KR101560526B1 - 동백꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부의 오염 방지용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동백꽃 추출물을 포함하는 피부 오염 방지용 조성물에 관한 것으로, 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 증기 추출물의 잔사 추출물의 복합 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 자연적 요인 또는 환경오염인자로부터 유도되는 섬유아세포 내 콜라게네이즈 활성을 억제하고, 콜라겐 합성 및 DEJ 단백질 발현을 향상시킴으로써 피부의 오염 방지 및 그로 인한 피부상태 개선 효과를 가진다. 또한, 상기 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물은 인체에 대한 부작용이 거의 없으므로 화장료 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Description

동백꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부의 오염 방지용 조성물{Composition for anti-pollution of skin comprising Camellia japonica flower extract}
본 발명은 동백꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부의 오염 방지용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 오염 방지를 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 노화가 일차적으로 나타나는 기관으로 이를 지연 또는 예방하기 위하여 화장품 영역에서도 많은 연구가 진행되어 왔다. 통상적으로 피부노화는 25세를 전후하여 진행되기 시작하여 40세를 전후한 시기에 본격적으로 피부노화가 진행된다. 피부노화의 대표적 현상으로 피지 분비량이 감소되어 피부가 건조해지고, 세포 재생이 늦어지고, 노화 각질이 많이 쌓여서 피부가 거칠어지는 특징이 있다. 또한, 표피를 지탱해주는 콜라겐의 합성양이 감소되고 엘라스틴(탄력섬유)이 변성되어 주름이 생긴다. 아울러, 피부색이 얼룩지거나 기미, 검버섯 등의 색소 침착 증상이 나타나며, 표피가 얇아져서 피부보호 기능이 약화된다. 그 밖의 현상으로는 피부 두께의 감소와 관련된 피부 장벽작용(Barrier Effect)의 저하로 인한 피부 트러블의 증가를 들 수 있다. 피부노화와 관련된 연구는 크게 피부노화의 주요원인이 되는 자외선과 활성산소로부터 피부를 보호하는 소재, 피부주름 개선 소재, 피부탄력 증진 소재, 피부 표피와 진피 접합부(Dermal-Epidermal Junction, DEJ) 강화에 관련된 소재로 분류하여 심도 깊게 연구되고 있다.
피부에 노화가 진행되면 진피의 변화가 현저하게 나타나며, 70세 이후 나타나는 진피위축은 대표적인 노화현상이다. 진피의 변화는 섬유아세포(fibroblast)의 숫자와 이들의 합성 능력의 감소로 인하여 세포 외 기질 중 큰 분자량을 가진 물질들의 변화로 발생된다. 그 구체적인 변화는 콜라겐 다발의 분리, 점다당질 합성감소, 콜라겐과 탄력섬유(elastin) 수와 직경 감소, 콜라겐과 탄력섬유 분해 및 혈관의 팽창 등을 들 수 있다. 일반적으로 피부의 수분 함유량, 콜라겐 함유량 및 외부 환경에 대한 면역 작용 능력 등 여러 가지 복합적인 요인들 중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량과 콜라겐의 함량을 감소시키는 콜라겐 분해 효소인 콜라게네이즈의 발현량과 활성이다. 콜라게네이즈는 기질단백질 분해에 중요한 역할을 하는 금속단백분해효소(Matrix metalloproteinases, MMPs) 그룹에 속한다. 이러한 콜라게네이즈는 자외선, 성장인자, 염증성 사이토카인, 포르볼 에스테르(phorbol ester)에 의해 발현이 촉진되어 제1,2,3,5형 교원질(collagen)을 분해하는 것으로 알려져 있으며, 특히 자외선에 의한 광노화에 주요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 그 밖에 금속단백분해효소(MMPs)는 4형 교원섬유(MMP-2,-3), 탄력섬유(MMP-2), 또는 피브로넥틴(fibronectin)이나 라미닌(laminin, MMP-3)과 같은 기질단백질을 분해하며, 노화된 피부에서 발현이 현저히 증가됨을 관찰할 수 있다. 따라서 금속단백분해효소의 활성을 감소시킬 수 있는 소재개발이 활발하게 이루어지고 있다.
