WO2017179085A1 - マイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キット - Google Patents

マイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キット Download PDF

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    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the labeling reaction kit of the present invention is a labeling reaction kit used for a labeling reaction in the probe position determination method in the microarray, and includes the marker polynucleotide.
  • a nucleic acid amplification method can be suitably used.
  • the nucleic acid amplification method include a PCR method, a LAMP method, an SDA method, and an LCA method.
  • the “labeling reaction” includes a reaction that does not involve nucleic acid amplification, and includes, for example, a reaction in which labeled RNA is synthesized by a reverse transcriptase reaction using a sample RNA and a fluorescent dye.
  • the PCR method is mainly used as the “labeling reaction” will be described as an example.
  • the microorganisms are sampled from food and the environment, and a plurality of microorganisms are enriched and cultured at the same time. It is preferable to extract DNA from the same.
  • the present invention attempts to eliminate the occurrence of non-specific amplification by making a special contrivance not to cause non-specific amplification, as will be described later, while trying this. It is possible.
  • the marker polynucleotide is chemically modified so that it does not serve as a PCR synthesis starting point so that it does not function as a primer even when the marker polynucleotide is hybridized to the target polynucleotide. That is, when the marker polynucleotide becomes the starting point of PCR synthesis instead of the primer, a non-specific amplification product is generated. Therefore, it is preferable to process the marker polynucleotide so that it does not function as a primer.
  • a PCR reaction solution was prepared with the following composition.
  • Primer and marker polynucleotides were outsourced to Sigma Aldrich Japan GK, and other reagents were manufactured by Takara Bio Inc.
  • ⁇ Buffer (10 ⁇ Ex Taq buffer) 2.0 ⁇ l
  • Nucleic acid synthesis substrate dNTP Mixture, 2.5mM each
  • Template 1.0 ⁇ l
  • Primer mix (8 types of primer pairs in Fig. 1)
  • 1.0 ⁇ l Nucleic acid synthase (TaKaRa Ex Taq Hot Start Version)
  • Marker polynucleotide (3 'end unmodified in Fig. 3) (160nM final conc.)
  • Sterile water (remaining amount) Total 20 ⁇ l)
  • a PCR reaction solution was prepared with the following composition.
  • Primer and marker polynucleotides were outsourced to Sigma Aldrich Japan GK, and other reagents were manufactured by Takara Bio Inc.
  • the marker polynucleotide is Cy5 modified at the 5 ′ end and phosphorylated at the 3 ′ end.
  • ⁇ Buffer (10 ⁇ Ex Taq buffer) 2.0 ⁇ l
  • Nucleic acid synthesis substrate dNTP Mixture, 2.5mM each
  • Template 1.0 ⁇ l
  • Primer mix 8 types of primer pairs in Fig.
  • a primer and a marker polynucleotide for detecting S. aureus were added to the PCR reaction solution, amplification products by S. aureus were detected, and non-specific amplification products were also detected.
  • Marker polynucleotides typically do not anneal to the target polynucleotide, but in rare cases this may cause the marker polynucleotide to anneal to the target polynucleotide, resulting in a non-specific amplification product.
  • a stock solution (100 ⁇ M) of a marker polynucleotide (3 ′ end unmodified in FIG. 3) was diluted 1000-fold by adding it to 999 ⁇ L of sterile water to prepare a 100 nM solution.
  • 4 ⁇ L of a 100 nM solution of this marker polynucleotide was mixed with 96 ⁇ L of a buffer solution (3 ⁇ SSC / 0.3% SDS citrate-saline-sodium dodecyl sulfate) used for hybridization to prepare a 100 ⁇ L mixture.
  • Example 8 Marker polynucleotide (3 ′ terminal unmodified) is added to the PCR reaction solution.
  • a culture solution obtained by adding a medium for enrichment to a commercial scallion in which Staphylococcus aureus was detected and culturing overnight at 37 ° C. was used as a specimen.
  • 1 mL of the culture solution was collected, and a DNA extract was obtained in the same manner as in Experiment 1. This DNA extract was used as a template for PCR.
  • the present invention is not limited to the above embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • the base sequences of the target polynucleotide, probe, marker polynucleotide, reference position probe, and primer are not essential and arbitrary. Can be made.
  • experiments are performed on microorganisms, but the present invention can be applied without limiting the types of target organisms.
  • the present invention can be suitably used for detecting various targets using a microarray in food inspection, epidemiological environmental inspection, environmental inspection, clinical test, livestock hygiene, and the like.

