WO2017095088A1 - Vegfr2에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents

Vegfr2에 특이적으로 결합하는 항체 Download PDF

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WO2017095088A1
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vegfr2
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seq
antigen
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이종서
김규태
고봉국
김기현
이현종
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention was made by task number 1415118385 under the support of the Ministry of Trade, Industry and Energy of Korea, the research and management institution of the project is the Korea Institute of Industrial Technology Promotion, the research project name is “International Joint Technology Development Project”, and the research title is “Innovation Epitope Discovery” Development of global antibody drug based on platform technology ", the host organization is Apclo Corp., and the research period is 2011.11.01-2014.10.31
  • the present invention relates to a VEGFR2 antibody for use in the prevention or treatment of human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) related diseases, particularly angiogenesis related diseases.
  • VEGFR2 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2
  • Angiogenesis is the mechanism by which new blood vessels are formed from existing blood vessels by the growth, division, and migration of endothelial cells, and plays an important role in normal growth processes including wound healing and women's menstrual cycle.
  • abnormal angiogenesis may include macular degeneration (MD), diabetic retinopathy, cancer growth and metastasis, psoriasis, rheumatoid arthritis and chronic inflammation.
  • MD macular degeneration
  • psoriasis rheumatoid arthritis
  • chronic inflammation Rosau. Nature . 386 (6626): 671-674 (1997), Carmeliet and Jain. Nature . 407 (4801): 249-257 (2000)).
  • Angiogenesis factors are typically Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).
  • VEGF is an important factor that functions to regulate vasculogenesis in embryonic development as well as angiogenesis in adults.
  • VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D and PLGF VEGF receptors (VEGFR) 1, 2 and 3 and heparin sulphate proteoglycans HSPGs) and neuropilins (NRPs).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGFR1 and VEGFR2 have been major targets for inhibiting angiogenic diseases (Ellis and Hicklin. Nat Rev Cancer . 8 (8): 579-591 (2008); Youssoufian et al. Clin Cancer Res . 13 (18Pt2) ): 5544s-5548s. (2007)).
  • Ramucirumab is a monoclonal antibody selected from a fully human Fab library and has been approved for use in colorectal cancer, non-plastic lung cancer and gastric cancer (Spratlin et al. J Clon) . Oncol . 28 (5): 780-787 (2010); Spratlin et al. Future Oncol . 6 (7): 1085-1094 (2010); Aprile et al. Drugs . 73 (18); 2003-2015 (2013); Chan et al. Biologics . 22 (9): 93-105 (2015)).
  • the present inventors have tried to develop an antibody that targets VEGFR2 and shows superior or equivalent activity to ramuslumab, an anticancer drug that inhibits angiogenesis.
  • the present invention was completed by confirming that the antibody of the present invention showed excellent binding ability to VEGFR2, and had the ability to inhibit vascular endothelial cell growth equivalent to ramusumab, and had the ability to inhibit angiogenesis and vascular endothelial cell invasion. .
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof against VEGFR2.
  • Still another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.
  • Still another object of the present invention is to provide a host cell transformed with the recombinant vector.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of angiogenesis-related diseases comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof against VEGFR2.
  • Still another object of the present invention is to provide an angiogenesis-related disease diagnosis and drug responsiveness assay kit comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof against VEGFR2 of the present invention.
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing or treating angiogenesis-related diseases, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an antibody against VEGFR2 or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient. .
  • the invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof against VEGFR2 comprising:
  • a heavy chain variable region comprising the following heavy chain CDR determining amino acid sequence; CDRH1 of SEQ ID NO: 1, CDRH2 of SEQ ID NO: 2 and CDRH3 of SEQ ID NO: 3, and
  • a light chain variable region comprising the following light chain CDR amino acid sequence; CDRL1 of SEQ ID NO: 4, CDRL2 of SEQ ID NO: 5 and CDRL3 of SEQ ID NO: 6.
  • the present inventors have tried to develop an antibody that targets VEGFR2 and shows superior or equivalent activity to ramuslumab, an anticancer drug that inhibits angiogenesis.
