WO2017159647A1 - フィーカリバクテリウム属細菌増殖剤 - Google Patents

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明仁 遠藤
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    • A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract

Definitions

  • the present invention relates to a Felicaribacterium spp. Proliferating agent containing 1-kestose as an active ingredient, a food composition for proliferating Ficaribacterium spp., A method for proliferating Ficaribacterium spp., Treatment or prevention of intestinal inflammation Methods and use of 1-kestose for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of intestinal inflammation.
  • Non-Patent Document 1 Physicobacteria are obligate anaerobic bacilli that are resident in the mucus layer in the intestine, and have a high retention rate and number in humans, and are the main constituent species of the intestinal flora.
  • Felicaribacterium spp. Have favorable physiological functions such as supplying energy to cells in the intestine, maintaining good intestinal environment, and strong anti-inflammatory effects.
  • Non-Patent Document 1 Furthermore, with regard to the anti-inflammatory action, it has been reported that the inflammatory state can be prevented or ameliorated by administering the Felicalibacterium spp. Or its culture supernatant to an enteritis model animal or cultured cells.
  • a method of administering a genus Phykaribacterium itself as described in Non-Patent Documents 1 and 2 to a living body includes the following (i) to (iv) ).
  • Felicaribacterium spp. Have no history of eating, so there is a concern in terms of safety.
  • Patent Document 1 discloses polydextrose or water-soluble bacteria. Disclosed is a method for increasing Phykaribacterium spp. By ingesting a composition comprising sex corn fiber.
  • the present invention has been made in order to solve the problem, and is capable of effectively proliferating bacteria of the genus Phericobacteria, thereby contributing to the prevention and treatment of diseases such as intestinal inflammation. And to provide a method.
  • the Felicaribacterium spp. Growth agent according to the present invention contains 1-kestose as an active ingredient.
  • the Felicaribacterium spp. Growth agent according to the present invention can be used for prevention or treatment of intestinal inflammation.
  • the Felicaribacterium spp. Proliferating agent according to the present invention can be suitably used for the prevention or treatment of inflammatory bowel disease among intestinal inflammations.
  • the Felicaribacterium spp. Growth agent according to the present invention can be suitably used for prevention or treatment of Crohn's disease or ulcerative colitis among inflammatory bowel diseases.
  • the food composition for the growth of Phykaribacterium spp. According to the present invention contains 1-kestose as an active ingredient.
  • the number of bacteria belonging to the genus Phecalibacterium genus in the human or animal body is obtained by ingesting 1-kestose to the human or animal.
  • a step of increasing the number of bacteria belonging to the genus Phecalibacterium genus in the human or animal body is obtained by ingesting 1-kestose to the human or animal.
  • the second aspect of the method for growing Phericabacterium according to the present invention includes the step of culturing by adding 1-kestose to a medium containing the Felicabacterium.
  • the method for treating or preventing enteric inflammation according to the present invention is a method in which a human or animal suffering from or possibly suffering from enteric inflammation is allowed to ingest 1-kestose. Or it has the process of increasing the number of the bacteria of the genus Phykaribacterium in the animal body.
  • the use of 1-kestose according to the present invention is the use of 1-kestose for producing a medicament for treating or preventing enteric inflammation.
  • 1-kestose is a kind of oligosaccharide contained in vegetables and grains such as onion, garlic, barley, rye, etc., and is a substance with a long history of eating, mutagenicity tests, acute Since no toxicity was observed in any of the toxicity test, subchronic toxicity test and chronic toxicity test, it can be said that the safety is extremely high (Food and Development, Vol. 49, No. 12, page 9, 2014). ).
  • 1-kestose is highly water-soluble and has a good sweetness similar to sugar. Therefore, it can be easily consumed on a daily basis as it is or as a seasoning such as a sweetener. And can be easily blended into pharmaceuticals.
  • the present invention it is possible to easily and effectively increase the number of bacteria belonging to the genus Phericobacteria in the body of humans and animals with little concern about side effects and safety.
  • intestinal inflammation can be prevented or treated by increasing the number of bacteria belonging to the genus Fecalibacterium in the body of a human or animal.
  • a Felicaribacterium spp. Proliferating agent a food composition for proliferating Ficaribacterium spp.
  • a method for proliferating Ficaribacterium spp, a method for treating or preventing intestinal inflammation, and an intestine The use of 1-kestose for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of inflammation is described in detail.
  • the “genus Felicalibacterium” refers to a microorganism belonging to the genus Faecalibacterium.
  • microorganisms belonging to the genus Fekaribacteria include Faecalibacterium prausnitzi.
  • 1-kestose is a trisaccharide oligosaccharide composed of one molecule of glucose and two molecules of fructose.
  • 1-kestose can be produced by performing an enzyme reaction with an enzyme as disclosed in JP-A-58-201980 using sucrose as a substrate. Specifically, first, ⁇ -fructofuranosidase is added to a sucrose solution, and allowed to stand at 37 ° C. to 50 ° C. for about 20 hours to perform an enzyme reaction to obtain a 1-kestose-containing reaction solution.
