JP7120663B2 - 糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法、糖尿病性腎臓病の検査用キット、動物治療方法、及び糖尿病性腎臓病用医薬 - Google Patents
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Description
本発明は、バイオマーカー、診断方法、検査用キット、動物治療方法、及び医薬に係り、特に糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカー、糖尿病性腎臓病の診断方法、糖尿病性腎臓病の検査用キット、動物治療方法、及び糖尿病性腎臓病用医薬に関する。
近年、糖尿病の患者数が年々急増している。この糖尿病に伴う糖尿病性腎症は、予後の悪い腎疾患である。
糖尿病性腎症では、自覚症状が殆どないため、病状が進行して末期腎不全に至り、透析導入となることが多い。透析導入は、糖尿病患者のＱＯＬを著しく低下させ、更に、重篤な場合には生命に関わってくる。
糖尿病性腎症では、自覚症状が殆どないため、病状が進行して末期腎不全に至り、透析導入となることが多い。透析導入は、糖尿病患者のＱＯＬを著しく低下させ、更に、重篤な場合には生命に関わってくる。
従来、この糖尿病性腎症の確定診断は、腎生検で行われている。腎生検は入院が必要な侵襲的検査であり、合併症の危険もある。このため、病状評価の目的などで繰り返しの検査はできない。その他、従来から、蛋白尿（アルブミン尿）、ｅＧＦＲによる腎機能の検査等で、腎臓の病状が評価されている。しかしながら、これらは、糖尿病性腎症に特異的な検査ではなく、殆どの腎疾患で共通したマーカーとなるにすぎない。
このように、糖尿病性腎症を早期に正確に診断できる診断方法は存在しなかった。
このように、糖尿病性腎症を早期に正確に診断できる診断方法は存在しなかった。
また、近年、微量アルブミン尿や蛋白尿を認めていなくても腎機能低下を示す糖尿病性腎症の患者が多数存在することが明らかになってきている。
このような従来の経過をとらない糖尿病性腎症を含めて、国際的に、病名として糖尿病性腎臓病（Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ、ＤＫＤ）と呼ばれるようになってきている。
このような従来の経過をとらない糖尿病性腎症を含めて、国際的に、病名として糖尿病性腎臓病（Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ、ＤＫＤ）と呼ばれるようになってきている。
一方、ＤＫＤに加え、糖尿病と直接関連しない腎疾患（ＩｇＡ腎症、ＰＫＤ等）患者が糖尿病を合併した場合を含む、より広い概念として、糖尿病合併ＣＫＤ（ＣＫＤ ｗｉｔｈ ｄｉａｂｅｔｅｓ）が存在する。
ところで、近年、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）が多様な病態に関与し、疾病早期診断のバイオマーカーとして有効であることが報告されている。
特許文献１を参照すると、慢性的な糖尿病の状態を示す指標、特に糖尿病性網膜症のバイオマーカーとして、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５０が記載されている。
特許文献１を参照すると、慢性的な糖尿病の状態を示す指標、特に糖尿病性網膜症のバイオマーカーとして、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５０が記載されている。
しかしながら、特許文献１のバイオマーカーは、糖尿病性腎臓病を特異的に診断できるものではなかった。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
本発明の糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法は、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐである糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーを用いることを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法は、前記ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの血清中での発現が上昇している場合及び／又は前記ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現が低下している場合、糖尿病性腎臓病と診断することを補助することを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法は、診断は、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）と、糖尿病を合併しているその他の腎障害との判別を含むことを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病の検査用キットは、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐを測定する試薬を含むことを特徴とする。
本発明の動物治療方法は、ヒト以外の動物の治療方法であって、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミックを含む組成物を投与し、糖尿病性腎臓病の腎臓を治療することを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病用医薬は、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミックを含む組成物であることを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病用医薬は、前記組成物は、ＩＩ型糖尿病による糖尿病性腎臓病用の医薬であることを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法は、前記ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの血清中での発現が上昇している場合及び／又は前記ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現が低下している場合、糖尿病性腎臓病と診断することを補助することを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法は、診断は、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）と、糖尿病を合併しているその他の腎障害との判別を含むことを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病の検査用キットは、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐを測定する試薬を含むことを特徴とする。
本発明の動物治療方法は、ヒト以外の動物の治療方法であって、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミックを含む組成物を投与し、糖尿病性腎臓病の腎臓を治療することを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病用医薬は、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミックを含む組成物であることを特徴とする。
本発明の糖尿病性腎臓病用医薬は、前記組成物は、ＩＩ型糖尿病による糖尿病性腎臓病用の医薬であることを特徴とする。
本発明によれば、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐを用いることで、糖尿病性腎臓病を特異的に診断可能なバイオマーカーを提供することができる。
＜実施の形態＞
従来、糖尿病性腎臓病の確定診断は腎生検が行われている。また、アルブミン尿、腎機能などで病状評価されているが、両者とも糖尿病性腎臓病に特異的ではなくほとんどの腎疾患で共通したマーカーにすぎなかった。
このため、本発明者らは、多様な病態に関与していることが知られてきたｍｉＲＮＡに着目した。ｍｉＲＮＡは人を含む哺乳類で２０００種類程度あることがわかっており、その塩基配列は、公共のデータベース（ｍｉＲＢａｓｅ等）に登録されている。
しかしながら、糖尿病性腎臓病のバイオマーカーとして有用なｍｉＲＮＡは確立されていなかった。
従来、糖尿病性腎臓病の確定診断は腎生検が行われている。また、アルブミン尿、腎機能などで病状評価されているが、両者とも糖尿病性腎臓病に特異的ではなくほとんどの腎疾患で共通したマーカーにすぎなかった。
このため、本発明者らは、多様な病態に関与していることが知られてきたｍｉＲＮＡに着目した。ｍｉＲＮＡは人を含む哺乳類で２０００種類程度あることがわかっており、その塩基配列は、公共のデータベース（ｍｉＲＢａｓｅ等）に登録されている。
しかしながら、糖尿病性腎臓病のバイオマーカーとして有用なｍｉＲＮＡは確立されていなかった。
このため、本発明者らは、鋭意実験を繰り返し、糖尿病性腎臓病に特異的なバイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡを探索した。
具体的には、後述の実施例１で詳細を説明するように、本発明者らは、糖尿病性腎臓病モデルマウスの腎臓と血液で変化しているｍｉＲＮＡをマイクロアレイ法、及びリアルタイムＰＣＲの一種であるｑＲＴ－ＰＣＲ法で網羅的に解析、同定した。さらに、同定したｍｉＲＮＡ発現変化をヒトの血清サンプルについて、ｑＲＴ－ＰＣＲで、健常人、腎障害のない糖尿病患者、腎生検で組織学的に診断された糖尿病性腎臓病患者、糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者で比較検討し、糖尿病性腎臓病患者の血清で特異的に変化するｍｉＲＮＡを同定し、本発明を完成させるに至った。
具体的には、後述の実施例１で詳細を説明するように、本発明者らは、糖尿病性腎臓病モデルマウスの腎臓と血液で変化しているｍｉＲＮＡをマイクロアレイ法、及びリアルタイムＰＣＲの一種であるｑＲＴ－ＰＣＲ法で網羅的に解析、同定した。さらに、同定したｍｉＲＮＡ発現変化をヒトの血清サンプルについて、ｑＲＴ－ＰＣＲで、健常人、腎障害のない糖尿病患者、腎生検で組織学的に診断された糖尿病性腎臓病患者、糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者で比較検討し、糖尿病性腎臓病患者の血清で特異的に変化するｍｉＲＮＡを同定し、本発明を完成させるに至った。
〔バイオマーカー〕
より詳細に説明すると、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーは、患者のｍｉＲＮＡであることを特徴とする。
ｍｉＲＮＡは、タンパク質へ翻訳されないＲＮＡであり、機能性のノンコーディングＲＮＡの一種である。ｍｉＲＮＡは、真核生物のゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て、最終的に２０～２５塩基程度の一本鎖ＲＮＡとなり、遺伝子の転写後発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、転写後発現調節により、発生、増殖、分化、アポトーシス、代謝といった広範な生物学的プロセスに重要な働きをする。
より詳細に説明すると、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーは、患者のｍｉＲＮＡであることを特徴とする。
ｍｉＲＮＡは、タンパク質へ翻訳されないＲＮＡであり、機能性のノンコーディングＲＮＡの一種である。ｍｉＲＮＡは、真核生物のゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て、最終的に２０～２５塩基程度の一本鎖ＲＮＡとなり、遺伝子の転写後発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡは、転写後発現調節により、発生、増殖、分化、アポトーシス、代謝といった広範な生物学的プロセスに重要な働きをする。
具体的には、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーは、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐであることを特徴とする。
このうち、マウスの成熟型ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ（ｍｉＲｂａｓｅ Ｎｏ：ＭＩＭＡＴ００００１３６）の配列を以下に示す：
５’－ｕｃｃｃｕｇａｇａｃｃｃｕａａｃｕｕｇｕｇａ－３’ （配列番号１）
このうち、マウスの成熟型ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ（ｍｉＲｂａｓｅ Ｎｏ：ＭＩＭＡＴ００００１３６）の配列を以下に示す：
５’－ｕｃｃｃｕｇａｇａｃｃｃｕａａｃｕｕｇｕｇａ－３’ （配列番号１）
ヒトの成熟型ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ（ｍｉＲｂａｓｅ Ｎｏ：ＭＩＭＡＴ００００４２３）の配列を以下に示す：
５’－ｕｃｃｃｕｇａｇａｃｃｃｕａａｃｕｕｇｕｇａ－３’ （配列番号２）
５’－ｕｃｃｃｕｇａｇａｃｃｃｕａａｃｕｕｇｕｇａ－３’ （配列番号２）
さらに、マウスの成熟型ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ（ｍｉＲｂａｓｅ Ｎｏ：ＭＩＭＡＴ００００６７３）の配列を以下に示す：
５’－ａａｃａｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｕｃｇｇｕｇｇｇｕｕ－３’（配列番号３）
５’－ａａｃａｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｕｃｇｇｕｇｇｇｕｕ－３’（配列番号３）
ヒトの成熟型ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ（ｍｉＲｂａｓｅ Ｎｏ：ＭＩＭＡＴ００００２５７）の配列を以下に示す：
５’－ａａｃａｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｕｃｇｇｕｇｇｇｕ－３’ （配列番号４）
５’－ａａｃａｕｕｃａｕｕｇｃｕｇｕｃｇｇｕｇｇｇｕ－３’ （配列番号４）
ここで、本実施形態のｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、それぞれの種において、一種単独でも二種以上併用することも可能である。
さらに、本実施形態のｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐとして、マウス及びヒト以外の真核生物、具体的には各種動物において、相同性のあるｍｉＲＮＡを用いることが可能である。この動物は特に限定されず、例えば、家畜動物種、野生動物等を含む。各ｍｉＲＮＡは、哺乳類で、ほぼ同じ塩基配列であるため、相同性を基に検索して用いることが可能である。この相同性としては、８０％以上であることが好適であり、９０％以上であることが更に好適である。さらに、これらの配列と相補的な配列、又は、ハイブリダイズ可能な程度に同一な配列を含んでいてもよい。
加えて、本実施形態の各ｍｉＲＮＡ及び後述する機能活性調整剤は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ、初期転写産物）又はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡ、前駆体）として提供されてもよい。この場合、本実施形態のｍｉＲＮＡは、一本鎖ではなくてもよく、ステム及びループ構造等により、二本鎖部分を形成していてもよい。
さらに、本実施形態の各ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ等をコードするＲＮＡ、ＤＮＡ等の核酸分子であってもよい。また、この核酸分子は、人工核酸分子、例えば、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ＰＮＡ）、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ＬＮＡ）等も含む。
さらに、本実施形態の各ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ等をコードするＲＮＡ、ＤＮＡ等の核酸分子であってもよい。また、この核酸分子は、人工核酸分子、例えば、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ＰＮＡ）、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ＬＮＡ）等も含む。
