WO2017131448A1 - 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물 - Google Patents

녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물 Download PDF

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이성란
유한봉
김태현
최태원
최종남
정태화
권형일
신성욱
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(주)넥스젠바이오텍
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Definitions

  • the present invention relates to a wrinkle improvement and anti-aging cosmetic composition
  • a wrinkle improvement and anti-aging cosmetic composition comprising a green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein having excellent cell proliferation effect and antioxidant function as an active ingredient.
  • the skin consists of the epidermis, dermis and subcutaneous tissue.
  • Skin is a tissue that plays an important role in keeping the body's water and body temperature while preventing the invasion of bacteria from outside.
  • the epidermis is composed of an extracellular matrix that performs skin protection, temperature control, and water retention and is involved in skin elasticity and flexibility.
  • the dermis is directly related to skin aging.
  • Human epidermal growth factor binds to the epidermal regeneration factor receptor present on the cell surface and induces dimerization of the epidermal regeneration factor receptor.
  • Epithelial cell regeneration factor receptor of the dimer activates the intracellular signaling system by activating the tyrosine kinase present in the receptor. This process promotes glycolysis and protein synthesis in the cell, resulting in cell growth. This is going on.
  • Epithelial cell regeneration factor which plays an important role in skin regeneration, decreases as aging progresses. Reduction of epithelial cell regeneration factor causes skin cell proliferation and migration to decrease, resulting in aging of the skin, increased wrinkles, and decreased elasticity. .
  • the green fluorescent protein consisting of 238 amino acids, is a protein of about 27 kDa, with 11 ⁇ sheet structures forming a beta barrel, and above and below the green fluorescent protein, respectively. There is a loop structure. Inside the beta barrel, there are serine 65-tyrosine 66-glycine 67, and these three amino acids form phosphors to produce green fluorescence.
  • the present inventors have developed a new protein for protecting the skin from free radicals that cause aging along with the skin regeneration function of human epithelial cell regeneration factor, and the human epithelial cell regeneration factor is derived from Aequorea victoria- derived green fluorescent protein. It has developed a new fusion protein with excellent skin regeneration effect and antioxidant function.
  • Korean Patent No. 11175803 discloses 'skin cell regeneration and wrinkle improvement cosmetic composition' including acetyl hexapeptide-3, copper peptide, palmitoyl pentapeptide, and epidermal growth factor
  • Korean Patent No. 1238706 No. discloses a camellia fermented infused oil containing an extract of sesame seed as an active ingredient, a preparation method thereof, and an anti-aging, anti-aging, anti-inflammatory, whitening, anti-wrinkle or anti-allergic cosmetic composition containing the same as an active ingredient.
  • the anti-wrinkle and anti-aging cosmetic composition containing the green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein having excellent antioxidant function as an active ingredient is not described.
  • the present invention was derived from the above requirements, and the present inventors have fused the jellyfish-derived green fluorescent protein to human epidermal regeneration factor protein known to have excellent cell regeneration effect.
  • Cell regeneration factor fusion protein was produced.
  • the fusion protein not only shows high free radical scavenging ability, but also has excellent cell proliferation effect of dermal fibroblasts compared to human epidermal regenerative factor protein alone, and various cosmetic formulations were performed to perform skin tests, thereby improving wrinkles of subjects. And the present invention was completed by confirming the whitening effect.
  • the present invention provides a wrinkle improvement and anti-aging cosmetic composition
  • a wrinkle improvement and anti-aging cosmetic composition comprising a green fluorescent protein-human epithelial cell regeneration factor fusion protein as an active ingredient.
  • Green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein of the present invention has an excellent antioxidant activity, has a higher skin cell proliferation effect than human epidermal regenerative factor protein alone, and has an excellent skin regeneration effect such as skin wrinkle improvement and whitening. It may be usefully used as an aging cosmetic composition.
  • GFP-EGF Green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein.
  • Figure 2 shows the results of DPPH experiment to determine the antioxidant efficacy of the green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein.
  • Figure 3 is a photograph confirming the cell proliferation effect on the skin fibroblasts of the green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein through crystal violet staining.
  • the present invention provides a wrinkle improvement and anti-aging cosmetic composition
  • a wrinkle improvement and anti-aging cosmetic composition comprising a green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein as an active ingredient.
  • the cosmetic composition of the present invention contains a protein fused with human epidermal regeneration factor protein having a skin regeneration effect and a green fluorescent protein having excellent antioxidant activity as an active ingredient. It is a cosmetic composition having an aging function.
  • the green fluorescent protein may be derived from jellyfish, preferably Owan jellyfish ( Aequorea victoria ), but is not limited thereto.
