KR102626140B1 - 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 안티폴루션 화장료 조성물 - Google Patents
동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 안티폴루션 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서, 항산화 및 항주름 효과가 우수한 안티폴루션 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부의 자극이 적으며, 미세먼지 등의 오염물질에 대한 항오염 효과를 제공해 피부를 보호한다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 항산화 및 항주름 효과가 우수하여 피부 트러블의 원인이 되는 활성산소의 소거 활성 효능이 뛰어나며, 피부주름을 유발하는 콜라겐 분해효소의 활성을 저해하고 콜라겐의 발현량을 증가시키는 효과가 있다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부의 자극이 적으며, 미세먼지 등의 오염물질에 대한 항오염 효과를 제공해 피부를 보호한다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 항산화 및 항주름 효과가 우수하여 피부 트러블의 원인이 되는 활성산소의 소거 활성 효능이 뛰어나며, 피부주름을 유발하는 콜라겐 분해효소의 활성을 저해하고 콜라겐의 발현량을 증가시키는 효과가 있다.
Description
본 발명은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서, 항산화 및 항주름 효과가 우수한 안티폴루션 화장료 조성물에 관한 것이다.
미세먼지(Particulate Matter, PM)는 대기 중에 떠다니는 지름 10μm 이하의 작은 먼지를 말하며, 호흡기 및 피부 등에 다양한 질환을 유발한다. 아황산가스, 질소 산화물, 납, 이산화질소, 오존, 일산화탄소 등을 포함하는 대기오염 물질이며, 자동차, 공장, 조리 과정 등에서 발생한다.
장기간 미세먼지에 노출될 경우 면역력이 급격히 저하되어 감기, 천식, 기관지염 등의 호흡기 질환은 물론 심혈관 질환, 피부질환, 안구질환 등 각종질병에 노출될 수 있다. 미세먼지에 포함된 수은, 납, 카드뮴 등의 중금속과 다이옥신, 블랙카본과 같은 1급 발암물질은 피부에 직접 닿을 경우 여러 가지 피부 염증을 유발한다.
미세먼지는 입자의 크기가 작을수록 건강에 미치는 영향이 크며, 특히 지름 2.5μm 이하의 먼지를 초미세먼지라고 한다. 모공보다 더 작은 초미세먼지는 입자가 매우 작고 잘 달라붙는 특성을 가지고 있어 모공 속에 깊이 침투해 각종 트러블을 유발하여 아토피 등 피부염의 원인이 된다. 피부에 침투한 미세먼지는 미토콘드리아에서 활성산소를 생산해 미토콘드리아에 손상을 주어 콜라겐 활성을 감소시키고 분해를 증가시켜 피부 노화를 유발한다.
미세먼지가 피부 노화에 심각한 영향을 준다는 것이 밝혀지면서, 미세먼지로부터 피부를 보호하기 위한 다양한 안티폴루션 화장품이 개발되고 있다. 안티폴루션 화장품이란 유해환경으로부터 피부를 보호하는 제품으로, 유해 성분을 차단하거나 제거하는 화장품이다. 외출 전에는 유해환경으로부터의 피부를 방어하고, 외출 후에는 남아있는 미세먼지를 피부에서 제거하는 효과가 있다.