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Abstract

マイクロアレイにおけるプローブの位置決定のための作業工程数と試薬のロスを削減することを可能とする。ターゲットポリヌクレオチドに標識する反応を経た後に、マイクロアレイによりプローブとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を含むマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法であって、プローブが固定化された複数の検出用スポットを有すると共に、基準位置プローブが固定化された基準位置スポットを有するマイクロアレイに、標識されたターゲットポリヌクレオチドと、基準位置プローブにハイブリダイズする標識されたマーカーポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、標識する反応の開始前に、該反応に用いられる反応液にマーカーポリヌクレオチドを添加する。

Description

マイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キット
　本発明は、生物の種類を遺伝子配列にもとづき特定する技術に関し、特にマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キットに関する。
　近年、食品検査や環境検査等において、食品や環境に存在する微生物などの生物の種類を遺伝子配列にもとづき特定するために、検出対象とする生物の遺伝子とハイブリダイズ（相補的に結合）するプローブが固定化されたスポットを有するマイクロアレイが広く用いられている。この場合において、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により標的とする遺伝子におけるＤＮＡ断片を増幅しつつ標識し、その増幅産物をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせ、増幅産物の標識を検出することで、生物の種類を特定することが行われている。
　通常、マイクロアレイは、様々な生物に関するプローブが固定化された検出用スポットを多数有しているため、標識を検出するにあたっては、プローブが固定化された検出用スポットの位置を正確に特定する必要がある。
　プローブが固定化された検出用スポットの位置を特定する方法として、例えば以下の特許文献１に記載の方法を挙げることができる。この方法では、マイクロアレイ上にプローブの位置を特定するための基準位置スポットを設け、基準位置スポットに蛍光物質がスポッティングされている。そして、標識の検出に際して、基準位置スポットにおける蛍光を検出して基準位置スポットの位置を特定することにより、基準位置スポットの位置からプローブが固定化された検出用スポットの位置を特定可能にしている。
　また、プローブが固定化された検出用スポットの位置を特定する方法として、例えば以下の特許文献２に記載の方法を挙げることもできる。この方法では、マイクロアレイ上にプローブの位置を特定するための基準位置スポットを設け、基準位置スポットに標識されていない基準位置プローブがスポッティングされている。また、基準位置プローブにハイブリダイズする標識されたマーカーポリヌクレオチドとハイブリダイズに用いる緩衝液とを混合して混合液を作成する。そして、ＰＣＲ増幅後、増幅産物を混合液に加えてマイクロアレイに滴下し、増幅産物の検出に際して、マーカーポリヌクレオチドの標識を検出して基準位置スポットの位置を特定することにより、基準位置スポットの位置からプローブが固定化された検出用スポットの位置を特定可能にしている。
　この方法によれば、プローブが固定化された検出用スポットの位置を特定できることに加え、ハイブリダイズ工程が正常に行えたか否かの確認も同時に行えるようになっている。
特許第４２６１６６１号公報 国際公開第２０１０／１４７１６７号公報
　しかしながら、このような基準位置スポットに標識されていない基準位置プローブをスポッティングする方式には、試験の度に、マーカーポリヌクレオチドを調製して、ハイブリダイズに用いる緩衝液と混合する必要があり、操作が煩雑であるという問題があった。
　また、ハイブリダイゼーション時のマーカーポリヌクレオチドの至適濃度は数～数十ｎＭと非常に低く、この濃度に調節する必要があるため、マーカーポリヌクレオチドは、千分の１などに希釈した後に、ハイブリダイズに用いる緩衝液と混合する必要がある。
　具体的には、例えばマーカーポリヌクレオチドの原液（１００μＭ）１μＬを９９９μＬの滅菌水に加えて１０００倍希釈して１００ｎＭ溶液を調製する。そして、このマーカーポリヌクレオチドの１００ｎＭ溶液４μＬをハイブリダイズに用いる緩衝液９６μＬと混合して、１００μＬの混合液を調製して使用する。
　ところが、このように低濃度に希釈されたマーカーポリヌクレオチドは、チューブへの吸着などが起こり易いために適切に保存することができない。このため、余ったマーカーポリヌクレオチドの希釈液や、緩衝液との混合液は、従来は廃棄せざるをえなかった。
　具体的には、前述の例では、使用されずに残ったマーカーポリヌクレオチドの１００ｎＭ溶液９９６μＬや余った混合液は廃棄することになり、検査コストが高くなってしまうという問題もあった。
　本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、プローブが固定化された検出用スポットの位置を特定するために、基準位置スポットに標識されていない基準位置プローブをスポッティングする方式において、作業工程数と試薬のロスを削減することが可能なマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キットの提供を目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法は、ターゲットポリヌクレオチドに標識する反応を経た後に、マイクロアレイによりプローブとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を含むマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法であって、前記プローブが固定化された複数の検出用スポットを有すると共に、基準位置プローブが固定化された基準位置スポットを有するマイクロアレイに、標識された前記ターゲットポリヌクレオチドと、前記基準位置プローブにハイブリダイズする標識されたマーカーポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記標識する反応の開始前に、該反応に用いられる反応液に前記マーカーポリヌクレオチドを添加する方法としてある。
　また、本発明の標識反応用キットは、前記マイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法における標識する反応に用いられる標識反応用キットであって、前記マーカーポリヌクレオチドを含有する構成としてある。
　本発明によれば、マイクロアレイにおけるプローブの位置決定のための作業工程数と試薬のロスを削減することが可能なマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キットを提供することが可能となる。