本実施形態の各ｍｉＲＮＡ、及び機能活性調整剤の製造は、当業者に一般的な化学合成法、又は組換え手法等で製造することが可能である。この組み換え手法では、上述のような成熟（ｍａｔｕｒｅ）型のｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのいずれか又はこれらをコードするＤＮＡの塩基配列が、適切なベクターに含まれるようにしてもよい。このベクターは、例えば、真核生物において、核酸の発現に適した発現ベクターである。このベクターに含まれる核酸分子は、各ｍｉＲＮＡ分子の転写、ｍｉＲＮＡに成熟するまでの前駆体又は一次転写産物を標的としていてもよい。さらに、各ｍｉＲＮＡのゲノム上のコピー等を変更するような配列、転写調製配列等を含んでいてもよい。
〔診断方法〕
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の診断方法は、上述の糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーを用いることを特徴とする。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の診断方法では、主に、患者の血清中又は血漿（以下、単に「血液」という。）に存在するｍｉＲＮＡレベルを検出することで、糖尿病性腎臓病であることを診断する。すなわち、本実施形態の糖尿病性腎臓病の診断方法は、糖尿病性腎臓病の検査方法としても用いることが可能である。
さらに、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、いずれも、糖尿病性腎臓病と、糖尿病を合併しているその他の腎障害と判別することが可能である。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の診断方法は、上述の糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーを用いることを特徴とする。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の診断方法では、主に、患者の血清中又は血漿（以下、単に「血液」という。）に存在するｍｉＲＮＡレベルを検出することで、糖尿病性腎臓病であることを診断する。すなわち、本実施形態の糖尿病性腎臓病の診断方法は、糖尿病性腎臓病の検査方法としても用いることが可能である。
さらに、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、いずれも、糖尿病性腎臓病と、糖尿病を合併しているその他の腎障害と判別することが可能である。
具体的には、患者のｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの血清での発現が上昇している場合には、糖尿病性腎臓病と診断することが可能である。加えて、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの腎臓での発現が低下している場合には、糖尿病性腎臓病と診断することが可能である。
さらに、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現が血清及び／又は腎臓中で低下している場合、糖尿病性腎臓病と診断することが可能である。
これら、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの血清での発現の上昇若しくは腎臓中での発現低下、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの血清並びに／若しくは腎臓中での発現の低下については、組み合わせて判断しても、いずれかの発現のみで判断してもよい。
ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現が低下と、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現の上昇とを組み合わせて判断すると、より確実に糖尿病性腎臓病と診断することが可能となる。後述の実施例２では、この組み合わせの効果について、実際の実験結果を示している。
さらに、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現が血清及び／又は腎臓中で低下している場合、糖尿病性腎臓病と診断することが可能である。
これら、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの血清での発現の上昇若しくは腎臓中での発現低下、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの血清並びに／若しくは腎臓中での発現の低下については、組み合わせて判断しても、いずれかの発現のみで判断してもよい。
ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現が低下と、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現の上昇とを組み合わせて判断すると、より確実に糖尿病性腎臓病と診断することが可能となる。後述の実施例２では、この組み合わせの効果について、実際の実験結果を示している。
これらの発現量の差は、例えば、患者の血液中に存在する発現量を測定し、得られた数値について、統計的に有意差があるか否かを検定する。
この血液中の発現量の測定としては、例えば、ヒト等の患者から採血をし、その上澄みを遠心し、血球を除いた血清又は血漿からトータルＲＮＡを抽出する。トータルＲＮＡの抽出方法としては、例えば、グアニジン－塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法、当業者に一般的なＲＮＡ抽出用カラム等を用いることが可能である。この上で、抽出されたトータルＲＮＡ中から、本実施形態の各ｍｉＲＮＡの発現量を測定する。この測定は、例えば、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）センサ測定法、ｑＲＴ－ＰＣＲを含むリアルタイムＰＣＲ法等、当業者に一般的な方法を用いて実現することが可能である。リアルタイムＰＣＲ法を用いる場合、内在性コントロール（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ）ｍｉＲＮＡを用いた発現補正を行うことが可能である。この際の内在性コントロールは、以前に内在性コントロールとして適切と報告されている配列から、健常と病気で変化しないものを当業者が適切に選択することが好適である。
その後、測定された発現量から統計的な有意差を検定する場合、健常者に由来するサンプルから得られたｍｉＲＮＡの発現量と比較し、例えば、５％、好ましくは１％有意であるか否かを統計検定する。この検定は、例えば、Ｔ検定、Ｆ検定、カイ二乗検定等の手法をデータ量やデータの性質等に対応して、適宜用いることが可能である。
検定の結果、統計的に有意であれば、当該患者は、糖尿病性腎臓病であると診断され得る。逆に、統計的に有意でなければ、当該患者は、糖尿病性腎臓病ではないと診断され得る。この場合、他の指標等から、糖尿病性腎臓病ではない、別の腎症の患者であると診断することも可能である。
このような診断方法により、発症初期の段階でも、高い信頼性をもって糖尿病性腎臓病であることを判定することができる。これにより、治療方針の決定に対して重要な情報を提供することができる。
検定の結果、統計的に有意であれば、当該患者は、糖尿病性腎臓病であると診断され得る。逆に、統計的に有意でなければ、当該患者は、糖尿病性腎臓病ではないと診断され得る。この場合、他の指標等から、糖尿病性腎臓病ではない、別の腎症の患者であると診断することも可能である。
このような診断方法により、発症初期の段階でも、高い信頼性をもって糖尿病性腎臓病であることを判定することができる。これにより、治療方針の決定に対して重要な情報を提供することができる。
本発明の実施の形態に係る診断方法についてまとめると、本実施形態の診断方法は、
本実施形態の診断方法は、糖尿病性腎臓病の疑いのある患者から血液及び／又は腎臓組織を採取する工程、採取した血液及び／又は腎臓組織についてｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量を測定する工程、測定されたｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量と健常者のｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量（標準量）とを比較する工程、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量がｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの標準量よりも低いこと検出する及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量がｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの標準量よりも高いこと検出する工程、及び検出された患者は糖尿病性腎臓病であるリスクが高いと決定する工程、を含む糖尿病性腎臓病の診断方法であることを特徴とする。
本実施形態の診断方法は、糖尿病性腎臓病の疑いのある患者から血液及び／又は腎臓組織を採取する工程、採取した血液及び／又は腎臓組織についてｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量を測定する工程、測定されたｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量と健常者のｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量（標準量）とを比較する工程、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量がｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの標準量よりも低いこと検出する及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量がｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの標準量よりも高いこと検出する工程、及び検出された患者は糖尿病性腎臓病であるリスクが高いと決定する工程、を含む糖尿病性腎臓病の診断方法であることを特徴とする。
〔検査用キット〕
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の検査用キットは、上述の糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを測定する試薬を含むことを特徴とする。
このようなｍｉＲＮＡ測定用の試薬としては、例えば、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ＱＣＭセンサ測定法、リアルタイムＰＣＲ法等の検出用の方式に対応したものを含む。すなわち、本実施形態の各ｍｉＲＮＡ検出用のプローブやプライマー等、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液等も含まれる。これに加えて、上述の方式によりｍｉＲＮＡを検出するための資材、器材等を含んでもよい。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の検査用キットは、上述の糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを測定する試薬を含むことを特徴とする。
このようなｍｉＲＮＡ測定用の試薬としては、例えば、ノーザンブロット、マイクロアレイ、ＱＣＭセンサ測定法、リアルタイムＰＣＲ法等の検出用の方式に対応したものを含む。すなわち、本実施形態の各ｍｉＲＮＡ検出用のプローブやプライマー等、各種酵素類、緩衝液、洗浄液、溶解液等も含まれる。これに加えて、上述の方式によりｍｉＲＮＡを検出するための資材、器材等を含んでもよい。
さらに、本実施形態の糖尿病性腎臓病の検査用キットは、診断結果を解析するために、コンピュータ上で検査結果を判断し、データ処理し、可視化するためのプログラム、当該コンピュータを備えた装置及びシステム等を含んでいてもよい。このような装置及びシステム等は、当業者に一般的な技術、方式等を用いて開発可能である。このような装置及びシステム等により、ハイスループットでの検査が可能となり、患者の診断が容易となる。
〔糖尿病性腎臓病用医薬〕
本実施形態の糖尿病性腎臓病用医薬（医療用組成物）は、ｍｉＲＮＡの発現量の増加又は低下させる組成物を含むことを特徴とする。
具体的には、本実施形態の医療用組成物は、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ、及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの機能活性調整剤を含むことを特徴とする。この機能活性調整剤は、ｍｉＲＮＡの発現を調節する作用を有する組成物である。
本実施形態の糖尿病性腎臓病用医薬（医療用組成物）は、ｍｉＲＮＡの発現量の増加又は低下させる組成物を含むことを特徴とする。
具体的には、本実施形態の医療用組成物は、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ、及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの機能活性調整剤を含むことを特徴とする。この機能活性調整剤は、ｍｉＲＮＡの発現を調節する作用を有する組成物である。
本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐに対する機能活性調整剤は、機能活性抑制剤を用いる。この機能活性抑制剤は、例えば、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐに対応したｍｉＲＮＡインヒビターを用いる。このｍｉＲＮＡインヒビターは、例えば、成熟型のｍｉＲＮＡの生成を阻害、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを切断等して、発現を抑制するアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等の核酸分子を含む各種組成物を用いることが可能である。
一方、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐに対する機能活性調整剤は、機能活性亢進剤を用いる。この機能活性亢進剤は、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐに対応したｍｉＲＮＡミミックを含む。このｍｉＲＮＡミミックは、合成されたｍｉＲＮＡを含む組成物であってもよい。
一方、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐに対する機能活性調整剤は、機能活性亢進剤を用いる。この機能活性亢進剤は、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐに対応したｍｉＲＮＡミミックを含む。このｍｉＲＮＡミミックは、合成されたｍｉＲＮＡを含む組成物であってもよい。
加えて、本実施形態の糖尿病性腎臓病用医薬は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又はインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で所望の標的細胞に導入される当業者に一般的な方式で、患者の細胞に導入される。このため、本実施形態の医療用組成物は、当業者に一般的な各種媒体を含んで提供されてもよい。
この媒体としては、例えば、プラスミドやウイルスベクターを用いてもよい。このウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の当業者に一般的なウイルスを用いて構成されてもよい。
この媒体としては、例えば、プラスミドやウイルスベクターを用いてもよい。このウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の当業者に一般的なウイルスを用いて構成されてもよい。
また、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬は、任意の製剤上許容しうる担体を含んでいてもよい。この担体は、例えば、リポソーム担体、コロイド金粒子、ポリペプチド、リポ多糖類、多糖類、脂質膜等であってもよい。これらの中で、機能活性調整剤の発現調整効果を向上させる担体を用いることが好適である。たとえば、ｍｉＲＮＡインヒビターやｍｉＲＮＡミミックについては、リポソーム、特にカチオン性リポソームを用いることが好適である。