또한, 노화가 진행되면 피부진피 뿐 아니라 진피와 표피 부착을 담당하는 DEJ(Dermal epidermal junction) 단백질 역시 발현이 감소하면서 표피-진피 접합부가 평평해지고 연결이 약해져 피부가 쉽게 손상을 받게 된다. DEJ가 약화되면 표피와 진피의 원활한 커뮤니케이션이 이루어지지 않아 피부재생이 원활히 이루어지지 않는다. 최근 연구결과에 따르면 DEJ가 주름과 피부장벽 뿐 아니라 자외선 자극에 의한 피부색소 침착에도 관련하고 있다고 알려져 있다(Iriyama S, J Dermatol Sci. 64(3):223-228, 2011). 진피 접합부에는 라미닌-5(laminin-5), 콜라겐-Ⅳ(collagen-IV), 콜라겐 Ⅶ(collagen Ⅶ)이 존재하고 이들 단백질 발현을 증가시킬 수 있는 소재는 피부주름을 개선시킬 수 있다.
한편, 최근 피부노화와 환경오염간의 상관성이 발표되면서 다핵방향족탄화수소(polynuclear aromatic hydrocarbons, PAHs), 담배연기, 자외선, 오존 등 환경오염(environmental toxin) 인자에 의해 유도되는 AhR(Aryl hydrocarbon receptor)을 억제하는 것이 피부노화 연구의 타겟이 되고 있다. 구체적으로, 환경오염인자에 의해 AhR(Aryl hydrocarbon receptor)이 활성화되면 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게네이즈의 활성이 증가하여 이로 인해 콜라겐 분해가 이루어져 피부노화가 가속되게 된다.
이에 따라 환경오염인자에 의해 유도되는 피부노화를 막을 수 있는 소재를 "피부 오염 방지물(anti-pollutant)"로 정의하며, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(Tsai MJ et al., J Mol Med (Berl). 2014 Jun;92(6):615-28.; Ono Y et al., Exp Dermatol. 2013 May;22(5):349-53), 아직까지 뚜렷한 연구 성과가 있는 것은 아니다. 더욱이 상기 문헌들을 포함한 종래 특허문헌들은 한 가지 용매의 추출방법에 따른 추출물의 효능에 관해 언급하고 있으나, 그 잔사물에 다른 유용한 성분이 많이 남아있을지라도 버려지는 경우가 많아 잔사물에 대한 효능을 명확히 알 수 없으므로 더 많은 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 피부 오염 방지물(anti-pollutant)에 관한 연구를 꾸준히 수행하던 중, 본 발명에서와 같은 동백꽃의 특정 추출물이 피부 오염 방지(anti-pollution) 효능을 가지고 있음을 밝혀내었다.
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KR 10-0467501 B1 KR 10-0816261 B1 KR 10-1398392 B1
따라서 상기한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하나의 목적으로 환경오염인자로부터 피부를 보호하고, 더 나아가 피부상태를 개선하는 효과가 우수하며, 안전성 및 안정성이 높아 피부 부작용이 없는 천연물질을 제공하고자 한다.
본 발명의 보다 구체적인 목적으로서, 상기 천연물질로 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 다른 하나의 목적으로 상기 천연물질을 포함하는 피부 오염 방지 및 그로 인한 피부상태를 개선하기 위한 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 동백꽃 증기 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부의 오염 방지(anti-pollution)용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "피부의 오염 방지(anti-pollution)"는 자연적 요인(내인성 노화) 또는 환경오염인자(다핵방향족탄화수소, 담배연기, 미세먼지 또는 중금속 등)로부터 피부를 보호하여 피부상태의 개선을 유도하는 것을 의미한다.
상기 피부상태의 개선은 피부주름, 피부 색소 침착, 피부각질, 피부건조 또는 피부염증 질환(아토피, 여드름 등) 등을 호전 및 양호화시키거나 일정수준으로 유지하는 것을 의미하며, 보다 바람직하게는 피부주름의 개선일 수 있다.