  • 1-kestose-containing reaction solution By subjecting this 1-kestose-containing reaction solution to a chromatographic separation method as disclosed in JP-A-2000-232878, 1-kestose and other sugars (dextrose, fructose, sucrose, tetrasaccharide or more) Oligosaccharide) is separated and purified to obtain a high purity 1-kestose solution. Subsequently, the high-purity 1-kestose solution is concentrated and then crystallized by a crystallization method as disclosed in Japanese Patent Publication No. 6-70075, whereby 1-kestose can be obtained as crystals.
  • 1-kestose is contained in commercially available fructooligosaccharides, it may be used as it is, or 1-kestose may be separated and purified from fructooligosaccharides by the method described above. That is, a 1-kestose-containing composition such as an oligosaccharide containing 1-kestose may be used as the 1-kestose of the present invention.
  • a 1-kestose-containing composition such as an oligosaccharide containing 1-kestose may be used as the 1-kestose of the present invention.
  • the purity of 1-kestose is preferably 80% by mass or more, more preferably 85% by mass or more, and further preferably 90% by mass or more.
  • the “purity” of a specific oligosaccharide refers to the mass% of the oligosaccharide when the total amount of sugar is 100%.
  • 1-Kestose is used by ingestion by humans and animals.
  • the intake (dose) of 1-kestose is, for example, 0.01 to 0.34 g / kg body weight, preferably 0.01 to 0.30 g / kg body weight, more preferably 0.01 to 0.24 g / kg. Examples include kg body weight.
  • Such intake is not limited to once a day, and may be divided into a plurality of times.
  • 1-kestose has the function of increasing the number of bacteria belonging to the genus Fecalbacterium in vivo as shown in Example 2 described later. For this reason, as a method for ingestion by humans and animals, any method may be used as long as it reaches the intestine where Haemophila bacteria live. As such a method, specifically, there can be mentioned a method in which 1-kestose is orally ingested by humans or animals as it is or in the form of food or drink or medicine. In addition, 1-kestose is administered directly from the anus or via a tube inserted, and 1-kestose is added to enteral nutrients, and this is passed through a tube inserted into the digestive tract such as the stomach or small intestine. And a method of administration by enteral nutrition.
  • 1-kestose can also be used to increase the number of phycobacteria in vitro, as shown in Example 1 described later.
  • a method in which 1-kestose is added to a medium containing a genus Phecalibacterium and left to stand at 37 ° C. for a predetermined time in an anaerobic environment can be mentioned.
  • Non-Patent Document 2 discloses that entericitis is administered to a mouse model of enteritis induced by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) by administering Fecalbacterium spp.Plasnitsii strain A2-165 or its culture supernatant. It is described that can be suppressed. Further, Non-Patent Document 3 discloses that IL-10, TGF- ⁇ 1 and IL- are added by adding Phykaribacterium sp.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • Non-Patent Document 3 discloses that anti-inflammatory cytokine production promotion and regulatory T can be achieved by orally administering Phykaribacterium spp. Prausnitsi (ATCC27766) and its culture supernatant to TNBS-induced enteritis model rats. In addition to promoting cell differentiation, it has also been shown to promote healing of inflamed tissues found on the intestinal mucosa.
  • intestinal inflammation can be prevented or treated by ingesting 1-kestose into humans or animals to increase the number of bacteria belonging to the genus Fecalbacterium in the body or intestine.
  • 1-kestose can also be used to produce a medicament for the treatment or prevention of intestinal inflammation.
  • intestinal inflammation refers to a state where inflammation occurs in the intestinal tract, and includes a state leading to a disease.
  • examples of the disease resulting from intestinal inflammation include inflammatory bowel disease.
  • Inflammatory bowel disease refers to ulcerative colitis and Crohn's disease in a broad sense, and in a broad sense as any inflammatory disease of the intestinal tract (Latest University of Medicine ⁇ Progress 8>, digestive system diseases, pp 320, 1997, Nakayama Shoten).
  • the term “inflammatory bowel disease” means any of the latter inflammatory diseases in the intestinal tract.
  • the present invention can be suitably used for the prevention or treatment of intestinal inflammation, particularly those excluding allergies.
  • Felicaribacterium spp. Growth agent of the present invention include health foods such as pharmaceuticals, quasi drugs, food additives, and supplements.
  • the dosage form of a pharmaceutical, quasi-drug or supplement containing 1-kestose is not particularly limited, and a dosage form suitable for the administration method can be appropriately selected.
  • a dosage form suitable for the administration method can be appropriately selected.
  • it can be made into solid or liquid dosage forms such as powders, tablets, dragees, capsules, granules, dry syrups, liquids, syrups, drops, drinks and the like.
  • the pharmaceuticals, quasi drugs, and supplements of the above dosage forms can be produced by methods known to those skilled in the art.
