WO2017195268A1 - ｍｉＲＮＡをマーカーとする歯周炎検査キット、及び検査方法 - Google Patents

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洋子 山口
真史 堀江
朗 齋藤
隆英 長瀬
久美 岩本
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Nihon University
University of Tokyo NUC
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Nihon University
University of Tokyo NUC
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a periodontitis test kit and a test method using a novel molecular marker.
  • the present invention relates to a test kit and a test method in which miRNA is extracted from a gingival crevicular fluid (Gingival Crystal Fluid, hereinafter sometimes referred to as GCF) and miRNA is used as a marker.
  • GCF gingival crevicular fluid
  • Periodontal disease is two major diseases of teeth along with dental caries. Periodontal disease is divided into gingivitis and periodontitis, but it is periodontitis called so-called alveolar pyorrhea that ultimately leads to tooth loss. Periodontal disease is said to be one of the most common diseases in the world, and it is said that about half of adults are affected (Non-patent Document 1).
  • Periodontitis is a chronic inflammatory disease that affects the periodontal ligament tissue between the root and alveolar bone.
  • the periodontal pocket which is the gap between the teeth and gingiva, becomes deep, the periodontal ligament fibers and the alveolar bone that are supporting the teeth are destroyed, and the teeth become wobbled, Eventually the teeth will fall out.
  • Periodontitis is associated with systemic diseases such as metabolic syndrome, coronary artery disease, and diabetes (Non-Patent Documents 2 to 4), and treatment and prevention of periodontitis is limited to the dental field. Rather, it is also a general health problem. Therefore, early detection of periodontitis is important in maintaining the general health of the whole body.
  • periodontitis is inspected by probing, X-ray photography, gingivitis index, plaque adhesion, and mobility. These examinations are non-quantitative examinations that are easily intruded by the dentist's subjectivity, and are largely based on dentist experience. Therefore, regarding the treatment of periodontitis, it has become uniform with a focus on plaque control. Therefore, a method capable of more objectively grasping the periodontal tissue condition and examining periodontitis has been required.
  • Patent Document 1 describes a method of diagnosing periodontal disease by proteomic analysis of protein biomarkers in gingival crevicular fluid and / or saliva samples.
  • Patent Document 2 discloses a method for examining invasive periodontitis by detecting a gene polymorphism.
  • Patent Documents 3 to 5 disclose methods for examining periodontal disease by immunologically detecting proteins in gingival crevicular fluid and saliva.
  • the miRNA is a short RNA having a chain length of 21 to 25 nt, and has a function of regulating gene expression by binding to the 3′-UTR of the target mRNA.
  • miRNA regulates biological processes such as cell differentiation or pathological processes such as canceration.
  • methods have been disclosed in which diagnosis is performed by extracting and detecting miRNA from body fluids such as blood and urine and miRNA is used for treatment (for example, Patent Documents 6 and 7). Examination and diagnosis methods using miRNA have also been disclosed for periodontal diseases (Non-Patent Documents 7 to 9).
  • Patent Documents 1 to 5 None of the methods described in Patent Documents 1 to 5 has been clinically put into practical use. Although the method described in Patent Document 1 is considered to be able to perform an accurate diagnosis, since it is necessary to perform a proteome analysis, a large-scale machine and a complicated analysis method are required. Since the method described in Patent Document 2 is SNP analysis, it does not grasp the current state of periodontitis.
  • the methods described in Patent Documents 3 to 5 are methods that can be performed in a dental clinic because they use test papers, but are more accurate than conventional diagnostic methods such as probing. The current situation is that it is not so popular, and it is not so popular.
  • the methods disclosed in Non-Patent Documents 7 to 9 need to be performed using a patient's periodontal tissue, and thus have not spread as a general examination for periodontitis.
  • the object of the present invention is not only to obtain objective data on periodontitis, but also to provide a non-invasive examination method and examination kit using gingival exudate (GCF).
  • GCF gingival exudate
  • the present invention relates to the following test methods, biomarkers, and test kits.
  • miRNA is extracted from the gingival crevicular fluid collected for each tooth, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-582-5p Hsa-miR-145-5p, hsa-miR-20a-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-140-5p, hsa -MiR-590-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-144-5p, hsa-miR -144-3p, hsa-miR-30e-3p, h
  • the periodontitis biomarker according to (4) comprising at least hsa-miR-223-3p and hsa-miR-200c-3p.
  • (6) hsa-miR-223-3p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-20a-3p Hsa-miR-194-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-590-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa -MiR-19a-3p, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-144-5p,
  • hsa-miR-324-5p at least one of hsa-miR-324-5p, hsa-miR-29c-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-30d-5p
  • Periodontitis biomarker according to any one of (4) to (6), characterized in that (8) hsa-miR-223-3p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-20a-3p Hsa-miR-194-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-590-5p, hsa-mi
  • FIG. 3A is a diagram showing the results of 2D hierarchical clustering analysis of miRNA expression in healthy subjects and patients with periodontitis.
