WO2017141879A1

WO2017141879A1 - 膵リパーゼ阻害用組成物及び膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法

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Publication number: WO2017141879A1
Application number: PCT/JP2017/005182
Authority: WO
Inventors: 彩宮島; 青木　秀之; 佐藤　ふみ; 剛旨亀田
Original assignee: 池田食研株式会社
Priority date: 2016-02-17
Filing date: 2017-02-13
Publication date: 2017-08-24
Also published as: JP2019062741A

Abstract

天然物由来の新規な膵リパーゼ阻害用組成物、当該膵リパーゼ阻害用組成物を含む飲食品、医薬品、当該リパーゼ阻害用組成物の製造方法を提供するために、本発明の膵リパーゼ阻害用組成物は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を含む。

Description

膵リパーゼ阻害用組成物及び膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法

　本発明は膵リパーゼ阻害用組成物及び膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法に関する。

　生体内に摂取された脂肪は、膵臓が産生した膵リパーゼによって脂肪酸とグリセリンとに分解された後に腸管に吸収される。そのため、膵リパーゼ活性を阻害する物質は、脂肪の分解吸収を抑制する働きを有する。ゆえに、膵リパーゼ活性を阻害する物質は、上述の生活習慣病を予防、改善又は治療するために有効である。膵リパーゼ活性を阻害する物質を有効成分とする抗肥満治療剤として、「オブリーン（登録商標）」錠が知られている（非特許文献１）。

　また、膵リパーゼ阻害用組成物として、非特許文献２には、大豆由来酵素蛋白が、特許文献１には、大豆由来ペプチドが、特許文献２及び特許文献３には、味噌のバッファー抽出物が、特許文献４には、大豆油不けん化物が、それぞれ記載されている。

日本国公表特許公報「特表２００２－５３５２８８号公報（２００２年１０月２２日公表）」日本国公開特許公報「特開２００６－６９９４９号公報（２００６年３月１６日公開）」日本国公開特許公報「特開２００６－７００１５号公報（２００６年３月１６日公開）」日本国公開特許公報「特開２００７－１６１６０２号公報（２００７年３月２８日公開）」

「オブリーン錠（登録商標）１２０ｍｇ」（武田薬品工業株式会社）　添付文書、２０１３年９月、第１版、１～３ページ K Satouchi at al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 66 (10), 2154-2160, 2002

　上述の健康問題を解決すべく、新規な膵リパーゼ阻害用組成物を提供することは有用である。特に、天然物由来の新規な膵リパーゼ阻害用組成物を提供することは有用である。

　本発明の主たる目的は、天然物由来の新規な膵リパーゼ阻害用組成物及び当該膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法を提供することにある。

　従来技術において、非特許文献２、特許文献１～４に記載の膵リパーゼ阻害用組成物は何れも大豆由来であるが、非特許文献２及び特許文献１～３に記載の物質は親水性物質であり、特許文献４に記載の物質は不けん化物である。これまで、大豆由来のけん化性脂質において、膵リパーゼを阻害する活性は確認されていない。

　本発明者らは、鋭意検討の結果、驚くべきことに、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ（以下、「Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ」のように略記する）及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物に含まれるけん化性脂質が、膵リパーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させた。

　すなわち、上記の課題を解決するために、本発明は以下の何れかの一態様を包含する。

　本発明の一態様に係る膵リパーゼ阻害用組成物は、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を含む。

　本発明の別の態様に係る膵リパーゼ阻害用組成物は、パルミチン酸及びステアリン酸のうちの少なくとも１種類を含む。

　本発明の一態様に係る膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法は、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を含む、膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法である。

　本発明によれば、天然物由来の新規な膵リパーゼ阻害用組成物及び当該膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法を提供することができる。

本発明の実施例に係る膵リパーゼ阻害用組成物による膵リパーゼ阻害効果を示す図である。本発明の実施例に係る各種リパーゼに対する各種遊離脂肪酸の阻害効果を示す図である。

　以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。

　〔１．膵リパーゼ阻害用組成物〕
　本発明の一実施形態に係る膵リパーゼ阻害用組成物は、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を含んでいる。

　［膵リパーゼ］
　本明細書において、膵リパーゼは、動物の膵臓で生産及び分泌されるリパーゼを指す。また、本発明において、その活性を阻害する対象となる膵リパーゼには、あらゆる動物由来の膵リパーゼが包含されるが、好ましくは哺乳類の膵リパーセであり、特にヒトの膵リパーゼが好ましい。

　本発明に係る膵リパーゼ阻害用組成物は、膵リパーゼの有する中性脂肪を分解する活性を阻害するものである。

　［大豆発酵物］
　本発明に係る膵リパーゼ阻害用組成物の有効成分は、大豆発酵物中に含まれるものである。大豆発酵物について以下に説明する。本実施形態に係る大豆発酵物は、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物である。換言すれば、本実施形態に係る大豆発酵物は、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類を用いて大豆を発酵させることによって得られたものであり得る。

　本実施形態に係る大豆発酵物の材料及び製造の方法及び条件等について、以下に詳細に記載する。

　（菌類）
　本実施形態において用いられる大豆を発酵させる菌類は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属の菌類を含む。本実施形態の菌には、インドネシアの伝統的な大豆発酵食品として知られる「テンペ」の製造に用いられる任意の菌が含まれる。

　本実施形態で大豆の発酵に用いられるのは、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類である。好ましくは、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ　ｖａｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ　ｖａｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ　ｖａｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ　ｖａｒ．ｌｙｏｃｏｃｃｕｓのうちの少なくとも１種類を含む菌類である。なお、菌の原産地は特に限定されない。上記の菌の他に、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ及びＲ．ｄｅｌｍａｒ等のＲｈｉｚｏｐｕｓ属の菌類、市販のテンペに含まれる菌類及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ等の他の属の菌を含んでいてもよい。

　また、大豆の発酵に用いるのは上述の菌の２種類以上の混合であってもよい。上述の菌を含む菌類を大豆に添加することにより、大豆を発酵させる。添加される菌の形態としては、栄養菌糸若しくは胞子、又はこれらの混合物等であればよく、特に限定されないが、保存の容易性及び菌の性状の安定性の観点からは、胞子形態の菌を用いることが好ましい。

　ここで、菌を複数種類の異なる菌の組み合わせにおいて用いる場合、大豆に添加する菌の胞子全体の個数あたりのＲ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓの胞子の個数の割合が、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％の割合である。又は、大豆に添加する菌の胞子全体の個数あたりのＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒの胞子の個数の割合が、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％である。

　Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓとＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒとの混合である場合は、例えば大豆に添加するＲｈｉｚｏｐｕｓ属の菌の胞子全体の個数としてのＲ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒの割合としては、それぞれの菌を等量ずつ含んでいてもよい。

　上述の割合の菌を大豆に添加することによって、得られる大豆発酵物には、本発明の膵リパーゼ阻害用組成物に用いるのに十分な量の有効成分を含有する。

　（大豆）
　本実施形態において用いられる大豆の形態としては、丸大豆であっても加工大豆であってもよく、大豆胚軸等を用いてもよい。

　（大豆の発酵条件）
　一実施形態において、大豆の発酵は、蒸煮した大豆に上述した菌類を植菌し、固体培養することによって行われる。以下に発酵における各工程及び条件について記載する。

　（大豆の前処理及び蒸煮）
　大豆は、蒸煮前に液体に浸漬したものを用いることが好ましい。また、浸漬するための好ましい液体としては、水又は食用の有機酸及びこれらの有機酸を含む食品を含む水溶液（食酢及び醸造酢等）等が挙げられる。中でも食用の有機酸としては、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸及びフマル酸から選択される少なくとも一つの有機酸であることが好ましい。また、有機酸水溶液中の有機酸の濃度は、特に限定されないが、大豆に添加する菌の生育を阻害しない程度であることが好ましく、例えば、０．１～０．５％（ｗ/ｗ）程度が好ましい。また、大豆は、液体への浸漬前、浸漬後又は蒸煮後に脱皮するのが好ましく、植菌時に大豆の外皮が残存しないことがより好ましい。蒸煮の温度及び蒸煮時間は、特に限定されないが、例えば大豆の浸漬後、５～９０分間程度水煮蒸煮、又は１０５～１２０℃で２～３０分間程度圧力蒸煮することが好ましい。蒸煮後に大豆を冷却し、前記菌を植菌する。

　＜菌の植菌及び培養＞
　蒸煮大豆への植菌には、好ましくは胞子懸濁液又は胞子粉末等を用い、蒸煮大豆１００ｇ（湿重量）に対して好ましくは１×１０^３～１×１０^９個、より好ましくは１×１０^４～１×１０^８個の胞子を添加する。

　ここで、複数の菌種を用いる場合、胞子はあらかじめ混合したものであってもよく、菌の種類ごとに別個に蒸煮大豆に添加してもよい。

　＜培養条件＞
　植菌後、蒸煮大豆と菌とを混合し、例えば、一つ以上穴をあけたポリ袋に充填又はステンレストレーに静置する等して、通常の方法で菌を固体培養する。好ましくは菌を酸素存在下で好気的に培養する。

　培養条件として、培養温度は、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３７℃、さらに好ましくは２８～３４℃である。培養時間は、温度及び植菌量等により異なるが、好ましくは１０～６０時間、より好ましくは１５～５０時間、さらに好ましくは２０～４０時間である。以上のような条件で菌を培養することにより、大豆発酵物中のけん化性脂質含量を増加させることができる。

　上述の条件で、発酵を行うことにより本発明の大豆発酵物を得ることができる。また、上述の条件で大豆を発酵させて得られる大豆発酵物は、本発明の膵リパーゼ用組成物における膵リパーゼ阻害活性の有効成分を高い濃度で含有するものである。

　得られた大豆発酵物は、凍結保存しておくことも可能である。また、大豆発酵物は、乾燥させてもよく、エアードライ、スプレードライ、真空乾燥、凍結乾燥又はこれらの方法の組み合わせの方法によって乾燥すればよい。さらに、大豆発酵物を、凍結乾燥等によって乾燥後、細切又は粉砕等して以降に記載する抽出に供してもよい。さらに、抽出前に、任意の方法で脱色及び／又は脱臭処理を行ってもよい。大豆発酵物を乾燥させることにより、乾燥品を粉砕することによって粉末化することが容易となり、また、乾燥工程以降の工程として抽出工程を行う場合は抽出操作が容易となる。脱色工程又は脱臭工程等を行うことによって得られた組成物は、汎用度が高く、上述の飲食品用及び医薬品用等の種々の用途に好適に用いることができる。

　（大豆発酵物の成分）
　上述の材料及び条件にて得られた大豆発酵物は、脂質を含んでおり、該脂質は、けん化性脂質と不けん化性脂質とに分類される。大豆発酵物からは、大豆発酵物中に含まれる脂質をその他の成分から分離し、抽出することができる。さらに、大豆発酵物中に含まれる脂質は、後述するとおり、公知の方法を用いてけん化性脂質と不けん化性脂質とに分離することができる。「けん化性脂質」とは、脂質をアルカリ処理した際に、加水分解され、脂肪酸塩を生じる脂質を指す。

　［本発明の膵リパーゼ阻害用組成物の有効成分］
　続いて、本発明に係る膵リパーゼ阻害用組成物の有効成分について、以下に記載する。

　上述の本発明に係る大豆発酵物にはけん化性脂質が含まれており、けん化性脂質の中には遊離脂肪酸が含まれている。さらに遊離脂肪酸としては遊離の飽和脂肪酸が含まれている。本発明に係る膵リパーゼ阻害用組成物の有効成分は、本発明に係る大豆発酵物に含まれるけん化性脂質であり、当該けん化性脂質は、より好ましくは、遊離飽和脂肪酸を含んでいる。

　ある実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物は、（１）上記の大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を全て含有している、又は（２）上記の大豆発酵物に含まれるけん化性脂質中の、（２－ａ）遊離脂肪酸全てを含んでいる、（２－ｂ）少なくとも１種類の遊離脂肪酸を含んでおり、当該少なくとも１種類の遊離脂肪酸中に、遊離飽和脂肪酸を含有している、（２－ｃ）遊離脂肪酸に含まれる２種類以上の遊離飽和脂肪酸を含んでいる、（２－ｄ）遊離脂肪酸に含まれる全ての種類の遊離飽和脂肪酸を含んでいる、（２－ｅ）遊離脂肪酸のうちの、少なくとも１種類の遊離飽和脂肪酸として炭素数１６以上の飽和脂肪酸のうちから選択されるものを含有している、若しくは（２－ｆ）遊離脂肪酸のうちの、パルミチン酸及びステアリン酸のうちの少なくとも１種類を含有しているものが、好ましい。

　（けん化性脂質の抽出方法）
　大豆発酵物中の脂質からのけん化性脂質の抽出は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、大豆発酵物を好適な極性有機溶媒に懸濁させ、その後上清と沈殿とに分離することによって、上清の該有機溶液中にけん化性脂質を可溶化させることにより大豆発酵物中の脂質からけん化性脂質を抽出できる。