さらに、製薬上許容される担体としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等を含んでいてもよい。さらに、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０等と共に投与することが可能である。また、適切な賦形剤等を更に含んでもよい。
また、本実施形態の糖尿病性腎臓病用医薬は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含んでいてもよい。このキャリアは、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。また、キャリアは、乳濁液として提供されてもよい。さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤等の製剤用添加物のいずれか又は任意の組み合わせを含有させてもよい。
本発明に係る糖尿病性腎臓病用医薬の医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、非経口的又は経口的に投与を行うことが可能である。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、腹腔内の投与、又は、腎臓等への直接投与が可能である。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬を上述の治療に用いる際に、投与間隔および投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬の１回の投与量および投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬の１回の投与量および投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
加えて、本発明の組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善又は軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善又は軽減であってもよいし、一定期間の改善又は軽減であってもよい。
さらに、本実施形態の糖尿病性腎臓病用医薬を予防用に用いることで、糖尿病性腎臓病の病態の進行を抑え、糖尿病や高血圧の治療と合わせて腎臓の機能を温存することが可能となる。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善又は軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善又は軽減であってもよいし、一定期間の改善又は軽減であってもよい。
さらに、本実施形態の糖尿病性腎臓病用医薬を予防用に用いることで、糖尿病性腎臓病の病態の進行を抑え、糖尿病や高血圧の治療と合わせて腎臓の機能を温存することが可能となる。
〔治療法〕
本発明の実施の形態に係る動物治療方法は、動物の治療方法であって、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ、及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの機能活性を調整することを特徴とする。
具体的には、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬は、動物の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。この動物は、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類は、例えば、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、又はウサギ等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、又は非ヒューマンのトランスジェニック霊長類等、及びヒトを含んでいてもよい。また、野生動物としては、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、エビや昆虫等を含む甲殻類、その他のイカ等の無脊椎動物等も広く含む。
すなわち、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬は、ヒトの治療の他に、各種動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。このため、本実施形態の患者は、ヒト、及び、上述のヒト以外の動物も含む。
本発明の実施の形態に係る動物治療方法は、動物の治療方法であって、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ、及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの機能活性を調整することを特徴とする。
具体的には、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬は、動物の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。この動物は、特に限定されるものではなく、脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類は、例えば、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、又はウサギ等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、又は非ヒューマンのトランスジェニック霊長類等、及びヒトを含んでいてもよい。また、野生動物としては、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、エビや昆虫等を含む甲殻類、その他のイカ等の無脊椎動物等も広く含む。
すなわち、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬は、ヒトの治療の他に、各種動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。このため、本実施形態の患者は、ヒト、及び、上述のヒト以外の動物も含む。
本発明の実施の形態に係る治療方法についてまとめると、本実施形態の治療方法は、糖尿病性腎臓病の疑いのある患者から血液及び／又は腎臓組織を採取する工程、採取した血液及び／又は腎臓組織についてｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量を測定する工程、測定されたｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量と健常者のｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量（標準量）とをそれぞれ比較する工程、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量がｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの標準量よりも低いこと検出する及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量がｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの標準量よりも高いこと検出する工程、及び検出された患者を治療する工程、を含む糖尿病性腎臓病の診断方法であることを特徴とする。
そして、この糖尿病性腎臓病の治療は、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの機能活性を調整する治療を含むことを特徴とする。このｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの機能活性を調整する治療は、上述の糖尿病性腎臓病用医薬を投与すること含むことを特徴とする。
そして、この糖尿病性腎臓病の治療は、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの機能活性を調整する治療を含むことを特徴とする。このｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの機能活性を調整する治療は、上述の糖尿病性腎臓病用医薬を投与すること含むことを特徴とする。
具体的には、本実施形態では、病態（病因）、病期等に依らず、糖尿病性腎臓病に特異的な治療として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの機能活性を調整することで、糖尿病性腎臓病の治療を行うことが可能である。特に、上述した糖尿病性腎臓病用医薬を投与する等して、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐを過剰発現させる補充療法、及び／又はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐのｍｉインヒビターによる発現抑制療法等により、糖尿病性腎臓病を予防及び治療することが可能となる。この際、例えば、上述のリポソームのようなＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）等でｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ等を投与することが可能である。
さらに、下記に示すような、当業者により実行される典型的な治療法を組み合わせることで、より効果的に糖尿病性腎臓病を治療することが可能となる。
さらに、下記に示すような、当業者により実行される典型的な治療法を組み合わせることで、より効果的に糖尿病性腎臓病を治療することが可能となる。
ここで、糖尿病性腎臓病では、病期として、１期（腎症前期）、２期（早期腎症期）、３Ａ期（前期顕性腎症期）、４期（腎不全期）、５期（透析療法期）に分類される。１期では、腎臓に病変が生じ、糸球体の基底膜が厚くなる。２期では、微量のアルブミンが尿に漏れるようになる。３Ａ期では、糸球体結節等が生じ、蛋白尿が明らかになる。そして、４期では、腎機能の低下も認められるようなる。４期では、腎機能の悪化が顕著となる。５期では、人工透析が必要となる。
これらの進行に応じた治療では、早期に診断をして、インスリン治療を含めた血糖管理をする。この際、糖尿病性腎症では、糖尿病の食事療法に加え、慢性腎不全の食事療法を併用する必要がある。薬物療法としては、高血圧の治療を行うため、一般にはアンジオテンシン変換酵素阻害薬又はアンジオテンシン受容体拮抗薬、カルシウム拮抗薬等を用いる。そして、降圧薬として利尿剤を投与し、浮腫の管理を行う。
これらの進行に応じた治療では、早期に診断をして、インスリン治療を含めた血糖管理をする。この際、糖尿病性腎症では、糖尿病の食事療法に加え、慢性腎不全の食事療法を併用する必要がある。薬物療法としては、高血圧の治療を行うため、一般にはアンジオテンシン変換酵素阻害薬又はアンジオテンシン受容体拮抗薬、カルシウム拮抗薬等を用いる。そして、降圧薬として利尿剤を投与し、浮腫の管理を行う。
加えて、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病用医薬は、動物の体内の一部分、又は動物から摘出又は排出された臓器や組織等についても、治療用の対象とすることができる。さらに、この治療は広義の治療であり、バイオリアクター、モデル動物での培養、人体移植様の培養臓器の培養等にも適用可能である。
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
従来から、透析導入となる腎疾患でもっとも多いのが糖尿病性腎臓病である。糖尿病性腎臓病は糖尿病に合併しておこる腎障害で全透析患者、新規導入透析患者のともに約４割を占めている。糖尿病性腎臓病は高齢者に多いため、今後の高齢化社会でさらに患者数が増加すると考えられている。このように糖尿病性腎臓病の予後が極めて悪く、大きな問題である原因は、糖尿病患者数が極めて多いこと、そのうち約半数が糖尿病性腎臓病に罹患していると考えられているにも関わらず、糖尿病性腎臓病の正確な診断法、特異的な治療法がないことである。糖尿病性腎臓病に特異的で有効な治療法が開発されない理由は、糖尿病性腎臓病を特異的に診断できる検査法がないため、正確な早期診断ができないこと、治療法の効果、病状の進行を正確に判断することができないことがある。
従来から、透析導入となる腎疾患でもっとも多いのが糖尿病性腎臓病である。糖尿病性腎臓病は糖尿病に合併しておこる腎障害で全透析患者、新規導入透析患者のともに約４割を占めている。糖尿病性腎臓病は高齢者に多いため、今後の高齢化社会でさらに患者数が増加すると考えられている。このように糖尿病性腎臓病の予後が極めて悪く、大きな問題である原因は、糖尿病患者数が極めて多いこと、そのうち約半数が糖尿病性腎臓病に罹患していると考えられているにも関わらず、糖尿病性腎臓病の正確な診断法、特異的な治療法がないことである。糖尿病性腎臓病に特異的で有効な治療法が開発されない理由は、糖尿病性腎臓病を特異的に診断できる検査法がないため、正確な早期診断ができないこと、治療法の効果、病状の進行を正確に判断することができないことがある。
従来、糖尿病性腎臓病の確定診断は腎生検で行われていたものの、腎生検は入院が必要な侵襲的検査であり、合併症の危険もあった。そのため、病状評価の目的などで繰り返しの検査はできなかった。その他、アルブミン尿、腎機能などで病状評価されているが、これらの評価は、糖尿病性腎臓病に特異的ではなく、殆どの腎疾患で共通したマーカーにすぎなかった。
また、特許文献１に記載されたような、従来の糖尿病についてのｍｉＲＮＡについては、少数の患者研究、コントロールが健常人のみの研究、特定ｍｉＲＮＡのみの研究等、糖尿病性腎臓病特異的なｍｉＲＮＡの解析ではなかった。すなわち、最大の問題は、報告されたｍｉＲＮＡが糖尿病性腎臓病のみで特異的に変化するのかどうかという特異性の検討がなされていなかった。さらに、腎生検組織との相関が解明されておらず、精度が不明であった。すなわち、従来、糖尿病性腎症のバイオマーカー及び治療ターゲットとして有用なｍｉＲＮＡは同定されていなかった。
また、特許文献１に記載されたような、従来の糖尿病についてのｍｉＲＮＡについては、少数の患者研究、コントロールが健常人のみの研究、特定ｍｉＲＮＡのみの研究等、糖尿病性腎臓病特異的なｍｉＲＮＡの解析ではなかった。すなわち、最大の問題は、報告されたｍｉＲＮＡが糖尿病性腎臓病のみで特異的に変化するのかどうかという特異性の検討がなされていなかった。さらに、腎生検組織との相関が解明されておらず、精度が不明であった。すなわち、従来、糖尿病性腎症のバイオマーカー及び治療ターゲットとして有用なｍｉＲＮＡは同定されていなかった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーは、血液中に存在するｍｉＲＮＡであり、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐを用いることで、糖尿病性腎臓病の診断に用いることが可能となる。
すなわち、本実施形態のバイオマーカーにより、予後の悪い腎疾患である糖尿病性腎臓病を、早期のうちに正確に診断できる。これにより、治療効果が期待できる。
加えて、本実施形態のバイオマーカーは、実際の腎生検組織との相関があったため、糖尿病性腎臓病の実際の病理的な症状との関連性が高く、診断用として有用である。
すなわち、本実施形態のバイオマーカーにより、予後の悪い腎疾患である糖尿病性腎臓病を、早期のうちに正確に診断できる。これにより、治療効果が期待できる。
加えて、本実施形態のバイオマーカーは、実際の腎生検組織との相関があったため、糖尿病性腎臓病の実際の病理的な症状との関連性が高く、診断用として有用である。
加えて、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の診断方法では、本実施形態の各ｍｉＲＮＡが疾患早期から発現変化しているため、早期診断に用いることが可能である。すなわち、本実施形態の診断方法は、腎症のうち糖尿病性腎臓病であることを早期に、被侵襲的に診断することが可能である。
また、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の診断方法では、判別の難しい糖尿病性腎臓病と、糖尿病を合併しているその他の腎障害とを、臨床上の診断にて判別可能となり、治療上の有益な指標を提供することができる。
また、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病の診断方法では、判別の難しい糖尿病性腎臓病と、糖尿病を合併しているその他の腎障害とを、臨床上の診断にて判別可能となり、治療上の有益な指標を提供することができる。
さらに、糖尿病性腎臓病の治療では、腎機能障害が軽度の段階で治療を開始する必要があるものの、特異的な治療薬も存在しなかった。