  • a powder 800 g of 1-kestose and 200 g of lactose are mixed well, and then 300 mL of 90% ethanol is added and moistened. Subsequently, after the wet powder is granulated, it is dried by ventilation at 60 ° C. for 16 hours, and then sized to obtain 1000 g of powder with an appropriate fineness (1-kestose content of 800 mg / 1 g).
  • the granules were sized using a sieve of 850 ⁇ m, and then 50 g of sucrose fatty acid ester was added to and mixed with 470 g of granules, followed by punching using a rotary tableting machine (6B-2, manufactured by Kikusui Seisakusho). It is possible to obtain 5000 tablets with a diameter of 8 mm and a weight of 200 mg (1-kestose content: 60 mg / 1 tablet).
  • Specific embodiments of the food composition for growing bacteria of the genus Feccalibacterium of the present invention include, for example, beverages, dairy products, edible granules, pastes, seasonings, retort foods, baby foods, fermented foods, and preserved foods.
  • Processed foods such as processed fishery products, processed meat products, processed cereal products, food additives, health foods, animal feeds and the like.
  • 1-kestose can be added and used in the normal production process of various foods, food additives, and animal feeds.
  • the sweetness of 1-kestose is 30, and its taste, physical properties and processability are close to those of sucrose, so in the production process of various foods and drinks, part or all of the sugar is replaced with 1-kestose.
  • Various foods and drinks, food additives, and animal feeds can be produced in the same manner as sugar.
  • Example 1 Examination of phytobacterium bacterium growth action in vitro A liquid medium having the following composition was prepared aseptically.
  • oligosaccharides 1-kestose (purity 99% by mass; product food science company), nystose (purity 98% by mass; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylooligosaccharide (purity 98% by mass; product food science company), raffinose ( Purity 98% by mass; Meiji Food Materia Co., Ltd.) or lactosucrose (purity 89% by mass; Shimizu Minato Sugar Co., Ltd.) was used.
  • a liquid medium containing no oligosaccharide was prepared in the same manner as described below.
  • ⁇ Composition of liquid medium / per liter >> (final pH: pH 7.0)
  • the pre-cultured Felicaribacterium Plaus Nitzy ATCC27768 strain was inoculated into the prepared liquid medium so that the turbidity at 660 nm was 0.05 to 0.06 OD (Optical Density) value.
  • This was statically cultured at 37 ° C. in an anaerobic environment, and turbidity (OD value) at 660 nm was measured using a spectrophotometer after 24 hours, 48 hours and 72 hours.
  • the results are shown in Table 1.
  • the relationship between the OD value and the culture time is shown in the line graph of FIG.
  • the OD value at a culture time of 72 hours is shown in the bar graph of FIG.
  • the OD values were 0.062 at 0 hours, 0.173 at 24 hours, 0.113 at 48 hours, 0.166 at 72 hours in the control liquid medium. Met. In contrast, in the liquid medium supplemented with 1-kestose, it was 0.063 at 0 hours, 0.345 at 24 hours, 0.885 at 48 hours, and 1.803 at 72 hours. On the other hand, in the liquid medium added with nystose, it was 0.063 at 0 hours, 0.290 at 24 hours, 0.443 at 48 hours, and 0.305 at 72 hours.
  • liquid culture medium which added xylooligosaccharide it was 0.069 in 0 hours, 0.271 in 24 hours, 0.234 in 48 hours, and 0.294 in 72 hours.
  • liquid culture medium which added raffinose it was 0.052 in 0 hours, 0.251 in 24 hours, 0.191 in 48 hours, and 0.246 in 72 hours.
  • lactosucrose it was 0.055 in 0 hours, 0.298 in 24 hours, 0.448 in 48 hours, and 0.295 in 72 hours.
  • the liquid medium supplemented with 1-kestose is compared with the liquid medium not added with oligosaccharide (control liquid medium) and the liquid medium added with other oligosaccharides (nystose, xylo-oligosaccharide, raffinose and lactosucrose).
  • the OD value was remarkably large at any of the culture times of 24 hours, 48 hours and 72 hours.
  • the medium turbidity (OD value) reflects the number of microorganisms. Therefore, from the above results, the number of strains of Fecalbacterium Plaus Nitzy ATCC27768 in the liquid medium supplemented with 1-kestose was added to the oligosaccharide at any culture time of 24 hours, 48 hours and 72 hours. It was revealed that the number of bacteria in the liquid medium not added and the liquid medium added with other oligosaccharides was remarkably large. From this result, it has been clarified that 1-kestose has a remarkably large effect of growing the genus Felicalibacterium in vitro.
  • Example 2 Examination of Phykaribacterium spp. Growth in vivo 58 infants aged 6 months to 6 years were divided into 2 groups of 29 infants, 1-kestose group and maltose group.
  • the 1-kestose group contains 1-kestose (purity 98% by mass or more; product food science company), and the maltose group contains maltose (purity 92% by mass or more; “San malt-S” powder product; Sanwa Starch Co., Ltd.). Ingested daily during the study period. The test period was 12 weeks.