이에 따라, 본 발명을 피부 자극을 줄이기 위해 천연물의 추출물을 유효성분으로 함유하며, 미세먼지 등의 오염물질로부터 피부를 보호하고, 항산화 및 항주름 효과가 우수한 안티폴루션 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항주름 효과가 우수한 안티폴루션 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하며, 항산화 및 항주름 효과를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물의 제조방법은 ① 준비한 동백꽃을 분쇄기로 분쇄하는 단계; ② 상기 동백꽃 분쇄물에 추출용매를 가해 추출하고, 필터로 여과하는 단계; ③ 상기 ②단계에서 여과된 용액을 농축하여 분말 상태의 동백 추출물을 제조하는 단계; ④ 금화규꽃으로 상기 ① ~ ③과정을 진행하여 금화규 추출물을 제조하는 단계; ⑤ 개서어 나뭇잎으로 상기 ① ~ ③과정을 진행하여 개서어 추출물을 제조하는 단계; ⑥ 누에가루로 상기 ② ~ ③과정을 진행하여 누에 추출물을 제조하는 단계; ⑦ 병풀로 상기 ① ~ ③과정을 진행하여 병풀 추출물을 제조하는 단계; 및 ⑧ 상기 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 일정비율로 배합하는 단계;를 포함하며, 상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 10의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상이고, 상기 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 3 : 2 : 3 : 1 : 1의 비율로 배합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부의 자극이 적으며, 미세먼지 등의 오염물질에 대한 항오염 효과를 제공해 피부를 보호한다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 항산화 및 항주름 효과가 우수하여 피부 트러블의 원인이 되는 활성산소의 소거 활성 효능이 뛰어나며, 피부주름을 유발하는 콜라겐 분해효소의 활성을 저해하고 콜라겐의 발현량을 증가시키는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 항산화 테스트(DPPH assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 DPPH라디칼 소거능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 세포독성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 피부섬유아세포 주름인자 발현 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 DPPH라디칼 소거능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 세포독성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 피부섬유아세포 주름인자 발현 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
아래에서는 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, <실시예> 및 <시험예>를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는 것이지만, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로 본 발명의 범위가 아래 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 "상에" 또는 "전에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우 뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "~ (하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
동백(Camellia)은 중국과 일본 그리고 우리나라에 자생하는 차나뭇과의 상록 활엽 교목이다. 겨울에 꽃이 핀다 하여 동백(冬柏)이란 이름이 붙었다고 하며, 다른 꽃들이 다지고 난 11월 말부터 꽃을 피우기 시작해서 2~3월에 만발하는 편이다. 꽃, 잎, 열매 모두가 유용한 성분들과 약효성분들이 많아 버릴 게 없다고 알려져 있다.
식물체와 꽃은 관상용으로 하며, 열매는 약용하거나 기름을 짜서 머릿기름, 등잔 기름 따위로 쓰고, 목재는 공예의 재료로 사용한다. 동백 열매에서 씨를 채취해 동백기름을 짜내는데, 올레산 등의 유용한 성분을 지니고 있다. 잘 증발하지도 않고 산패하지도 않으며 냄새도 적고 인체에도 무해하기 때문에 예전부터 여러 용도로 사용되었다. 여자들의 머릿기름으로 쓰인 것으로 유명하며, 금속제나 목제 물건들의 부식 방지용으로 쓰기도 한다.
금화규(Aurea Helianthus)는 아욱과에 가을해바라기속에 속하는 다년생 초본식물로서, 꽃은 물론이고 줄기부터 잎과 뿌리까지 모두 건강에 도움이 되는 약용식물이다. 플라본(flavone), 비타민E, 하이페로사이드(hyperoside), 식물성 에스트로겐, 불포화지방산, 우르솔산(Ursolic acid), 식물성 콜라겐, 페놀화합물, 렉틴(lectin) 등을 함유하며, 금화규 추출물이 항산화 효과를 비롯하여 항멜라닌효과혈중지방감소, 당뇨병개선, 혈관질환 개선 등에 뛰어난 효과가 있다. 금화규꽃은 식물성 콜라겐이 풍부하고 노화방지, 항암, 성인병 예방에 효과가 있다고 알려져 있으며, 화장품, 꽃차, 담금주 등으로 활용된다.
개서어(CARPINUS TSCHONOSKII)는 강원도 이남에 나는 낙엽교목으로 높이 15m, 지름 70cm이다. 껍질은 회색, 작은가지는 털이 있고, 흰색 피목이 산재하며, 어린잎과 잎자루에 털이 있다. 잎은 2줄로 끝이 뾰족하고, 잎 밑은 둥글거나 뾰족하며, 길이 4~8cm, 가늘고 뾰족한 겹톱니가 있다. 표면과 뒷면 맥 위에 누운 털이 있으며, 잎자루는 길이 8~12mm이다. 꽃은 단성화이며 수꽃은 한 포비늘 안에 1송이씩 달리고, 4~8개의 수술이 있다. 암꽃 유이꽃차례는 자루가 있으며, 암꽃은 각 포비늘 안에 2송이씩 달리고, 각각 1개의 지방과 2개의 암술대가 있다. 개화기는 4~5월, 결실기는 10월이며 목재는 표고의 원목 등으로 쓰인다. 민간요법에서는 초봄에 채취한 수액을 견풍건(見風乾)이라 하여 골다공증 치료에 사용하였으며, 개서어나무 추출물이 미세먼지 등 유해물질로부터 세포를 보호하는 효과가 있음이 확인되었다.