  • the antibody of the present invention exhibited excellent binding ability to VEGFR2, and had the same ability to inhibit vascular endothelial cell growth as that of ramuslumab, and had the ability to inhibit angiogenesis and vascular endothelial cell invasion.
  • Ramucirumab refers to the antibody disclosed in US Pat. No. 7,498,414 B2.
  • Antibodies of the invention have excellent killing or proliferation inhibitory ability against cells of VEGFR2 expression.
  • the term “killing” or “proliferation suppression” used while referring to an angiogenesis-related disease inhibitory effect is used interchangeably.
  • antibody includes antigen binding fragments of antibody molecules as well as complete antibody forms.
  • a complete antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, each of which is linked by heavy and disulfide bonds.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3). ), Gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant regions of the light chains have kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, MJ, Ed., Chapter 45, pp. 41-50, WB Saunders Co. Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4, pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
  • the term “antigen binding fragment” means a fragment having antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 , Fv, and the like.
  • Fab in the antibody fragment has a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and the first constant region of the heavy chain (C H1 ) having one antigen binding site.
  • F (ab ') 2 antibodies are produced by disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Double-chain Fv is a non-covalent bond in which the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked, and the single-chain Fv is generally shared by the variable region of the heavy chain and the short chain variable region through a peptide linker. It may be linked by bond or directly at the C-terminus to form a dimer-like structure such as a double chain Fv.
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (for example, restriction digestion of the entire antibody with papain can yield Fab and cleavage with pepsin can yield F (ab ') 2 fragment), or It can be produced through genetic recombination technology.
  • proteolytic enzymes for example, restriction digestion of the entire antibody with papain can yield Fab and cleavage with pepsin can yield F (ab ') 2 fragment
  • It can be produced through genetic recombination technology.
  • the antibody is preferably in the form of Fab or in the form of a complete antibody.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant regions are gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3) and gamma 4 (IgG4), and in another embodiment, the gamma 1 (IgG1) isotype.
  • the light chain constant region may be of kappa or lambda type and, according to one embodiment, is kappa type. Therefore, according to one embodiment of the present invention, the antibody of the present invention is in Fab form or IgG1 form having a kappa ( ⁇ ) light chain and a gamma 1 ( ⁇ 1) heavy chain.
  • the term “heavy chain” refers to an entirety comprising a variable region domain V H and three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen. It means both length heavy chains and fragments thereof.
  • the term “light chain” herein refers to both the full-length light chain and fragment thereof including the variable region domain V L and the constant region domain C L comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen. it means.
  • the term “complementarity determining region” refers to the amino acid sequences of the hypervariable regions of immunoglobulin heavy and light chains (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)).
  • the heavy and light chains each contain three CDRs (heavy chains (CDRH1, CDRH2 and CDRH3) and light chains (CDRL1, CDRL2 and CDRL3)).
  • CDRs provide key contact residues for the antibody to bind antigen or epitope.
  • the VEGFR2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may include a variant of the amino acid sequence described in the attached sequence list within a range capable of specifically recognizing VEGFR2.
  • changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • modifications include, for example, deletions, insertions and / or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have a similar shape.
  • arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically equivalent functions.
  • each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in contributing to the interactive biological function of proteins. It is known that substitution with amino acids having similar hydrophobicity indexes can retain similar biological activity. When introducing mutations with reference to the hydrophobicity index, substitutions are made between amino acids that exhibit a hydrophobicity index difference of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, even more preferably within ⁇ 0.5.
  • substitutions are made between amino acids which exhibit a hydrophilicity value difference of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, even more preferably within ⁇ 0.5.
  • an antibody of the present invention or a nucleic acid molecule encoding the same is also interpreted to include sequences that exhibit substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing.
  • the above substantial identity is at least 61% when the sequence of the present invention is aligned as closely as possible with any other sequence, and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • a sequence that shows homology more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology.
  • Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2: 482 (1981) ; Needleman and Wunsch, J.
  • the heavy chain variable region of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 sequence.
  • the light chain variable region of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 sequence.