これに対して、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの機能活性調整剤を用いることで、新規の糖尿病性腎臓病用医薬を提供でき、上述の診断と合わせて早期治療が可能となる。
これに対して、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの機能活性調整剤を用いることで、新規の糖尿病性腎臓病用医薬を提供でき、上述の診断と合わせて早期治療が可能となる。
実際に、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量を増大させるｍｉＲＮＡミミックを用いることで、後述の実施例２に示したように、糖尿病モデルマウスに投与して蛋白尿の増加を抑制し、メサンギウム基質の増大を抑制することが可能である。
このように、本実施形態のｍｉＲＮＡは、糖尿病性腎臓病の診断から治療まで一括して使用でき、診断及び治療による糖尿病性腎臓病の予後改善が可能となる。
このように、本実施形態のｍｉＲＮＡは、糖尿病性腎臓病の診断から治療まで一括して使用でき、診断及び治療による糖尿病性腎臓病の予後改善が可能となる。
なお、上述の実施の形態において、糖尿病性腎臓病の検査方法として、血液からｍｉＲＮＡを取得する例について記載した。
しかしながら、ｍｉＲＮＡは血液以外、例えば、尿中にも安定して存在している。このため、血液以外の組織、体液、尿等から取得されたｍｉＲＮＡの量により、糖尿病性腎臓病であると検出するように構成することも可能である。
しかしながら、ｍｉＲＮＡは血液以外、例えば、尿中にも安定して存在している。このため、血液以外の組織、体液、尿等から取得されたｍｉＲＮＡの量により、糖尿病性腎臓病であると検出するように構成することも可能である。
さらに、本実施形態の診断方法は、腎症の予後を診断する糖尿病性腎臓病予後診断方法としても用いることが可能である。すなわち、糖尿病性腎臓病では、通常の腎症とは異なり、症状が出にくい。このため、早期に診断し、腎症としての予後を予測することで、早期治療に努めて、透析導入となる時期を遅らせることが可能となる。
加えて、糖尿病性腎臓病用医薬となるｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ、及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの機能活性調整剤として、ｍｉＲＮＡインヒビター及びｍｉＲＮＡミミック以外のものを用いることも可能である。
さらに、後述する実施例１に記載したような、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現調整の対象となる遺伝子、遺伝子産物、アゴニスト／アンタゴニスト、その他のパスウェイに対する作用を介した組成物を、機能活性調整剤として用いることも可能である。
さらに、後述する実施例１に記載したような、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現調整の対象となる遺伝子、遺伝子産物、アゴニスト／アンタゴニスト、その他のパスウェイに対する作用を介した組成物を、機能活性調整剤として用いることも可能である。
さらに、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ、及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの機能活性調整剤として、その他のｍｉＲＮＡの転写調節因子を用いたり、各種ベクターによる発現調節、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等による遺伝子治療等を行うことも可能である。
加えて、後述する実施例１に記載した対象とする遺伝子やパスウェイに対する作用を介した遺伝子治療を行うことも可能である。
加えて、後述する実施例１に記載した対象とする遺伝子やパスウェイに対する作用を介した遺伝子治療を行うことも可能である。
ここで、上述のバイオマーカー、診断方法、検査用キット、治療方法、及び医薬のいずれにおいても、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、いずれか単独でも、両方を組み合わせて使用してもよい。
また、本発明の実施の形態に係る医薬は、他の組成物等と併用することも可能である。本発明の組成物を、他の組成物と同時に投与、散布、塗布等をしてもよい。
加えて、本発明の実施の形態に係る機能活性調整剤を、医薬以外の用途の試薬として用いることも可能である。すなわち、糖尿病性腎臓病における作用機序の動物実験やモデル等に使用可能である。
以下で、本発明の実施の形態に係る糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーについて、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
〔実験方法〕
（マイクロアレイ分析）
ｍｉＲＮＡ発現の分析は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ及びＨｙｂキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ社製）を用いて、北海道システムサイエンス社（北海道、日本）に外注して実行した。１００ｎｇのトータルＲＮＡを、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて３７℃で３０分間脱リン酸化し、１００℃で７分間、１００％ジメチルスルホキシドを用いて変性させた。次いで、このサンプルを氷上で２分間冷却した。次いで、サンプルにＴ４リガーゼを用いて１６℃で、２時間インキュベーションさせｐＣｐ－Ｃｙ３で標識した。その後ｐＣｐ－Ｃｙ標識サンプルを８×１５ＫフォーマットＡｇｉｌｅｎｔマウスｍｉｃｒｏＲＮＡアレイ上でハイブリダイズさせた。その後プレートを洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスキャナーを用いて３μｍの分解能でスキャンした。データは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアバージョン１０．７．３．１を使用して解析した。
（マイクロアレイ分析）
ｍｉＲＮＡ発現の分析は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ及びＨｙｂキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ社製）を用いて、北海道システムサイエンス社（北海道、日本）に外注して実行した。１００ｎｇのトータルＲＮＡを、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて３７℃で３０分間脱リン酸化し、１００℃で７分間、１００％ジメチルスルホキシドを用いて変性させた。次いで、このサンプルを氷上で２分間冷却した。次いで、サンプルにＴ４リガーゼを用いて１６℃で、２時間インキュベーションさせｐＣｐ－Ｃｙ３で標識した。その後ｐＣｐ－Ｃｙ標識サンプルを８×１５ＫフォーマットＡｇｉｌｅｎｔマウスｍｉｃｒｏＲＮＡアレイ上でハイブリダイズさせた。その後プレートを洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスキャナーを用いて３μｍの分解能でスキャンした。データは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアバージョン１０．７．３．１を使用して解析した。
（マイクロアレイデータ処理及び統計解析）
ＡｇｉｌｅｎｔデータをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にインポートし、チップあたり９０パーセンタイルに正規化した。 一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて異なる群間の差異を解析した。ＡＮＯＶＡによって統計的有意性が検出された場合、２つの異なる群の平均を比較するためにポストホック検定としてＴｕｋｅｙ検定を行った。Ｐ＜０．０５を有意差ありと判定した。
ＡｇｉｌｅｎｔデータをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にインポートし、チップあたり９０パーセンタイルに正規化した。 一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて異なる群間の差異を解析した。ＡＮＯＶＡによって統計的有意性が検出された場合、２つの異なる群の平均を比較するためにポストホック検定としてＴｕｋｅｙ検定を行った。Ｐ＜０．０５を有意差ありと判定した。
（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
（マウス腎臓）
ガラスホモジナイザー及びフィルターカラムシュレッダー（ＱＩＡシュレッダー、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ製）を用いて、マウス腎臓をホモジナイズした。その後、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、均質化した腎臓サンプルからｍｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを単離した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、単離された１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを逆転写した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を行った。ｑＲＴ－ＰＣＲの条件はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍを用いて、９５℃で１５分間のプレインキュベーション、次いで、（１）９４℃で１５秒間の変性、（２）５５℃で３０秒間のアニーリング、（３）７０℃で３０秒間の伸長のサイクルを４０サイクル行い、結果は、ＲＮＵ６－２（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）をｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いて、２－ΔΔＣＴ ｍｅｔｈｏｄで解析した。
（マウス腎臓）
ガラスホモジナイザー及びフィルターカラムシュレッダー（ＱＩＡシュレッダー、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ製）を用いて、マウス腎臓をホモジナイズした。その後、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、均質化した腎臓サンプルからｍｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを単離した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、単離された１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを逆転写した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を行った。ｑＲＴ－ＰＣＲの条件はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍを用いて、９５℃で１５分間のプレインキュベーション、次いで、（１）９４℃で１５秒間の変性、（２）５５℃で３０秒間のアニーリング、（３）７０℃で３０秒間の伸長のサイクルを４０サイクル行い、結果は、ＲＮＵ６－２（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）をｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いて、２－ΔΔＣＴ ｍｅｔｈｏｄで解析した。
（ヒト血清）
ヒト血清のｍｉＲＮＡレベル解析は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、ＰＡ、ＵＳＡ製）を用いて４００μｌの血清からトータルＲＮＡを単離した。次に、単離したトータルＲＮＡをｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。ｑＲＴ－ＰＣＲの条件はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ－１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍを用いて、９５℃で１５分間のプレインキュベーション、次いで（１）９４℃で１５秒間の変性、（２）５５℃で３０秒間のアニーリング、（３）及び７０℃で３０秒間の伸長のサイクルを４０サイクル行い、結果は、ｍｉＲＮＡ－１６－５ｐ（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）をｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いて、２－ΔΔＣＴ ｍｅｔｈｏｄで解析した。
ヒト血清のｍｉＲＮＡレベル解析は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、ＰＡ、ＵＳＡ製）を用いて４００μｌの血清からトータルＲＮＡを単離した。次に、単離したトータルＲＮＡをｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写した。次に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。ｑＲＴ－ＰＣＲの条件はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ－１２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍを用いて、９５℃で１５分間のプレインキュベーション、次いで（１）９４℃で１５秒間の変性、（２）５５℃で３０秒間のアニーリング、（３）及び７０℃で３０秒間の伸長のサイクルを４０サイクル行い、結果は、ｍｉＲＮＡ－１６－５ｐ（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）をｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いて、２－ΔΔＣＴ ｍｅｔｈｏｄで解析した。
以下のプライマーを用いた。
マウスｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ：
５’－ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡ－３’ （配列番号５）
マウスｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ－３’（配列番号６）
ヒトｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ：
５’－ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡ－３’ （配列番号７）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ－３’（配列番号８）
マウスｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ：
５’－ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡ－３’ （配列番号５）
マウスｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ－３’（配列番号６）
ヒトｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ：
５’－ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡ－３’ （配列番号７）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ－３’（配列番号８）
（マウス）
糖尿病性腎臓病マウス（Ｉ型糖尿病モデルマウス）：ＡＫＩＴＡ／ＳＬｃマウス（日本エスエルシー株式会社より購入）。
糖尿病性腎臓病マウス（ＩＩ型糖尿病モデルマウス）：ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ Ｉａｒ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ マウス。動物繁殖研究所より購入）。
コントロールマウス：正常マウス（Ｃ５７／Ｂ６系統）、動物繁殖研究所より購入。