  • FIG. 3B shows a Volcano plot.
  • FIG. 3C shows the expression level of each RNA as a Box plot.
  • FIG. 3 shows a comparison of two different sample sets.
  • FIG. 4A is a diagram showing a correlation between sample set # 1 and set # 2 of the expression ratio ( ⁇ Cq value) of 40 miRNAs.
  • FIG. 4B shows the expression level of 40 miRNAs in a Box plot.
  • the present invention is characterized in that RNA is isolated from GCF and miRNA is analyzed.
  • the examination of periodontitis by miRNA so far has been performed using gingival tissue.
  • the test method of the present invention is a non-invasive test in which miRNA is isolated and tested from GCF, and the burden on the patient is small.
  • GCF can be collected for each tooth suspected of periodontitis, the tooth affected by periodontitis, which could not be performed by the saliva test, was identified and the tooth It became possible to objectively judge the condition of peritonitis.
  • miRNAs whose expression changes are specifically observed in periodontitis patients are disclosed, and in particular, it is disclosed that accurate examination can be performed by using 40 miRNAs as a panel.
  • the amount of miRNA used as a reference and the amount of miRNA in which change was observed in periodontitis are 1 One or more may be selected and measured.
  • quantification of miRNA was performed here by quantitative PCR, but any method may be used as long as the amount of miRNA can be quantified.
  • miRNAs used as a panel shown below may be used by selecting some of them, or may be used for examination by replacing with other miRNAs disclosed in the present invention.
  • the present invention will be described in detail with reference to analysis results.
  • ⁇ Target audience ⁇ The samples whose data are shown below were obtained from patients and healthy volunteers after obtaining informed consent based on a study approved by the Ethics Committee of Tokyo Medical and Dental University. Periodontitis was diagnosed by the periodontal pocket depth and bleeding during probing. GCF collection is performed prior to diagnosis. In addition, no one patient with periodontitis was associated with systemic disease except that one patient had mild diabetes. Diabetes mellitus patients who had comorbid diabetes also had mild diabetes and had not received any medication.
  • the subjects analyzed were those obtained from healthy subjects and periodontitis patients shown in Tables 1 and 2 below.
  • the eight subjects shown in Table 1 are 5 healthy subjects and 3 periodontitis patients, and the average ages are 38 and 53, respectively.
  • the 12 subjects shown in Table 2 were 6 healthy subjects and 6 periodontitis patients, and the average ages were 28 and 65, respectively.
  • H1 to H11 in the data shown below indicate samples of healthy persons shown in the above table, and P1 to P9 are also samples of periodontitis patients shown in the above table. Indicates that
  • GCF Collecting gingival crevicular fluid
  • Trizol LS reagent manufactured by Life Technologies
  • the total RNA amount was measured with an Agilent 2100 BioAnalyzer (manufactured by Agilent Technologies) using an eukaryotic total RNA nano assay.
  • the electropherogram showed a clean peak for all samples.
  • An example is shown in FIG.
  • the left panel of FIG. 1 shows an electrophoretic diagram of an RNA sample obtained from a healthy person, and the right panel from a periodontitis patient. In both samples, a peak of small RNA of 25 to 200 nt is observed.
  • ⁇ MiRNA expression analysis The miRNA expression analysis was analyzed using miRCURY LNA (registered trademark) Universal RT microRNA PCR System (manufactured by Exiqon). Single-stranded cDNA was synthesized from 8 ⁇ l of RNA using universal cDNA Synthesis kit II (Exiqon). The synthesized cDNA is diluted, mixed with ExiLET SYBR (registered trademark) Green master mix, and dispensed into Human miRNome microRNA PCR panel (manufactured by Exiqon), and quantitative PCR is performed by LightCycler 480 Real-Time PCR system It was performed using.
  • miRCURY LNA registered trademark
  • Universal RT microRNA PCR System manufactured by Exiqon
  • Single-stranded cDNA was synthesized from 8 ⁇ l of RNA using universal cDNA Synthesis kit II (Exiqon). The synthesized cDNA is diluted, mixed with ExiLET SYBR (registered trademark) Green master
  • hsa-miR-324-5p, hsa-miR-29c-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-30d-5p whose expression was stable in GCF were used. Used for normalization. The normalized value is expressed as ⁇ Cq.
  • GCF miRNA (sample set # 1) collected from 5 healthy subjects and 3 periodontitis patients shown in Table 1 were analyzed.
  • periodontitis patients had a periodontal pocket depth greater than 3 mm (most periodontal pocket depths were 4-8 mm), and bleeding due to probing was observed in many patients.