누에(SILKWORM)는 나비목 누에나방과에 속하는 누에나방의 유충이다. 몸색깔은 젖빛을 띠고 연한 키틴질로 된 껍질로 덮여서 부드러운 감촉을 준다. 13개의 마디로 이루어졌으며 몸에는 검은 무늬가 있다. 알에서 나올 때에는 검은 털이 있다가 뒤에 털을 벗고 잿빛이 된다. 네 번 잠잘 때마다 꺼풀을 벗고 25여 일 동안 8cm 정도 자란 다음 실을 토하여 고치를 짓는다. 고치 안에서 번데기가 되었다가 다시 나방이 되어 나온다.
누에는 과거엔 비단을 생산하기 위해 키웠으나, 최근에는 건강 보조 식품으로 가공하기 위한 원료로 생산되고 있다. 누에가 번데기가 되어 실주머니를 만들기 전 영양분을 가장 많이 가지고 있는 시기인 5령 3일(누에떨기 후 19일)에 햇볕에 말려 분쇄기로 가루를 만들어 급속 냉동으로 살균시킨 뒤 건조하여 누에가루 또는 누에환으로 만든다. 누에는 당뇨병, 고혈압, 간 기능 개선, 혈당 강하, 중풍 예방, 뇌 신경 활성화, 위장병 등과 같은 성인병을 치유하고 예방하는데 효과가 큰 것으로 알려져 있다.
병풀(CENTELLA ASIATICA)은 쌍떡잎식물 이판화군 산형화목 미나리과의 여러해살이풀이다. 한국, 일본, 중국 등지에 분포하고, 전통적으로 중국 및 남동아시아국가에서 다양한 질환의 치료에 사용된다. 인도 및 스리랑카 전통 의학에서는 피부병, 매독, 류머티즘, 정신병, 간질, 히스테리, 탈수 및 한센병 치료에 사용되며, 동남아시아 국가에서는 설사, 안질환, 감염, 천식 및 고혈압 치료에 사용된다.
병풀에는 주로 트리테르페노이드 사포닌, 트리테르펜 및 플라보노이드 성분이 함유되어 있으며, 위 점막을 보호하고, 항바이러스, 소염, 항우울 및 항종양 효과가 있다. 피부로션, 머리색, 항-비듬, 오가닉샴퓨, 헤어오일, 헤어젤, 컨디셔너, 피부크림, 스킨토너, 마스크팩, 클렌징밤, 피부보습제, 피부세럼 등으로 사용된다.
본 발명은 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항주름 효과가 우수한 안티폴루션 화장료 조성물이다.
준비한 동백꽃을 분쇄기를 이용하여 분쇄한다. 분쇄크기는 특별히 제한되지 않으며, 1~3cm의 크기로 분쇄될 수 있다. 상기 동백꽃 분쇄물에 20배 중량의 추출용매를 넣고 25℃에서 24시간동안 100rpm으로 진탕혼합한다. 이를 필터를 사용하여 여과하고, 농축기를 사용하여 추출용매가 제거된 분말 상태의 동백 추출물을 제조한다.
상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 10의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것으로 한다.
상기의 방법으로 금화규꽃, 개서어 나뭇잎, 누에가루 및 병풀로부터 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물, 병풀 추출물을 제조한다.
상기 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 3 : 2 : 3 : 1 : 1의 비율로 배합하여 안티폴루션 화장료 조성물을 제조한다.
본 발명의 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 안티폴루션 화장료 조성물은 해당분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있다. 상기 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 에센스, 파우더, 화장수, 패치, 마스크 시트, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 오일, 바디오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 동백 추출물 제조
① 동백꽃을 준비하여, 세척한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다.