　けん化性脂質を大豆発酵物から抽出するための、極性有機溶媒は、該極性有機溶媒中でけん化性脂質が可溶化するものであれば特に限定されない。さらに、抽出は極性有機溶媒を水に分散してなる有機溶媒水溶液を用いることもできるが、その場合、用いる有機溶媒水溶液中の有機溶媒濃度は、有機溶媒水溶液全量容積あたり、少なくとも７０％（ｖ／ｖ）が好ましく、少なくとも７５％（ｖ／ｖ）がより好ましく、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）がさらに好ましく、少なくとも８５％（ｖ／ｖ）がさらにより好ましく、少なくとも９０％（ｖ／ｖ）が特に好ましく、少なくとも９５％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。該有機溶媒又は有機溶媒水溶液は、１種類の液を単独で使用しても良く、２種以上の液を混合して使用してもよい。

　一例として、大豆発酵物乾燥粉末にエタノールを適量添加して撹拌後、静置して上清と沈殿とに分離させ、上清を回収する。上清回収後に残った沈殿にエタノールをさらに添加して同様の操作で上清を回収する。この操作をさらに繰り返し、回収した全ての上清を一つに合わせて混合したものを脂質抽出液とする。なお、以降、脂質抽出液は抽出油とも記載する。

　脂質をけん化性脂質と不けん化性脂質とに分離及び抽出する方法は、ソックスレー抽出及びアルカリ脱炭酸法等の公知の方法を組み合わせることによって行う方法であってもよい。

　なお、いずれの抽出方法を用いた場合においても、一連の抽出操作は、２回以上繰り返し行ってもよく、繰り返し行われる各回の一連の抽出操作において、用いる溶媒は全ての抽出操作において同一の溶媒を用いてもよく、一連の抽出操作毎に異なる溶媒を使用してもよい。繰り返しの抽出操作を行うことによって、抽出前の大豆発酵物中に含まれる有効成分を無駄にすることなく効率よく得られ、生産性が高まる。また、上述したけん化性脂質の分離のための各種有機溶媒の全容積と大豆発酵物の容積の比は、適宜変更することができるが、大豆発酵組成物とけん化性脂質抽出用の溶媒との比率は、該大豆発酵組成物１重量部に対して有機溶媒１～１，０００重量部が好ましく、２～５００重量部がより好ましく、５～１００重量部がさらに好ましい。抽出温度は、室温から常圧下での溶剤沸点の範囲が好ましい。また、得られた抽出液をフィルター等を用いてろ過すること等によって精製してもよい。フィルターは、例えば孔径０．４５μｍフィルターを用いる。精製工程を行うことによって、不要な不純物又は抽出操作によって生じた残渣等を除去することができる。

　けん化性脂質はさらに、遊離脂肪酸とその他の成分とに分類される。一実施形態において、大豆発酵物は、大豆発酵物乾燥品あたりの遊離脂肪酸含量が、少なくとも４．５％（ｗ／ｗ）であり、好ましくは少なくとも５．０％（ｗ／ｗ）であり、より好ましくは少なくとも５．５％（ｗ／ｗ）であり、さらに好ましくは少なくとも６．０％（ｗ／ｗ）である。本実施形態において、遊離脂肪酸は、例えば１０～２４個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸である。かかる濃度で遊離脂肪酸を含有する大豆発酵物は、膵リパーゼ阻害活性有効成分を含有する。

　一実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物は、上述の含量にて遊離脂肪酸を含有する大豆発酵物に含まれている、上記遊離飽和脂肪酸を含んでいるものである。

　一実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物は、上記遊離脂肪酸を、上記膵リパーゼ阻害用組成物の総重量あたり、少なくとも４．５％（ｗ／ｗ）にて含有していることが好ましく、少なくとも５．０％（ｗ／ｗ）にて含有していることがより好ましく、少なくとも５．５％（ｗ／ｗ）にて含有していることがさらに好ましく、少なくとも６．０％（ｗ／ｗ）にて含有していることが特に好ましい。

　また、遊離脂肪酸は、さらに、遊離飽和脂肪酸と遊離不飽和脂肪酸とに分類される。

　本実施形態に係る大豆発酵物は、少なくとも発酵前の大豆に含まれる遊離脂肪酸を含んでいるものが好ましい。例えば、上述の大豆中に含まれる遊離脂肪酸に加え、少なくとも１種類の遊離脂肪酸をさらに含んでいるものである。

　（遊離飽和脂肪酸の分離及び抽出）
　上述の方法で得られたけん化性脂質中の遊離脂肪酸から、遊離飽和脂肪酸のみをさらに分離及び抽出してもよい。例えば、結晶化による分離抽出及びカラム分離法等の方法が挙げられる。

　（遊離飽和脂肪酸含量）
　本実施形態に係る大豆発酵物は、上述の少なくとも１種類の遊離飽和脂肪酸を、上記大豆発酵物の乾燥重量あたり、少なくとも０．７５％（ｗ／ｗ）にて含有しているものが好ましい。また、大豆発酵物は、上述の少なくとも１種類の遊離飽和脂肪酸を、上記大豆発酵物の乾燥重量あたり、好ましくは少なくとも０．８０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも０．８５％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは少なくとも０．９０％（ｗ／ｗ）、特に好ましくは少なくとも０．９５％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは少なくとも１．０％（ｗ／ｗ）にて含有している。かかる濃度で遊離飽和脂肪酸を含有する大豆発酵物は、膵リパーゼ阻害活性有効成分を含有する。

　一実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物は、上述の含量にて遊離飽和脂肪酸を含有する大豆発酵物に含まれている、遊離飽和脂肪酸を含んでいるものである。

　一実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物は、上記少なくとも１種類の遊離飽和脂肪酸を、上記膵リパーゼ阻害用組成物の総重量あたり、少なくとも０．７５％（ｗ／ｗ）にて含有していることが好ましく、少なくとも０．８０％（ｗ／ｗ）にて含有していることがより好ましく、少なくとも０．８５％（ｗ／ｗ）にて含有していることがさらに好ましく、少なくとも０．９０％（ｗ／ｗ）にて含有していることがさらにより好ましく、少なくとも０．９５％（ｗ／ｗ）にて含有していることが特に好ましく、少なくとも１．０％（ｗ／ｗ）にて含有していることが最も好ましい。