本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法の実施例で用いられたプライマーの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法による非特異的増幅の有無の確認試験の結果（１）を示す図である。 本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法の実施例で用いられたマーカーポリヌクレオチドの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法による非特異的増幅の有無の確認試験の結果（２）を示す図である。 本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法による非特異的増幅の有無の確認試験の結果（３）を示す図である。 本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法の実施例で用いられたプローブの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法による標識の検出試験の結果（蛍光強度値）を示す図である。 本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法による標識の検出試験の結果（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。 本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法による標識の検出試験の結果（マイクロアレイ画像）を示す図である。
　以下、本発明の実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識検出用キットについて、詳細に説明する。
　本実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法は、ターゲットポリヌクレオチドに標識する反応を経た後に、マイクロアレイによりプローブとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を含むマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法であって、プローブが固定化された複数の検出用スポットを有すると共に、基準位置プローブが固定化された基準位置スポットを有するマイクロアレイに、標識されたターゲットポリヌクレオチドと、基準位置プローブにハイブリダイズする標識されたマーカーポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、標識する反応の開始前に、該反応に用いられる反応液にマーカーポリヌクレオチドを添加することを特徴とする。
　本実施形態における「標識する反応」としては、例えば核酸増幅法を好適に用いることができる。この核酸増幅法としては、例えばＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＡ法等を挙げることができる。また、「標識する反応」には、核酸増幅を伴わない反応も含まれ、例えばサンプルＲＮＡと蛍光色素を用いて、逆転写酵素反応により標識されたｃＤＮＡを合成する反応などを挙げることができる。
　以下においては、「標識する反応」として、主としてＰＣＲ法を用いた場合を例に説明する。
　まず、本実施形態のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法が用いられる場面の概要について説明し、従来技術と比較しつつ、本発明の特徴について説明する。
　本実施形態のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法は、マイクロアレイにより生物の種類などを遺伝子配列にもとづき特定する標的遺伝子の検出方法において好適に用いることができる。
　すなわち、この標的遺伝子の検出方法では、検出対象生物の細胞からＤＮＡを抽出し、このＤＮＡにおいて標的とする増幅対象領域を増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲを実施し、標識された増幅産物（ターゲットポリヌクレオチド）を生成する（標識工程）。
　なお、食中毒菌やカビなどの微生物の検出を行う場合には、標識工程に先立って、食品や環境中から微生物のサンプリングを行い、複数の微生物を同時に増菌培養した後、得られた培養液からＤＮＡを同時に抽出することが好ましい。
　次に、増幅産物とハイブリダイズするように設計されたプローブが固定化された検出用スポットを有するマイクロアレイに、増幅産物を接触させることによって、増幅産物をプローブにハイブリダイズさせる（ハイブリダイズ工程）。
　そして、増幅産物における標識を検出することによって、検出対象生物の存在を確認する（検出工程）。
　このような標的遺伝子の検出方法において、プローブが固定化されたスポットの位置を正確に特定するために、マイクロアレイにはプローブの位置を特定するための基準位置スポットが設けられており、この基準位置スポットに標識のされていない基準位置プローブが固定化されている。
　そして、基準位置プローブにハイブリダイズする標識されたマーカーポリヌクレオチド（基準位置スポット検出用核酸）を用いて、基準位置スポットを特定し、この基準位置スポットから検出用スポットの位置を特定することにより、標識が検出された検出用スポットの位置を正確に特定できるようになっている。
　ここで、従来は、ハイブリダイズに用いる緩衝液にマーカーポリヌクレオチドを混合して混合液を作成し、この混合液に増幅産物を加えてマイクロアレイに滴下していた。
　このため、試験を行う度に、緩衝液とマーカーポリヌクレオチドの混合液を調製する必要があり、操作が煩雑になるという問題があった。また、マーカーポリヌクレオチドは、混合前に例えば千分の１程度に希釈してから混合する必要があるが、核酸濃度の低い混合液中ではマーカーポリヌクレオチドは不安定になるために保存ができず、余った混合液や希釈液は廃棄することになり、検査コストが高くなるという問題もあった。
　なお、低濃度に希釈されたポリヌクレオチドを保存する方法として、キャリアＤＮＡを添加する方法、吸着抑制液で希釈する方法、低吸着チューブを使用する方法等を挙げることができる。しかしながら、いずれの方法を用いる場合も、検査コストが高くなるという問題があった。
　そこで、本実施形態のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法では、ＰＣＲの開始前に、ＰＣＲに用いる反応液にマーカーポリヌクレオチドを添加するようにしている。
　これにより、試験を行う度に、ハイブリダイズに用いる緩衝液とマーカーポリヌクレオチドの混合液を調製する必要がなく、またマーカーポリヌクレオチドの入れ忘れを防止することが可能となっている。さらに、マーカーポリヌクレオチドを反応液に添加するに際して、実質的に希釈を行う必要がなく、試薬のロスの発生を防止することが可能となっている。
　また、反応液には核酸合成基質やプライマーなどの核酸が含まれると共に、マーカーポリヌクレオチドが希釈されずに含まれるため、この反応液を冷凍することにより、マーカーポリヌクレオチドを安定して保存することが可能である。
　さらに、反応液とは別個に、マーカーポリヌクレオチドをＰＣＲに用いられる複数のプライマー対からなるプライマーミックスに添加して冷凍し、ＰＣＲ反応液の成分として用いるためのＰＣＲ増幅用試薬として保存可能にすることも好ましい。このようなＰＣＲ増幅用試薬は、安定的に長期間保存することが可能である。
　一方、ターゲットポリヌクレオチドの増幅に関係しないポリヌクレオチドをＰＣＲ反応液に添加することは、非特異的な増幅が生じる原因になり得るため、従来は決して行われることがない操作であった。しかしながら、本発明では、これを試みつつ、後述するように、非特異的な増幅の原因にならないようにするための特別な工夫をすることによって、非特異的な増幅の発生を排除することを可能にしている。