② 상기 동백꽃 분쇄물 50g을 에탄올 1L에 넣었다. 이를 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕혼합한 후, 필터를 사용하였다.
③ 상기 여과된 용액을 진공회전농축기(N-1000S)를 사용해 에탄올이 제거된 분말 상태의 동백 추출물을 제조하였다.
<실시예 2> 금화규 추출물 제조
① 금화규꽃을 준비하여, 세척한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다.
② 상기 금화규꽃 분쇄물 50g을 에탄올 1L에 넣었다. 이를 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕혼합한 후, 필터를 사용하였다.
③ 상기 여과된 용액을 진공회전농축기(N-1000S)를 사용해 에탄올이 제거된 분말 상태의 금화규 추출물을 제조하였다.
<실시예 3> 개서어 추출물 제조
① 개서어 나뭇잎을 준비하여, 세척한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다.
② 상기 개서어 나뭇잎 분쇄물 50g을 에탄올 1L에 넣었다. 이를 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕혼합한 후, 필터를 사용하였다.
③ 상기 여과된 용액을 진공회전농축기(N-1000S)를 사용해 에탄올이 제거된 분말 상태의 개서어 추출물을 제조하였다.
<실시예 4> 누에 추출물 제조
① 누에가루 50g을 에탄올 1L에 넣었다. 이를 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕혼합한 후, 필터를 사용하였다.
② 상기 여과된 용액을 진공회전농축기(N-1000S)를 사용해 에탄올이 제거된 분말 상태의 누에 추출물을 제조하였다.
<실시예 5> 병풀 추출물 제조
① 병풀을 준비하여, 세척한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다.
② 상기 병풀 분쇄물 50g을 에탄올 1L에 넣었다. 이를 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 진탕혼합한 후, 필터를 사용하였다.
③ 상기 여과된 용액을 진공회전농축기(N-1000S)를 사용해 에탄올이 제거된 분말 상태의 병풀 추출물을 제조하였다.
<실시예 6> 안티폴루션 화장료 조성물 제조
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 6>에서 제조한 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 적절한 비율로 배합하여 안티폴루션 화장료 조성물을 제조하였다.
본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물에 대하여 항산화 및 항주름 테스트를 진행하였다.
<시험예 1> 항산화 테스트(DPPH assay)
항산화는 활성산소를 제거하여 산화가 진행되는 것을 억제하거나 완화하는 것을 의미한다. 인간을 포함한 생물은 호흡이라는 과정을 통해 ATP 등의 에너지를 얻는다. 이러한 과정에서 필연적으로 흡입된 산소의 2%를 활성산소로 변환시키게 된다. 이 활성산소는 Free radical을 가진 산소를 의미하며, free radical은 세포막 산화, 촉진, 노화, DNA 변형 등의 문제를 야기한다.
DPPH 항산화능 측정은 DPPH free radical과 항산화물질이 반응하여 DPPH free radical이 감소되는 정도를 측정하는 것이다. DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 안정한 유리기(stable free radical)로서, 분자 내 비공유 전자(N·)를 갖고 있으나 전자나 free radical과 반응하면 안정한 구조 (N-H)로 변한다. DPPH는 수용액 상태에서 보라색이지만, free radical이 소거되면 전자공여능(electron donating ability)이 되며 담황색으로 변한다. 이때 감소하는 흡광도 값을 UV/Vis 분광광도계를 이용하여 515~517nm에서 측정하여 free radical 소거능력을 측정한다.