  • the miRNA expression pattern by principal component analysis was clearly divided into two for healthy subjects and periodontitis patients (FIG. 2A).
  • the analysis results of RNA samples obtained from 5 healthy subjects (H1 to H5) and 3 periodontitis patients (P1 to P3) shown in Table 1 indicate that the expression patterns of the two are different.
  • the X axis represents PCA Component 1 (PC1: 46.9% variation), and the Y axis represents PCA Component 2 (PC2: 15.7% variation).
  • 619 miRNA expression data could be obtained from at least one of each group of healthy subjects and periodontitis patients. Among them, increased expression of 332 miRNA was observed in periodontitis patients, and decreased expression of 287 miRNA was observed (FIG. 2B).
  • the X-axis shows the relative expression ratio expressed by - ⁇ Cq value, and the Y-axis shows -log 10 (p-value) obtained from t-test between two groups.
  • the black circles ( ⁇ ) indicate miRNAs having a p value of ⁇ 0.05, ⁇ Cq> 1.0, or ⁇ Cq ⁇ 1.0 (indicated by a line as a cut-off in FIG. 2B). It shows that expression is significantly increased or decreased in patients with periodontitis.
  • miRNAs There were 63 (Table 3) and 55 (Table 4) miRNAs in which expression reduction or expression enhancement was significantly observed in periodontitis patients. Since these miRNAs are miRNAs in which a significant difference was found in the expression between periodontitis patients and healthy subjects, these miRNAs may be used alone or in combination in some cases. In order to make an accurate diagnosis, it is preferable to use a combination of a plurality of miRNAs for the test.
  • miRNA satisfying the criteria of ⁇ Cq ⁇ 2.5, p-value ⁇ 0.05, ⁇ Cq> 0.7, or ⁇ Cq ⁇ 0.7 is extracted from the analysis result of gingival crevicular fluid sample set # 1 (Table 5). Therefore, miRNA shown in Table 5 can be preferably used as a diagnostic marker for periodontitis alone or in combination.
  • hsa-miR-223-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, and hsa-miR-16-5p are preferably used as markers because of their good sensitivity and reproducibility. it can.
  • miRNAs with enhanced expression in 19 periodontitis patients shown in Table 6 and miRNAs with decreased expression of 21 were extracted.
  • the five miRNAs hsa-miR-324-5p, hsa-miR-29c-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-324-3p, and hsa-miR-30d-5p are Since it was stably expressed in all samples, it was included in the subsequent experimental analysis and used for normalization as a reference miRNA (reference miRNA).
  • hsa-miR-101-3p hsa-miR-145-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-582-5p, highlighted in the table, hsa-miR-181b-5p, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-200c-5p, hsa-miR-203a, hsa-miR-31-3p It is a molecule with no known association with periodontitis or periodontal disease.
  • the expression levels of the 40 selected miRNAs are shown in a Volcano plot (FIG. 3B). Similar to FIG. 2B, the X-axis shows the relative expression ratio expressed in ⁇ Cq values, and the Y-axis shows ⁇ log 10 (p-value) obtained from the t-test between the two groups. .
  • a black circle ( ⁇ ) indicates a miRNA having a p value of ⁇ 0.05 and
  • each miRNA was represented by a Box plot (FIG. 3C). Open squares indicate the results of healthy subjects, and gray squares indicate the results of periodontitis patients. The horizontal bar indicates each median value. The upper panel shows the results of analysis of miRNAs whose expression was enhanced in 19 periodontitis patients, and the lower panel shows the results of miRNAs whose expression was decreased. Judging from the ⁇ Cq value, it was revealed that hsa-miR-223-3p, hsa-miR-203a, and hsa-miR-205-5p have high expression levels in GCF. Therefore, it is possible to measure with high sensitivity by detecting at least one of these miRNAs.
  • FIG. 4A is a scatter diagram showing values between samples. Spearman's correlation coefficient ( ⁇ ) was 0.95, indicating a strong correlation between the two.
  • hsa-miR-16-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-106b-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-365a-3p, and hsa-miR-22-3p can be detected with good sensitivity. It can be preferably used for examination of periodontitis.