　次に、本実施形態のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法における各工程について、詳細に説明する。本実施形態のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法は、前述の通り、標識工程、ハイブリダイズ工程、及び検出工程を含むものとすることができる。
　標識工程では、検出対象生物の細胞のＤＮＡにおける標的とする増幅対象領域を増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲが行われ、標識されたターゲットポリヌクレオチドが生成される。
　本実施形態でＰＣＲに用いる反応液には、プライマー、検出対象生物の細胞から抽出されたＤＮＡ（又はＲＮＡ）、マーカーポリヌクレオチド、核酸合成酵素、核酸合成基質、緩衝液、及び残りの成分として水を含むものを好適に用いることができる。
　本実施形態において、反応液に含まれるプライマーは、標的とする増幅対象領域を増幅するために用いられる一又は二種類以上のプライマー対からなる。
　本実施形態において、標識の方法は特に限定されないが、蛍光標識を好適に用いることができる。
　ＰＣＲにおいて蛍光標識を行う場合、蛍光標識されたプライマーを用いて、末端のみが標識されたターゲットポリヌクレオチドを生成することができる。また、蛍光標識された核酸合成基質を用いて、内部に標識が含まれたターゲットポリヌクレオチドを生成することもできる。いずれの場合も蛍光標識成分として、Ｃｙ５やＣｙ３などを好適に用いることが可能である。
　さらに、標識として、ジゴキシゲニン、ビオチン、放射性同位体などの蛍光以外のその他の方式のものを用いることも可能である。
　本実施形態において、ターゲットポリヌクレオチドは、標識を付加する対象であるＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を意味する。また、この核酸は、核酸アナログであっても良く、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）／Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　（ＬＮＡ，登録商標）などを挙げることができる。
　ＰＣＲによってターゲットポリヌクレオチドを標識する場合、検出対象生物の細胞から抽出されたＤＮＡ（テンプレート）における遺伝子から選択された標的の領域が増幅され、標識された増幅産物を得ることができる。
　本実施形態において、マーカーポリヌクレオチドは、基準位置プローブにハイブリダイズする核酸であり、前述した核酸アナログであっても良い。
　マーカーポリヌクレオチドには、標識されたものが用いられ、好ましくは蛍光標識されたものが用いられる。蛍光標識としては、Ｃｙ５やＣｙ３などを好適に用いることができ、また前述したその他の標識を用いても良い。
　マーカーポリヌクレオチドは、ターゲットポリヌクレオチドにアニーリングしない塩基配列からなるものであることが好ましく、ＰＣＲにおいて誤ってプライマーとして機能することがないようにすることが望ましい。ただし、本発明によれば、後述するように、マーカーポリヌクレオチドがターゲットポリヌクレオチドにアニーリングした場合でも、プライマーとして機能しないようにすることが可能となっている。
　また、ハイブリダイズ工程において、マーカーポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイズして偽陽性反応が生じることがないように、マーカーポリヌクレオチドは、プローブとハイブリダイズしない塩基配列からなっている。なお、ターゲットポリヌクレオチドは、基準位置プローブとハイブリダイズしない塩基配列からなっている。
　さらに、マーカーポリヌクレオチドがターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズした場合でも、プライマーとして機能しないように、マーカーポリヌクレオチドは、ＰＣＲの合成起点とならないように化学修飾したものとすることが好ましい。すなわち、マーカーポリヌクレオチドがプライマーの代わりにＰＣＲの合成起点になると、非特異的な増幅産物が生じるため、プライマーとして機能しないようにマーカーポリヌクレオチドを加工しておくことが好ましい。
　ここで、マーカーポリヌクレオチドを、ターゲットポリヌクレオチドに含ハイブリダイズしない塩基配列からなるものとすれば、基本的には、マーカーポリヌクレオチドをＰＣＲの合成起点にならないものにすることができる。しかしながら、例えばマーカーポリヌクレオチドが夾雑菌由来のＤＮＡにアニーリングし、プライマーとして機能する可能性をより確実に排除するために、マーカーポリヌクレオチドをＰＣＲの合成起点とならないように修飾しておくことが好ましい。このようにマーカーポリヌクレオチドをＰＣＲの合成起点とならないように修飾しておけば、マーカーポリヌクレオチドがターゲットポリヌクレオチドにアニーリングしたとしても非特異的増幅の生成を排除することが可能である。
　マーカーポリヌクレオチドをＰＣＲの合成起点とならないように修飾する方法としては、特に限定されないが、例えばマーカーポリヌクレオチドの３’末端をリン酸化修飾する方法を好適に用いることができる。その他、ジデオキシヌクレオチドの使用、３’末端のアミノ化等によって、修飾することも可能である。
　このようなマーカーポリヌクレオチドは、標識反応において用いる試薬（標識反応用キット）の形態で使用することが好ましい。特に、マーカーポリヌクレオチドとプライマーとを含むＰＣＲ増幅用試薬の形態で、反応液に添加して用いるようにすれば、安定的に長期間保存することが可能であり、またマーカーポリヌクレオチドの添加し忘れを効果的に防止することが可能となる。
　なお、ＰＣＲにより増幅産物が得られているか否かは、例えば電気泳動を行うことによって確認することができる。この電気泳動としては、アガロースゲル電気泳動やアクリルアミド電気泳動、マイクロチップ電気泳動等を挙げることができる。
　次に、ハイブリダイズ工程では、標識する反応を経た反応液に緩衝液を混合し、得られた混合液をマイクロアレイに接触させる。
　本実施形態において、マイクロアレイは、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプローブが固定化された担体を意味する。このようなマイクロアレイは、ＤＮＡチップとも呼ばれ、その表面に核酸断片からなるプローブをスポッティングして固定化された検出用スポットが複数形成されている。
　本実施形態において用いられるマイクロアレイには、プローブとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するための検出用スポットが形成されている。すなわち、この検出用スポットには、ターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズするプローブが固定化されている。各スポットには、同一のプローブを固定化しても、異なる遺伝子や生物を特定するための異なるプローブを固定化しても良い。
　また、このマイクロアレイには、プローブの位置を特定するために用いられる基準位置スポットが、一箇所以上、好ましくは二箇所以上設けられている。この基準位置スポットには、プローブの位置を特定するために用いられる基準位置プローブが固定化されている。
　基準位置プローブは、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸からなり、前述した核酸アナログであっても良い。
　さらに、検出工程では、増幅産物における標識を検出することによって、検出対象生物の存在の確認が行われる。また、このとき、基準位置スポットにおけるマーカーポリヌクレオチドの標識を検出し、基準位置スポットの位置にもとづきプローブが固定化された検出用スポットの位置を決定する。