  • the range of jellyfish-derived green fluorescent protein according to the present invention includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a functional equivalent of the protein.
  • “Functional equivalent” means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a result of the addition, substitution or deletion of the amino acid It refers to a protein having a sequence homology of% or more and exhibiting substantially homogeneous activity with the protein represented by SEQ ID NO: 1.
  • “Substantially homogeneous activity” means antioxidant activity.
  • the range of the green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein according to the present invention includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a functional equivalent of the protein.
  • “Functional equivalent” means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution or deletion of the amino acid It refers to a protein having a sequence homology of% or more and exhibiting substantially homogeneous activity with the protein represented by SEQ ID NO: 2.
  • “Substantially homogeneous activity” means the effect of improving wrinkles through skin regeneration while having antioxidant activity.
  • the content of the fusion protein is preferably included in 0.000002 to 0.002% by weight relative to the total weight of the cosmetic composition.
  • the cosmetic composition of the present invention includes components conventionally used in cosmetic compositions in addition to the active ingredient, and include, for example, fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners and gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents ( foaming agents), fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion sequestrants and chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents , Conventional adjuvants such as lipid vesicles, and carriers.
  • fatty substances organic solvents, solubilizers, thickeners and gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents ( foaming agents), fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion sequestrants and chelating agents, pre
  • compositions of the present invention can be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, oils, powder foundations, emulsion foundations It may be formulated as a wax foundation, a spray, and the like, but is not limited thereto. More specifically, Skin, Skin Softener, Skin Toner, Astringent, Lotion, Milk Lotion, Moisture Lotion, Nutrition Lotion, Massage Cream, Nutrition Cream, Eye Cream, Moisture Cream, Hand Cream, Essence, Nutrition Essence, Pack, Cleansing It can be prepared in cosmetic formulations of foams, cleansing water, cleansing lotions, cleansing creams, body lotions, body cleansers, soaps and powders.
  • the carrier component is animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide. This can be used.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a powder or a spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as the carrier component, and in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluoro hydro Propellant such as carbon, propane / butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester as carrier components
  • Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) analysis one of the methods for measuring the free radical scavenging effect, was performed to measure the antioxidant efficacy of green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein.
  • L-ascorbic acid was used as a control for DPPH analysis.
  • L-ascorbic acid, green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein, and human epidermal cell regenerative factor protein were prepared at 10 ⁇ M concentration, respectively, and DPPH was prepared to have a final concentration of 200 ⁇ M.
  • the proteins and DPPH were mixed 1: 1 and left at 37 ° C. for 30 minutes. Then, absorbance at 520 nm was measured with an ELISA reader. Free radical scavenging ability (%) was calculated by the following equation 1, the results are shown in FIG.
  • the green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein showed about 2.5 times higher free radical scavenging ability than the ascorbic acid control group.
  • the free radical scavenging ability was about 2.5 times higher (FIG. 2). Therefore, the fusion protein of the present invention was confirmed to have a high antioxidant effect by the green fluorescent protein, which means that it can have a skin anti-aging effect by the excellent antioxidant effect of the fusion protein.
  • Example 1 The final isolated and purified green fluorescence protein-human epithelial cell regenerative factor in Example 1 was selected as a sample to confirm the cell proliferation effect of human dermal fibroblasts (Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell) .
  • Human epithelial cell regeneration factor protein which is not fused with 0, 0.02 ppm, 0.2 ppm fusion protein or green fluorescence protein to skin fibroblasts cultured to measure cell proliferation activity of green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein After treatment, the cells were incubated at 37 ° C. for 3 days, and then cell proliferation was confirmed by crystal violet staining. As a result, the cell proliferation effect of the dermal fibroblasts with increasing concentration of the fusion protein treatment was confirmed, and the cell proliferation effect of the fusion protein was more excellent than the cell proliferation by the human epidermal regeneration factor protein alone treatment. 3).
  • the green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein has an anti-wrinkle effect and an anti-wrinkle effect.
  • Green fluorescent protein-human epithelial cell regeneration factor fusion protein (GFP-EGF) was added or not added as an active ingredient to prepare a skin with the ingredients and contents shown in Table 1 below.
  • a lotion was prepared by adding or not adding green fluorescent protein-human epithelial cell regeneration factor fusion protein (GFP-EGF) as an active ingredient.
  • GFP-EGF green fluorescent protein-human epithelial cell regeneration factor fusion protein
  • Green fluorescent protein-human epithelial cell regenerative factor fusion protein (GFP-EGF) was added or not added as an active ingredient to prepare a cream with the ingredients and contents shown in Table 7 below.