상기 "피부주름의 개선"은 피부 진피층의 치밀성을 증진시키고, 진피층-표피층 접합부의 접합력을 향상시켜 피부주름의 모든 형태의 호전 및 양호화를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 동백꽃 증기 추출물은 수증기 증류법(steam distillation)을 이용하여 동백꽃에서 추출된 것으로, 종래 유기용매 추출법 또는 열수 추출법을 이용하여 추출한 동백꽃 추출물에 비하여 20 내지 40% 향상된 피부 주름 개선 효능을 갖는 물질을 말한다.
하나의 구체적 실시예로서, 본 발명의 동백꽃 증기 추출물은 동백꽃을 95 내지 110℃의 증기로 30 내지 90분 동안 처리한 후, 상기 동백꽃에 처리된 증기를 냉각하여 수집한 다음 농축하여 수득할 수 있다.
상기 수득된 동백꽃 증기 추출물은 유기용매 추출물 또는 동백꽃 열수 추출물에 비하여 섬유아세포 내의 콜라겐 합성 증가율을 30 내지 40% 향상시키고, 콜라게네이즈 활성 억제율을 20 내지 25% 향상시키며, DEJ 단백질 합성 증가율을 30 내지 40% 향상시키는 효능이 있음이 확인되었다.
본 발명의 피부 오염 방지를 위한 조성물에 포함되는 동백꽃 증기 추출물은 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부의 오염 방지(anti-pollution)용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 상기한 동백꽃 증기 추출물과 동백꽃 잔사 추출물을 혼합한 복합 추출물의 경우 섬유아세포 내 콜라겐 합성 효율을 증가시키고, 콜라게네이즈 활성이 보다 억제되었으며, DEJ 단백질 합성 효율이 증가되었음을 확인하여 상기 복합 추출물이 피부 오염 방지 및 그로 인한 피부 상태 개선, 보다 바람직하게는 피부 주름 개선에 유용함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 있어서, 상기 동백꽃 잔사 추출물은 동백꽃 증기 추출물을 제조한 후 남은 잔사를 유기용매 추출방법을 이용하여 추출된 물질을 말한다.
상기 유기용매는 예를 들어, (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름 또는 (f) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 또는 부탄올을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
또한, 상기 동백꽃 잔사 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 동백꽃 잔사 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물은 일정 중량비로 혼합하여 사용한다. 상기 일정 중량비는 동백꽃 증기 추출물과 동백꽃 잔사 추출물이 3 내지 4 : 1 내지 2, 바람직하게는 3.3 내지 3.7 : 1.2 내지 1.8, 보다 바람직하게는 3.5 : 1.5이다. 이러한 혼합비에서 피부의 오염 방지 및 그로 인한 피부상태 개선, 보다 바람직하게는 피부주름 개선의 탁월한 증진효과를 기대할 수 있다.
이때, 동백꽃 증기 추출물에 비하여 피부 주름 개선의 탁월한 증진 효과를 나타내는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물은 "동백꽃 유효성분 증진 추출물(CJF 추출물)"이라고도 표현할 수 있다.
본 발명의 피부 오염 방지를 위한 조성물에 포함되는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물은 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 상기 조성물은 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물에 대한 피부누적 자극실시 결과 인체에 무해한 물질임이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
본 발명의 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물은 자연적 요인 또는 환경오염인자로부터 유도되는 섬유아세포 내 콜라게네이즈 활성을 억제하고, 콜라겐 합성 및 DEJ 단백질 발현을 향상시킴으로써 피부의 오염 방지 및 그로 인한 피부상태를 개선하는 효과를 가진다. 또한, 상기 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물은 인체에 대한 부작용이 거의 없으므로 화장료 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 동백꽃 증기 추출물, 동백꽃 증기 추출물의 잔사 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물이 다양한 중량비로 혼합된 복합 추출물의 콜라겐 합성 증가 효과, 콜라게네이즈 활성 억제 효과 및 라미닌-5 합성 증가 효과를 합산하여 보여주는 그래프이다.
도 3은 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 처리한 피부 외식편에서 콜라겐 합성 및 MMP-1 활성 억제 효과를 보여주는 그림이다.
도 4는 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 처리한 피부 외식편에 중금속화합물과 하이드로카본 복합물질을 처리하여 중금속화합물과 하이드로카본 복합물질에 의해 유도되는 콜라게네이즈 활성 억제 및 콜라겐 보호 효과를 나타낸 그림이다.