  • the daily intake of 1-kestose or maltose is 1 g for younger than 1 year (reference intake; 0.121 g / kg body weight / day), and 2 g for 1 to 3 years (reference intake; 0.169 g / kg body weight) / Day) 4 to 6 years old was 3 g (reference intake: 0.170 g / kg body weight / day). Feces were collected at the start of the test period (0 weeks), 6 weeks (6 weeks), and 12 weeks (12 weeks).
  • the above-mentioned reference intake was calculated based on the age-specific weight data published in the “Ministry of Health, Labor and Welfare 2010 Infant Physical Growth Survey”. That is, from the minimum and maximum values of the weight data corresponding to the age (months) of the test participants of Example 2, the median was determined for each gender, and the median average was calculated. Subsequently, an average value of men and women was calculated for the average value of the median value, and this was used as a standard weight. The estimated body weight was 8.26 kg for those under 1 year old, 11.85 kg for 1 to 3 years old, and 17.62 kg for 4 to 6 years old. The value obtained by dividing the daily intake of 1-kestose or maltose by this standard body weight was taken as the standard intake.
  • the number of bacteria of the genus Phecalibacterium in the collected feces was quantified by a real-time PCR method. Specifically, first, genomic DNA was extracted from feces using a reagent for genome extraction “Ultra Clean DNA Isolation Kit” (Mo Bio Laboratories) and “High Pure PCR Template Preparation Kit” (Roche). .
  • the average number of bacteria was calculated for each group.
  • a significant difference test was performed on the average value of the number of bacteria at 0 week by Wilcoxon's sign rank test to obtain a p value. The results are shown in Table 2.
  • the number of bacteria in the 1-kestose group was 3.7 ⁇ 10 6 cells / g stool at 0 weeks, whereas 1.4 ⁇ 10 7 cells / g stool at 6 weeks. In 12 weeks, it was 3.5 ⁇ 10 7 pieces / feces 1 g. That is, the number of bacteria compared with week 0 increased to 3.5 times or more at 6 weeks, although there was no significant difference, and increased significantly to 9 times or more at 12 weeks.
  • the number of bacteria in the maltose group was 7.6 ⁇ 10 6 cells / g stool at 0 weeks, whereas 5.8 ⁇ 10 6 cells / g stool at 6 weeks and 1.3 g at 12 weeks. ⁇ 10 7 pieces / feces 1 g. That is, the number of bacteria compared with week 0 decreased slightly at 6 weeks and increased slightly at 12 weeks, but there was no significant difference.

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Abstract

【課題】　フィーカリバクテリウム属細菌を効果的に増殖させることができ、もって、腸内炎症等の疾患の予防や治療に寄与しうる物質および方法を提供する。 【解決手段】　１－ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤。本発明によれば、生体外および生体内のいずれにおいても、フィーカリバクテリウム属細菌を効果的に増殖させることができる。特に、副作用や安全性をほとんど懸念することなく、簡便かつ効果的に、ヒトや動物の体内のフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることができる。また、ヒトや動物の体内のフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることにより、腸内炎症の予防ないし治療をすることができる。

Description

フィーカリバクテリウム属細菌増殖剤