　標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物の蛍光強度値を測定することにより行うことができる。
　また、測定結果として、蛍光強度値の他、Ｓ／Ｎ比値（Signal　to　Noise　ratio，（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を算出することも好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを、精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合、陽性と判定することができる。
　基準位置スポットの位置から検出用スポットの位置を特定する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、マイクロアレイにおいて検出用スポットを格子状に配置すると共に、基準位置スポットを最下段の両端に配置し、基準位置スポットからの距離及び角度にもとづき各検出用スポットの位置を特定することが可能である。
　以上説明したように、本実施形態のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キットによれば、標識反応の前に、マーカーポリヌクレオチドを反応液に混合することができる。これにより、試験の度に行う必要のあった混合液の調製を省略することが可能となり、マーカーポリヌクレオチドの入れ忘れを防止することも可能となる。このような効果は、ユーザの使用上の煩雑性やミスの発生を低減できることから大変有用である。また、これにより、マーカーポリヌクレオチド及び緩衝液を含む試薬のロスを低減することが可能となる。さらに、マーカーポリヌクレオチドは核酸濃度が低い溶液中では保存できないが、標識反応用キットの形態により、安定して保存することが可能である。
＜試験１：非特異的増幅の有無の確認＞
　ＰＣＲによる増幅反応の前に、マーカーポリヌクレオチドを反応液に添加することにより、非特異的増幅が生じるか否かを確認するための試験を行った。
実験１はマーカーポリヌクレオチドを添加しなかった場合、実験２，３はマーカーポリヌクレオチド（３’末端非修飾）を添加した場合の実験である。また、実験４，５はマーカーポリヌクレオチド（３’末端リン酸化）を添加した場合の実験である。
（実験１：マーカーポリヌクレオチドの添加なし）
　黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus）が検出された市販のおはぎに、増菌用培地を加えて３７℃で一晩培養して得られた培養液を検体とした。この増菌用培地としては、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、塩化ナトリウム１５ｇ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ、及び滅菌水９６４．５ｇを混合し、ｐＨを７．０に調製したものを使用した。
　次に、培養液を１ｍＬ回収し、５０００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ　ＥＤＴＡ，１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。プライマーはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture,　2.5mM each）　　　　　（1.6μl）
・テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・プライマーミックス（図１の８種類のプライマー対）　　（1.0μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version）（0.2μl）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（残量）
（全量　20μl）
　ＰＣＲによる遺伝子の増幅には、サーマルサイクラーｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社）を使用した。反応条件は、以下の通りである。
（１）９５℃　２分
（２）９５℃　１０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）５２℃　３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃　３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃　２分
（２）～（４）を４０サイクル
　次に、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図２に示す。
　同図に示されるように、電気泳動の結果、黄色ブドウ球菌のＤＮＡにおける標的遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅するためのプライマー対による増幅産物（推定サイズ２３８ｂｐ）が検出された。一方、非特異的な増幅産物は検出されなかった。
（実験２：マーカーポリヌクレオチド（３’末端非修飾）の添加あり）
　黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus，菌株番号：NCTC　10788株）を、ＢＤ　ＢａｃｔｏＴＭ　トリプティックソイブロス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いて３７℃で一晩培養して得られた純粋培養液を検体とした。
　次に、この純粋培養液を１ｍＬ回収し、実験１と同様にして、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。プライマーとマーカーポリヌクレオチドはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture,　2.5mM each）　　　　　（1.6μl）
・テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・プライマーミックス（図１の８種類のプライマー対）　　（1.0μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version）（0.2μl）
・マーカーポリヌクレオチド（図３の３’末端非修飾のもの）(160nM　final　conc.）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（残量）
（全量　20μl）
　ＰＣＲによる遺伝子の増幅を実験１と同様に行い、得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図２に示す。
　同図に示されるように、電気泳動の結果、黄色ブドウ球菌のＤＮＡにおける標的遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅するためのプライマー対による増幅産物（推定サイズ２３８ｂｐ）が検出された。一方、非特異的な増幅産物は検出されなかった。
（実験３：マーカーポリヌクレオチド（３’末端非修飾）の添加あり）
　実験１と同様に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus）が検出された市販のおはぎに、増菌用培地を加えて３７℃で一晩培養して得られた培養液を検体とした。