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Abstract

본 발명은 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 융합단백질은 항산화 활성이 우수하며 피부 세포 증식 효과가 높아, 피부 주름 개선, 미백 등의 피부 재생 효과가 우수한 기능성 화장료의 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물
본 발명은 세포 증식 효과 및 항산화 기능이 우수한 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 표피, 진피, 피하 조직으로 구성되어 있다. 피부는 외부에서 유입되는 균의 침투를 막는 동시에 체내의 수분 유지와 체온 유지에 중요한 역할을 하는 조직이다. 표피는 피부 보호와 체온 조절, 및 수분 유지 기능을 수행하며, 피부 탄력성 및 유연성에 관여하는 세포외 기질(extracellular matrix)로 구성되어 있다. 진피는 피부 노화와 직접적인 관계가 있다.
인간 상피세포재생인자(Human epidermal growth factor, hEGF)는 세포 표면에 존재하는 상피세포재생인자 수용체와 결합하여 상피세포재생인자 수용체의 이합체화 반응(dimerization)을 유도한다. 이합체의 상피세포재생인자 수용체는 수용체 내에 존재하는 타이로신 키나아제를 활성화시켜 세포내 신호전달 시스템을 유도하게 되고, 이러한 과정을 통해 세포 내에서는 해당 작용(glycolysis)과 단백질 합성 이 촉진되어 최종적으로 세포의 성장이 진행된다.
피부 재생의 중요한 역할을 하는 상피세포재생인자는 노화가 진행될수록 감소되는데, 상피세포재생인자의 감소는 피부 세포 증식 및 이동의 감소를 유발하여 피부의 노화, 주름 증가, 탄력 감소 등의 현상을 나타낸다.
238개의 아미노산으로 구성된 녹색형광단백질(green fluorescent protein)은 약 27 kDa의 단백질로, 11개의 베타 병풍(β sheet) 구조가 베타 베럴(β barrel)을 이루고 있으며, 녹색형광단백질의 위, 아래에는 각각 루프 구조가 존재한다. 베타 베럴 내부에는 세린65-타이로신66-글라이신67이 존재하며, 이 세 가지 아미노산이 형광체를 이뤄 녹색 형광이 만들어진다.
본 발명자들은 인간 상피세포재생인자의 피부 재생 기능과 함께 노화의 원인이 되는 활성산소로부터 피부를 보호하기 위한 새로운 단백질 개발을 진행하여, 오완해파리(Aequorea victoria) 유래 녹색형광단백질을 인간 상피세포재생인자와 융합하여 피부 재생 효과가 우수하면서 항산화 기능을 갖춘 새로운 융합단백질을 개발하였다.
한편, 한국등록특허 제1175803호에는 아세틸 헥사펩타이드-3, 코퍼펩타이드, 팔미토일 펜타펩타이드 및 상피세포 성장인자를 포함하는 '피부세포 재생 및 주름개선 화장료 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1238706호에는 '섬오가피 추출물을 유효성분으로 함유하는 동백 발효 인퓨즈드오일, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항노화, 항염, 미백, 항주름 또는 항알러지용 화장료 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 항산화 기능이 우수한 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 세포 재생 효과가 우수한 것으로 알려진 인간 상피세포재생인자 단백질에 해파리 유래 녹색형광단백질을 융합하여 항산화 활성이 우수한 신규의 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 생산하였다. 상기 융합단백질은 높은 자유라디칼 소거능을 보일 뿐만 아니라, 인간 상피세포재생인자 단백질 단독에 비해 피부섬유아세포의 세포 증식 효과도 우수하며, 다양한 화장품 제형을 제조하여 피부 테스트를 수행한 결과, 피험자들의 주름 개선 및 미백 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질은 항산화 활성이 우수하며, 인간 상피세포재생인자 단백질 단독에 비해 피부 세포 증식 효과가 높아, 피부 주름 개선, 미백 등의 피부 재생 효과가 우수한 항노화 화장품 조성료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 발현을 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 확인한 결과이다. GFP-EGF: 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질.
도 2는 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 항산화 효능을 알아보기 위해 DPPH 실험을 수행한 결과이다.
도 3은 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 피부섬유아세포에 대한 세포 증식 효과를 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인한 사진이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 재생 효과가 있는 인간 상피세포재생인자 단백질과 항산화 활성이 우수한 녹색형광단백질을 융합한 단백질을 유효성분으로 포함하고 있으므로, 피부 세포 재생을 통한 주름 개선 및 항산화 활성에 의한 항노화 기능을 가진 화장료 조성물이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 상기 녹색형광단백질은 해파리 유래일 수 있으며, 바람직하게는 오완해파리(Aequorea victoria) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 해파리 유래 녹색형광단백질의 범위는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 항산화 활성을 의미한다.