　本発明は、１－ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤、フィーカリバクテリウム属細菌増殖用食品組成物、フィーカリバクテリウム属細菌の増殖方法、腸内炎症の治療または予防方法、および、腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するための１－ケストースの使用に関する。
　フィーカリバクテリウム属細菌は腸内の粘液層に常在する偏性嫌気性桿菌であり、ヒトにおける保有率および保有数はともに高く、腸内細菌叢の主要な構成菌種である。近年の研究において、フィーカリバクテリウム属細菌は、腸内の細胞にエネルギーを供給する作用や腸内環境を良好に保つ作用、強い抗炎症作用などの、好ましい生理機能を有することが示されている（非特許文献１）。さらに、抗炎症作用に関しては、フィーカリバクテリウム属細菌やその培養上清を腸炎モデル動物や培養細胞に投与することにより、炎症状態を予防または改善できることが報告されている（非特許文献２、３）。
　一方で、疾患の予防や治療ないし健康増進を目的として、非特許文献１および２に記載されているようなフィーカリバクテリウム属細菌そのものを生体に投与する方法では、下記（ｉ）～（ｉｖ）のような問題点がある。（ｉ）経口投与においては胃酸や胆汁、消化液の作用を受けて、大多数の菌が腸内に到達する前に死滅してしまう。（ｉｉ）一般に、外来の菌は腸内に定着し難く、大多数が消化管を素通りしてしまうため、効果が一過性と考えられる。（ｉｉｉ）フィーカリバクテリウム属細菌は食経験の歴史が無いため、安全性の点で懸念がある、（ｉｖ）フィーカリバクテリウム属細菌は偏性嫌気性であるため、生菌のまま医薬品や食品に配合するためには、特殊な加工や保存条件を必要とする。
　そこで、上記（ｉ）～（ｉｖ）の問題点を解決すべく、生体に内在するフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることが試みられており、例えば、特許文献１には、ポリデキストロースまたは水溶性トウモロコシ繊維を含む組成物を摂取することによりフィーカリバクテリウム属細菌を増加させる方法が開示されている。
特開２０１４－５３２７１０号公報
Ｙｕａｎ　Ｇａｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｃｈ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｖｏｌ．２０１４、Ａｒｔ．ＩＤ ８７２７２５、２０１４年３月２７日 Ｍｉｑｕｅｌ Ｓ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１６（３）、第２５５～２６１頁、２０１３年６月 Ｘｉｎｙｕｎ Ｑｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ａｎｄ Ｃｏｌｉｔｉｓ、Ｖｏｌ．７、Ｉｓｓｕｅ１１、ｅ５５８～ｅ５６８、２０１３年１２月
　しかしながら、フィーカリバクテリウム属細菌の数を十分に増加させることができる物質ないし方法は未だ十分に提供されておらず、そのような物質ないし方法の開発が求められていた。本発明は係る課題を解決するためになされたものであって、フィーカリバクテリウム属細菌を効果的に増殖させることができ、もって、腸内炎症等の疾患の予防や治療に寄与しうる物質および方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、１－ケストースが、生体外および生体内のいずれにおいても、フィーカリバクテリウム属細菌の数を顕著に増加させることを見出した。そこで、この知見に基づいて、下記の各発明を完成した。
（１）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤は、１－ケストースを有効成分とする。
（２）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤は、腸内炎症の予防または治療に用いることができる。
（３）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤は、腸内炎症のうち、特に、炎症性腸疾患の予防または治療に好適に用いることができる。
（４）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤は、炎症性腸疾患のうち、特に、クローン病または潰瘍性大腸炎の予防または治療に好適に用いることができる。
（５）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖用食品組成物は、１－ケストースを有効成分とする。
（６）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌の増殖方法の第１の態様は、ヒトまたは動物に１－ケストースを摂取させることにより前記ヒトまたは動物の体内におけるフィーカリバクテリウム 属細菌の数を増加させる工程を有する。
（７）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌の増殖方法の第２の態様は、フィーカリバクテリウム属細菌を含む培地に１－ケストースを添加して培養する工程を有する。
（８）本発明に係る腸内炎症の治療または予防方法は、腸内炎症を罹患している、または、罹患する可能性があるヒトもしくは動物に、１－ケストースを摂取させることにより、前記ヒトもしくは動物の体内におけるフィーカリバクテリウム属細菌の数を増加させる工程を有する。
（９）本発明に係る１－ケストースの使用は、腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するための１－ケストースの使用である。
　本発明によれば、生体外および生体内のいずれにおいても、フィーカリバクテリウム属細菌を効果的に増殖させることができる。
　また、１－ケストースは、タマネギやニンニク、大麦、ライ麦などの野菜や穀物にも含まれているオリゴ糖の一種であり、古来より食経験を有する物質であることや、変異原性試験、急性毒性試験、亜慢性毒性試験および慢性毒性試験のいずれにおいても毒性が認められていないことから、安全性は極めて高いといえる（食品と開発、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．１２、第９頁、２０１４年）。また、１－ケストースは、水溶性が高く、砂糖に似た良好な甘味質を有するため、そのまま、あるいは甘味料等の調味料として、日常的に簡便に摂取することができるほか、様々な食品や医薬品等に容易に配合することができる。
　したがって、本発明によれば、副作用や安全性をほとんど懸念することなく、簡便かつ効果的に、ヒトや動物の体内のフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることができる。また、本発明によれば、ヒトや動物の体内のフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることにより、腸内炎症の予防ないし治療をすることができる。