　次に、培養液を１ｍＬ回収し、実験１と同様にして、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。プライマーとマーカーポリヌクレオチドはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture,　2.5mM each）　　　　　（1.6μl）
・テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・プライマーミックス（図１の８種類のプライマー対）　　（1.0μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version）（0.2μl）
・マーカーポリヌクレオチド（図３の３’末端非修飾のもの）(160nM　final　conc.）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（残量）
（全量　20μl）
　ＰＣＲによる遺伝子の増幅を実験１と同様に行い、得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図２に示す。
　同図に示されるように、電気泳動の結果、黄色ブドウ球菌のＤＮＡにおける標的遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅するためのプライマー対による増幅産物（推定サイズ２３８ｂｐ）が検出された。また、非特異的な増幅産物が検出された。
（実験４：マーカーポリヌクレオチド（３’末端リン酸化）の添加あり）
　実験１と同様に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus）が検出された市販のおはぎに、増菌用培地を加えて３７℃で一晩培養して得られた培養液を検体とした。
　次に、培養液を１ｍＬ回収し、実験１と同様にして、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。プライマーとマーカーポリヌクレオチドはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。本実験では、マーカーポリヌクレオチドは５’末端がＣｙ５修飾されており３’末端がリン酸化修飾されている。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture,　2.5mM each）　　　　　（1.6μl）
・テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・プライマーミックス（図１の８種類のプライマー対）　　（1.0μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version）（0.2μl）
・マーカーポリヌクレオチド（図３の３’末端リン酸化のもの）(160nM　final　conc.）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（残量）
（全量　20μl）
　ＰＣＲによる遺伝子の増幅を実験１と同様に行い、得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図４に示す。
　同図に示されるように、電気泳動の結果、黄色ブドウ球菌のＤＮＡにおける標的遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅するためのプライマー対による増幅産物（推定サイズ２３８ｂｐ）が検出された。また、非特異的な増幅産物は検出されなかった。
（実験５：マーカーポリヌクレオチド（３’末端リン酸化）の添加あり）
　実施例２と同様に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus，菌株番号：NCTC　10788株）を、ＢＤ　ＢａｃｔｏＴＭ　トリプティックソイブロス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を用いて３７℃で一晩培養して得られた純粋培養液を検体とした。
　次に、この純粋培養液を１ｍＬ回収し、実験１と同様にして、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。プライマーとマーカーポリヌクレオチドはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。本実験では、マーカーポリヌクレオチドは５’末端がＣｙ５修飾されており３’末端がリン酸化修飾されている。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture,　2.5mM each）　　　　　　（1.6μl）
・テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・プライマーミックス（図１の８種類のプライマー対）　　　（1.0μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version）　（0.2μl）
・マーカーポリヌクレオチド（図３の３’末端リン酸化のもの）(160nM　final　conc.）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（残量）
（全量　20μl）
　ＰＣＲによる遺伝子の増幅を実験１と同様に行い、得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図５に示す。
　同図に示されるように、電気泳動の結果、黄色ブドウ球菌のＤＮＡにおける標的遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅するためのプライマー対による増幅産物（推定サイズ２３８ｂｐ）が検出された。また、非特異的な増幅産物は検出されなかった。
　実験１では、ＰＣＲ反応液に黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーが添加されているが、マーカーポリヌクレオチドは添加されておらず、黄色ブドウ球菌による増幅産物は検出されたが、非特異的な増幅産物は検出されなかった。
　また、実験２では、ＰＣＲ反応液に黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーとマーカーポリヌクレオチドが添加されており、黄色ブドウ球菌による増幅産物は検出されたが、非特異的な増幅産物は検出されなかった。このように、ＰＣＲ反応液にマーカーポリヌクレオチドを添加しても、マーカーポリヌクレオチドは、通常、ターゲットポリヌクレオチドにアニーリングせず、非特異的な増幅産物を生じる原因とはならない場合が多い。
　一方、実験３では、ＰＣＲ反応液に黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーとマーカーポリヌクレオチドが添加されており、黄色ブドウ球菌による増幅産物は検出され、非特異的な増幅産物も検出された。マーカーポリヌクレオチドは、通常は、ターゲットポリヌクレオチドにアニーリングしないが、このように希に、マーカーポリヌクレオチドがターゲットポリヌクレオチドにアニーリングして非特異的な増幅産物を生じる原因となる場合がある。
　そこで、実験４では、実験３のマーカーポリヌクレオチド（３’末端非修飾）に代えて、マーカーポリヌクレオチド（３’末端リン酸化）をＰＣＲ反応液に添加して、その他の点については同様の実験を行った。その結果、このようなＰＣＲによる核酸増幅の合成起点にならないようにしたマーカーポリヌクレオチドを用いることにより、マーカーポリヌクレオチドに基づく非特異的な増幅産物の発生を防止できていることが分かる。
＜試験２：標識の検出＞