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Abstract

本発明の歯周炎の診断マーカーとなるｍｉＲＮＡは、歯周炎に特異的に変化が見られるものである、正確に歯周炎の診断を行うことができる。

Description

ｍｉＲＮＡをマーカーとする歯周炎検査キット、及び検査方法
　本発明は、新規の分子マーカーを用いた歯周炎検査キット、及び検査方法に関する。特に、歯肉溝滲出液（Ｇｉｎｇｉｖａｌ　Ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ　Ｆｌｕｉｄ、以下ＧＣＦと記載することもある。）からｍｉＲＮＡを抽出し、ｍｉＲＮＡをマーカーとする検査キット、及び検査方法に関する。
　歯周病はう蝕とともに、歯の二大疾患である。歯周病は歯肉炎と歯周炎とに分けられるが、最終的な歯の喪失に至るのは、いわゆる歯槽膿漏といわれる歯周炎である。歯周病は世界で最も多い疾患の一つであるともいわれ、成人の約半数が罹患していると言われている（非特許文献１）。
　歯周炎は、歯根と歯槽骨間の歯根膜組織に影響を及ぼす慢性炎症性疾患である。進行した歯周炎では、歯と歯肉間の隙間である歯周ポケットが深くなり、歯を支持している結合組織である歯根膜線維や歯槽骨の破壊が生じ、歯がぐらつくようになり、最終的には歯が抜けてしまう。
　高齢者では、生活の質を損なうような重度の歯周炎に罹患する傾向がある。歯周炎は、メタボリック・シンドローム、冠動脈疾患、糖尿病のような全身性疾患と関連性があることも指摘されており（非特許文献２～４）、歯周炎の治療と予防は歯科分野だけではなく、一般的な健康状態に関わる問題ともなる。したがって、歯周炎の早期発見は、全身の健康状態を維持するうえでも重要である。
　現在のところ、歯周炎の検査は、プロービング、Ｘ線写真、歯肉炎指数、プラークの付着状態、動揺度の検査などによって行われている。これらの検査は、歯科医の主観が入り込みやすい非定量的な検査であり、歯科医の経験による部分が大きかった。そのため、歯周炎の治療法に関しても、プラークコントロールを中心とした画一的なものとなっていた。したがって、より客観的に歯周組織の状態を捉え、歯周炎の検査を行うことのできる方法が必要とされていた。
　従来から歯周炎を含む歯周病に関して客観的なデータを得ることができる検査方法として様々な方法が提案されている。特許文献１には、歯肉溝滲出液及び／又は唾液サンプル中のタンパク質バイオマーカーをプロテオーム分析により歯周疾患の状態を診断する方法が記載されている。特許文献２には、遺伝子多型を検出することにより侵襲性歯周炎を検査する方法が開示されている。特許文献３～５には、歯肉溝滲出液や唾液中のタンパク質を免疫学的に検出することにより歯周病を検査する方法が開示されている。
　また、近年、様々な疾患においてｍｉＲＮＡによって診断や治療を行う方法が開示されている。ｍｉＲＮＡは、鎖長２１～２５ｎｔの短いＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡの３´-ＵＴＲに結合して遺伝子の発現を調節する機能を担っている。最近の研究によって、ｍｉＲＮＡは、細胞の分化のような生物学的過程、あるいは癌化のような病理学的過程を調節することが明らかとなってきている（非特許文献５、６）。特に血液や尿などの体液からｍｉＲＮＡを抽出し、検出することにより診断を行ったり、ｍｉＲＮＡを治療に用いる方法が開示されている（例えば、特許文献６、７）。歯周疾患でもｍｉＲＮＡを用いた検査、診断方法が開示されている（非特許文献７～９）。
特表２０１５－５２９３３３号公報 国際公開第２００４／０４２０５４号 特開２０１６－０３１３０６号公報 特開２０１３－２５７３１２号公報 特開２００９－０５２９４５号公報 特開２０１５－２３１３７６号公報 特表２０１４－５２７８０７号公報
Eke, P.I. et al., 2015, J Periodontol.Vol.86(5), pp.611-622. Kaye, E.K. et al., 2016, J Dent Res.,. pii:0022034516641053. Ryden, L., et al., 2016, Circulation. Vol.133(6),pp.576-583. Gurav, A. & Jadhav, V. 2011, J.Diabetes. Vol.3(1), pp.21-28. Gregory, P.A. et al., 2008, Nat. Cell Biol.Vol.10(5), pp.593-601. Johnson, S.M. et al., 2005, Cell.Vol.120(5), pp.635-647. Stoecklin-Wasmer C.et al., 2012, J. Dent. Res. Vol.91(10), pp.934-940. Xie Y.F. et al., 2011, Int. J. Oral. Sci. Vol.3(3), pp.125-134. Ogata Y. et al., 2014, J. Oral Sci. Vol.56(4), pp.253-260.