各種のオリゴ糖を用いて培養したフィーカリバクテリウム　プラウスニッツィーＡＴＣＣ２７７６８株の培地の濁度（ＯＤ値）と培養時間との関係を示す折れ線グラフである。 各種のオリゴ糖を用いて、７２時間培養したフィーカリバクテリウム　プラウスニッツィーＡＴＣＣ２７７６８株の培地の濁度（ＯＤ値）を示す棒グラフである。
　以下、本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤、フィーカリバクテリウム属細菌増殖用食品組成物、フィーカリバクテリウム属細菌の増殖方法、腸内炎症の治療または予防方法、および、腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するための１－ケストースの使用について詳細に説明する。
　本発明において、「フィーカリバクテリウム属細菌」は、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物をいう。フィーカリバクテリウム属に属する微生物としては、フィーカリバクテリウム プラウスニッツィー（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を挙げることができる。
　「１－ケストース」は、１分子のグルコースと２分子のフルクトースからなる三糖類のオリゴ糖である。１－ケストースは、スクロースを基質として、特開昭５８－２０１９８０号公報に開示されているような酵素による酵素反応を行うことにより作ることができる。具体的には、まず、β－フルクトフラノシダーゼをスクロース溶液に添加し、３７℃～５０℃で２０時間程度静置することにより酵素反応を行って、１－ケストース含有反応液を得る。この１－ケストース含有反応液を、特開２０００－２３２８７８号公報で開示されているようなクロマト分離法に供することよって、１－ケストースと他の糖（ブドウ糖、果糖、ショ糖、４糖以上のオリゴ糖）とを分離して精製し、高純度１－ケストース溶液を得る。続いて、この高純度１－ケストース溶液を濃縮した後、特公平６－７００７５号公報に開示されているような結晶化法で結晶化することにより、１－ケストースを結晶として得ることができる。
　また、１－ケストースは市販のフラクトオリゴ糖に含まれているため、これをそのまま、あるいは、フラクトオリゴ糖から上述の方法により１－ケストースを分離精製して用いてもよい。すなわち、本発明の１－ケストースとして、１－ケストースを含有するオリゴ糖などの１－ケストース含有組成物を用いてもよい。１－ケストース含有組成物を用いる場合、１－ケストースの純度は８０質量％以上であることが好ましく、８５質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明において、特定のオリゴ糖の「純度」とは、糖の総量を１００％とした場合の、当該オリゴ糖の質量％をいう。
　１－ケストースは、ヒトや動物に摂取させることにより用いる。１－ケストースの摂取量（投与量）としては、例えば、０．０１～０．３４ｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１～０．３０ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１～０．２４ｇ／ｋｇ体重などを挙げることができる。係る摂取量は、１日１回に限らず、複数回に分割して摂取してもよい。　　
　１－ケストースは、後述する実施例２に示すように、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においてフィーカリバクテリウム属細菌の数を増加させるという機能を有する。このことから、ヒトや動物に摂取させる方法としては、フィーカリバクテリウム属細菌の生息場所である腸内に到達させる方法であればよい。そのような方法として、具体的には、１－ケストースを、そのまま、あるいは飲食物や医薬品の形態で、ヒトまたは動物に経口摂取させる方法を挙げることができる。その他、１－ケストースを肛門から直接あるいは挿入したチューブを経由して投与する方法、１－ケストースを経腸栄養剤に添加して、これを、胃や小腸などの消化管に挿入したチューブを経由して経腸栄養法により投与する方法などを挙げることができる。
　一方、１－ケストースは、後述する実施例１に示すように、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）においてフィーカリバクテリウム属細菌の数を増加させるために用いることもできる。この場合は、例えば、フィーカリバクテリウム属細菌を含む培地に１－ケストースを添加して、嫌気環境下にて３７℃で所定の時間静置培養する方法を挙げることができる。
　上述したとおり、フィーカリバクテリウム属細菌は、菌体やその培養上清の投与によって、炎症状態を予防または改善できることが示されている。すなわち、非特許文献２には、２，４，６－ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＴＮＢＳ）で誘導した腸炎モデルマウスにフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー Ａ２－１６５株やその培養上清を投与することにより、腸炎を抑制できることが記載されている。また、非特許文献３には、ヒト末梢血単核球細胞の培地にフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー（ＡＴＣＣ２７７６６）やその培養上清を添加することにより、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β１およびＩＬ－１２ｐ７０といった抗炎症性サイトカインの産生を促進し、制御性Ｔ細胞の分化を促進できることが示されている。さらに、非特許文献３には、ＴＮＢＳで誘導した腸炎モデルラットにフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー（ＡＴＣＣ２７７６６）やその培養上清を経口投与することにより、抗炎症性サイトカインの産生促進および制御性Ｔ細胞の分化促進の他、腸粘膜上に見られる炎症組織の治癒を促進できることも示されている。
　従って、１－ケストースをヒトや動物に摂取させてその体内ないし腸内においてフィーカリバクテリウム属細菌の数を増加させることにより、腸内炎症を予防または治療することができる。また、１－ケストースは、腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するために使用することができる。
　ここで、本発明において、「腸内炎症」とは、腸管において炎症が生じている状態をいい、疾患に至っている状態も含む。腸内炎症から至る疾患としては、炎症性腸疾患が挙げられる。炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎とクローン病とを指すとして、狭義に解釈する立場と、腸管のあらゆる炎症性疾患を指すとして、広義に解釈する立場とがある（最新内科学大系〈プログレス８〉、消化器疾患、ｐｐ３２０、１９９７年、中山書店）。本発明において炎症性腸疾患という場合は、後者の、腸管におけるあらゆる炎症性疾患を意味する。本発明は、腸内炎症のうち、特に、アレルギーを除くものの予防または治療に好適に用いることができる。