　マーカーポリヌクレオチドの添加の有無、マーカーポリヌクレオチドの添加のタイミング、及びマーカーポリヌクレオチドの３’末端の修飾の有無について各種ケースを想定し、マイクロアレイにおける標識の検出を確認するための試験を行った。実験６はマーカーポリヌクレオチド（３’末端非修飾）を標識反応の後、ハイブリダイズ工程の前に混合液に添加した場合、実験７はマーカーポリヌクレオチドを添加しなかった場合、実験８はマーカーポリヌクレオチド（３’末端非修飾）をＰＣＲ反応液に添加した場合、実験９はマーカーポリヌクレオチド（３’末端リン酸化）をＰＣＲ反応液に添加した場合の実験である。
（実験６：マーカーポリヌクレオチド（３’末端非修飾）を標識反応の後、ハイブリダイズ工程の前に混合液に添加）
　実験１と同様に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus）が検出された市販のおはぎに、増菌用培地を加えて３７℃で一晩培養して得られた培養液を検体とした。
　次に、培養液を１ｍＬ回収し、実験１と同様にして、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製し、実験１と同様にＰＣＲによる遺伝子の増幅を行った。プライマーと後述のマーカーポリヌクレオチドはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture,　2.5mM each）　　　　　（1.6μl）
・テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・プライマーミックス（図１の８種類のプライマー対）　　（1.0μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version）（0.2μl）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（残量）
（全量　20μl）
　また、予め、図６に示す各プローブを固定化したスポットを有するマイクロアレイを準備した。具体的には、図６に示すマイクロアレイにおいて、スポット２９～３２に黄色ブドウ球菌の標的とする増幅対象領域から選択されたプローブが固定化され、スポット２５～２８，３７～４０にはその他の菌種の遺伝子から選択されたプローブが固定化されている。また、スポット５７，６４は基準位置スポットであり、基準位置プローブが固定化されている。基準位置プローブは、φ-X174バクテリオファージから選択された塩基配列からなっている。
　次に、マーカーポリヌクレオチド（図３の３’末端非修飾）の原液（１００μＭ）１μＬを９９９μＬの滅菌水に加えることにより１０００倍希釈して、１００ｎＭ溶液を調製した。そして、このマーカーポリヌクレオチドの１００ｎＭ溶液４μＬをハイブリダイズに用いる緩衝液９６μＬ（3×SSC／0.3%SDS　クエン酸－生理食塩水－ドデシル硫酸ナトリウム）と混合して、１００μＬの混合液を調製した。そして、得られた混合液２μＬとＰＣＲ反応液４μＬを混合したものを、上記マイクロアレイに滴下して、４５℃で１時間反応させた。なお、余ったマーカーポリヌクレオチドの希釈液９９６μＬと混合液９８μＬは保存できないため廃棄した。
　反応後、マイクロアレイを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Ｂｉｏｓｈｏｔ(東洋鋼鈑株式会社製)により各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。
　具体的には、プローブにハイブリダイズした増幅産物の標識成分（Cy5）をレーザー光により励起して発光させ、その光量を検出器内に取り付けたＣＣＤカメラにより検出した。また、光量を電気信号に置換して数値化し、蛍光強度値を得た。この蛍光強度値は、当該装置での強度指標であり、単位はない。また、Ｓ／Ｎ比値を算出した。その結果を図７，８に示す。また、マイクロアレイの画像を図９に示す。
　これらの図に示されるように、黄色ブドウ球菌を検出するためのプローブが固定化された検出用スポットにおいて、強い蛍光強度が観察され、陽性と判定されるＳ／Ｎ比値が得られていることが分かる。また、基準位置スポットにおいても、強い蛍光強度が観察され、陽性と判定されるＳ／Ｎ比値が得られていることが分かる。
（実験７：マーカーポリヌクレオチドの添加なし）
　実験１と同様に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus）を培養し、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。そして、実験１と同様にＰＣＲによる遺伝子の増幅を行った。このＰＣＲ反応液にはマーカーポリヌクレオチドは含まれていない。
　また、予め、実験６と同様のマイクロアレイを準備した。
　次に、ＰＣＲ反応液４μＬとハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS　クエン酸－生理食塩水－ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、上記マイクロアレイに滴下して、４５℃で１時間反応させた。この混合液にもマーカーポリヌクレオチドは含まれていない。
　反応後、実験６と同様にして各プローブのスポット領域の蛍光を検出し、蛍光強度値とＳ／Ｎ比値を得た。その結果を図７，８に示す。また、マイクロアレイの画像を図９に示す。
　これらの図に示されるように、黄色ブドウ球菌を検出するためのプローブが固定化された検出用スポットにおいて、強い蛍光強度が観察され、陽性と判定されるＳ／Ｎ比値が得られていることが分かる。一方、マーカーポリヌクレオチドを添加していないため、基準位置スポットにおいては、蛍光が検出されていない（ほぼバックグラウンド値である）ことが分かる。
（実験８：マーカーポリヌクレオチド（３’末端非修飾）をＰＣＲ反応液に添加）
　実験１と同様に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus）が検出された市販のおはぎに、増菌用培地を加えて３７℃で一晩培養して得られた培養液を検体とした。
　次に、培養液を１ｍＬ回収し、実験１と同様にして、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製し、実験１と同様にＰＣＲによる遺伝子の増幅を行った。プライマーとマーカーポリヌクレオチドはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture,　2.5mM　each）　　　　　（1.6μl）
・テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・プライマーミックス（図１の８種類のプライマー対）　　（1.0μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version）（0.2μl）
・マーカーポリヌクレオチド（図３の３’末端非修飾のもの）(160nM　final　conc.）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（残量）
（全量　20μl）
　また、予め、実験６と同様のマイクロアレイを準備した。
　次に、ＰＣＲ反応液４μＬとハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS　クエン酸－生理食塩水－ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、上記マイクロアレイに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