도 5는 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 포함하는 화장료에 의한 피부결 및 피부 주름 개선 효과를 보여주는 그림이다.
도 6은 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 포함하는 화장료에 의한 피부 진피 치밀도의 증가 효과를 보여주는 그림이다.
이하, 제조예 및 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1: 동백꽃 증기 추출물 제조
세척 후 음건하여 건조한 동백꽃을 증기공급 장치 내부에 충전한 다음, 1기압 및 105℃의 수증기를 1시간 동안 충진층과 증기재킷에 동시에 공급하였다. 그 후 냉각파이프를 통과하여 응축된 증유를 수집한 다음 감압 농축하여 동백꽃 증기 추출물을 제조하였다.
제조예 2: 동백꽃 복합 추출물 제조
상기 제조예 1의 동백꽃 증기 추출물을 제조한 후 남은 동백꽃 잔사를 80% 에탄올 용매 담근 후 48시간 상온에서 교반 추출한 다음 여과 후 감압 농축하여 동백꽃 잔사 추출물을 제조하였다.
그 다음 제조예 1의 동백꽃 증기 추출물과 상기 동백꽃 잔사 추출물을 하기 표 1의 중량비로 혼합하여 동백꽃 복합 추출물을 제조하였으며, 동백꽃 분획별 추출물의 조성비에 의한 효능의 유, 무 또는 상승효과를 판별하였다.
복합물 번호 잔사추출물 증기추출물
#1 2 0
#2 1.4 0.6
#3 1 1
#4 0.6 1.4
#5 0 2
비교예 1: 동백꽃 유기용매 추출물 제조
세척 후 음건하여 건조한 동백꽃에 동백꽃 중량의 10배량(w/v)의 80% 에탄올을 가하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 유기용매 추출방법을 이용하여 동백꽃 에탄올 추출물을 제조하였다.
비교예 2: 동백꽃 열수 추출물 제조
세척 후 음건하여 건조한 동백꽃에 동백꽃 중량의 10배량(w/v)의 증류수를 가하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 열수추출 방법을 이용하여 동백꽃 열수 추출물을 제조하였다.
실시예 1: In vitro 에서 동백꽃 증기 추출물의 콜라겐 합성능 측정
상기 제조예 1에서 제조한 동백꽃 증기추출물, 비교예 1에서 제조한 동백꽃 유기용매 추출물 및 비교예 2에서 제조한 동백꽃 열수 추출물의 섬유아세포 내 콜라겐 합성능을 측정하였다.
구체적으로, 인체 유래 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2×105 세포/웰), 5% 농도의 CO2 배양기에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 제조예 1의 증기 추출물, 비교예 1의 유기용매 추출물 또는 비교예 2의 열수 추출물을 각각 100 ㎍/mL(ppm) 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.
콜라겐 합성능은 콜라겐 측정 키트 (Procollagen Type I C-peptide EIA kit MK101, 다카라, 일본)를 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 자세한 실시방법은 (주)다카라의 키트 설명서에 따라 수행하였다. 콜라겐 합성량의 수치는 동백꽃 추출물을 처리하지 않은 섬유아세포에 비해 증가된 수치를 백분율(%)로 환산한 값이다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
추출물 종류 콜라겐 합성 증가율(%)
비교예 1(유기용매 추출물) 11
비교예 2(열수 추출물) 13
제조예 1(증기 추출물) 47
상기 표 2에서 보듯이, 제조예 1의 동백꽃 증기 추출물은 비교예 1의 동백꽃 유기용매 추출물 및 비교예 2의 열수 추출물에 비하여 현저히 우수한 콜라겐 합성 증가율을 나타내었다.
실시예 2: In vitro 에서 동백꽃 증기 추출물의 콜라게네이즈 활성 억제 효과 측정
상기 제조예 1에서 제조한 동백꽃 증기추출물, 비교예 1에서 제조한 동백꽃 유기용매 추출물 및 비교예 2에서 제조한 동백꽃 열수 추출물의 섬유아세포 내 콜라게네이즈 활성 억제 효과를 측정하였다.