糖尿病性腎臓病マウス（Ｉ型糖尿病モデルマウス）：ＡＫＩＴＡ／ＳＬｃマウス（日本エスエルシー株式会社より購入）。
糖尿病性腎臓病マウス（ＩＩ型糖尿病モデルマウス）：ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ Ｉａｒ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ マウス。動物繁殖研究所より購入）。
コントロールマウス：正常マウス（Ｃ５７／Ｂ６系統）、動物繁殖研究所より購入。
〔結果〕
（糖尿病性腎臓病マウスの腎臓の変化）
図１に、糖尿病性腎臓病モデルマウスであるＡＫＩＴＡ／ＳＬｃマウスの腎臓の変化を示す。図１（ａ）がコントロールマウス（正常マウス）、図１（ｂ）が糖尿病性腎臓病モデルマウス（ＡＫＴＡマウス）の腎臓を示す。糖尿病性腎臓病マウスでは、糸球体腫大とメサンギウム基質の増大が認められた。
（糖尿病性腎臓病マウスの腎臓の変化）
図１に、糖尿病性腎臓病モデルマウスであるＡＫＩＴＡ／ＳＬｃマウスの腎臓の変化を示す。図１（ａ）がコントロールマウス（正常マウス）、図１（ｂ）が糖尿病性腎臓病モデルマウス（ＡＫＴＡマウス）の腎臓を示す。糖尿病性腎臓病マウスでは、糸球体腫大とメサンギウム基質の増大が認められた。
（マイクロアレイ解析及びｑＲＴ－ＰＣＲ結果）
図２に、マイクロアレイ解析の結果を示す。本実施例１では、糖尿病性腎臓病マウス（４匹）と正常マウス（コントロールマウス）（４匹）の腎臓で、１，８８０種類のｍｉＲＮＡのマイクロアレイ解析を行った。
結果として、糖尿病性腎臓病マウス（ＡＫＩＴＡ／ＳＬｃ）の腎臓で１．２倍以上上昇しているｍｉＲＮＡを１３種類、１．２倍以上低下しているｍｉＲＮＡを２８種類、合計４１種類を選出し、更に、ｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。
なお、糖尿病性腎症マウス（ＡＫＩＴＡ／ＳＬｃマウス）はＩ型糖尿病モデルマウスでもあるため、ＩＩ型糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）での変化も、ｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。糖尿病性腎症マウス及びｄｂ／ｄｂマウスの血清でも、コントロールマウスに比べて変化していることを確認した。
図２に、マイクロアレイ解析の結果を示す。本実施例１では、糖尿病性腎臓病マウス（４匹）と正常マウス（コントロールマウス）（４匹）の腎臓で、１，８８０種類のｍｉＲＮＡのマイクロアレイ解析を行った。
結果として、糖尿病性腎臓病マウス（ＡＫＩＴＡ／ＳＬｃ）の腎臓で１．２倍以上上昇しているｍｉＲＮＡを１３種類、１．２倍以上低下しているｍｉＲＮＡを２８種類、合計４１種類を選出し、更に、ｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。
なお、糖尿病性腎症マウス（ＡＫＩＴＡ／ＳＬｃマウス）はＩ型糖尿病モデルマウスでもあるため、ＩＩ型糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）での変化も、ｑＲＴ－ＰＣＲで確認した。糖尿病性腎症マウス及びｄｂ／ｄｂマウスの血清でも、コントロールマウスに比べて変化していることを確認した。
（ヒトでのｑＲＴ－ＰＣＲ結果）
マウスの血清で特異的に変化するｍｉＲＮＡについて、ヒトにおいて、健常人、腎障害のない糖尿病患者、他の腎疾患患者と比較し、糖尿病性腎臓病のバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを同定した。
具体的には、上述の４１種類のｍｉＲＮＡの血清での発現変化をｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、健常人（１７例）、腎障害のない糖尿病患者（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは２２例、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐは１０例）、腎生検で診断された糖尿病性腎臓病患者（１０例）、腎生検で診断された糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは１８例、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐは１７例。このうち、ＩｇＡ腎症５例、膜性腎症４例、腎硬化症３例、間質性腎炎３例、微小変化ネフローゼ３例）で比較検討し、糖尿病性腎臓病患者の血清でのみ特異的に発現変化する２種類のｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐと、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐとを同定した。なお、腎疾診断は全て腎生検で、組織学的診断した。
マウスの血清で特異的に変化するｍｉＲＮＡについて、ヒトにおいて、健常人、腎障害のない糖尿病患者、他の腎疾患患者と比較し、糖尿病性腎臓病のバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを同定した。
具体的には、上述の４１種類のｍｉＲＮＡの血清での発現変化をｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、健常人（１７例）、腎障害のない糖尿病患者（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは２２例、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐは１０例）、腎生検で診断された糖尿病性腎臓病患者（１０例）、腎生検で診断された糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは１８例、ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐは１７例。このうち、ＩｇＡ腎症５例、膜性腎症４例、腎硬化症３例、間質性腎炎３例、微小変化ネフローゼ３例）で比較検討し、糖尿病性腎臓病患者の血清でのみ特異的に発現変化する２種類のｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐと、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐとを同定した。なお、腎疾診断は全て腎生検で、組織学的診断した。
（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現解析）
ここで、図３により、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量の変化について説明する。
図３（ａ）は、リアルタイムＰＣＲによる血清中のｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの測定について、健常人（１５例）、糖尿病患者（２２例）、糖尿病性腎臓病患者（１０例）、及び糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（１５例）について、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現量の差をみたグラフである。ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、同様の対照患者に比べて、Ｐ＜０．０５で有意に発現量が増加した。
この解析結果について、下記の表１に平均及び標準偏差を示す。
ここで、図３により、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量の変化について説明する。
図３（ａ）は、リアルタイムＰＣＲによる血清中のｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの測定について、健常人（１５例）、糖尿病患者（２２例）、糖尿病性腎臓病患者（１０例）、及び糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（１５例）について、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現量の差をみたグラフである。ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、同様の対照患者に比べて、Ｐ＜０．０５で有意に発現量が増加した。
この解析結果について、下記の表１に平均及び標準偏差を示す。
図３（ｂ）は、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐについてのＲＯＣ曲線（感度／１－特異度）による精度評価（信用性）を示すグラフである。ここでは、糖尿病性腎臓病１０例と、それ以外の４０例（健常人１５例、腎障害のない糖尿病１０例、その他の腎疾患１５例）に分けた合計５０例での解析を行った。ＡＵＣは０．７７８となり、Ｐ＜０．０５で特異的なマーカーであった。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表２に示す。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表２に示す。
（ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現解析）
次に、図４により、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量の変化について説明する。
図４（ａ）は、健常人、糖尿病患者、糖尿病性腎臓病患者、糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者について、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現量の差をみたグラフである。ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量は、Ｐ＜０．０５で有意に低下していた。
この解析結果について、下記の表３に平均及び標準偏差を示す。
次に、図４により、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量の変化について説明する。
図４（ａ）は、健常人、糖尿病患者、糖尿病性腎臓病患者、糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者について、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現量の差をみたグラフである。ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量は、Ｐ＜０．０５で有意に低下していた。
この解析結果について、下記の表３に平均及び標準偏差を示す。
図４（ｂ）は、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐについてのＲＯＣ曲線による精度評価（信用性）を示すグラフである。ここでは、糖尿病性腎臓病１０例と、それ以外の４０例（健常人１５例、腎障害のない糖尿病１０例、その他の腎疾患１５例）に分けた合計５０例での解析を行った。ＡＵＣは０．８３２となり、Ｐ＜０．０１で特異的なマーカーであった。加えて、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐよりも、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの方がやや高い精度を示した。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表４に示す。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表４に示す。
〔まとめ〕
図５により、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現の変化による糖尿病性腎臓病の作用機序についての考察について説明する。
ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、従来から、血管平滑筋細胞で、ヘテロクロマチンの形成や機能の維持に中心的な役割を果たすヒストンメチル化酵素であるＳｕｖ３９ｈ１を標的ｍＲＮＡとして抑制し、その結果ＭＣＰ－１、ＩＬ－６を上昇させることが知られている。さらに、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、滑膜繊維芽細胞でＩκＢ及びｐ６５上昇を介して、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１βを上昇させ、マクロファージを活性化させることが知られている。このため、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量が上昇することで、炎症関連の因子により、糖尿病性腎臓病の症状を生じさせると考えられる。
図５により、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現の変化による糖尿病性腎臓病の作用機序についての考察について説明する。
ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、従来から、血管平滑筋細胞で、ヘテロクロマチンの形成や機能の維持に中心的な役割を果たすヒストンメチル化酵素であるＳｕｖ３９ｈ１を標的ｍＲＮＡとして抑制し、その結果ＭＣＰ－１、ＩＬ－６を上昇させることが知られている。さらに、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、滑膜繊維芽細胞でＩκＢ及びｐ６５上昇を介して、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１βを上昇させ、マクロファージを活性化させることが知られている。このため、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量が上昇することで、炎症関連の因子により、糖尿病性腎臓病の症状を生じさせると考えられる。
一方、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、血管内皮細胞でＮＦ－κＢによる炎症パスウェイに関する転写因子であるｐ６５を抑制し、動脈硬化を抑制することが知られている。さらに、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、血管内皮細胞でｉｍｐｏｒｔｉｎ－α３を標的ｍＲＮＡとして抑制を介してＴＮＦ－α、ＮＦ－κＢを抑制することも知られている。これに加えて、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、血管平滑筋でＴＧＦ－β１を抑制し、動脈石灰化を抑制することも知られている。このため、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量が下降することで、これらの因子が活性化して炎症が生じやすくなり、糖尿病性腎臓病の症状を生じさせると考えられる。
これらの作用機序のパスウェイに関する調整剤を用いることで、さらなる糖尿病性腎臓病の診断及び治療効果が期待できる。また、遺伝子治療にも用いることが可能である。
これらの作用機序のパスウェイに関する調整剤を用いることで、さらなる糖尿病性腎臓病の診断及び治療効果が期待できる。また、遺伝子治療にも用いることが可能である。
〔追加試験結果〕
（糖尿病性腎臓病の作用機序）
図６に、他の予備実験を含めて推定された、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐによる糖尿病性腎臓病の発症、進展の推定機序について説明する。
ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、Ｓｕｖ３９ｈ１の他にもＩｋＢ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ－α、ＩＲＦ４等の発現を調整し、これを介して、少なくとも一部は、Ｐ５３、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの発現を調整することで、糖尿病性腎臓病の発症、進展に関わると考えられる。
一方、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、ＴＧＦβＲ１、ｉｍｐｏｒｔｉｎ α３、ＰＨＬＰＰ２、ＣＹＬＤ、ＴＩＭＰ３等の発現を調整し、これを介して、少なくとも一部は、ＴＮＦ－α、ＮＦ－ｋＢの発現を抑制することで、糖尿病性腎臓病の発症、進展に関わると考えられる。
（糖尿病性腎臓病の作用機序）