  • Antibodies of the invention include monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain Fvs (scFV), single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') fragments, disulfide-binding Fvs (sdFV) And anti-idiotype (anti-Id) antibodies, epitope-binding fragments of the antibodies, and the like.
  • the antibody CDR sequence of the present invention is very low homology (similarity) compared to the CDR sequences of conventional antibodies, there is a uniqueness of the sequence.
  • the protein disclosed in US Pat. No. 7,947,809 which was found to have the highest homology in the BLSAT search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), has a homology with the CDRH3 sequence of the antibody of the present invention. The sex is low at 71%, little sequence homology with CDRL3, and less than 50% overall CDR sequence homology.
  • the antibody described in US Pat. No. 7,947,809 is an antibody that recognizes a glucagon receptor, which differs from the antibody of the present invention and its target.
  • the invention provides a nucleic acid molecule encoding a heavy chain variable region of an antibody against VEGFR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 sequence.
  • the nucleic acid molecule of the present invention comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding a light chain variable region of an antibody against vascular endothelial cells comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the nucleic acid molecule of the present invention comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • nucleic acid molecule is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides that are the basic building blocks of nucleic acid molecules are naturally modified nucleotides, as well as modified sugar or base sites.
  • Analogues Schott al., Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90: 543-584 (1990)
  • Nucleic acid molecular sequences encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention can be modified. Such modifications include addition, deletion or non-conservative substitutions or conservative substitutions of nucleotides.
  • Nucleic acid molecules of the present invention encoding VEGFR2 antibodies are also construed to include nucleotide sequences that exhibit substantial identity to the nucleotide sequences described above.
  • the above substantial identity is 80% when the nucleotide sequence of the present invention and any other sequence are aligned to the maximum correspondence, and when the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art, A nucleotide sequence that exhibits 90% or 95% homology.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule described above.
  • vector refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Cosmid vector; And viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors, and the like.
  • the nucleic acid molecule encoding the light chain variable region and the nucleic acid molecule encoding the heavy chain variable region in the vector of the present invention is operatively linked (operatively linked) with the promoter.
  • operably linked refers to a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the regulatory sequence is To regulate transcription and / or translation of said other nucleic acid sequences.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter or array of transcriptional regulator binding sites
  • the recombinant vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). This document is incorporated herein by reference.
  • Vectors of the present invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression.
  • the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothionine promoter, ⁇ -actin promoter, human heroglobin promoter and Human muscle creatine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, tk promoter of HSV, mouse breast tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV, promoter of Moroni virus, promoter of Epstein Barr virus (EBV) and promoter of Loews sacoma virus (RSV)
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter cytomegalovirus promoter
  • tk promoter of HSV e.g., mouse breast tumor virus (MMTV) promoter
  • LTR promoter of HIV e.g., promoter of Moroni virus, promoter of Ep
  • Vectors of the invention may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • the protein expressed by the vector of the present invention is an antibody
  • the expressed antibody can be easily purified through a Protein A column or the like without additional sequences for purification.
  • the expression vector of the present invention as an optional marker, and includes antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo There are genes resistant to mycin and tetracycline.
  • the invention provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vectors of the present invention are known in the art and can be used with any host cell, for example, suitable eukaryotic cell host cells of the vector may be monkey kidney cells 7 (COS7: monkey). kidney cells, NSO cells, SP2 / 0, Chinese hamster ovary (CHO) cells, W138, baby hamster kidney (BHK) cells, MDCK, myeloma cell lines, HuT 78 cells and HEK-293 cells Including but not limited to.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (a) a pharmaceutically effective amount of a VEGFR2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention; And (b) provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of angiogenesis-related diseases comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition of the present invention utilizes the above-described VEGFR2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention as an active ingredient, the contents common to both are described in detail in order to avoid excessive complexity of the present specification by repeated description. Omit.