　［有効成分の活性評価］
　（酸価（Ａｃｉｄ　Ｖａｌｕｅ：ＡＶ））
　酸価は、油脂の加熱による変性等の劣化の程度の指標として用いられる値の１つであり、油脂１ｇを中和するのに要する水酸化カリウムのｍｇ数として定義される。本実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物中に含まれる有効成分の膵リパーゼ阻害活性を評価する値の１つとして用いられ得る。また、ＡＶ値は、組成物自体を用いて測定してもよく、大豆発酵物から抽出した抽出油としての遊離脂肪酸に対するＡＶ値を測定してもよい。

　例えば、大豆発酵物乾燥品から抽出した抽出油中の酸価（ＡＶ）は、好ましくは少なくとも５０であり、より好ましくは少なくとも６０であり、さらに好ましくは少なくとも６５であり、特に好ましくは少なくとも７０である。酸価が少なくとも５０であれば、膵リパーゼ阻害用組成物中の有効成分のリパーゼ阻害活性が高いものと思われる。

　また、有効成分としての油脂の有効性の指標並びに評価法としては、ＡＶの他に、公知の定量的分析の手法が挙げられる。組成物中の有効成分の評価としては、上述の評価試験を２つ以上組み合わせてもよい。また、有効成分を組成物から抽出油として抽出せずに評価する方法を用いることも可能である。

　［膵リパーゼ阻害用組成物の形態］
　ある実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物は、膵リパーゼ阻害用調合物又は膵リパーゼ阻害用製剤であってもよい。

　一実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物は、上述した通り、大豆発酵物含有成分を有効成分としており、一実施形態における膵リパーゼ阻害用組成物は、大豆発酵物そのものであっても、大豆発酵物中の全成分を含有するものであっても、大豆発酵物の乾燥物そのものであっても、又は大豆発酵物の乾燥物中の全成分を含有するものであってもよい。別の実施形態における膵リパーゼ阻害用組成物は、大豆発酵物から上述の方法で抽出されたけん化性脂質を含むものである。さらに別の実施形態における膵リパーゼ阻害用組成物は、大豆発酵物から、上述の方法で抽出されたけん化性脂質中の遊離脂肪酸のうちの少なくとも一種類の遊離飽和脂肪酸を含むものである。

　また、上述の大豆発酵物からの抽出物は、さらにエアードライ、スプレードライ、真空乾燥、凍結乾燥等により得られる、エキス乾燥品として利用してもよい。

　本発明の膵リパーゼ阻害用組成物はその有効成分が天然由来であり、かつ、製造が容易であるため、膵リパーゼ活性の阻害の有効成分として種々の用途に用いることが可能である。例えば飲食品として飲食品組成物とすること及び医薬品として医薬品組成物とすることのみならず、試験研究用及びペットフード等に使用できる。本発明のリパーゼ阻害用組成物は、生体内において、膵液又は腸液中に存在するリパーゼの活性を阻害するのに有用である。

　［膵リパーゼ阻害用組成物のその他の成分］
　大豆又は大豆発酵物にはさらに、タンパク質、食物繊維、アミノ酸、ビタミン類（例えば、ビタミンＥ及びＢ群ビタミン）、鉄等のミネラル類、レシチン、サポニン、イソフラボン類等が豊富に含まれており、栄養価に富み、各種機能性成分を含む。したがって、一実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物は、膵リパーゼ阻害活性を有する成分のみならず、大豆又は大豆発酵物由来の各種機能性成分の少なくとも１つを有している。そのため、膵リパーゼ阻害用組成物は、膵リパーゼ阻害効果だけではなく、大豆又は大豆発酵物に含まれる公知又は新規の、１つ以上の成分による健康増進効果を併せ持つものであり得る。

　（飲食品組成物である場合のその他の成分）
　膵リパーゼ阻害用組成物が飲食品組成物である場合のその他の成分としては、リパーゼ阻害用組成物のリパーゼ阻害効果を損なわない限り、任意の所望の添加剤であればよい。例えば、ｐＨ調整剤、有機酸、糖アルコール、甘味料、香料、ビタミン類、骨代謝ビタミン類、抗酸化剤、賦形剤、可溶化剤、結合剤、滑沢剤、懸濁剤、湿潤剤、皮膜形成物質、矯味剤、矯臭剤、着色料、保存剤、抗菌剤、殺菌剤、抗炎症剤等の組成物において通常用いられている添加剤が挙げられる。

　（飲食品組成物である場合の形態）
　飲食品組成物である場合の形態は、特に限定されず、例えば、製剤形態、加工食品及び各種飲料とすることができる。製剤形態としては、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が挙げられる。なお、特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）は、その包装容器等に、日本国厚生労働省が承認又は認可した機能表示又は保健用途の表示をすることが可能な食品である。本発明の「飲食品組成物」を、製剤形態とする場合は医薬品に準じた構成にすることができる。すなわち、膵リパーゼ阻害用飲食品組成物中の膵リパーゼ阻害有効成分の含有量を医薬品に準じた含有量とし、剤形を医薬品に準じた、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、粉剤等の剤形とすることができる。

　本発明に係る飲食品組成物は、生体に経口摂取させることによって、当該生体内においてリパーゼ活性を阻害する。したがって、当該飲食品組成物は、経口摂取が容易な形態であることが好ましい。例えば、茶、コーヒー、紅茶、豆乳等の公知の飲料、粉末ジュース、チューインガム、ビスケット、キャンディ、グミキャンディ等の菓子、又はトローチ、タブレット、カプセル、打錠、顆粒等の製剤化された形態が挙げられる。

　一実施形態において、上述した公知の各種飲食品に添加することにより、飲食品組成物を製造することができる。

　（医薬品組成物である場合のその他の成分）
　本発明の医薬品組成物は、製剤用の材料として公知の、各種の所望の物質を含んでいてもよい。水、緩衝液、これらの２種類以上の溶媒の混合物等の好適な溶媒、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、補助剤、防腐剤、着色剤、天然色素、甘味剤等の製剤添加物等から選択される少なくとも一つの物質をさらに含んでいる。

　（医薬品組成物である場合の剤型）
　本発明の医薬品組成物の剤形は特に限定されず、水性の溶媒に本発明に係る膵リパーゼ阻害用組成物を分散、懸濁若しくは溶解して含有させた液体製剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセル及びマイクロカプセル）等の固体製剤、又は軟膏、ローション、クリーム、ゲル、懸濁剤、乳剤等の半固体製剤若しくは半液体製剤とすることができる。これらの剤形は、当業者に公知の方法に基づき、容易に製造することができる。以上の医薬品組成物は、製剤技術分野における慣用の方法を用いて製造することができる。