　しかしながら、特許文献１～５に記載のいずれの方法も、臨床的に実用化されていない。特許文献１に記載の方法は、正確な診断を行えると考えられるが、プロテオーム解析を行う必要があるため、大掛かりな機械と複雑な解析方法が必要である。特許文献２に記載の方法は、ＳＮＰｓ解析であることから、現在の歯周炎の状態を把握するものではない。特許文献３～５に記載の方法は、試験紙を用いる方法であることから歯科クリニックでも行うことが可能な方法ではあるが、従来から行われているプロービング等の診断方法に比べて、より正確に診断を行うことができるというわけではなく、さほど普及していないのが現状である。また、非特許文献７～９に開示されている方法は、患者の歯周組織を用いて行う必要があるため、一般的な歯周炎の検査として普及するにはいたっていない。
　本発明は、歯周炎の客観的なデータが得られるだけではなく、歯肉滲出液（ＧＣＦ）を用いた非侵襲的検査方法、及び検査キットを提供することを課題とする。
　本発明は、以下の検査方法、バイオマーカー、及び検査キットに関する。
（１）歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、得られた試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐのｍｉＲＮＡ量と、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ量を検出し、参照標準に対して比較解析することを特徴とする歯周炎の検査方法。
（２）歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐからなるｍｉＲＮＡ量を検出し、参照標準に対して比較解析することを特徴とする歯周炎の検査方法。
（３）前記参照標準として、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐの少なくとも１つ以上を用いることを特徴とする（１）又は（２）に記載の検査方法。
（４）ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む歯周炎バイオマーカー。
（５）少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐを含むことを特徴とする（４）記載の歯周炎バイオマーカー。
（６）ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐからなるｍｉＲＮＡであることを特徴とする（４）又は（５）記載の歯周炎バイオマーカー。
（７）参照標準として、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐの少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする（４）～（６）のいずれか１つ記載の歯周炎バイオマーカー。
（８）ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したアレイを含む歯周炎検査キット。
（９）前記アレイが少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したものであることを特徴とする（８）記載の歯周炎検査キット。
（１０）前記アレイが、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したアレイであることを特徴とする（８）又は（９）記載の歯周炎検査キット。
（１１）参照標準として、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐの少なくとも１つ以上をアレイに含むことを特徴とする（８）～（１０）のいずれか１つ記載の歯周炎検査キット。
（１２）歯肉溝滲出液採取用ペーパーストリップ、ｍｉＲＮＡ抽出試薬、ｍｉＲＮＡ検出試薬を含むことを特徴とする（８）～（１１）いずれか１項記載の歯周炎検査キット。
（１３）歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、表３～表６に記載されるｍｉＲＮＡの群から選択される少なくとも１つ以上のｍｉＲＮＡ量を検出することを特徴とする歯周炎の検査方法。
　ＧＣＦを用い、正確に歯周炎の診断を行うことのできる検査方法、及び検査キットを提供することができる。
歯肉溝滲出液から抽出したｍｉＲＮＡの電気泳動図。 歯肉溝滲出液試料セット＃１のｍｉＲＮＡ解析を示す図。図２Ａは主成分分析結果を、図２Ｂは、Ｖｏｌｃａｎｏプロットを示す図。 歯肉溝滲出液試料セット＃２のｍｉＲＮＡ解析を示す図。図３Ａは、健常者、歯周炎患者のｍｉＲＮＡ発現の２Ｄ　ｈｉｅｒａｒｃｈｉａｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ解析の結果を示す図。図３Ｂは、Ｖｏｌｃａｎｏプロットを示す図。図３Ｃは、各ＲＮＡの発現レベルをＢｏｘプロットで表した図。 ２つの異なる試料セットの比較を示した図。図４Ａは、４０個のｍｉＲＮＡの発現の比（-ΔΔＣｑ値）の試料セット＃１、セット＃２間の相関を示した図。図４Ｂは、４０個のｍｉＲＮＡの発現レベルをＢｏｘプロットで表した図。
　本発明はＧＣＦからＲＮＡを単離して、ｍｉＲＮＡを解析することを特徴としている。これまでのｍｉＲＮＡによる歯周炎の検査は、歯肉組織を用いて行われていた。本発明の検査方法はＧＣＦからｍｉＲＮＡを単離して検査する非侵襲的な検査であり、患者の負担が少ない。また、歯周炎が疑われる歯ごとにＧＣＦを採取することができるため、唾液を用いた検査では行うことができなかった、歯周炎に罹患している歯を特定し、歯毎に歯周炎の状態を客観的に判断することが可能となった。
　本発明では歯周炎患者で特異的に発現の変化が見られるｍｉＲＮＡを開示し、特に４０のｍｉＲＮＡをパネルとして用いることにより、正確な検査が行えることを開示している。ただし、簡便な検査では、ここで示した歯周炎に特異的なｍｉＲＮＡの発現量を求めることができればいいので、参照となるｍｉＲＮＡ量と、歯周炎で変化が見られたｍｉＲＮＡ量を１つ以上選択して測定すればよい。また、歯周炎患者で発現増強が確認されたｍｉＲＮＡと、減少が確認されたｍｉＲＮＡを組み合わせて検査に用いれば、より正確に診断を行うことができることから好ましい。