  • angiogenesis-related diseases of the present invention include macular degeneration, diabetic retinopathy, cancer, psoriasis, rheumatoid arthritis, chronic inflammation, cancer, diabetic retinopathy, prematurity retinopathy, corneal graft rejection, neovascular glaucoma, erythematosis, proliferative retinopathy , Hemophiliac joints, capillary hyperplasia in atherosclerotic plaques, keloids, wound granulation, vascular adhesion, osteoarthritis, autoimmune diseases, Crohn's disease, restenosis, atherosclerosis, intestinal adhesion, cat scratch disease, ulcers, cirrhosis Pathologies, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, malignant neurosis, thrombotic microangiopathy, organ transplant rejection, renal glomerulopathy, diabetes and
  • the VEGFR2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention inhibits the growth of vascular endothelial cells, inhibits angiogenesis and invasion of vascular endothelial cells (FIGS. 3 and 4). It is effective in preventing or treating related diseases.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • compositions of the present invention can be administered parenterally, such as intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, topical, intranasal, pulmonary and rectal.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction, Usually a skilled practitioner can easily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg / kg.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to prevent or treat cancer.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media or in the form of extracts, powders, suppositories, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the present invention provides a method for preventing or preventing angiogenesis-related diseases comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an antibody against VEGFR2 or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient. Provide treatment.
  • administer refers to administering a therapeutically effective amount of a composition of the invention directly to a subject (an individual) in need thereof so that the same amount is formed in the subject's body. Say that.
  • a “therapeutically effective amount” of a composition means a content of the composition that is sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to a subject to whom the composition is to be administered, and includes a “prophylactically effective amount” as used herein.
  • the term “subject” includes, without limitation, humans, mice, rats, guinea pigs, dogs, cats, horses, cows, pigs, monkeys, chimpanzees, baboons or rhesus monkeys. to be.
  • a method for preventing or treating angiogenesis-related diseases since the method comprises administering a pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenesis-related diseases, which is an aspect of the present invention, Omitted to avoid excessive complexity of the description.
  • Antibodies of the invention can be used to diagnose, such as angiogenesis-related diseases, diseases or conditions.
  • the present invention provides a diagnostic kit for angiogenesis-related diseases, diseases or conditions comprising the antibody of the present invention described above.
  • the diagnostic kit of the present invention comprises the above-described VEGFR2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and diagnoses the same disease as the pharmaceutical composition of the present invention. In order to avoid excessive complexity, the description is omitted.
  • the antibodies of the present invention can be used to analyze whether the antibodies of the present invention are drug responsiveness to a patient.
  • the present invention provides a drug responsiveness assay kit comprising the antibody of the present invention described above.
  • Assay kits of the invention can be used to analyze whether a particular patient is medicinally responsive to the antibodies of the invention. For example, when a cell of a patient is treated with the antibody of the present invention, if the result of the binding of the antibody of the present invention results, the patient can be determined to be medicinally reactive with the antibody of the present invention.
  • kits described above contain antibodies, they can basically be made suitable for various immunoassays or immunostaining.
  • the immunoassay or immunostaining may include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or competition assay, sandwich assay, flow cytometry, immunofluorescence staining and Immunoaffinity tablets, including but not limited to.
  • the immunoassay or method of immunostaining is described in Enzyme Immunoassay , ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology , Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.
  • the surface of a vascular endothelial cell in which an antibody labeled with a radioisotope (eg, C 14 , I 125 , P 32 and S 35 ) surrounds a cancer cell. It can be used to detect receptors in.
  • a radioisotope eg, C 14 , I 125 , P 32 and S 35
  • a specific embodiment of the present invention comprises the steps of (i) coating the sample to be analyzed on the surface of the solid substrate; (ii) reacting said cell lysate with a VEGFR2 antibody as a primary antibody; (iii) reacting the resultant of step (ii) with the secondary antibody to which the enzyme is bound; And (iv) measuring the activity of the enzyme.
  • Suitable as the solid substrate are hydrocarbon polymers (eg polystyrene and polypropylene), glass, metals or gels, most particularly microtiter plates.
  • hydrocarbon polymers eg polystyrene and polypropylene
  • glass e.g polystyrene and polypropylene
  • metals or gels most particularly microtiter plates.
  • Enzymes bound to the secondary antibody include, but are not limited to, enzymes catalyzing color reaction, fluorescence, luminescence or infrared reaction, for example, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, hose Radish peroxidase, luciferase and cytochrome P 450 .