　医薬品組成物の投与経路、投与方法及び投与量については、それぞれ、治療目的、投与の対象となる生体の年齢、体重、性別、目的とする膵リパーゼ阻害効果の程度等によって適宜選択可能である。また、医薬品組成物の投与期間についても、目的とする膵リパーゼ阻害効果が得られるように適宜選択することができる。

　（使用対象）
　本発明に係る飲食品組成物又は医薬品組成物の使用対象となる被験体としては、あらゆる動物が挙げられ、哺乳類及び鳥類等の脊椎動物が好ましく、哺乳類であることがより好ましい。さらに、哺乳類の前記被験体はヒトであることが好ましいが、家畜、実験動物又はペット動物が被験体となる場合もあり得る。具体的にはニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の家畜類、ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギ、モルモット等のペット動物、又はマウス、サル、魚類、鳥類等が挙げられる。

　本実施形態の膵リパーゼ阻害用組成物は、顕著な膵リパーゼ阻害活性を有するので、これを飲食品組成物として摂取するか、医薬品組成物として被験体に投与すれば、被験体の体内で脂肪の分解を抑制することにより脂質類の体内吸収を低減させて体重増加を防止したり、血中脂質の代謝改善を促したりすることができる。よって、飲食品組成物として用いれば、当該飲食品組成物を摂取した被験体のリパーゼの関連する疾病、疾患又は障害を、予防又は改善することができる。また、医薬品組成物として用いれば、例えば、生体においてリパーゼに関連する疾病、疾患又は障害を有する患者の治療に有用である。また、本発明の医薬品組成物は、リパーゼに関連する疾病、疾患又は障害に罹患する危険性が高くなっている被験体を、治療的又は予防的に処置するために用いることができる。

　ここで、リパーゼに関連する疾病、疾患又は障害としては、肥満、高脂血症、脂質異常症、心肥大、虚血性心疾患、生活習慣病等が挙げられる。生活習慣病としては、動脈硬化、糖尿病、高血圧症、高コレステロール血症等が挙げられる。

　本発明の膵リパーゼ阻害用組成物は、リパーゼ阻害の有効成分が天然由来であって、安全性が高いため、長期間にわたる服用に好適に用いられる。よって、本発明に係る膵リパーゼ阻害用組成物を、健康飲食品組成物又は医薬品組成物として生体に長期的に摂取させておいてもよい。

　〔２．膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法〕
　本発明はさらに、膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法であって、当該膵リパーゼ阻害用組成物がＲ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を含む、膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法を提供する。

　一実施形態において、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類を用いて大豆を発酵させることにより大豆発酵物を製造する工程（大豆発酵物生成工程）、及び上記大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を含む、上記乾燥工程において得られた粉末を他の成分と混合すること等によって、膵リパーゼ阻害用組成物を調製する工程（膵リパーゼ阻害用組成物調製工程）を包含する。

　ある実施形態において、上記の大豆発酵物からけん化性脂質を抽出する工程（けん化性脂質抽出工程）をさらに包含していてもよい。

　さらに別の実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法は、上記のけん化性脂質抽出工程に加え、遊離脂肪酸を分離抽出する工程をさらに含んでいてもよい。

　また、さらに別の実施形態において、膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法は、上述の大豆発酵工程で得られた大豆発酵物、又はけん化性脂質抽出工程で得られた大豆発酵物からのけん化性脂質抽出物を、乾燥させる工程（乾燥工程）をさらに包含していてもよい。また、けん化性脂質の抽出のあと、遊離飽和脂肪酸の分離及び抽出する工程をさらに行ってもよい。遊離飽和脂肪酸の分離及び抽出を行うことによって、他の成分を含まない、より精製度の高い有効成分を得ることができる。さらに、抽出工程後、得られた抽出液をフィルター等を用いてろ過すること等によって精製する精製工程を行ってもよい。

　本発明に係る膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法によれば、膵リパーゼ阻害効果の高い有効成分を含む、種々の広範な用途に使用可能な組成物が製造可能である。

　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

　〔実施例１：菌種Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及び培養温度２５℃の条件における大豆発酵物乾燥粉末の調製〕
　脱皮大豆１００ｇを、３％醸造酢溶液５００ｇ中に、常温で一晩浸漬し、浸漬大豆１６０ｇを得た。得られた浸漬大豆を、圧力鍋を用いて、水道水３２０ｇ中で、１００℃で１０分間蒸煮し、蒸煮大豆２００ｇを得た。得られた蒸煮大豆２００ｇを蒸煮後室温まで冷却した。Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ　ＮＢＲＣ３２００２の胞子が３．０×１０^６個含まれた胞子懸濁液を、得られた蒸煮大豆のうちの１００ｇに添加し、混合した。続いて、胞子懸濁液が添加された蒸煮大豆を、表面に複数の穴を空けたポリ袋に、ポリ袋の底からの高さが１．５ｃｍ程度になるまで充填し、２５℃で４０時間培養した。得られた大豆発酵物を凍結乾燥した後、粉砕し、大豆発酵物乾燥粉末を得た。

　〔実施例２～９：各菌種及び各培養温度条件における大豆発酵物乾燥粉末の調製〕
　実施例２～９として、菌種及び各培養温度条件を変え、それ以外は実施例１と同様に処理して、大豆発酵物乾燥粉末を得た。なお、いずれの実施例又は比較例においても、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓの菌としては、ＮＢＲＣ３２００２を、Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒの菌としては、ＮＢＲＣ３０８１６を、Ｒ．ｏｒｙｚａｅの菌としては、ＮＢＲＣ４７１６をそれぞれ用いた。

　実施例１～９、比較例１及び２における用いた菌種及び条件を以下の表にまとめた。

　〔実施例１０：実施例１～９の大豆発酵物乾燥粉末からの抽出液の調製〕
　実施例１で得られた大豆発酵物乾燥粉末０．５ｇにエタノールを適量添加して撹拌後、静置して上清と沈殿とに分離させ、上清を回収した。上清回収後に残った沈殿にエタノールをさらに添加して同様の操作で上清を回収した。この操作をさらに繰り返し、回収した全ての上清を一つに合わせて混合したものを抽出液とした。なお、エタノールは３回の抽出操作における総添加量が２５ｍＬを超えない量とした。次に、抽出液をエタノールで２５ｍＬにメスアップし、孔径０．４５μｍフィルターを透過させた溶液を、実施品１とした。

