる。
　一方、制御部１４は、ステップＳ１２において、第１焦点位置より撮影部１３に近い位置（以下、「第２焦点位置」と表記する。）に焦点を合わせた状態で、撮影部１３に第３写真を撮影させ、且つ第１焦点位置より撮影部１３から離れた位置（以下、「第３焦点位置」と表記する。）に焦点を合わせた状態で、撮影部１３に第４写真を撮影させてもよい。このときの焦点の位置は、第２撮影条件の一例である。すなわち、第１焦点位置は、第２焦点位置及び第３焦点位置の間に位置する。第１焦点位置及び第２焦点位置の距離、及び第１焦点位置及び第３焦点位置の距離は、例えば、１０μｍ～３０μｍである。
　第３写真及び第４写真を比較すると、細胞核３１の位置のコントラストが相対的に高く、細胞核３１と異なる位置のコントラストが相対的に低くなる。そこで、制御部１４は、ステップＳ１２において、第３写真及び第４写真の画素値の差を、第２写真として取得してもよい。より詳細には、制御部１４は、第３写真及び第４写真の同一の位置（例えば、左端）の画素値の差を、第２写真における当該位置（例えば、左端）の画素値とすればよい。この場合の第２写真は、細胞核３１がはっきり写った写真となる。
　また、上記の実施形態に係る細胞観察装置１０は、図１に示される全ての構成要素を一体化したものに限定されない。細胞観察装置１０は、例えば、照射部１１、偏光板１２、及び撮影部１３を備える撮影装置と、制御部１４及び表示部１５を備える画像処理装置とが通信ネットワークを通じて接続されていてもよい。この場合の画像処理装置は、例えば、一般的なＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）であってもよい。
　さらに、細胞観察処理の各ステップの実行順序は、図２の例に限定されない。例えば、ステップＳ１２の処理は、ステップＳ１６、Ｓ１７の間で実行されてもよい。但し、ステップＳ１１、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６はこの順に実行され、ステップＳ１２、Ｓ１３、Ｓ１７、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｓ２１はこの順に実行される。
１０・・・細胞観察装置
１１・・・照射部
１２Ａ，１２Ｂ・・・偏光板
１３・・・撮影部
１４・・・制御部
１５・・・表示部

Claims (12)

  1. 　写真を撮影する撮影部と、
    　制御部と、を備えており、
    　上記制御部は、
    　培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第１写真を取得する第１撮影処理と、
    　上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第２写真を取得する第２撮影処理と、
    　上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、
    　上記第２写真内において、上記培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理と、
    　上記第２特定処理で特定された上記細胞位置のうち、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域内に位置する上記細胞位置の数を、上記培養細胞の細胞数としてカウントするカウント処理と、を実行する細胞観察装置。
  2. 　上記制御部は、上記第１特定処理において、
    　上記第１写真を示す第１写真データのうち、第１閾値未満の画素値を第１値に置換し、上記第１閾値以上の画素値を第２値に置換した二値画像データを生成する生成処理と、
    　上記二値画像データで示される二値画像のうち、上記第１値の画素の領域を上記細胞領域として特定する領域特定処理と、を実行する請求項１に記載の細胞観察装置。
  3. 　上記制御部は、上記領域特定処理において、上記第１値の画素が閾値数以上連続する領域を上記細胞領域として特定する請求項２に記載の細胞観察装置。
  4. 　上記制御部は、上記第２特定処理において、
    　上記第２写真を示す第２写真データから特定周波数成分を抽出する抽出処理と、
    　上記特定周波数成分が抽出された上記第２写真の画素値を走査したときに、画素値の変化が減少及び増加の一方から他方に転じる境界の画素位置を上記細胞位置として特定する位置特定処理と、を実行する請求項１から３のいずれかに記載の細胞観察装置。
  5. 　上記制御部は、上記抽出処理において、
    　上記第２写真データをＦＦＴ変換する変換処理と、
    　上記変換処理後の上記第２写真データに上記特定周波数成分を通過させるフィルタを適用するフィルタ処理と、
    　上記フィルタ処理後の上記第２写真データをＦＦＴ逆変換する逆変換処理と、を実行する請求項４に記載の細胞観察装置。
  6. 　上記制御部は、上記第１特定処理で特定された上記細胞領域の面積を算出する算出処理を実行する請求項１から５のいずれかに記載の細胞観察装置。
  7. 　出力部をさらに備えており、
    　上記制御部は、上記カウント処理でカウントされた細胞数を上記出力部に出力させる出力処理を実行する請求項１から６のいずれかに記載の細胞観察装置。
  8. 　該細胞観察装置は、上記培地へ光を照射する照射部を備えており、
    　上記第１撮影条件は、上記照射部によって照射された光のうち、上記培地から出力された第１波長の光で上記第１写真を撮影することを示し、
    　上記第２撮影条件は、上記培地から出力された上記第１波長より長い第２波長の光で上記第２写真を撮影することを示す請求項１から７のいずれかに記載の細胞観察装置。
  9. 　上記第１波長は、４００ｎｍ以上で７００ｎｍ以下であり、
    　上記第２波長は、７００ｎｍ以上であり、且つ上記第１波長より長い請求項８に記載の細胞観察装置。
  10. 　上記撮影部は、焦点の位置を調整する調整手段を備えており、
    　上記第１撮影条件は、上記培養細胞の輪郭に焦点を合わせた状態で上記第１写真を撮影することを示し、
    　上記第２撮影条件は、上記第１撮影条件より上記撮影部に近い位置に焦点を合わせた状態で第３写真を撮影し、且つ上記第１撮影条件より上記撮影部から離れた位置に焦点を合わせた状態で第４写真を撮影することを示し、
    　上記制御部は、上記第２撮影処理において、上記第３写真及び上記第４写真の画素値の差を、上記第２写真として取得する請求項１から９のいずれかに記載の細胞観察装置。
  11. 　写真を撮影する撮影部と、
    　制御部と、を備えており、
    　上記制御部は、
    　培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第１写真を取得する第１撮影処理と、
    　上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って上記撮影部に撮影させることによって、第２写真を取得する第２撮影処理と、
    　上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、
    　上記第１特定処理で特定された上記細胞領域の面積を算出する算出処理と、を実行する細胞観察装置。
  12. 　コンピュータによって実行可能なプログラムであって、
    　培養細胞を含む培地を第１撮影条件に従って撮影した第１写真、及び上記培地を上記第１撮影条件と異なる第２撮影条件に従って撮影した第２写真を示す写真データを取得する取得処理と、
    　上記第１写真内において、上記培養細胞が存在する領域と推定される細胞領域を特定する第１特定処理と、
    　上記第２写真内において、上記培養細胞の細胞核の位置と推定される細胞位置を特定する第２特定処理と、
    　上記第１特定処理で特定された上記細胞領域及び上記第２特定処理で特定された上記細胞位置の少なくとも一方に基づいて、上記培養細胞の細胞数或いは上記細胞領域の面積を算出する算出処理と、を上記コンピュータに実行させるプログラム。
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