　また、ｍｉＲＮＡの定量はここでは定量的ＰＣＲ法によって行ったが、ｍｉＲＮＡ量を定量することができれば、どのような方法を用いてもよい。
　また、以下で示すパネルとして用いる４０のｍｉＲＮＡは、そのうちのいくつかを選択して用いてもよいし、本発明で開示している他のｍｉＲＮＡと入れ替えて検査に用いてもよい。以下、解析結果を挙げながら本発明を詳細に説明する。
≪対象者≫
　以下にデータを示す試料は、東京医科歯科大学の倫理委員会で承認された研究に基づき、インフォームドコンセントを得たうえで患者、及び健常者のボランティアから得られたものである。歯周炎の診断は、歯周ポケットの深さ、プロービングの際の出血によって行った。なお、ＧＣＦの採取は、診断に先立って行っている。また、歯周炎患者の一人が、軽度の糖尿病を併発していた他は、全身性疾患を伴っていたものはいない。なお、糖尿病を併発していた歯周炎患者の糖尿病も軽度であり投薬治療は受けてはいない。
　解析を行った対象は、以下の表１、表２に示す健常者、歯周炎患者から得たものである。表１で示す８名の対象は、健常者５名、歯周炎患者３名であり、平均年齢は夫々３８歳、５３歳である。また、表２で示す１２名の対象者は、健常者６名、歯周炎患者６名であり、平均年齢は夫々２８歳、６５歳であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表中の符号は以下のとおりである。Ｍ：男性、Ｆ：女性、Ｈ：健常者、ＣＰ：慢性歯周炎（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、ＡｇＰ：侵襲性歯周炎（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、ＰＤ：歯周ポケット深さ（ｐｒｏｂｉｎｇ　ｐｏｃｋｅｔ　ｄｅｐｔｈ）、ＮＳ：非喫煙者、Ｓ：喫煙者なお、以下に示すデータのＨ１～Ｈ１１は上記表に示す健常者のサンプルであることを示し、Ｐ１～Ｐ９は同様に上記表に示す歯周炎患者のサンプルであることを示す。
≪歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）の採取≫
　ＧＣＦを採取する前に、歯肉縁上の歯垢、及び歯の周辺の唾液は綿球で除去し、エアードライヤーによって、ＧＣＦを採取する歯の周辺を乾燥させた。コットンロールによって、周辺から隔離した後に、濾紙片（Ｏｒａｌｆｌｏｗ社製）を歯周ポケットに穏やか挿入し、ＧＣＦを採取した。血液が付着している濾紙片は解析には用いなかった。
　複数の濾紙片により、各対象者から約４．８μｌのＧＣＦを採取して解析に用いた。濾紙は６０μｌのリン酸緩衝液を含むチューブに集め、急速凍結し、ＲＮＡを単離するまで保存した。
≪ＲＮＡの単離≫
　以下のようにして、ＧＣＦからＴｒｉｚｏｌ　ＬＳ試薬（ライフテクノロジーズ社製）を用いてＲＮＡを抽出した。ＧＣＦは、７５０μｌのＴｒｉｚｏｌ　ＬＳ試薬に溶解し、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ精製水により１ｍｌになるように調整した。次に、０．２ｍｌのクロロホルムを加え、水相を集め、イソプロパノールを加えた。遠心して沈殿を集め、乾燥してエタノールで洗浄後、５０μｌのｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ精製水に溶解した。ＲＮＡの精製度と濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて測定した。Ａ２６０／２３０の比が０．９～１．６、Ａ２６０／２８０の比が１．６～１．８の試料をｍｉＲＮＡ解析に用いた。
　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ量は、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｎａｎｏ　ａｓｓａｙを用い、Ａｇｉｌｅｎｔ　２１００　ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー社製）によって測定した。電気泳動図はいずれの試料もきれいなピークを示した。一例を図１に示す。図１の左パネルは健常者、右パネルは歯周炎患者から得られたＲＮＡ試料の電気泳動図を示している。どちらの試料も２５～２００ｎｔのｓｍａｌｌ　ＲＮＡのピークが観察される。
≪ｍｉＲＮＡの発現解析≫
　ｍｉＲＮＡ発現解析は、ｍｉＲＣＵＲＹ　ＬＮＡ（登録商標）　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＲＴ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｘｉｑｏｎ社製）を用いて解析した。一本鎖ｃＤＮＡは８μｌのＲＮＡからｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ　ＩＩ（Ｅｘｉｑｏｎ社製）を用いて合成した。合成したｃＤＮＡは希釈し、ＥｘｉＬＥＴ　ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘと混合しＨｕｍａｎ　ｍｉＲＮｏｍｅ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ＰＣＲ　ｐａｎｅｌ（Ｅｘｉｑｏｎ社製）に分注し、定量的ＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）を用いて行った。
　参照プローブとして、ＧＣＦで発現が安定していたｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐを正規化に用いた。正規化した値はΔＣｑと表している。
　≪解析結果≫
　表１に示す５名の健常者、３名の歯周炎患者から採取したＧＣＦのｍｉＲＮＡ（試料セット＃１）を解析した。健常者のＧＣＦを採取した部位は、歯周ポケット深さが３ｍｍ以下であり、プロービングによる出血は見られなかった。一方、歯周炎患者は歯周ポケット深さが３ｍｍより大きく（ほとんどの歯周ポケット深さは４～８ｍｍ）、多くの患者でプロービングによる出血が観察された。