본 발명에 따른 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 항산화 활성을 가지면서 피부 재생을 통한 주름 개선 효과를 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 상기 융합단백질의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000002 내지 0.002 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 녹색형광단백질 -인간 상피세포재생인자 융합단백질의 발현유도 및 분리
녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 생산을 위한 유전자 컨스트럭트 및 이를 이용한 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 생산방법은 한국등록특허 제1482187호(㈜넥스젠바이오텍)에서 제공된 형질전환 대장균, E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS를 1ℓ LB 혹은 BSB 배지에 배치 컬쳐 시 OD600 값이 0.6~0.8이 될 때까지 배양시키거나 20ℓ 발효기를 사용하여 연속배양 시 OD600=15~20가 될 때까지 배양하였다. 이후, 각각 1~5mM IPTG 또는 2% 락토오즈를 첨가하여 클로닝 된 유전자들의 발현을 유도하였다. 유전자 발현 유도 후 4~5시간 더 배양한 후 세포들을 원심분리방법으로 회수하였다. 이 세포들을 완충용액 (Phosphate buffered saline, NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g/ℓ, pH 7.4)에 완전히 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기를 사용하여 세포를 파괴하고 세포 내 단백질 포함 용액을 얻었다. 그 후, 단백질 포함 세포 용액을 Sepabeads Resin Brominated Styrenic Adsorbent(Sorbent Technologies, Inc., 미국)를 사용하여 최종적으로 GFP-EGF를 분리, 정제하였다.
상기 용액 내 융합단백질의 존재 유무를 확인하기 위해 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한 결과, 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 시료 내에서 확인할 수 있었다(도 1).
실시예 2. 녹색형광단백질 -인간 상피세포재생인자 융합단백질의 항산화 활성 측정
녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 항산화 효능을 측정하기 위해 자유라디칼 소거 효과 측정 방법 중 하나인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 분석을 수행하였다.
DPPH 분석 시 대조군으로 L-아스코르브산(Ascorbic acid)을 사용하였다. 실험 방법은 L-아스코르브산, 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질 및 인간 상피세포재생인자 단백질을 각각 10μM 농도로 준비하였으며, DPPH는 최종 농도가 200μM이 되도록 준비하였다. 상기 각 단백질들과 DPPH를 1:1로 혼합한 후 37℃에서 30분 방치하였다. 이후, ELISA 리더로 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거능(%)은 하기 식 1로 계산하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
자유라디칼 소거능(%) = 100-((B/A)*100) (식 1)
[A: 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도
B: 시료를 처리한 대조군 또는 실험군의 흡광도]
그 결과, 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질은 아스코르브산 대조군보다 약 2.5배의 높은 자유라디칼 소거능을 보였다. 또한, 녹색형광단백질을 융합하지 않은 인간 상피세포재생인자 단백질과 비교해도 약 2.5배 이상의 높은 자유라디칼 소거능을 보여주었다(도 2). 따라서, 본 발명의 융합단백질은 녹색형광단백질에 의해 높은 항산화 효능을 갖게 된 것을 확인할 수 있었고, 이는 상기 융합단백질의 우수한 항산화 효능에 의해 피부 노화 방지 효과를 가질 수 있다는 것을 의미하였다.
실시예 3. 녹색형광단백질 -인간 상피세포재생인자 융합단백질의 세포 증식 효과
실시예 1에서 최종 분리, 정제된 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 존재가 확인된 분획을 시료로 택하여 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell)의 세포 증식 효과를 확인하였다.
녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질의 세포 증식 활성 측정을 위해 배양한 피부섬유아세포에 0, 0.02 ppm, 0.2 ppm 농도의 융합단백질 또는 녹색형광단백질을 융합하지 않은 인간 상피세포재생인자 단백질을 처리한 후 3일 동안 37℃에서 배양하고, 이후 크리스탈 바이올렛 염색법으로 세포 증식 여부를 확인하였다. 그 결과, 융합단백질 처리 농도 증가에 따른 피부섬유아세포의 세포 수 증식 효과를 확인할 수 있었으며, 인간 상피세포재생인자 단백질 단독 처리에 의한 세포 증식보다 융합단백질의 세포 증식 효과가 더욱 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 3).