図６に、他の予備実験を含めて推定された、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐによる糖尿病性腎臓病の発症、進展の推定機序について説明する。
ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、Ｓｕｖ３９ｈ１の他にもＩｋＢ、ＳＴＡＴ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ－α、ＩＲＦ４等の発現を調整し、これを介して、少なくとも一部は、Ｐ５３、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの発現を調整することで、糖尿病性腎臓病の発症、進展に関わると考えられる。
一方、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、ＴＧＦβＲ１、ｉｍｐｏｒｔｉｎ α３、ＰＨＬＰＰ２、ＣＹＬＤ、ＴＩＭＰ３等の発現を調整し、これを介して、少なくとも一部は、ＴＮＦ－α、ＮＦ－ｋＢの発現を抑制することで、糖尿病性腎臓病の発症、進展に関わると考えられる。
（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現解析）
次に、図７Ａ及び図７Ｂにより、上述の実施例１における実験と同様の手法により、患者数を増加させて、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量の変化を調べた結果について説明する。
図７Ａは、リアルタイムＰＣＲによる血清中のｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの測定について、健常人（２０例）、糖尿病患者（１０例）、糖尿病性腎臓病患者（１５例）、及び糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（５０例）について、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現量の差をみたグラフである。グラフは、グラフ中の「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示す。ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、同様の対照患者に比べて、Ｐ＜０．０５で有意に発現量が増加した。
この解析結果について、下記の表５に、平均、標準偏差、２±ＳＥ（標準誤差）の解析結果を示す。
次に、図７Ａ及び図７Ｂにより、上述の実施例１における実験と同様の手法により、患者数を増加させて、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量の変化を調べた結果について説明する。
図７Ａは、リアルタイムＰＣＲによる血清中のｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの測定について、健常人（２０例）、糖尿病患者（１０例）、糖尿病性腎臓病患者（１５例）、及び糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（５０例）について、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現量の差をみたグラフである。グラフは、グラフ中の「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示す。ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、同様の対照患者に比べて、Ｐ＜０．０５で有意に発現量が増加した。
この解析結果について、下記の表５に、平均、標準偏差、２±ＳＥ（標準誤差）の解析結果を示す。
次に、この解析結果のうち、分散分析を行った結果を下記の表６に示す。
次に、この解析結果のうち、多重比較を行った結果を下記の表７に示す。
図７Ｂは、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐについてのＲＯＣ曲線（感度／（１－特異度））による精度評価（信用性）を示す。ここでは、糖尿病性腎臓病１５例と、それ以外の８０例（健常人２０例、腎障害のない糖尿病１０例、その他の腎疾患５０例）に分けた合計９５例での解析を行った。ＡＵＣは０．８５３となり、Ｐ＜０．０１であった。これにより、特異的なマーカーであることがより裏付けられた。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表８に示す。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表８に示す。
（ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現解析）
次に、図８Ａ、図８Ｂにより、上述の実施例１における実験と同様の手法により、患者数を増加させて、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量の変化を調べた結果について説明する。
図８Ａは、健常人（２０例）、糖尿病患者（１０例）、糖尿病性腎臓病患者（２０例）、及び糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（５０例）について、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現量の差をみたものである。ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量は、Ｐ＜０．０５で有意に低下していた。
この解析結果について、下記の表９に、平均、標準偏差、２±ＳＥ（標準誤差）の解析結果を示す。
次に、図８Ａ、図８Ｂにより、上述の実施例１における実験と同様の手法により、患者数を増加させて、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量の変化を調べた結果について説明する。
図８Ａは、健常人（２０例）、糖尿病患者（１０例）、糖尿病性腎臓病患者（２０例）、及び糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（５０例）について、健常人を１として正規化し、ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現量の差をみたものである。ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量は、Ｐ＜０．０５で有意に低下していた。
この解析結果について、下記の表９に、平均、標準偏差、２±ＳＥ（標準誤差）の解析結果を示す。
次に、この解析結果のうち、分散分析を行った結果を下記の表１０に示す。
次に、この解析結果のうち、多重比較を行った結果を下記の表１１に示す。
図８Ｂは、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐについてのＲＯＣ曲線による精度評価（信用性）を示す。ここでは、糖尿病性腎臓病２０例と、それ以外の８０例（健常人２０例、腎障害のない糖尿病１０例、その他の腎疾患５０例）にわけた合計１００例での解析を行った。ＡＵＣは０．７６６となり、Ｐ＜０．０１で特異的なマーカーであった。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表１２に示す。
この曲線の下の領域積についての検定結果を、下記の表１２に示す。
（ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの組み合わせ）
次に、図９により、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐを組み合わせて診断した結果について説明する。
図９（ａ）は、各個人でｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの２つのマイクロＲＮＡの比を算出し、診断能力について解析した結果を示すグラフである。
具体的には、健常人（２０例）、糖尿病患者（１０例）、糖尿病性腎臓病患者（１５例）、及び糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（５０例）について、
発現量の比 ＝ ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量／ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量
を算出し、健常人を１として正規化することで、相対的な変化量を算出した。結果として、この相対的な変化量は、糖尿病性腎臓病患者で、Ｐ＜０．０１で統計的に有意に上昇した。
次に、図９により、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐを組み合わせて診断した結果について説明する。
図９（ａ）は、各個人でｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの２つのマイクロＲＮＡの比を算出し、診断能力について解析した結果を示すグラフである。
具体的には、健常人（２０例）、糖尿病患者（１０例）、糖尿病性腎臓病患者（１５例）、及び糖尿病性腎臓病以外の腎疾患患者（５０例）について、
発現量の比 ＝ ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量／ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量
を算出し、健常人を１として正規化することで、相対的な変化量を算出した。結果として、この相対的な変化量は、糖尿病性腎臓病患者で、Ｐ＜０．０１で統計的に有意に上昇した。
図９（ｂ）は、上述の相対的な変化量についてのＲＯＣ曲線による精度評価（信用性）を示すグラフである。ＡＵＣは０．８５３、Ｐ＜０．０１で特異的なマーカーであった。また、Ｃｕｔ ｏｆｆ ｖａｌｕｅは１．８倍、感度は０．８７、特異度は０．７５となった。
このように、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐとｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐとの組み合わせ（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ／ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ）により、更に糖尿病性腎臓病の診断能の感度と特異度を上昇させることができた。
このように、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐとｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐとの組み合わせ（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ／ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ）により、更に糖尿病性腎臓病の診断能の感度と特異度を上昇させることができた。
〔糖尿病合併ＣＫＤの判別性能〕
次に、糖尿病合併ＣＫＤのうち、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）（１３例）と、糖尿病を合併しているその他の腎障害（１０例）とについて、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐで鑑別可能であるかを調べた。いずれも腎生検で確定診断している症例について調べた。
図１０に、この解析結果を示す。図１０（ａ）はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの結果、図１０（ｂ）はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの結果を示す。
結果として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量は、Ｐ＜０．０１で有意に低下していた。一方、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量については、５％有意にはならなかったものの、明らかに増加していた。
次に、糖尿病合併ＣＫＤのうち、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）（１３例）と、糖尿病を合併しているその他の腎障害（１０例）とについて、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐで鑑別可能であるかを調べた。いずれも腎生検で確定診断している症例について調べた。
図１０に、この解析結果を示す。図１０（ａ）はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの結果、図１０（ｂ）はｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの結果を示す。
結果として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量は、Ｐ＜０．０１で有意に低下していた。一方、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量については、５％有意にはならなかったものの、明らかに増加していた。
上述のように、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐは、いずれも、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）と糖尿病を合併しているその他の腎障害と判別可能であった。このように、臨床上で診断の難しい症状の判別が可能となり、有用性が高い。
なお、更に、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐとｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの組み合わせ（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ／ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ）の比（相対的な変化量）を求めることで、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）と、糖尿病を合併しているその他の腎障害とを、より顕著に鑑別（判別）可能であった。すなわち、さらに糖尿病性腎臓病の診断能の感度と特異度とが上昇した。
なお、更に、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐとｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの組み合わせ（ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ／ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ）の比（相対的な変化量）を求めることで、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）と、糖尿病を合併しているその他の腎障害とを、より顕著に鑑別（判別）可能であった。すなわち、さらに糖尿病性腎臓病の診断能の感度と特異度とが上昇した。
〔ヒト血清でのファミリーＲＮＡのバイオマーカー評価〕
ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐと相同性のあるファミリーＲＮＡについて、上述の実施例１と同様にｑＲＴ－ＰＣＲで発現量が変化するか評価した。このうち、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐのファミリーＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１２５ａ－５ｐ、及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－３ｐを用いた。
ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐと相同性のあるファミリーＲＮＡについて、上述の実施例１と同様にｑＲＴ－ＰＣＲで発現量が変化するか評価した。このうち、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐのファミリーＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１２５ａ－５ｐ、及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－３ｐを用いた。
プライマーは、以下のものを用いた：