구체적으로, 인체 유래 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2×105 세포/웰), 5% 농도의 CO2 배양기에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 상기 섬유아세포에 제조예 1의 증기 추출물, 비교예 1의 유기용매 추출물 또는 비교예 2의 열수 추출물을 각각 100 ㎍/mL(ppm) 처리한 다음 TNF-α(종양괴사인자 알파)를 50 ng/mL 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 배양 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.
콜라게네이즈 활성은 타입 I 콜라게네이즈 어세이 키트(Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기(Bio-Tek ELx808™ Series Ultra Microplate Reader, 영국)로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균±표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 콜라게네이즈 활성 억제 수치는 동백꽃 추출물을 처리하지 않고 TNF-α만을 처리한 섬유아세포에 비해 억제된 수치를 백분율(%)로 환산한 값이다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
추출물종류 콜라게네이즈 활성 억제율 (%)
비교예 1(유기용매 추출물) 14
비교예 2(열수 추출물) 11
제조예 1(증기 추출물) 35
상기 표 3에서 보듯이, 제조예 1의 동백꽃 증기 추출물은 비교예 1의 동백꽃 유기용매 추출물 및 비교예 2의 열수 추출물에 비하여 현저히 우수한 콜라게네이즈 활성 억제 효능을 나타내었다.
실시예 3: In vitro 에서 동백꽃 증기 추출물의 진피 접합부(DEJ) 합성능 측정
상기 제조예 1에서 제조한 동백꽃 증기추출물, 비교예 1에서 제조한 동백꽃 유기용매 추출물 및 비교예 2에서 제조한 동백꽃 열수 추출물의 섬유아세포 내 진피 접합부(DEJ) 합성능을 측정하였다.
진피 접합부(DEJ) 합성 효과는 진피와 표피 부착 단백질 중 하나인 라미닌-5(Laminin-5) 합성량을 측정하여 확인할 수 있는데, 상기 라미닌-5 합성량은 라미닌 측정 키트(Abcam, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 자세한 실시방법은 Abcam의 키트 설명서에 따라 수행하였다.
구체적으로, 인체 유래 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 마이크로 플레이트에 접종시키고(2×105 세포/웰), 5% 농도의 CO2 배양기에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 상기 제조예 1의 증기 추출물, 비교예 1의 유기용매 추출물 또는 비교예 2의 열수 추출물을 각각 100 ㎍/mL(ppm) 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 라미닌-5 합성능의 수치는 동백꽃 추출물을 처리하지 않은 섬유아세포에 비해 증가된 수치를 백분율(%)로 환산한 값이다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
추출물종류 DEJ 합성 증가율 (%)
비교예 1(유기용매 추출물) 20
비교예 2(열수 추출물) 11
제조예 1(증기 추출물) 51
상기 표 4에서 보듯이, 제조예 1의 동백꽃 증기 추출물은 비교예 1의 동백꽃 유기용매 추출물 및 비교예 2의 열수 추출물에 비하여 현저히 우수한 라미닌-5 합성 증진 효과를 나타내었다.
상기한 결과로부터, 동백꽃 증기 추출물은 우수한 피부 오염 방지(anti-pollution) 효능 및 그로 인한 주름 개선에 유의한 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: In vitro 에서 동백꽃 복합 추출물의 주름개선 효과 측정
상기 제조예 2에서 제조한 동백꽃 복합 추출물의 주름개선 효과는 인체 유래 정상 섬유아세포에 동백꽃 복합 추출물을 50 ㎍/mL(ppm) 처리한 것을 제외하고, 상기 실시예 1 내지 3과 동일한 방법으로 콜라겐 합성능, 콜라게네이즈 활성 억제 및 진피 접합부(DEJ) 합성능을 측정하였다. 콜라겐 합성능과 진피 접합부(DEJ) 합성능 결과 수치는 동백꽃 복합 추출물을 처리하지 않은 음성대조군에 비해 증가된 수치를 백분율(%)로 환산한 값이고, 콜라게네이즈 활성 억제 결과 수치는 콜라게네이즈 유도물질인 TNF-α 처리군에 비해 억제된 수치를 백분율(%)로 환산한 값이다. 각 효능별 개선정도의 합산값을 이용하여 복합 추출물의 주름개선 효과를 비교하였다. 수치가 높을수록 피부 오염 방지(anti-pollution) 효능 및 그로 인한 주름개선에 유의한 효과를 가지는 물질로 해석할 수 있다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
하기 도 2에서 보듯이, 동백꽃 증기 추출물과 잔사 추출물이 1.4:0.6의 중량비로 혼합하여 제조된 복합 추출물(#4)을 처리한 세포의 주름개선 합산값이 110으로 가장 높은 값을 나타내었다.