1-1. 시료 제조
① 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물, 병풀 추출물을 4℃에서 보관하며, 하기의 <표 1>의 비율로 배합하여 4종류의 시료를 제조한다.
| 동백 | 금화규 | 개서어 | 누에 | 병풀 | |
| 조합1 | 4 | 3 | 2 | 1 | - |
| 조합2 | 3 | 2 | 3 | 1 | 1 |
| 조합3 | 2 | 4 | 2 | 1 | 1 |
| 조합4 | 2 | 1 | 1 | 4 | 2 |
② 상기 배합한 4종류의 시료는 하기의 <표 2>와 같이 100% ethanol에 연속희석(serial dilution)한다.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 농도(%) | 0.8 | 0.4 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 0.025 |
③ Equivalent value 산출을 위한 양성대조군으로는 Gallic acid를 사용한다. Gallic acid를 10mg/mL의 농도로 100% ethanol에 녹이고, 하기의 <표 3>와 같이 100% ethanol에 연속희석(serial dilution)한다. 음성대조군(negative control)으로는 100% ethanol(Gallic acid 0 농도로 표기)을 준비한다.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6(음성대조군) | |
| 농도(ug/mL) | 240 | 120 | 90 | 60 | 30 | 0 |
④ color를 띄는 시료는 DPPH negative control로 DPPH를 넣지 않고 흡광도 측정한 뒤, DPPH 첨가 시료 흡광도 값에서 보정한다.
1-2. 시험 방법
① 96 well plate에 Gallic acid 및 시료를 세반복으로 넣는다.
② 실온, 암실에서 30분간 반응시키며 중간중간 inverting(시험관이나 tube를 조심스럽게 뒤집으며 섞는 기법)한다.
③ 반응액은 microplate reader를 이용하여 517nm 파장 흡광도를 측정한다.
1-3. 시험 결과
[도 1]은 본 발명의 항산화 테스트(DPPH assay) 결과를 나타낸 그래프이다.
Gallic acid equivalent(GAE)는 gallic acid 농도별(x) 흡광값(y)을 사용하여 standard curve를 그려서 추세선에서 산출된 equation을 이용하여 시료의 흡광도(y)에 해당하는 x값을 계산하였다.
저해율(radical scavenging activity)은 하기의 [수학식 1]을 이용하여 계산하였다.
EC50(effective concentration of 50%)은 시료의 농도별(x) 저해율(y)을 사용하여 curve를 그려서 추세선에서 산출된 equation을 이용하여 시료의 저해율(y)에 50을 대입하여 해당되는 x값을 계산하였다.
[도 2]는 본 발명의 DPPH라디칼 소거능 평가 결과를 나타낸 그래프로서, DPPH 테스트 결과, 조합2의 항산화능이 가장 높은 것으로 나타났다.
항산화능이 가장 높은 조합2의 시료를 이용하여 항주름 테스트를 진행하였다.
<시험예 2> 세포독성 평가
피부섬유아세포는 피부를 구성하는 섬유질을 만드는 세포이다. 세포독성시험으로는 MTT assay가 있으며, 인간 피부섬유아세포인 CCD-986SK cell에 시료를 처리하여 in vitro 상에서 세포 생존율 확인한다.
MTT assay는 cell의 metabolic 활성을 색 변화로 측정한다. NAD(P)H에 의존적인 oxidoreductase enzyme은 많은 cell에 존재하는데, 이 enzyme은 tetrazolium dye인 dye MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]를 insoluble 형태인 formazan으로 환원시킨다. 본래 MTT 시약은 노란색의 수용성 용액이지만, formazan은 청자색의 비수용성 결정이다. 따라서 formazan을 DMSO와 같은 유기용매에 녹여서 농도를 측정하면 세포의 탈수소효소 환원능력을 측정 할 수 있다. 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 탈수소효소의 활성을 측정할 수 있으며, 약물을 처리하고 세포가 살아있는지(탈수소효소 활성이 있는지)를 측정한다.
약을 처리한 경우 농도구배 별로 formazan의 형성정도가 달라지며, 이를 통해 세포가 50%정도 살아있는 있는 농도를 결정할 수 있고, 이를 #IC50 값이라고 한다.
2-1. 시료 제조
① IMDM(Iscove Modified Dulbecco Media) growth media (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)을 이용해 하기의 <표 4>와 같이 시료를 제조한다.
| 처리군 명칭 | 처리 농도(%) |
| 1. control | - |
| 2. 미세먼지 화합물 | 0.2 |
| 3. 미세먼지 화합물 + 조합2 | 미세먼지 0.2 |
| 조합2 0.02 | |
| 4. 조합2 | 0.02 |
② 공시험액(no-treatment)은 아무 처리하지 않은 IMDM growth media를 사용한다.