  • alkaline phosphatase When alkaline phosphatase is used as the enzyme binding to the secondary antibody, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol-AS) as a substrate Chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis) if colorimetric substrates such as -B1-phosphate) and enhanced chemifluorescence (ECF) are used, and horse radish peroxidase is used -N-methylacridinium nitrate), resorupin benzyl ether, luminol, Amflex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol (HYR), TMB (tetramethyl
  • certain embodiments of the present invention comprise the steps of: (i) coating the surface of a solid substrate with a VEGFR2 antibody as a capturing antibody; (ii) reacting the capture antibody with the sample; (iii) reacting the product of step (ii) with a VEGFR2 detecting antibody having a label that generates a signal; And (iv) measuring the signal resulting from the label.
  • the detection antibody carries a label which generates a detectable signal.
  • the label may include chemicals (eg biotin), enzymes (alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P 450 ), radioactive substances (eg C 14 , I 125 , P 32 and S 35 ), fluorescent materials (eg, fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • chemicals eg biotin
  • enzymes alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P 450
  • radioactive substances eg C 14 , I 125 , P 32 and S 35
  • fluorescent materials eg, fluorescein
  • luminescent materials eg, chemiluminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • Measurement of the final enzyme activity or signal in the ELISA method and the capture-ELISA method can be carried out according to various methods known in the art. If biotin is used as a label, the signal can be easily detected with streptavidin and luciferin if luciferase is used.
  • Samples that may be applied to the kits of the present invention include, but are not limited to, cells, tissues or tissue-derived extracts, lysates or purified products, blood, plasma, serum, lymph or ascites.
  • Antibodies of the invention can be used for in vivo or in vitro imaging.
  • the present invention provides a composition for imaging comprising the above-described antibody of the present invention and a label bound conjugate for generating a detectable signal bound to the antibody.
  • Labels that generate the detectable signal include T1 contrast material (eg, Gd chelate compound), T2 contrast material (eg, superparamagnetic material (eg, magnetite, Fe 3 O 4 , ⁇ -Fe 2 O 3 , manganese ferrite, cobalt) Ferrites and nickel ferrites)), radioisotopes (e.g., 11 C, 15 O, 13 N, P 32 , S 35 , 44 Sc, 45 Ti, 118 I, 136 La, 198 Tl, 200 Tl, 205 Bi, and 206 Bi), fluorescent materials (fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5), chemiluminescent groups, magnetic particles, mass labels or electron-dense particles It is not limited to this.
  • T1 contrast material eg, Gd chelate compound
  • T2 contrast material eg, superparamagnetic material (eg, magnetite, Fe 3 O 4 , ⁇ -F
  • the antibody of the present invention alone can be used to treat angiogenesis-related diseases, since it can target VEGFR2-expressing cells, it can be provided in the form of an ADC (antibody drug conjugate) by binding to other drugs.
  • ADC antibody drug conjugate
  • the present invention provides an antibody pharmaceutical conjugate (ADC) comprising the antibody of the present invention described above and a drug bound to the antibody.
  • ADC antibody pharmaceutical conjugate
  • Drugs bound to the antibodies of the present invention are not particularly limited and include chemicals, radionuclides, immunotherapeutics, cytokines, chemokines, toxins, biologic agents and enzyme inhibitors, and more specifically, the following anticancer agents: Acibaicin, aclarubicin, acodazole, acronycin, adozelesin, alanosine, aldehydes, allopurinol sodium, altretamine, aminoglutetidemide, amonafide, ampligen, amsacrine , Androgens, anguidine, apidicholine glycinate, asaray, asparaginase, 5-azacytidine, azathioprine, bacillus calmethe-guerrin (BCG), bakers antipole, beta-2 -Dioxythioguanosine, bisanthrene HCl, bleomycin sulfate, lysine, butionine sul
  • the present invention encodes a heavy chain and light chain variable region of an antibody against VEGFR2 or an antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain CDR and a light chain CDR amino acid sequence of a novel sequence, an antibody to VEGFR2 comprising a novel amino acid sequence.