상기의 결과들을 통해, 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질은 우수한 항산화 효능과 함께 주름 개선 효능을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 1. 주름개선 및 미백 등의 피부재생 기능과 항산화 효능에 관한 피부자극 관능시험
상기 실시예 1에서 분리, 정제된 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효 성분으로 하는 제조예 1, 2, 3, 4와 비교예 1, 2, 3, 4의 화장료 조성물을 제조하여 관능시험을 실시하였다.
구체적으로는, 피부 재생 기능 항목 중 주름 개선 사항을 확인하기 위해 30세 이상 60세 미만의 여성과 남성 총 30명(30대 10명, 40대 10명 및 50~60대 10명)을 대상으로 하여, 안면 왼쪽 눈가 부분에는 비교예(대조군)를, 안면 오른쪽 눈가 부분에는 제조예(시험군)를 1일 1회 2주간 지속적으로 사용하게 하였다. 평가는 눈 주의 주름 펴짐 현상을 평가하였다. 또한, 상기 기능 항목 중 하나인 미백 관련 사항에 대해서도 동일한 방법으로 피부색 톤의 변화 정도를 평가하였다. 또한, 항산화 효능 관련 사항은 항노화 효과를 노화 완화 효과로 분석하였으며 육안으로 상대 비교하여 관찰하였다. 피부 자극 항목에 대해서도 동일한 방법으로 피부의 가려움, 따가움 및 홍반 현상 등에 관하여 관능시험을 실시하였다. 평가 기준은 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였다. 그 결과를 하기 표 2, 4, 6, 8에 나타내었다.
<제조예 1 및 비교예 1>
녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질(GFP-EGF)을 유효성분으로 첨가 또는 미첨가하여 하기 표 1에 기재된 성분과 함량으로 스킨을 제조하였다.
스킨 조성물
성분 제조예 1 (중량%) 비교예 1 (중량 %)
GFP-EGF 0.002 -
아미노산 스탁 0.1 0.1
미네랄 혼합물 0.0007 0.0007
정제수 잔량 잔량
상기 표 1의 제조예 1 및 비교예 1을 사용한 관능시험의 결과는 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2017000909-appb-T000001
<제조예 2 및 비교예 2>
녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질(GFP-EGF)을 유효성분으로 첨가 또는 미첨가하여 하기 표 3에 기재된 성분과 함량으로 에센스를 제조하였다.
에센스 조성물
성분 제조예 2 (중량 %) 비교예 2 (중량 %)
GFP-EGF 0.002 -
아미노산 스탁 0.05 0.05
미네랄 혼합물 0.0007 0.0007
글리세롤 5 5
1,3-부틸렌글리콜 10 10
카보폴 940 0.3 0.3
정제수 잔량 잔량
상기 표 3의 제조예 2 및 비교예 2를 사용한 관능시험의 결과는 하기 표 4와 같다.
Figure PCTKR2017000909-appb-T000002
<제조예 3 및 비교예 3>
녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질(GFP-EGF)을 유효성분으로 첨가 또는 미첨가하여 하기 표 5에 기재된 성분과 함량으로 로션을 제조하였다.
로션 조성물
성분 제조예 3 (중량 %) 비교예 3 (중량 %)
GFP-EGF 0.002 -
아미노산 스탁 0.05 0.05
미네랄 혼합물 0.0007 0.0007
글리세롤 3 3
1,3-부틸렌글리콜 10 10
미네랄 오일 5 5
세틸알코올 2 2
잔탄검 0.5 0.5
정제수 잔량 잔량
상기 표 5의 제조예 3 및 비교예 3을 사용한 관능시험의 결과는 하기 표 6과 같다.
Figure PCTKR2017000909-appb-T000003
<제조예 4 및 비교예 4>
녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질(GFP-EGF)을 유효성분으로 첨가 또는 미첨가하여 하기 표 7에 기재된 성분과 함량으로 크림을 제조하였다.
크림 조성물
성분 제조예 4 (중량 %) 비교예 4 (중량 %)
GFP-EGF 0.002 -
아미노산 스탁 0.05 0.05
미네랄 혼합물 0.0007 0.0007
글리세롤 2 2
미네랄 오일 10 10
올리브유화왁스 3 3
세틸알코올 2 2
정제수 잔량 잔량
상기 표 7의 제조예 4 및 비교예 4를 사용한 관능시험의 결과는 하기 표 8과 같다.
Figure PCTKR2017000909-appb-T000004

Claims (6)

  1. 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 녹색형광단백질은 오완해파리(Aequorea victoria) 유래 녹색형광단백질인 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 녹색형광단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 녹색형광단백질-인간 상피세포재생인자 융합단백질은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000002 내지 0.002 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물.
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