2-2. 시험 방법
① CCD-986SK 세포는 IMDM growth media에 현탁하여 96 well microplate에 6 × 103 cells을 well 당 200㎕씩 세반복으로 분주 후 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 24시간 배양한다.
② 24시간 배양 후 플레이트의 배양액을 제거한다.
③ 각 well에 시료를 200㎕ 씩 처리한다.
④ 시료 처리 후 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 48시간 배양한다.
⑤ 처리 배양액/시료를 제거한다.
⑥ MTT 배지(50% MTT reagent in serum-free IMDM)를 각 well에 50㎕씩 처리 후 CO2 배양기에서 2시간 반응시킨다.
⑦ 150㎕ 부피의 MTT solvent를 추가하고 15분간 shaking incubation한다.
⑧ 반응 완료된 배지를 Microplate reader를 이용하여 590nm reference 파장 흡광도를 측정한다.
2-3. 시험 결과
[도 3]은 본 발명의 피부섬유아세포 세포독성시험 결과를 나타낸 그래프이다.
세포생존율은 하기의 [수학식 2]을 이용하여 계산하였다.
미세먼지 화합물 처리군에서 세포독성이 나타난 반면, 조합2와 공동 처리시 세포독성이 회복되는 경향을 보였다. 조합2 단독 처리시 세포독성이 나타나지 않았다.
동일한 농도에서 주름 관련 인자의 발현량 평가를 진행하였다.
<시험예 3> 항주름 테스트(인간 피부섬유아세포 항주름 관련 인자 발현량 평가)
피부 섬유아세포인 CCD-986SK cell에 시료를 처리하여 피부의 탄력과 관련된 효소(gelatinase, collagenase, matrix metalloproteinase)와 Type 1 collagen(COL1A) 유전자 발현 정도 측정한다.
in vitro 상에서 콜라겐을 분해하는 collagenase의 효소 또는 세포외 기질을 분해하는 효소를 공시료액과 비교하여 collagenase 또는 세포외 기질을 분해하는 효소의 억제 정도를 확인하고, in vitro 상에서 공시료액과 비교하여 노화로 인해 진피층 세포외기질에서 많이 감소하는 type 1 collagen의 증가된 합성 정도를 측정한다.
3-1. 시료 제조
① 시료는 IMDM growth media (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)을 이용해 하기의 <표 5>와 같이 시료를 제조한다.
| 처리군 명칭 | 처리 농도(%) |
| 1. control | - |
| 2. 미세먼지화합물 | 0.2 |
| 3. 미세먼지화합물 + 조합2 | 미세먼지 0.2 |
| 조합2 0.02 | |
| 4. 조합2 | 0.02 |
② 공시험액(no-treatment)은 아무 처리하지 않은 IMDM growth media를 사용한다.
3-2. 시험 방법
① CCD-986SK 세포는 IMDM growth media에 현탁하여 6 well microplate에 1 × 105 cells을 well 당 2mL씩 분주 후 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 24시간 배양한다.
② 24시간 배양 후 플레이트의 배양액을 제거한다.
③ 각 well에 시료 2mL씩 처리한다.
⑤ 시료 처리 후 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 48시간 배양한다.
⑥ 처리 배양액 제거 후, 세포를 수거하여 RNA를 추출한다.
⑦ 4μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성한다.
⑧ qRT-PCR에 사용한 타깃 유전자의 primer 염기서열 및 PCR 조건은 하기의 <표 6> 및 <표 7>와 같다.
| Gene | Primer sequence | Annealing temp.(℃) |
| GAPDH | F-TGCACCACCACCTGCTTAGC R-GGCATGGACTGTGGTCATGAG |
56.9 |
| COL1A | F-AGAAACACGTCTGGCTAGGAG R-GCATGAAGGCAAGTTGGGTAG |
56.9 |
| MMP-1 | F-AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT R-CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA |
60.6 |
| 1 cycle | 30 cycle | 1 cycle | ||
| 95℃ | 95℃ | Annealing temp | 72℃ | 72℃ |
| 3분 | 30초 | 30초 | 1분 | 5분 |
3-3. 시험 결과
도 4는 본 발명의 피부섬유아세포 주름인자 발현 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
control gene(housekeeping gene)인 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(GAPDH)에 대하여 역치 사이클 Ct 값과의 차이(△Ct)를 산출한 다음 무처리군 △Ct와의 차이인 △△Ct 값을 산출하여, 최종적으로 2-△△Ct 값을 유전자의 발현량으로 평가 분석하였다.