　本発明のフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤の具体的な態様としては、例えば、医薬品や医薬部外品、食品添加物、サプリメントなどの健康食品などを挙げることができる。
　１－ケストースを含有する医薬品や医薬部外品、サプリメントの剤型は特に限定されず、投与方法に適した剤型を適宜選択することができる。例えば、経口投与の場合には、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤、ドリンク剤等の固形または液状の剤型にすることができる。
　上記各剤型の医薬品や医薬部外品、サプリメントは、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、散剤であれば、１－ケストース８００ｇおよび乳糖２００ｇをよく混合した後、９０％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させる。続いて、湿潤粉末を造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥し、その後、整粒して、適当な細かさの散剤１０００ｇ（１－ケストース含有量８００ｍｇ／１ｇ）を得ることができる。また、錠剤であれば、１－ケストース３００ｇ、粉末還元水飴３８０ｇ、コメデンプン１８０ｇおよびデキストリン１００ｇをよく混合した後、９０％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させる。続いて、湿潤粉末を押し出し造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥して顆粒を得る。その後、この顆粒を８５０μｍの篩を用いて整粒し、続いて顆粒４７０ｇにショ糖脂肪酸エステル５０ｇを添加して混合した後、ロータリー打錠機（６Ｂ－２、菊水製作所製）を用いて打錠し、直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤５０００錠（１－ケストース含有量６０ｍｇ／１錠）を得ることができる。
　本発明のフィーカリバクテリウム属細菌増殖用食品組成物の具体的な態様としては、例えば、飲料、乳製品、食用に供する顆粒、ペースト、調味料、レトルト食品、ベビーフード、発酵食品、保存食、水産加工品、食肉加工品、穀物加工品などの加工食品、食品添加物、健康食品、動物飼料などを挙げることができる。
　１－ケストースは、各種の飲食品や食品添加物、動物飼料の通常の製造過程で、添加して用いることができる。１－ケストースの甘味度は３０で、その味質・物性・加工性はショ糖に近いことから、各種飲食物の製造過程において、砂糖の一部または全部を１－ケストースに置き換えるなどして、砂糖と同様に扱って各種の飲食品や食品添加物、動物飼料を製造することができる。
　以下、本発明について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。また、本実施例においては、所定の純度で特定のオリゴ糖を含有する組成物を、当該オリゴ糖の名称で記載する。
＜実施例１＞生体外でのフィーカリバクテリウム属細菌増殖作用の検討
　下記の組成の液体培地を無菌的に調製した。各種オリゴ糖としては、１－ケストース（純度９９質量％；物産フードサイエンス社）、ニストース（純度９８質量％；和光純薬社）、キシロオリゴ糖（純度９８質量％；物産フードサイエンス社）、ラフィノース（純度９８質量％；明治フードマテリア社）またはラクトスクロース（純度８９質量％；塩水港精糖社）を用いた。また、コントロールとして、下記の組成のうちオリゴ糖を含まない液体培地を同様に調製した。
《液体培地の組成／１Ｌあたり》（最終ｐＨ：ｐＨ７．０）
　カゼイン分解物１５．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、Ｌ－シスチン０．５ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、チオグリコール酸０．５ｇ、トリプトファン２５ｍｇ、ヘミン（Ｈｅｍｉｎ）適量、ビタミンＫ１適量、各種オリゴ糖５．０ｇ。
　コンフルエントまで前培養したフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー ＡＴＣＣ２７７６８株を、６６０ｎｍでの濁度が０．０５～０．０６のＯＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）値となるように、調製した液体培地に接種した。これを嫌気環境下にて３７℃で静置培養し、２４時間後、４８時間後および７２時間後に、分光光度計を用いて６６０ｎｍでの濁度（ＯＤ値）を測定した。その結果を表１に示す。また、ＯＤ値と培養時間との関係を図１の折れ線グラフに示す。また、培養時間７２時間のＯＤ値を図２の棒グラフに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１、図１および図２に示すように、ＯＤ値は、コントロールの液体培地では、０時間で０．０６２、２４時間で０．１７３、４８時間で０．１１３、７２時間で０．１６６であった。これに対して、１－ケストースを添加した液体培地では、０時間で０．０６３、２４時間で０．３４５、４８時間で０．８８５、７２時間で１．８０３であった。一方、ニストースを添加した液体培地では、０時間で０．０６３、２４時間で０．２９０、４８時間で０．４４３、７２時間で０．３０５であった。また、キシロオリゴ糖を添加した液体培地では、０時間で０．０６９、２４時間で０．２７１、４８時間で０．２３４、７２時間で０．２９４であった。また、ラフィノースを添加した液体培地では、０時間で０．０５２、２４時間で０．２５１、４８時間で０．１９１、７２時間で０．２４６であった。また、ラクトスクロースを添加した液体培地では、０時間で０．０５５、２４時間で０．２９８、４８時間で０．４４８、７２時間で０．２９５であった。
　すなわち、１－ケストースを添加した液体培地では、オリゴ糖を添加していない液体培地（コントロールの液体培地）ならびに他のオリゴ糖（ニストース、キシロオリゴ糖、ラフィノースおよびラクトスクロース）を添加した液体培地と比較して、２４時間、４８時間および７２時間のいずれの培養時間においてもＯＤ値が顕著に大きかった。
　培地の濁度（ＯＤ値）は微生物数の大小を反映する。従って、上記の結果から、２４時間、４８時間および７２時間のいずれの培養時間においても、１－ケストースを添加した液体培地におけるフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー ＡＴＣＣ２７７６８株の菌数は、オリゴ糖を添加していない液体培地ならびに他のオリゴ糖を添加した液体培地における菌数と比較して、顕著に大きいことが明らかになった。この結果から、１－ケストースは、生体外において、フィーカリバクテリウム属細菌を増殖させる作用が顕著に大きいことが明らかになった。