　実施例２～９の大豆発酵物乾燥粉末についても同様に抽出し、実施品２～９とした。

　上述の実施品１の抽出液の調製の操作においてエタノールの代わりに水で希釈した７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液を用い、同様の操作を行い、得られた溶液を実施品１０とした。さらに実施例４における菌種Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ及び培養温度２５℃の条件における大豆発酵物乾燥粉末についても同様に抽出し、実施品１１とした。

　〔比較例１：蒸煮大豆のみ（菌なし、未発酵）乾燥粉末の調製及びその大豆乾燥粉末からの抽出液の調製〕
　実施例１記載の蒸煮で得られた蒸煮大豆を凍結乾燥した後、粉砕し、蒸煮大豆乾燥粉末を得た。次に、実施例１０における実施例１で得られた大豆発酵物乾燥粉末０．５ｇの代わりに、蒸煮大豆乾燥粉末０．５ｇを用いる以外は、実施例１０と同様の操作によって、得られた溶液を、比較品１とした。

　また、上述の比較品１の抽出液の調製の操作においてエタノールの代わりに、水で希釈した７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液又は水を用いて同様の操作を行い、得られた溶液をそれぞれ比較品２又は比較品３とした。

　〔比較例２：菌種Ｒ．ｏｒｙｚａｅ及び培養温度２５℃の条件における大豆発酵物乾燥粉末の調製及びその大豆乾燥粉末からの抽出液の調製〕
　表１に記載の条件を用いた以外は実施例１と同様に処理して、大豆発酵物乾燥粉末を得た。次に、実施例１０における、実施例１で得られた大豆発酵物乾燥粉末０．５ｇの代わりに、本比較例２の大豆発酵物乾燥粉末０．５ｇを用いる以外は、実施例１０と同様の操作によって得られた溶液を、比較品４とした。

　〔比較例３：実施例１及び実施例４の大豆発酵物乾燥粉末からの水を用いた抽出液の調製〕
　上述の実施例１０における、実施品１及び４の抽出液の調製の操作においてエタノールの代わりに水を用い、同様の操作を行い、得られた溶液をそれぞれ比較品５及び６とした。

　〔比較例４：豆味噌乾燥粉末の調製及びその豆味噌乾燥粉末からの抽出液の調製〕
　市販の豆味噌を凍結乾燥した後、粉砕し、豆味噌乾燥粉末を得た。該粉末０．５ｇに、エタノールを適量添加して撹拌後、上清を回収し、さらに沈殿にエタノールを添加して同様に２回抽出した。全抽出液を混合後、エタノールで２５ｍＬにメスアップし、０．４５μｍフィルターパスしたものを、比較品７とした。なお、豆味噌は、麹菌による大豆発酵組成物である。

　豆味噌乾燥粉末０．５ｇに、水を適量添加して撹拌後、上清を回収し、さらに沈殿に水溶液を添加して同様に２回抽出した。全抽出液を混合後、水で２５ｍＬにメスアップし、０．４５μｍフィルターパスしたものを、比較品８とした。

　豆味噌乾燥粉末０．５ｇに、４０ｍＭ　ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー（ｐＨ７．４）を適量添加して撹拌後、上清を回収し、さらに沈殿に該バッファーを添加して同様に２回抽出した。全抽出液を混合後、該バッファーで２５ｍＬにメスアップし、０．４５μｍフィルターパスしたものを、比較品９とした。

　以上で得られたサンプル品のうち、実施例２、実施例５、比較例１及び比較例２における各大豆発酵物乾燥粉末中の脂質含量％（ｗ／ｗ）、遊離脂肪酸含量％（ｗ／ｗ）及び遊離飽和脂肪酸含量％（ｗ／ｗ）、並びに該サンプルから抽出した抽出油の酸価（ＡＶ）を測定し、表２にまとめた。なお、含量は全て大豆発酵物乾燥品の総重量あたりの％（ｗ／ｗ）を示している。

　〔実施例１１：実施品及び比較品の生成物のリパーゼ阻害効果の評価試験１〕
　上述の実施品１～１１及び比較品１～９についてリパーゼ阻害効果を測定した。

　（試験試薬及び試験サンプル）
　「リパーゼキットＳ」（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を使用した。尚、リパーゼとしては、ブタ膵リパーゼ（シグマアルドリッチジャパン社製、ＴｙｐｅＩＩ）を１２５ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍＬに調製したものを膵リパーゼ溶液として使用した。該酵素濃度は、リパーゼキットＳで活性測定した結果、１６５ＩＵ／Ｌであった。サンプルとしては、実施品１～１１及び比較品１～９の各サンプルを使用した。また、基質液はキットに添付のものを使用した。

　（試験方法）
　試験については、上記キットの添付文書に準じた手順にて行った。

　まず、試験管２本に、発色液１ｍＬ、膵リパーゼ溶液３０μＬ、エステラーゼ阻害液２０μＬ及びサンプル５０μＬを各々入れて混和した。試験管の内１本は検体用とし、もう１本はブランク用とした。混和後、各試験管を３０℃で５分間予熱した。予熱後、検体用試験管にのみ基質液１００μＬを加え、混和後、２本共、３０℃で３０分間インキュベートした。次に反応停止液２ｍＬを各試験管に添加し、混和した。続いてブランク用試験管にのみ基質液１００μＬを加え、混和した。各試験管中の溶液の吸光度を波長４１２ｎｍで測定した。なお、サンプルの代わりに、エタノールを使用した測定値をコントロール１、７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液を使用した測定値をコントロール２、水を使用した測定値をコントロール３、４０ｍＭ　ＭｃＩｌｖａｉｎｅバッファー（ｐＨ７．４）を使用した測定値をコントロール４とした。

　（リパーゼ阻害率（％）の算出方法）
　各実施品及び比較品サンプルについて、各検体の測定値（Ｓ）から各検体に対応する検体用の各ブランクの測定値（Ｓｂ）を引き算し、差分（Ｓ－Ｓｂ）を算出した。各コントロールについて、各コントロールの測定値（Ｃ）から各ブランク（Ｃｂ）の測定値を引き算し、差分（Ｃ－Ｃｂ）を算出した。得られた値を用いて、以下の式によって、リパーゼ阻害率（％）を算出した。なお、実施品１～９、比較品１、４及び７についてはコントロール１の値（Ｃ１－Ｃｂ１）を使用し、実施品１０、１１及び比較品２についてはコントロール２の値（Ｃ２－Ｃｂ２）を使用し、比較品３、５、６及び８についてはコントロール３（Ｃ３－Ｃｂ３）の値を使用し、比較品９については、コントロール４（Ｃ４－Ｃｂ４）の値を使用した。
リパーゼ阻害率（％）＝（１－（Ｓ－Ｓｂ／Ｃ－Ｃｂ））×１００
ここで、Ｓ：各検体の測定値、Ｓｂ：各ブランクの測定値（Ｃ）；各コントロールの測定値Ｃｂ：各コントロールのブランクの測定値
　（結果）
　膵リパーゼ阻害効果について、膵リパーゼ阻害率（％）として図１に示した。