　主成分解析（ＰＣＡ）によるｍｉＲＮＡ発現パターンは健常者、歯周炎患者ではっきりと２つに分かれて分布していた（図２Ａ）。表１に示す５名の健常者（Ｈ１～Ｈ５）、３名の歯周炎患者（Ｐ1～Ｐ３）から得られたＲＮＡ試料を解析した結果は、両者の発現パターンが異なることを示している。Ｘ軸は、ＰＣＡ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　１（ＰＣ１：４６．９％　ｖａｒｉａｎｃｅ）、Ｙ軸はＰＣＡ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　２（ＰＣ２：１５．７％　ｖａｒｉａｎｃｅ）を示す。
　７５１のヒトｍｉＲＮＡのプライマーセットのうち、健常者、歯周炎患者の各群の夫々少なくとも一人から６１９のｍｉＲＮＡの発現データを得ることができた。それらのうち、歯周炎患者において３３２のｍｉＲＮＡは発現増強が認められ、２８７のｍｉＲＮＡは発現減少が認められた（図２Ｂ）。Ｘ軸は、－ΔΔＣｑ値で表す相対的な発現比を示し、Ｙ軸は２群間でのｔ-テストから得られた－ｌｏｇ１０（ｐ－ｖａｌｕｅ）を表している。
　黒丸（●）で示したのは、ｐ値が＜０．０５、ΔΔＣｑ＞１．０、又はΔΔＣｑ＜－１．０（図２Ｂにカットオフとして線で示している。）のｍｉＲＮＡであり、歯周炎患者で有意に発現増強、又は減少が見られるものを示す。
　歯周炎患者で、有意に発現減少、又は発現増強が観察されたｍｉＲＮＡは、夫々６３（表３）、５５個（表４）あった。これらのｍｉＲＮＡは歯周炎患者と健常者との間で発現に有意な差が見られたｍｉＲＮＡであることから、単独で用いても、いくつかを組み合わせて検査に用いてもよい。また、正確な診断を行うためには、複数のｍｉＲＮＡを組み合わせて検査に用いるのが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　さらに、上記の結果において、ΔＣｑ値が低いほどｍｉＲＮＡの発現量が多く、検出感度が比較的良いと想定される。したがってΔＣｑ＜－２．５、ｐ値が＜０．０５、ΔΔＣｑ＞０．７、又はΔΔＣｑ＜－０．７、との基準を満たすｍｉＲＮＡを歯肉溝滲出液試料セット＃１の解析結果から抽出した（表５）。したがって、表５に示すｍｉＲＮＡは単独、あるいはいくつかを組み合わせて歯周炎の診断マーカーとして好ましく用いることができる。特に、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐは、感度も再現性も良いことから、マーカーとして好ましく用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　また、各ｍｉＲＮＡの機能により着目して、次の５つの基準に基づいて発現量に変化が見られたｍｉＲＮＡから４０個のｍｉＲＮＡを抽出した。
（１）健常者、歯周炎患者で有意に差が認められるもの（できればｐ値が０．０５より小さいもの）
（２）初期の発現レベルが高いと考えられるΔＣｑ値が比較的小さいもの
（３）ΔＣｑ値の差（ΔΔＣｑ）が大きいもの
（４）標的遺伝子が機能的に重要であると示唆されているもの、又はこれまでの研究成果により確認されているもの
（５）歯周炎との関連が今までの研究により報告されているもの
　各ｍｉＲＮＡについて上記５つの基準で評価し、表６に示す１９の歯周炎患者で発現増強が認められるｍｉＲＮＡ、２１の発現減少が認められるｍｉＲＮＡを抽出した。また、上述のように、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐの５つのｍｉＲＮＡは、すべての試料で安定して発現していたことから、参照ｍｉＲＮＡ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｍｉＲＮＡ）として、以後の実験解析に含め、正規化に用いた。なお、表６の分子のうち、表中ハイライトの付してあるｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐは、今までに歯周炎、歯周病との関連が全く知られていない分子である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表１の試料を用いて得られた結果を評価するために、次に表２で示した対象から得られた試料を用いて上記で選択した４０のｍｉＲＮＡの発現を測定した。健常者６名、歯周炎患者６名から得られた結果は、両者ではっきりとした差があることが示された（図３Ａ）。なお、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐはＰ７の試料で増幅することができなかったため、図３Ａでは、これを除いて表示している。
　選択した４０のｍｉＲＮＡの発現レベルをＶｏｌｃａｎｏプロットで示す（図３Ｂ）。図２Ｂと同様に、Ｘ軸は、－ΔΔＣｑ値で表す相対的な発現比を示し、Ｙ軸は２群間でのｔ-テストから得られた－ｌｏｇ１０（ｐ－ｖａｌｕｅ）を表している。黒丸（●）で示したのは、ｐ値が＜０．０５、｜ΔΔＣｑ｜＞１．０のｍｉＲＮＡを示す。３４のｍｉＲＮＡは発現レベルのｐ値＜０．００５であり、１７のｍｉＲＮＡはΔΔＣｑ＞１．０、又は＜－１．０と有意差があった。
　さらに、各ｍｉＲＮＡの発現レベルをＢｏｘプロットで表した（図３Ｃ）。白抜きの四角は、健常者、灰色の四角は歯周炎患者の結果を示す。横棒は各中央値を示している。上段のパネルは１９の歯周炎患者で発現増強の見られたｍｉＲＮＡ、下段は発現減少の見られたｍｉＲＮＡの解析結果である。ΔＣｑ値から判断すると、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐがＧＣＦでの発現レベルが高いことが明らかとなった。したがって、これらのｍｉＲＮＡの少なくともいずれかを検出することにより、感度良く測定を行うことができる。
　次に、表１、表２で示した試料間で、４０のｍｉＲＮＡの発現の比（－ΔΔＣｑ値）に相関があるか解析を行った。図４Ａは試料間の値を散布図で示したものである。Ｓｐｅａｒｍａｎの相関係数（ρ）は０．９５であり両者に強い相関があることが示された。