＜実施例２＞生体内でのフィーカリバクテリウム属細菌増殖作用の検討
　６か月～６歳の乳幼児５８名を２９名ずつ２つの群に分け、１－ケストース群およびマルトース群とした。１－ケストース群には１－ケストース（純度９８質量％以上；物産フードサイエンス社）を、マルトース群にはマルトース（純度９２質量％以上；「サンマルト－Ｓ」粉末品；三和澱粉工業社）を、試験期間中、毎日経口摂取させた。試験期間は１２週間とした。１－ケストースまたはマルトースの１日の摂取量は、１歳未満が１ｇ（目安摂取量；０．１２１ｇ／ｋｇ体重／日）、１?３歳が２ｇ（目安摂取量；０．１６９ｇ／ｋｇ体重／日）、４?６歳が３ｇ（目安摂取量；０．１７０ｇ／ｋｇ体重／日）とした。試験期間の開始時（０週）、６週間経過時（６週）および１２週間経過時（１２週）に糞便を回収した。
　なお、上記の目安摂取量は、「厚生労働省　平成２２年乳幼児身体発育調査」に掲載の年齢別体重データに基づいて算出した。すなわち、本実施例２の試験参加者の年齢（月齢）に該当する体重データの最小値と最大値とから、男女別に中央値を求め、中央値の平均値を算出した。続いて、中央値の平均値について、男女の平均値を算出し、これを目安体重とした。目安体重は、１歳未満が８．２６ｋｇ、１～３歳が１１．８５ｋｇ、４～６歳が１７．６２ｋｇであった。１－ケストースまたはマルトースの１日の摂取量を、この目安体重で除した値を目安摂取量とした。
　回収した糞便中のフィーカリバクテリウム属細菌の菌数を、リアルタイムＰＣＲ法により定量した。具体的には、まず、ゲノム抽出用試薬「Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｒｏｃｈｅ社）とを用いて、糞便からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、フィーカリバクテリウム属細菌に特異的なプライマー（配列は以下に示す）、リアルタイムＰＣＲ試薬「ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびリアルタイムＰＣＲ装置「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、糞便１ｇあたりのフィーカリバクテリウム属細菌の菌数（個）を定量した。検出範囲は１０５個／ｇ以上であり、検出範囲以下の検体に対しては、１０２．５個／ｇの数値を代入した。検量線は、純粋培養して顕微鏡下で計数したフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー ＡＴＣＣ２７７６８株から同様の方法にて抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、同条件でリアルタイムＰＣＲを行った結果を基に作製したものを用いた。
《フィーカリバクテリウム属細菌に特異的なプライマーの配列》
　フォワードプライマー；ＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴ（配列番号１）
　リバースプライマー；ＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴＴＧＧＴ（配列番号２）
　求めた菌数は、各群ごとに平均値を算出した。また、６週および１２週の菌数の平均値について、０週の菌数の平均値に対してウィルコクソンの符号順位検定により有意差検定を行い、ｐ値を求めた。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、１－ケストース群の菌数は、０週で３．７×１０６個／糞便１ｇであったのに対して、６週では１．４×１０７個／糞便１ｇ、１２週では３．５×１０７個／糞便１ｇであった。すなわち、０週と比較した菌数は、６週では、有意差は無いものの３．５倍以上に増加し、１２週では９倍以上に有意に増加した。
　一方、マルトース群の菌数は、０週で７．６×１０６個／糞便１ｇであったのに対して、６週では５．８×１０６個／糞便１ｇ、１２週では１．３×１０７個／糞便１ｇであった。すなわち、０週と比較した菌数は、６週ではわずかに減少し、１２週ではやや増加したものの、有意差は無かった。
　以上のとおり、フィーカリバクテリウム属細菌の菌数は、マルトース群では増加しなかったのに対して、１－ケストース群では顕著に増加したことが示された。この結果から、１－ケストースは、生体内において、フィーカリバクテリウム属細菌を増殖させる作用が顕著に大きいことが明らかになった。

Claims (9)

  1. 　１－ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
  2. 　腸内炎症の予防または治療に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
  3. 　腸内炎症が炎症性腸疾患である、請求項２に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
  4. 　炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項３に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
  5. 　１－ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖用食品組成物。
  6. 　ヒトまたは動物に１－ケストースを摂取させることにより前記ヒトまたは動物の腸内におけるフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の数を増加させる工程を有する、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の増殖方法。
  7. 　フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌を含む培地に１－ケストースを添加して培養する工程を有する、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の増殖方法。
  8. 　腸内炎症を罹患している、または、罹患する可能性があるヒトもしくは動物に、１－ケストースを摂取させることにより、前記ヒトもしくは動物の腸内におけるフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の数を増加させる工程を有する、腸内炎症の治療または予防方法。
  9. 　腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するための１－ケストースの使用。
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