ヒトｍｉＲＮＡ－１２５ａ－３ｐ：
５’－ＡＣＡＧＧＵＧＡＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＣ－３’ （配列番号９）
ヒトｍｉＲＮＡ－１２５ａ－５ｐ：
５’－ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＵＵＡＡＣＣＵＧＵＧＡ－３’（配列番号１０）
ヒトｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－１－３ｐ：
５’－ＡＣＧＧＧＵＵＡＧＧＣＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＵ－３’ （配列番号１１）
ヒトｍｉＲＮＡ－１２５ａ－３ｐ：
５’－ＡＣＡＧＧＵＧＡＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＣ－３’ （配列番号９）
ヒトｍｉＲＮＡ－１２５ａ－５ｐ：
５’－ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＵＵＡＡＣＣＵＧＵＧＡ－３’（配列番号１０）
ヒトｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－１－３ｐ：
５’－ＡＣＧＧＧＵＵＡＧＧＣＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＵ－３’ （配列番号１１）
ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐのファミリーＲＮＡとしては、ｍｉＲＮＡ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－５ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－３ｐ、及びｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－５ｐを用いた。
プライマーは、以下のものを用いた：
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ａ－３ｐ：
５’－ＡＣＣＡＵＣＧＡＣＣＧＵＵＧＡＵＵＧＵＡＣＣ－３’ （配列番号１２）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵ－３’ （配列番号１３）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－３ｐ：
５’－ＣＵＣＡＣＵＧＡＡＣＡＡＵＧＡＡＵＧＣＡＡ－３’ （配列番号１４）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－３ｐ：
５’－ＡＡＣＣＡＵＣＧＡＣＣＧＵＵＧＡＧＵＧＧＡＣ－３’ （配列番号１５）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵ－３’ （配列番号１６）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－３ｐ：
５’－ＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＡＵＧＡＡＵＧＵＣＡＣ－３’ （配列番号１７）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＵＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ－３’ （配列番号１８）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ａ－３ｐ：
５’－ＡＣＣＡＵＣＧＡＣＣＧＵＵＧＡＵＵＧＵＡＣＣ－３’ （配列番号１２）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵ－３’ （配列番号１３）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－３ｐ：
５’－ＣＵＣＡＣＵＧＡＡＣＡＡＵＧＡＡＵＧＣＡＡ－３’ （配列番号１４）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－３ｐ：
５’－ＡＡＣＣＡＵＣＧＡＣＣＧＵＵＧＡＧＵＧＧＡＣ－３’ （配列番号１５）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵ－３’ （配列番号１６）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－３ｐ：
５’－ＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧＡＵＧＡＡＵＧＵＣＡＣ－３’ （配列番号１７）
ヒトｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－５ｐ：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＵＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵ－３’ （配列番号１８）
これらのうち、患者血清で発現があったファミリーＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－３ｐ、及びｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－５ｐの３種類のみであった。
図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃに、これらのファミリーＲＮＡの相対発現量の変化を示す。具体的には、図１１ＡはｍｉＲＮＡ－１２５ａ－５ｐ、図１１ＢはｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－３ｐ、図１１ＣはｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－５ｐにおける健常人、糖尿病患者、糖尿病性腎臓病患者、他腎疾患患者についての発現量の差をそれぞれ調べた結果である。いずれも、灰色の点線は、健常人を１と正規化した際の、糖尿病性腎臓病の相対発現量（ｆｏｌｄ）を示す。
結果として、いずれも糖尿病性腎臓病で特異的に変化する傾向は、認められなかった。すなわち、上述のｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐのみが特異的に糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーとして効果的に利用可能であることが分かった。
図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃに、これらのファミリーＲＮＡの相対発現量の変化を示す。具体的には、図１１ＡはｍｉＲＮＡ－１２５ａ－５ｐ、図１１ＢはｍｉＲＮＡ－１８１ｃ－３ｐ、図１１ＣはｍｉＲＮＡ－１８１ｄ－５ｐにおける健常人、糖尿病患者、糖尿病性腎臓病患者、他腎疾患患者についての発現量の差をそれぞれ調べた結果である。いずれも、灰色の点線は、健常人を１と正規化した際の、糖尿病性腎臓病の相対発現量（ｆｏｌｄ）を示す。
結果として、いずれも糖尿病性腎臓病で特異的に変化する傾向は、認められなかった。すなわち、上述のｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐのみが特異的に糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーとして効果的に利用可能であることが分かった。
〔マウスでの治療効果〕
次に、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）として、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＰＥＩ－ＮＰｓ）を用いて、ｍｉＲＮＡミミックをマウス腎臓へのデリバリーし、実際の糖尿病性腎臓病への治療効果について調べた。
次に、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）として、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＰＥＩ－ＮＰｓ）を用いて、ｍｉＲＮＡミミックをマウス腎臓へのデリバリーし、実際の糖尿病性腎臓病への治療効果について調べた。
（方法）
（マウス）
本実施例においては、上述の実施例１と同じＩＩ型糖尿病モデルマウスｄｂ／ｄｂ（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ Ｉａｒ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ マウス（動物繁殖研究所より購入）を、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）のモデルマウスとして用いた。
（マウス）
本実施例においては、上述の実施例１と同じＩＩ型糖尿病モデルマウスｄｂ／ｄｂ（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ Ｉａｒ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ マウス（動物繁殖研究所より購入）を、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）のモデルマウスとして用いた。
（ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ－ｍｉｍｉｃ－ＰＥＩ－ＮＰの調製）
ＤＤＳとして、Ｌｉｎｅａｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（ＴＭ）、以下「ＰＥＩ－ＮＰ」という。）は、Ｐｏｌｙｐｌｕｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ， Ｉｌｌｋｉｒｃｈ－Ｇｒａｆｆｅｎｓｔａｄｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック（ジーンデザイン社製）を蒸留水に溶解し１００μＭとした。このｍｉＲＮＡミミック及びＰＥＩ－ＮＰを混合し、室温で１５分間インキュベートし、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰとして調整した（以下、図面では「ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ－ｍｉｍｉｃ」と記載する。）。同じ方法を用いて、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰ（以下、図面では「ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ－ｍｉｍｉｃ」と記載する。）、及びｍｉＲＮＡコントロール－ＰＥＩ－ＮＰ（以下、図面では「ｍｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ」と記載する。）を調製した。ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐミミック、ｍｉＲＮＡコントロールは、いずれもジーンデザイン社製である。
ＤＤＳとして、Ｌｉｎｅａｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（ＴＭ）、以下「ＰＥＩ－ＮＰ」という。）は、Ｐｏｌｙｐｌｕｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ， Ｉｌｌｋｉｒｃｈ－Ｇｒａｆｆｅｎｓｔａｄｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック（ジーンデザイン社製）を蒸留水に溶解し１００μＭとした。このｍｉＲＮＡミミック及びＰＥＩ－ＮＰを混合し、室温で１５分間インキュベートし、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰとして調整した（以下、図面では「ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ－ｍｉｍｉｃ」と記載する。）。同じ方法を用いて、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰ（以下、図面では「ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ－ｍｉｍｉｃ」と記載する。）、及びｍｉＲＮＡコントロール－ＰＥＩ－ＮＰ（以下、図面では「ｍｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌ」と記載する。）を調製した。ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐミミック、ｍｉＲＮＡコントロールは、いずれもジーンデザイン社製である。
これらのミミック及びコントロールの配列は以下の通りである：
マウスｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵＵ－３’（配列番号１９）
マウスｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐミミック：
５’－ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡ－３’ （配列番号２０）
ｍｉＲＮＡコントロール：
５’－ＧＧＵＵＣＧＵＡＣＧＵＡＣＡＣＵＧＵＵＣＡ－３’ （配列番号２１）
マウスｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック：
５’－ＡＡＣＡＵＵＣＡＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＧＧＵＵ－３’（配列番号１９）
マウスｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐミミック：
５’－ＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡ－３’ （配列番号２０）
ｍｉＲＮＡコントロール：
５’－ＧＧＵＵＣＧＵＡＣＧＵＡＣＡＣＵＧＵＵＣＡ－３’ （配列番号２１）
（投与プロトコル）
図１２によると、ミミックの添付プロトコルに従って、各ｄｂ／ｄｂマウスに、合計２００μＬのｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰ（ｍｉＲＮＡ：５０μｇ、Ｎ／Ｐ比＝６）を尾静脈から静脈注射して投与した。コントロールとして、ｄｂ／ｄｂマウスに水（Ｍｏｃｋ）だけ投与（以下、図面では「ｄｂ／ｄｂ」と記載する。）、正常マウスにｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰを投与したもの（以下、図面では「ｍ＋／ｍ＋」と記載する。）も用意した。期間、回数としては、１０週齢から週１回、合計１０回投与し、２０週齢で解剖して比較した。
図１２によると、ミミックの添付プロトコルに従って、各ｄｂ／ｄｂマウスに、合計２００μＬのｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰ（ｍｉＲＮＡ：５０μｇ、Ｎ／Ｐ比＝６）を尾静脈から静脈注射して投与した。コントロールとして、ｄｂ／ｄｂマウスに水（Ｍｏｃｋ）だけ投与（以下、図面では「ｄｂ／ｄｂ」と記載する。）、正常マウスにｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰを投与したもの（以下、図面では「ｍ＋／ｍ＋」と記載する。）も用意した。期間、回数としては、１０週齢から週１回、合計１０回投与し、２０週齢で解剖して比較した。
（蛋白尿の測定）
２４時間尿を蓄尿し尿中アルブミンを免疫比濁法で測定（μｇ／Ｌ）し、同時に尿中クレアチニンを酵素法で測定（ｍｇ／Ｌ）し、ＵＡＣＲ（尿アルブミン／クレアチニン比）（μｇ／ｍｇ Ｃｒ）を算出して、蛋白尿の評価とした。
２４時間尿を蓄尿し尿中アルブミンを免疫比濁法で測定（μｇ／Ｌ）し、同時に尿中クレアチニンを酵素法で測定（ｍｇ／Ｌ）し、ＵＡＣＲ（尿アルブミン／クレアチニン比）（μｇ／ｍｇ Ｃｒ）を算出して、蛋白尿の評価とした。
（メサンギウム拡張の評価）
マウスの腎臓を４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後パラフィンに包埋した。ＰＡＳ染色を使用して、ＡＭＤＣＣプロトコルに従ってメサンギウムインデックス（ＰＡＳ染色の面積／糸球体の総面積）を決定し、メサンギウム拡張を評価した。マウスから各々１０個の糸球体をランダムに選出し、その平均を計算した。個体数は各群３匹（ｎ＝３）ずつで、糸球体の総計は３０個である。