이에 이하 실시예에서는 피부 오염 방지(anti-pollution) 효능 및 그로 인한 주름개선에 이상적인 상승 효능을 보이는 동백꽃 증기 추출물과 잔사 추출물이 1.4:0.6의 중량비로 혼합된 복합 추출물을 사용하였으며, 상기 복합 추출물을 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)이라 칭한다.
실시예 5: Ex-vivo 에서 동백꽃 유효성분 증진 조성물의 주름개선 효과 측정
먼저, 59세의 백인 여성으로부터 피부 외식편(Human skin explants, BioEC)을 얻었다. 그 다음 상기 얻은 피부 외식편을 BEM 배지가 들어있는 웰-플레이트에서 37℃가 유지되는 5% 농도의 CO2 배양기에서 배양하였다. 그 다음 0.1% 농도의 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF) 또는 전색제(vehicle)를 상기 피부 외식편에 4일 동안 매일 1회 국소투여(Topical application)하였다. 배양이 끝난 세포배지를 수거하여 샘플을 제조하였다. 배양이 끝난 피부 외식편은 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 파라핀으로 고정하고, 5 μm 두께로 절편을 만들어 콜라겐 (Collagen)과 콜라게네이즈 타입 I(MMP-1)의 발현정도를 면역화학조직염색을 통해 피부전체 형상과 진피치밀도를 확인하였다. 음성 대조군으로는 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 포함하지 않은 비히클(vehicle)을 처리한 피부 외식편을 사용하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3a에서 보듯이, 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 포함한 군에서 DEJ 부착력이 강화되고 진피 내 콜라겐 함량이 우수하게 증가되었다. 또한 도 3b에서 보듯이, 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)이 처리된 군에서 표피와 진피 두 부분의 MMP-1의 활성이 우수하게 감소되었다.
실시예 6: Ex-vivo 에서 동백꽃 유효성분 증진 조성물의 피부 오염 방지(anti-pollution) 효능 및 그로 인한 주름개선 효과 측정
상기 실시예 5와 같은 방법으로 피부 외식편을 BEM 배지에 배양하여 준비하였다. 그 다음 0.1% 농도의 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF) 또는 전색제(vehicle)를 상기 피부 외식편에 4일 동안 매일 1회 국소투여(Topical application)하였다. 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF) 처리 후, 공해물질로 중금속혼합물과 하이드로카본 복합물질을 사용하였다. 중금속혼합물(ICP multi-element standard V Certi Pur®, Merke)과 하이드로카본 복합물질(bezopyren, benzen, Anthrancen, Xylen, naphtalen, toluen)을 페이퍼 디스크(9 mm Φ)에 30 ㎕ 적셔 피부 외식편에 처리하고, 24 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 피부 외식편은 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 파라핀으로 고정하고, 5 μm 두께로 절편을 만들어 콜라겐과 콜라게네이즈 타입 I (MMP-1)의 발현정도를 면역화학조직염색을 통해 확인하였다. 음성 대조군으로는 시링산 또는 전색제를 처리한 피부 외식편에 공해물질을 처리하지 않은 피부 외식편을 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보듯이, 피부 외식편에서 공해물질에 의해 감소된 진피 내 콜라겐 함량이 동백꽃 유효성분 증진 조성물에 의해 증가되었다. 이에 반해, 공해물질에 의해 활성화된 콜라게네이즈의 활성은 동백꽃 유효성분 증진 조성물에 의해 억제되었다.