　図１は、本発明の実施例に係る膵リパーゼ阻害用組成物による膵リパーゼ阻害効果を示す図である。エタノール抽出品を黒棒で、７０％エタノール水溶液抽出品を白棒で示した。実施品１～９は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属による大豆発酵物をエタノールで抽出した抽出品である。実施品１０及び１１は、それぞれ実施品１及び実施品４で使用した大豆発酵物をエタノールの代わりに７０％エタノール水溶液で抽出した抽出品である。なお、比較例１～９は何れも阻害効果がみられなかった。

　（結果の考察）
　図１において、実施品１～９に示されている結果の概要は以下の（１）～（５）の通りである。（１）実施品１～９（Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒの何れか一方、又は両方（培養温度２５℃、３０℃、又は３７℃）の大豆発酵物のエタノール抽出物）全てに膵リパーゼ阻害効果あり。（２）比較品４（Ｒ．ｏｒｙｚａｅのみの大豆発酵物のエタノール抽出物）に膵リパーゼ阻害効果なし。比較品１～３（未発酵の蒸煮大豆のエタノール、７０％エタノール又は水抽出物）に膵リパーゼ阻害効果なし。（３）比較品７～９（麹菌による大豆発酵物である豆味噌の、エタノール、７０％エタノール又は水抽出物）に膵リパーゼ阻害効果なし。（４）実施品１０及び１１（Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒの何れか一方の７０％エタノール抽出物）に膵リパーゼ阻害効果あり。（５）比較品５及び６（Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒの何れか一方の大豆発酵物の水抽出物）に膵リパーゼ阻害効果なし。

　上記（１）～（３）の結果から、実施例１～９における大豆発酵物における膵リパーゼ阻害効果を有する有効成分は、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒの何れか一方、又は両方の混合による発酵によって生成されたと考えられる。さらに、Ｒ．ｏｒｙｚａｅのみを用いた発酵で得られる組成物は、膵リパーゼ阻害効果を有する有効成分は生成されないが、Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒの何れか一方、又は両方の混合に加え、Ｒ．ｏｒｙｚａｅをさらに含む発酵においても、膵リパーゼ阻害効果を有する有効成分の生成が生じ、膵リパーゼ阻害用組成物が得られると考えられる。

　上記（４）及び（５）の結果から、本実施例に係る膵リパーゼ阻害用組成物の有効成分は、水よりも有機溶媒に溶解し易い物質が示された。よって、本実施例に係る膵リパーゼ阻害用組成物の有効成分は、すなわち、ペプチド等の親水性物質ではなく、疎水性物質であると考えられる。

　〔実施例１１：大豆発酵物中に含まれる不けん化性脂質及びけん化性脂質の膵リパーゼ阻害効果の評価試験〕
　（菌種Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ及び培養温度３０℃の条件における大豆発酵物乾燥粉末の調製）
　実施例１の胞子懸濁液の代わりに、Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ　ＮＢＲＣ３０８１６の胞子が３．０×１０^６個含まれた胞子懸濁液を用い、培養温度を３２℃とした他は、実施例１と同様に処理して、大豆発酵物乾燥粉末を得た。

　（大豆発酵物中に含まれる不けん化性脂質及びけん化性脂質の分離及び抽出）
　大豆発酵物からソックスレー抽出によって抽出油を回収し、さらにアルカリ脱酸法に基づき抽出油を処理した。すなわち、抽出油１．０ｇ（ＡＶ７０）に対して、水酸化カリウム７５ｍｇを含む水溶液０．７５ｍＬを添加し、１分間ボルテックスミキサーで撹拌した。次に、ヘキサン４０ｍＬ、水２０ｍＬ及びエタノール２０ｍＬを添加し、撹拌後静置して、ヘキサン層と含水エタノール層とに分別した。ヘキサン層を回収後、水洗してヘキサンを留去したものをヘキサン画分とした。ヘキサン画分は、不けん化性脂質を含む。一方、含水エタノール層は、けん化された脂質である脂肪酸塩を含む。

　含水エタノール層に、濃塩酸を適量加えてｐＨ２に調整し、脂肪酸塩を遊離脂肪酸に戻した。次に、ヘキサン４０ｍＬを添加し、撹拌後静置して、ヘキサン層と含水エタノール層とに分別した。ヘキサン層を回収後、水洗してヘキサンを留去し、けん化性脂質を回収した。

　（大豆発酵物中に含まれる不けん化性脂質及びけん化性脂質の膵リパーゼ阻害効果の評価試験）
　＜試験方法＞
　上述の操作において回収した不けん化性脂質とけん化性脂質の膵リパーゼ阻害効果を各々測定した。上述の分離及び抽出方法で得られたけん化性脂質と不けん化性脂質とを用い、それぞれ脂質をアセトンで希釈することによってサンプルとして調製し、それぞれ測定した。

　測定方法の詳細については、〔実施例１１：実施品及び比較品の生成物のリパーゼ阻害効果の評価試験１〕の項目において記載したとおりである。

　＜試験結果＞
　測定の結果、けん化性脂質のみに膵リパーゼ阻害効果（７２％阻害）が見られた。一方、不けん化性脂質には、膵リパーゼ阻害効果がみられなかった。よって、本願発明の膵リパーゼ阻害用組成物の有効成分は、主に不けん化性脂質（不けん化物）中には存在しておらず、けん化性脂質中に存在しており、遊離脂肪酸が有効成分の一種であると考えられる。

　〔実施例１２：大豆発酵物中に含まれる遊離脂肪酸の分析〕
　（ｉ）培養温度を３２℃に変更した以外は実施例１と同様に処理して得られたＲ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓを用いた大豆発酵物乾燥粉末、（ｉｉ）培養温度を３２℃に変更した以外は実施例４と同様に処理して得られたＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒを用いた大豆発酵物乾燥粉末、（ｉｉｉ）比較例１と同様に処理して得られた蒸煮大豆乾燥粉末、（ｉｖ）培養温度を３２℃に変更した以外は比較例２と同様に処理して得られたＲ．ｏｒｙｚａｅを用いた大豆発酵物乾燥粉末について、ガスクロマトグラフィーを実施して、大豆発酵物乾燥品又は蒸煮大豆乾燥品あたりの遊離脂肪酸組成を分析した。