　反応後、実験６と同様にして各プローブのスポット領域の蛍光を検出し、蛍光強度値とＳ／Ｎ比値を得た。その結果を図７，８に示す。また、マイクロアレイの画像を図９に示す。
　これらの図に示されるように、黄色ブドウ球菌を検出するためのプローブが固定化された検出用スポットにおいて、強い蛍光強度が観察され、陽性と判定されるＳ／Ｎ比値が得られていることが分かる。また、基準位置スポットにおいても、強い蛍光強度が観察され、陽性と判定されるＳ／Ｎ比値が得られていることが分かる。
　一方、腸炎ビブリオを検出するためのプローブが固定化された検出用スポットにおいても陽性と判定されるＳ／Ｎ比値が得られており、偽陽性反応が生じていることが分かる。
（実験９：マーカーポリヌクレオチド（３’末端リン酸化）をＰＣＲ反応液に添加）
　実験１と同様に、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus　aureus）が検出された市販のおはぎに、増菌用培地を加えて３７℃で一晩培養して得られた培養液を検体とした。
　次に、培養液を１ｍＬ回収し、実験１と同様にして、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
　次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製し、実験１と同様にＰＣＲによる遺伝子の増幅を行った。プライマーとマーカーポリヌクレオチドはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。
・緩衝液（10×Ex　Taq　buffer）　　　　　　　　　　　　　(2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP　Mixture,　2.5mM　each）　　　　　　（1.6μl）
・テンプレート　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（1.0μl）
・プライマーミックス（図１の８種類のプライマー対）　　　（1.0μl）
・核酸合成酵素（TaKaRa　Ex　Taq　Hot　Start　Version）　（0.2μl）
・マーカーポリヌクレオチド（図３の３’末端リン酸化のもの）(160nM　final　conc.）
・滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（残量）
（全量　20μl）
　また、予め、実験６と同様のマイクロアレイを準備した。
　次に、ＰＣＲ反応液４μＬとハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS　クエン酸－生理食塩水－ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、上記マイクロアレイに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
　反応後、実験６と同様にして各プローブのスポット領域の蛍光を検出し、蛍光強度値とＳ／Ｎ比値を得た。その結果を図７，８に示す。また、マイクロアレイの画像を図９に示す。
　これらの図に示されるように、黄色ブドウ球菌を検出するためのプローブが固定化された検出用スポットにおいて、強い蛍光強度が観察され、陽性と判定されるＳ／Ｎ比値が得られていることが分かる。また、基準位置スポットにおいても、強い蛍光強度が観察され、陽性と判定されるＳ／Ｎ比値が得られていることが分かる。そして、その他の菌種について、偽陽性反応が生じていないことが分かる。
　以上の通り、マーカーポリヌクレオチドをＰＣＲ反応液に添加した実験９によれば、マーカーポリヌクレオチドをハイブリダイズ工程前に混合液に添加した実験６の結果と同等の結果を得ることができ、かつ作業工程数と試薬のロスを削減することが可能となっている。さらに、実験９によれば、３’末端非修飾のマーカーポリヌクレオチドをＰＣＲ反応液に添加した実験８の場合における偽陽性反応の発生を排除することができていることが分かる。
　本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。例えば、本実施形態に係るマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キットにおいて、ターゲットポリヌクレオチド、プローブ、マーカーポリヌクレオチド、基準位置プローブ、及びプライマーの塩基配列は本質的なものではなく、任意のものにすることが可能である。また、実施例では微生物を対象として実験を行っているが、本発明は、対象とする生物の種類を限ることなく適用することが可能である。
　本発明は、食品検査、疫学的環境検査、環境検査、臨床試験、及び家畜衛生等において、マイクロアレイを用いて各種標的を検出する場合などに好適に利用することが可能である。

Claims (8)

  1. 　ターゲットポリヌクレオチドに標識する反応を経た後に、マイクロアレイによりプローブとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を含むマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法であって、
    　前記プローブが固定化された複数の検出用スポットを有すると共に、基準位置プローブが固定化された基準位置スポットを有するマイクロアレイに、前記標識されたターゲットポリヌクレオチドと、前記基準位置プローブにハイブリダイズする標識されたマーカーポリヌクレオチドを接触させる工程を含み、
    　前記標識する反応の開始前に、該反応に用いられる反応液に前記マーカーポリヌクレオチドを添加する
    　ことを特徴とするマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法。
  2. 　前記標識する反応を経た前記反応液に緩衝液を混合して、得られた混合液をマイクロアレイに接触させ、前記基準位置スポットにおける前記マーカーポリヌクレオチドの標識を検出し、前記基準位置スポットの位置にもとづき前記プローブの位置を決定する
    　ことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法。
  3. 　前記基準位置スポットを二箇所以上有することを特徴とする請求項１又は２記載のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法。
  4. 　前記標識する反応がＰＣＲであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法。
  5. 　前記マーカーポリヌクレオチドを、ＰＣＲによる核酸増幅の合成起点にならないように修飾した後、前記反応液に添加することを特徴とする請求項４記載のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法。
  6. 　前記マーカーポリヌクレオチドの３’末端をリン酸化修飾した後、前記反応液に添加することを特徴とする請求項４又は５記載のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載のマイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法における標識する反応に用いられる標識反応用キットであって、前記マーカーポリヌクレオチドを含有することを特徴とする標識反応用キット。
  8. 　前記ターゲットポリヌクレオチドを増幅するための一又は二種類以上のプライマー対をさらに含有することを特徴とする請求項７記載の標識反応用キット。
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