マウスの腎臓を４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後パラフィンに包埋した。ＰＡＳ染色を使用して、ＡＭＤＣＣプロトコルに従ってメサンギウムインデックス（ＰＡＳ染色の面積／糸球体の総面積）を決定し、メサンギウム拡張を評価した。マウスから各々１０個の糸球体をランダムに選出し、その平均を計算した。個体数は各群３匹（ｎ＝３）ずつで、糸球体の総計は３０個である。
（結果）
（ミミックの腎臓での発現量の確認）
図１３により説明すると、まず、実施例１と同様のｑＲＴ－ＰＣＲで、Ｍｏｃｋ（水のみ投与）、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミックの投与、ｍｉＲＮＡコントロール－ＰＥＩ－ＮＰの投与について発現量の変化を調べた。結果として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰの投与により、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量増加（ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が１週間程度持続できることを確認した。
（ミミックの腎臓での発現量の確認）
図１３により説明すると、まず、実施例１と同様のｑＲＴ－ＰＣＲで、Ｍｏｃｋ（水のみ投与）、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミックの投与、ｍｉＲＮＡコントロール－ＰＥＩ－ＮＰの投与について発現量の変化を調べた。結果として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰの投与により、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量増加（ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が１週間程度持続できることを確認した。
（糖尿病性腎臓病の治療効果評価）
図１４に、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰを投与したマウスの蛋白尿の状態を測定した結果を示す。このグラフの横軸は、投与週（Ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、縦軸はＵＡＣＲ（μｇ／ｍｇ Ｃｒ）の値を示す。
結果として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰの投与により、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、蛋白尿の増加が抑制された。
図１４に、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰを投与したマウスの蛋白尿の状態を測定した結果を示す。このグラフの横軸は、投与週（Ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、縦軸はＵＡＣＲ（μｇ／ｍｇ Ｃｒ）の値を示す。
結果として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰの投与により、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、蛋白尿の増加が抑制された。
（メサンギウム拡張の評価結果）
図１５に、各マウスにおいて、腎臓のメサンギウム細胞の機能障害を示すメサンギウム拡張の評価を行った結果を示す。このグラフは、１０週（Ｗｅｅｋ １０）、２０週（Ｗｅｅｋ ２０）における、各マウスのメサンギウムインデックス（ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （％ ｏｆ ａｒｅａ））を示す。
結果として、２０週では、ｄｂ／ｄｂマウスにｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰを投与したものは、ｄｂ／ｄｂマウスにｍｉＲＮＡコントロール－ＰＥＩ－ＮＰを投与したものに比べて、ｐ＜０．０５でメサンギウムインデックスが減少した。すなわち、メサンギウム細胞の増加を抑制した。
図１６に、この２０週の状態で固定した腎臓の状態を示す。ｄｂ／ｄｂマウスと、ｄｂ／ｄｂマウスにｍｉＲＮＡコントロール－ＰＥＩ－ＮＰを投与したものは、メサンギウム細胞の増加が確認できる。これに対して、ｄｂ／ｄｂマウスにｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰを投与したものは、正常マウスに比べて、あまりメサンギウム細胞が増加していなかった。
図１５に、各マウスにおいて、腎臓のメサンギウム細胞の機能障害を示すメサンギウム拡張の評価を行った結果を示す。このグラフは、１０週（Ｗｅｅｋ １０）、２０週（Ｗｅｅｋ ２０）における、各マウスのメサンギウムインデックス（ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （％ ｏｆ ａｒｅａ））を示す。
結果として、２０週では、ｄｂ／ｄｂマウスにｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰを投与したものは、ｄｂ／ｄｂマウスにｍｉＲＮＡコントロール－ＰＥＩ－ＮＰを投与したものに比べて、ｐ＜０．０５でメサンギウムインデックスが減少した。すなわち、メサンギウム細胞の増加を抑制した。
図１６に、この２０週の状態で固定した腎臓の状態を示す。ｄｂ／ｄｂマウスと、ｄｂ／ｄｂマウスにｍｉＲＮＡコントロール－ＰＥＩ－ＮＰを投与したものは、メサンギウム細胞の増加が確認できる。これに対して、ｄｂ／ｄｂマウスにｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰを投与したものは、正常マウスに比べて、あまりメサンギウム細胞が増加していなかった。
（血液生化学検査及び組織病理）
上述の各マウス（ｎ＝３）の血液について、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ－ＧＴＰ、ＬＤＨの生化学検査を行った。
この結果を、下記の表１３に示す。
上述の各マウス（ｎ＝３）の血液について、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ－ＧＴＰ、ＬＤＨの生化学検査を行った。
この結果を、下記の表１３に示す。
結果として、血清学的に肝機能に異常は認められなかった。
また、投与後の組織病理についても目視で確認した。結果として、肉眼的所見で肝、脾、肺、心には、異常は認められなかった。
また、投与後の組織病理についても目視で確認した。結果として、肉眼的所見で肝、脾、肺、心には、異常は認められなかった。
（まとめ）
結果として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現を増加させることで、糖尿病性腎臓病に特異的な治療薬として用いることが可能であることが分かった。すなわち、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰのような核酸医薬、これを模した低分子化合物等を新規の糖尿病性腎臓病用医薬として提供可能であることが裏付けられた。
結果として、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現を増加させることで、糖尿病性腎臓病に特異的な治療薬として用いることが可能であることが分かった。すなわち、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミック－ＰＥＩ－ＮＰのような核酸医薬、これを模した低分子化合物等を新規の糖尿病性腎臓病用医薬として提供可能であることが裏付けられた。
〔マウスでの追加評価項目〕
（方法）
次に、上述の実施例１のＡＫＩＴＡ／ＳＬｃマウス（ＡＫＩＴＡマウス）、及び実施例１並びに実施例２のｄｂ／ｄｂマウスにおいて、高カロリー食を投与した群と、水のみ投与のコントロール（Ｍｏｃｋ）とについて、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの腎臓での発現量が変化するかどうか、２０週の腎臓を取得し、上述と同様のｑＲＴ－ＰＣＲで調べた。
さらに、ｍｉＲＮＡの発現量を経時的に観察して解析した。具体的には、ＡＫＩＴＡマウス及びｄｂ／ｄｂマウスにおいて、５週（５ｗ）、１２週（１２ｗ）、２８週（２８ｗ）の血清及び腎臓におけるｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量の変化をｑＲＴ－ＰＣＲで調べた。
（方法）
次に、上述の実施例１のＡＫＩＴＡ／ＳＬｃマウス（ＡＫＩＴＡマウス）、及び実施例１並びに実施例２のｄｂ／ｄｂマウスにおいて、高カロリー食を投与した群と、水のみ投与のコントロール（Ｍｏｃｋ）とについて、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの腎臓での発現量が変化するかどうか、２０週の腎臓を取得し、上述と同様のｑＲＴ－ＰＣＲで調べた。
さらに、ｍｉＲＮＡの発現量を経時的に観察して解析した。具体的には、ＡＫＩＴＡマウス及びｄｂ／ｄｂマウスにおいて、５週（５ｗ）、１２週（１２ｗ）、２８週（２８ｗ）の血清及び腎臓におけるｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量の変化をｑＲＴ－ＰＣＲで調べた。
これに加え、老化腎障害（腎硬化症）モデルマウスであるＳＡＭＰ１マウス（日本エスエルシー株式会社より購入）、腎繊維化モデルマウスであるＵＵＯマウス、急性腎臓損傷（ＡＫＩ）モデルマウスである虚血再灌流（ＩＲＩ）マウス）でも同様に、腎臓で発現量が変化するかどうか調べた。
ＵＵＯマウスは、正常マウスの尿管を片側性に結紮する（ＵＵＯ）ことで作成した。
ＩＲＩマウスは、Ｃ５７／Ｂ６ ｍｉｃｅ（９週齢、雄）の右腎臓を摘出後、左腎動脈を４５分間クランプして腎血流を遮断し、急性腎不全を誘導し、２４時間後に解剖した。
ＵＵＯマウスは、正常マウスの尿管を片側性に結紮する（ＵＵＯ）ことで作成した。
ＩＲＩマウスは、Ｃ５７／Ｂ６ ｍｉｃｅ（９週齢、雄）の右腎臓を摘出後、左腎動脈を４５分間クランプして腎血流を遮断し、急性腎不全を誘導し、２４時間後に解剖した。
（結果）
図１７に、ＡＫＩＴＡマウス及びｄｂ／ｄｂマウスにおける腎臓での発現量の変化を示す。図１７（ａ）は、ＡＫＩＴＡマウスでのｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量、図１７（ｂ）はＡＫＩＴＡマウスでのｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量、図１７（ｃ）はｄｂ／ｄｂマウスでのｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量、図１７（ｄ）はｄｂ／ｄｂマウスでのｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量を、それぞれ示す。各グラフは、コントロール（Ｍｏｃｋ）群の発現量を１で正規化した、相対発現量を示す。
いずれも、高カロリー食を投与した群では、コントロール群に比べて、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの腎臓での発現量は低下していた。つまり、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量については、血清とは異なり、腎臓では低下していた。
図１７に、ＡＫＩＴＡマウス及びｄｂ／ｄｂマウスにおける腎臓での発現量の変化を示す。図１７（ａ）は、ＡＫＩＴＡマウスでのｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量、図１７（ｂ）はＡＫＩＴＡマウスでのｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量、図１７（ｃ）はｄｂ／ｄｂマウスでのｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現量、図１７（ｄ）はｄｂ／ｄｂマウスでのｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量を、それぞれ示す。各グラフは、コントロール（Ｍｏｃｋ）群の発現量を１で正規化した、相対発現量を示す。
いずれも、高カロリー食を投与した群では、コントロール群に比べて、ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの腎臓での発現量は低下していた。つまり、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量については、血清とは異なり、腎臓では低下していた。
図１８に、糖尿病性腎臓病以外のモデルマウスでの発現量の変化を示す。図１８（ａ）（ｂ）にＳＡＭＰ１マウス、図１８（ｃ）（ｄ）にＵＵＯマウス、図１８（ｅ）（ｆ）にＩＲＩマウスでのｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの発現量を調べた結果を、それぞれ示す。各グラフは、コントロール（ＳＡＭＲ、ｓｈａｍ、Ｍｏｃｋ）を１として正規化し、相対発現量を調べたものである。
結果として、糖尿病性腎臓病以外のモデルマウスでは、いずれの発現量も変化していなかった。
これらの結果から、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、糖尿病性腎臓病に特異的であると考えられる。
結果として、糖尿病性腎臓病以外のモデルマウスでは、いずれの発現量も変化していなかった。
これらの結果から、ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及びｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐは、糖尿病性腎臓病に特異的であると考えられる。
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
本発明によれば、血液中に存在するｍｉＲＮＡを糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーとして用いることで、糖尿病性腎臓病の早期診断と治療用の医薬の提供が期待でき、産業上利用可能である。
Claims (7)
- ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐである
糖尿病性腎臓病特異的バイオマーカーを用いる
ことを特徴とする糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法。 - 前記ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐの血清中での発現が上昇している場合及び／又は前記ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐの発現が低下している場合、糖尿病性腎臓病と診断することを補助する
ことを特徴とする請求項１に記載の糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法。 - 診断は、糖尿病性腎臓病（ＤＫＤ）と、糖尿病を合併しているその他の腎障害との判別を含む
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の糖尿病性腎臓病の診断することを補助する方法。 - ｍｉＲＮＡ－１２５ｂ－５ｐ及び／又はｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐを測定する試薬を含む
ことを特徴とする糖尿病性腎臓病の検査用キット。 - ヒト以外の動物の治療方法であって、
ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミックを含む組成物を投与し、
糖尿病性腎臓病の腎臓を治療する
ことを特徴とする動物治療方法。 - ｍｉＲＮＡ－１８１ｂ－５ｐミミックを含む組成物である
ことを特徴とする糖尿病性腎臓病用医薬。 - 前記組成物は、
ＩＩ型糖尿病による糖尿病性腎臓病用の医薬である
ことを特徴とする請求項６に記載の糖尿病性腎臓病用医薬。
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Citations (1)
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| 渡邊乃梨子 ほか，糖尿病性腎症，京府医大誌，2017年，Vol. 126，pp. 685-695 |
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|---|---|
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