실시예 7: 동백꽃 유효성분 증진 조성물을 포함하는 화장료의 주름개선 효과 측정
7-1. 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 포함하는 영양크림 제조
동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 포함하는 화장료의 주름개선효과를 확인하기 위하여, 하기 표 5의 성분 및 함량으로 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 함유한 영양크림을 제조한 다음 임상효능 검정 실험을 수행하였다. 먼저, 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하고 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF) 및 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하여 영양크림을 제조하였다. 대조군(placebo 그룹)으로는 동백꽃 유효성분 증진 조성물을 첨가하지 않은 영양크림을 사용하였다.
성분 함량 (중량%)
Group A
(대조군, placebo 그룹)		 Group B
(동백꽃 유효성분 증진 조성물 그룹)
동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF) - 0.01
호호바 오일 5.0 5.0
유동 파라핀 7.0 7.0
세틸아릴 알코올 2.0 2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이 2.0 2.0
글리세릴 스테아레이트 0.5 0.5
스쿠알란 3.0 3.0
프로필렌글리콜 4.0 4.0
글리세린 5.0 5.0
트리에탄올 아민 0.3 0.3
카르복시 비닐폴리머 0.3 0.3
토코페릴 아세테이트 0.2 0.2
방부제, 향 미량 미량
정제수 잔량 잔량
합계 100 100
7-2. 주름 개선 임상실험
상기 7-1에서 제조한 영양크림을 39-53세 여성 30명을 대상으로 4주간 1일 2회(아침, 저녁) 안면전체에 사용하게 하였다. 평가는 제품 사용 전 사용 2주 및 4주 후 시점에서 피부결, 주름변화 및 진피 치밀도를 통해 제품에 의한 개선 효과를 평가하였다.
먼저, 피부결 및 주름변화는 3차원 피부측정장치인 PRIMOS®premium (GFMesstechnik GmbH, Germany)을 이용하여 측정하였다. 각 평가 시점마다 촬영된 영상 이미지는 매칭(matching) 기능을 이용하여 동일한 부위의 변화를 비교, 측정이 가능하며, 아래의 파라미터를 이용하여 피부결 및 주름변화를 분석하게 된다. 본 실시예에서는 제품 사용전, 사용 4주 및 8주 후 시점에서 눈가 주름을 촬영하고, 파라미터(Ra, Rmax, Rz, Rp, Rv)를 분석하였다. 파라미터 값이 감소할수록 주름이 개선되는 것으로 해석할 수 있다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
피부 진피 치밀도의 측정은 Dermascan®C (Cortex, Denmark)를 이용하였다. 이 측정기기는 초음파 진단영상장치로써, 높은 주파수의 음파를 인체표면에서 보낸 후 인체내부에서 반사되는 음파를 영상화한다. 교원질과 수분함량이 풍부한 세포간 기질이 교대로 쌓여 있어서 이들 음파저항이 다른 매질 사이를 음파가 지나가면 많은 에코가 발생하며 이를 이미지로 변환시켜 진피 치밀도를 측정한다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 5에서 보듯이, 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 함유한 영양크림을 도포한 피부군(Group B)은 대조군(Group A; placebo 그룹)에 비하여 모든 파라미터 값이 유의하게 감소되었다.
또한, 도 6에서 보듯이, 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 함유한 영양크림을 도포한 피부군(Group B)은 포함한 군에서 대조군(Group A; placebo 그룹)에 비하여 진피 치밀도 값이 2배 이상 증가되었다.
상기한 결과로부터, 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)은 우수한 피부 오염방지(anti-pollution) 효능 및 그로 인한 주름개선 효능을 가지고 있음을 알 수 있었다.
실시예 8: 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험
동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 피부 안전성 검증을 위해 통상의 피부누적자극실험을 실시하였다.
8-1. 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 함유한 피부 외용제 제조
동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)이 인체 피부에 안전한지 확인하기 위하여, 하기 표 6의 성분 및 함량으로 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)을 함유한 피부 외용제를 제조하였다. 구체적으로, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하고 70℃에서 용해하였으며(물파트), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 70℃에서 용해하였다(오일파트). 상기 오일파트를 물파트에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 1차 유화하였고, 여기에 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다. 다음으로, 상기 혼합액에 생성된 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 피부 외용제를 제조하였다.