　さらに、各対象において、歯周炎患者において発現増強が認められた１９のｍｉＲＮＡ、発現減少が認められた２１のｍｉＲＮＡに関して、表１、表２の各対象において、ΔＣｑ値の分布を比較した（図４Ｂ）。表１、表２、どちらの試料であっても発現増強、発現減少を示すｍｉＲＮＡの特徴的なパターンは同様であった。これらの結果は選択した４０のｍｉＲＮＡの発現が歯周炎患者の特徴を表す、再現性の良いものであることを示している。
　以上の結果から、歯周炎の診断を行う検査には、上記表６に選択した４０のｍｉＲＮＡをパネルとして用いれば正確な診断を行うことができる。しかし、これら４０のｍｉＲＮＡをすべて使用する必要はなく、必要に応じて選択して用いることもできる。また、表６の４０のｍｉＲＮＡ以外にも、表３～５に示したｍｉＲＮＡは歯周炎の患者で特異的に変化が見られることから好ましく用いることができる。特に、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐは感度も良く検出を行うことができるので、歯周炎の検査に好ましく用いることができる。

Claims (13)

  1. 　歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、
    　得られた試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐのｍｉＲＮＡ量と、
    　ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、
    　及びｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ量を検出し、
    　参照標準に対して比較解析することを特徴とする歯周炎の検査方法。
  2. 　歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、
    　ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐからなるｍｉＲＮＡ量を検出し、
    　参照標準に対して比較解析することを特徴とする歯周炎の検査方法。
  3. 　前記参照標準として、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐの少なくとも１つ以上を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の検査方法。
  4. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、
    　及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む歯周炎バイオマーカー。
  5. 　少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐを含むことを特徴とする請求項４記載の歯周炎バイオマーカー。
  6. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐからなるｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項４又は５記載の歯周炎バイオマーカー。
  7. 　参照標準として、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐの少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする請求項４～６のいずれか１項記載の歯周炎バイオマーカー。
  8. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、
    　及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したアレイを含む歯周炎検査キット。
  9. 　前記アレイが少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したものであることを特徴とする請求項８記載の歯周炎検査キット。
  10. 　前記アレイが、
    　少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したアレイであることを特徴とする請求項８又は９記載の歯周炎検査キット。
  11. 　参照標準として、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐの少なくとも１つ以上をアレイに含むことを特徴とする請求項８～１０のいずれか１項記載の歯周炎検査キット。
  12. 　歯肉溝滲出液採取用ペーパーストリップ、
    　ｍｉＲＮＡ抽出試薬、
    　ｍｉＲＮＡ検出試薬を含むことを特徴とする請求項８～１１いずれか１項記載の歯周炎検査キット。
  13. 　歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、
    　ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４５－３ｐｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－３ｐｈｓａ－ｍｉＲ－１２４７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５－２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ-５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１５－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ以上のｍｉＲＮＡ量を検出することを特徴とする歯周炎の検査方法。
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