　その結果、上記（ｉｉｉ）の蒸煮大豆乾燥粉末では、遊離飽和脂肪酸として、パルミチン酸及びステアリン酸が、遊離不飽和脂肪酸のうち遊離の一価の不飽和脂肪酸として、オレイン酸及びバクセン酸が、遊離の多価の不飽和脂肪酸として、リノール酸及びα－リノレン酸が少なくとも含まれていたが、これらの脂肪酸の含量は、上記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の大豆発酵物乾燥粉末において（ｉｉｉ）の蒸煮大豆乾燥粉末よりも増加していた。また、上記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の大豆発酵物乾燥粉末においてイコセン酸及びイコサトリエン酸をさらに含有しており、（ｉｉ）ではミリスチン酸及びアラキジン酸をさらに含有していた。

　〔実施例１３：大豆発酵物中に含まれるけん化性脂質中の各種遊離脂肪酸の各種リパーゼに対する阻害効果の測定〕
　（試験方法）
　膵リパーゼ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．由来リパーゼ（シグマアルドリッチジャパン社製、ＴｙｐｅＸＩＩＩ）に対する、各種遊離脂肪酸のリパーゼ阻害効果を測定した。試験サンプルとしての遊離脂肪酸は、飽和脂肪酸としてはパルミチン酸、不飽和脂肪酸としてはオレイン酸及びリノール酸を用いた。それぞれの遊離脂肪酸は標品をサンプルとした。また、その他のサンプルとして、ダイゼイン及びゲニステインの７００ｐｐｍエタノール溶解物、並びにレシチンの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶解物をそれぞれ準備した。なお、各リパーゼは「リパーゼキットＳ」にて各々活性測定し、活性濃度を各々１６５ＩＵ／Ｌに調製して用いた。結果を図２に示した。

　（試験結果）
　図２は、各種リパーゼに対する各種遊離脂肪酸の阻害効果を示す図である。

　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．由来リパーゼは、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸の全てで阻害された。一方、膵リパーゼは、飽和脂肪酸であるパルミチン酸では阻害されたが、不飽和脂肪酸であるオレイン酸及びリノール酸では阻害されなかった。よって、リパーゼの種類の違いによって、遊離脂肪酸による阻害効果が大きく異なることが分かった。さらに、膵リパーゼは、遊離脂肪酸の中でも飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸では阻害効果が異なることが分かった。以上より、本願発明の膵リパーゼ阻害用組成物の有効成分は、少なくとも飽和脂肪酸が有効成分の一種であると考えられた。

　一方、大豆及び大豆発酵物中に含まれているダイゼイン又はゲニステインの７００ｐｐｍエタノール溶解物について、前記方法により膵リパーゼ阻害効果を測定したが、何れも膵リパーゼ阻害効果は見られなかった。実施品１～１０中のダイゼインは３００ｐｐｍ未満であり、ゲニステインは６５０ｐｐｍ未満である。また、ダイゼイン及びゲニステインは、不けん化物質である。さらに、レシチンの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶解物について、上記方法による膵リパーゼ阻害効果の測定では、膵リパーゼ阻害効果は見出されなかった。なお、実施品１～１０中のレシチン濃度は１％（ｗ／ｖ）未満である。以上の結果から、本実施例における評価系において観察された膵リパーゼ阻害効果は、ダイゼイン及びゲニステイン等のイソフラボンに起因するものではなく、また、レシチンに起因するものでもないと考えられる。

　また、表１から、実施例２及び実施例５の大豆発酵物乾燥品は、それぞれ油脂の酸価が７０及び８９、大豆発酵物乾燥品の総重量あたりの遊離脂肪酸含量は６．７％及び８．９％、遊離飽和脂肪酸含量は１．１％及び１．４％と、何れも比較例に比べ高かった。よって、大豆発酵物乾燥品あたりの油脂の酸価が少なくとも５０程度、大豆発酵物乾燥品の総重量あたりの遊離脂肪酸含量が少なくとも４．５％程度又は遊離飽和脂肪酸含量が少なくとも０．７５％程度の大豆発酵物であることが、膵リパーゼ阻害効果に重要であると考えられる。さらに、大豆発酵物成分が、膵リパーゼ阻害効果を備えるためには、得られる大豆発酵物が上述の程度の含有量で遊離脂肪酸又は遊離飽和脂肪を含むような条件で大豆をＲ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも一種類により発酵させることが重要であると考えられる。

　本発明に係る膵リパーゼ阻害用組成物は膵リパーゼ阻害効果を有しており、飲食品及び医薬品用途のみならず、試験研究用等の広範な分野で利用することができる。

Claims

　Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を含む、膵リパーゼ阻害用組成物。
　上記けん化性脂質は、乾燥重量あたりの遊離脂肪酸の含有量が少なくとも４．５％（ｗ／ｗ）である上記大豆発酵物に含まれるけん化性脂質である、請求項１に記載の膵リパーゼ阻害用組成物。
　上記けん化性脂質は、遊離飽和脂肪酸を含有している、請求項１又は２に記載の膵リパーゼ阻害用組成物。
　上記けん化性脂質は、乾燥重量あたりの遊離飽和脂肪酸の含有量が少なくとも０．７５％（ｗ／ｗ）である上記大豆発酵物に含まれるけん化性脂質である、請求項１～３の何れか一項に記載の膵リパーゼ阻害用組成物。
　上記遊離飽和脂肪酸は、炭素数１６以上の飽和脂肪酸である、請求項３又は４に記載の膵リパーゼ阻害用組成物。
　パルミチン酸及びステアリン酸のうちの少なくとも１種類を含む、膵リパーゼ阻害用組成物。
　飲食品組成物である、請求項１～６の何れか一項に記載の膵リパーゼ阻害用組成物。
　医薬品組成物である、請求項１～６の何れか一項に記載の膵リパーゼ阻害用組成物。
　膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法であって、
　上記膵リパーゼ阻害用組成物は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒのうちの少なくとも１種類を含む菌類による大豆発酵物に含まれるけん化性脂質を含む、膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法。
　上記大豆発酵物は、乾燥重量あたりの遊離脂肪酸の含有量が少なくとも４．５％（ｗ／ｗ）である、請求項９に記載の膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法。
　上記大豆発酵物は、乾燥重量あたりの遊離飽和脂肪酸の含有量が少なくとも０．７５％（ｗ／ｗ）である、請求項９又は１０に記載の膵リパーゼ阻害用組成物の製造方法。