성분 함량 (%)
대조군 시험군 1 시험군 2 시험군 3
정제수 72 71.9 71.5 71
글리세린 8.0 8.0 8.0 8.0
부틸렌글리콜 4.0 4.0 4.0 4.0
동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF) 0 0.1 0.5 1.0
카프릴릭 카프리 트리글리세라이드 8.0 8.0 8.0 8.0
스쿠알란 5.0 5.0 5.0 5.0
세테아릴 글루쿠사이드 1.5 1.5 1.5 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4 0.4 0.4 0.4
세테아릴 알코올 1.0 1.0 1.0 1.0
트리메탄올아민 0.1 0.1 0.1 0.1
총중량 100 100 100 100
8-2. 피부누적 자극 실험
상기 8-1에서 제조한 피부 외용제를 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회, 24시간 누적 첩포를 시행하여 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다.
첩포 방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였으며, 챔버에 상기 각 피부 외용제를 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 1을 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.
[수학식 1]
평균반응도 = [[{(반응지수 × 반응도)/(총 피검자수 × 최고점수(4점))}] × 100] / 검사회수(9회)
반응도에서 ±는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.
시험물질 반응이 나타난 피검자 수 평균
반응도
1주 2주 3주
1차 2차 3차 4차 5차 6차 7차 8차 9차
±/+/++ ±/+/++ ±/+/++ ±/+/++ ±/+/++ ±/+/++ ±/+/++ ±/+/++ ±/+/++
대조군 1/-/- 0/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- 0.09
시험군 1 0/-/- 0/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- 0.00
시험군 2 0/-/- 0/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- 0.00
시험군 3 0/-/- 0/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- -/-/- 0.00
상기 표 7에서 보듯이, 시험군 1, 2 및 3 모두 ±, + 및 ++에 해당하는 사람의 수가 각각 0명, 0명 및 0명이고, 평균 반응도는 각각 0.00, 0.00, 0.00이었다. 그러므로 평균반응도가 3이하의 반응도를 나타내므로, 동백꽃 유효성분 증진 조성물(CJF)은 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않는 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 화장료 제제
1-1. 유연화장수
성분 중량%
동백꽃 유효성분 증진 조성물 0.01
글리세린 3.0
부틸렌 글리콜 2.0
프로필렌 글리콜 2.0
카복시비닐폴리머 0.1
에탄올 10.0
트리에탄올아민 0.1
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 82.79
총계 100.0
1-2. 영양화장수
성분 중량%
동백꽃 유효성분 증진 조성물 0.01
밀납 4.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄세스퀴올레이트 0.5
유동파라핀 5.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5.0
글리세린 3.0
부틸렌 글리콜 3.0
프로필렌 글리콜 3.0
카복시비닐폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 69.69
총계 100.0
1-3. 영양크림
성분 중량%
동백꽃 유효성분 증진 조성물 0.01
밀납 10.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄세스퀴올레이트 0.5
유동파라핀 10.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5.0
글리세린 5.0
부틸렌 글리콜 3.0
프로필렌 글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 56.79
총계 100.0
1-4. 마사지 크림
성분 중량%
동백꽃 유효성분 증진 조성물 0.01
밀납 10.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄세스퀴올레이트 0.8
유동파라핀 40.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 4.0
글리세린 5.0
부틸렌 글리콜 3.0
프로필렌 글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 27.49
총계 100.0
1-5. 팩
성분 중량%
동백꽃 유효성분 증진 조성물 0.01
폴리비닐알콜 13.0
소듐카복시메틸셀룰로스 0.2
알란토인 0.1
에탄올 5.0
노닐페닐에테르 0.3
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 81.39
총계 100.0
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물을 포함하는 피부의 오염 방지(anti-pollution)용 화장료 조성물로서, 상기 피부의 오염 방지는 자연적 요인 또는 환경오염인자로부터 피부를 보호하여 피부주름을 개선하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 동백꽃 잔사 추출물은 동백꽃 증기 추출물을 제조하고 남은 잔사를 유기용매로 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 복합 추출물은 동백꽃 증기 추출물과 동백꽃 잔사 추출물이 3 내지 4 : 1 내지 2의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 동백꽃 증기 추출물, 또는 동백꽃 증기 추출물 및 동백꽃 잔사 추출물의 복합 추출물이 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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