control gene에 미세먼지화합물 처리시 콜라겐 발현은 변화가 없으나, 콜라겐분해효소의 발현은 통계적으로 유의하게 증가하였다. 조합2 처리시, 미세먼지화합물 처리 여부와 상관없이 콜라겐 발현량이 증가하였으며, 콜라겐분해효소의 발현은 조합2 처리 시 매우 큰 폭으로 감소하였다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 안티폴루션 화장료 조성물은 천연물 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부 자극이 적으며, 항산화 및 항주름 효능이 우수하고, 미세먼지 등의 오염물질로부터 피부를 효과적으로 보호할 수 있다.
상기와 같이 명세서에 최적의 실시예가 개시되었다. 여기서 특정한 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명을 설명하기 위한 목적에서 사용된 것이지 의미 한정이나 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하기 위하여 사용된 것은 아니다. 그러므로, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.
Claims (11)
- 동백꽃 추출물, 금화규꽃 추출물, 개서어 나뭇잎 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 동백꽃 추출물은 동백꽃 분쇄물에 20배 중량의 추출용매를 가하여 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 추출한 후, 여과하고 농축하여 추출용매가 제거된 분말 상태인 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 금화규꽃 추출물은 금화규꽃 분쇄물에 20배 중량의 추출용매를 가하여 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 추출한 후, 여과하고 농축하여 추출용매가 제거된 분말 상태인 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 개서어 나뭇잎 추출물은 개서어 나뭇잎 분쇄물에 20배 중량의 추출용매를 가하여 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 추출한 후, 여과하고 농축하여 추출용매가 제거된 분말 상태인 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 누에 추출물은 누에가루에 20배 중량의 추출용매를 가하여 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 추출한 후, 여과하고 농축하여 추출용매가 제거된 분말 상태인 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 병풀 추출물은 병풀 분쇄물에 20배 중량의 추출용매를 가하여 25℃에서 24시간 동안 100rpm으로 추출한 후, 여과하고 농축하여 추출용매가 제거된 분말 상태인 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 2항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 10의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 동백꽃 추출물, 금화규꽃 추출물, 개서어 나뭇잎 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 3 : 2 : 3 : 1 : 1의 비율로 배합하는 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서,
항산화 및 항주름 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 안티폴루션 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 에센스, 파우더, 화장수, 패치, 마스크 시트, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 오일, 바디오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물.
- ① 준비한 동백꽃을 분쇄기로 분쇄하는 단계;
② 상기 동백꽃 분쇄물에 추출용매를 가해 추출하고, 필터로 여과하는 단계;
③ 상기 ②단계에서 여과된 용액을 농축하여 분말 상태의 동백꽃 추출물을 제조하는 단계;
④ 금화규꽃으로 상기 ① ~ ③과정을 진행하여 금화규꽃 추출물을 제조하는 단계;
⑤ 개서어 나뭇잎으로 상기 ① ~ ③과정을 진행하여 개서어 나뭇잎 추출물을 제조하는 단계;
⑥ 누에가루로 상기 ② ~ ③과정을 진행하여 누에 추출물을 제조하는 단계;
⑦ 병풀로 상기 ① ~ ③과정을 진행하여 병풀 추출물을 제조하는 단계; 및
⑧ 상기 동백꽃 추출물, 금화규꽃 추출물, 개서어 나뭇잎 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 일정비율로 배합하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 안티폴루션 화장료 조성물의 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210136038A KR102626140B1 (ko) | 2021-10-13 | 2021-10-13 | 동백 추출물, 금화규 추출물, 개서어 추출물, 누에 추출물 및 병풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 안티폴루션 화장료 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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