  • Agents for the prophylaxis or treatment of angiogenesis-related diseases comprising each nucleic acid molecule, a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule of the invention, a host cell transformed with the recombinant vector of the invention, an antibody of the invention or an antigen-binding fragment thereof
  • the antibody of the present invention is an antibody that specifically binds to VEGFR2 overexpressed in vascular endothelial cells and is an antibody that binds to an epitope different from ramusumab, and is a CDR of conventional VEGFR2 target antibodies.
  • the homology is very low compared to the sequence, there is a uniqueness of the sequence.
  • the antibody of the present invention has the same activity as that of ramusumumab and has the activity of inhibiting growth of angiogenesis-related cells, inhibiting angiogenesis, and inhibiting invasion of vascular endothelial cells, and thus are very effective in preventing or treating angiogenesis-related diseases. Do.
  • the antibody of the present invention can be used not only as a therapeutic agent for angiogenesis-related diseases, but also as a diagnostic, pharmaceutical reactivity assay, imaging and antibody drug conjugate (ADC).
  • ADC antibody drug conjugate
  • 1 is a graph showing the binding capacity of the 1A10 antibody to human VEGFR2.
  • RAMU lamuslumab
  • hIgG human IgG
  • FIGS. 2A and 2B are graphs showing the efficacy of 1A10 antibody inhibiting VEGF-VEGFR2 binding.
  • Figure 2a shows the efficacy of the 1A10 antibody binds to VEGFR2 to inhibit VEGF-VEGFR2 binding
  • Figure 2b shows the effect of inhibiting the VEGF-VEGFR2 binding already formed 1A10 antibody.
  • RAMU lamuslumab
  • hIgG human IgG
  • FIGS. 3A and 3B are graphs showing the effect of inhibiting proliferation by treatment with 1A10 antibody alone and in combination with 1A10 antibody and ramusumab against vascular endothelial cells, HUVEC.
  • Figure 3a induced cell growth with VEGF
  • Figure 3b was carried out without the induction of cell growth by VEGF.
  • RAMU lamuslumab
  • hIgG human IgG
  • 4A and 4B show the activity of the 1A10 antibody inhibiting tubulation and invasion of vascular endothelial cells.
  • FIG. 5 shows the efficacy of 1A10 antibody inhibiting VEGFR2 cell signaling. Reduction of VEGFR2 downstream signaling by the 1A10 antibody, ramusumab and bevacizumab was confirmed using Western blot.
  • the extracellular domain (ECD) region of the VEGFR2 protein was produced using animal cells and used as an antigen.
  • DNA in the form of the hinge of the human IgG1 and the Fc region (CH 2 -CH 3 ) at the C-terminus of the ECD was cloned into a pCEP4 vector (Invitrogen, Cat. No. V044-50).
  • the cloned vector was temporarily transformed into FreeStyle TM 293F (Invitrogen, Cat. No. R790-07) cells to obtain a VEGFR2-ECD Fc fusion protein. Phage bio-panning was performed using the VEGFE2-ECD Fc fusion protein and opal library.
  • Antibody libraries were obtained in phage form using VCSM13 helper phage and used for panning.
  • the number of library phages that bind to the first antigen was used 10 12 .
  • Panning rounds were carried out up to 4 rounds, and a panning strategy in which a high affinity phage can be selectively screened was selected. As the number of panning rounds increased, the amount of antigen was reduced and the number of washings was increased. .
  • the number of phages bound to the target antigen was ER2537. E. coli was used to titrate as follows. Binder phage obtained in each round of bio-panning was eluted with pH2.5 glycine buffer.
  • ER2537 which was incubated overnight in SB culture, was passaged by diluting to 1/200 using fresh SB culture. Subsequently, further incubation at 37 ° C. for 3 hours was allowed to reach log phage. 100 ⁇ l of fresh ER2537 and 10 ⁇ l of diluted phages were mixed in a 1.5 ml tube, incubated for 30 minutes and then plated on ampicillin LB plates. Subsequently, phage counts were determined by applying colony number and dilution factor produced by overnight incubation at 37 ° C. Binder phage obtained in each round of bio-panning was infected by ER2537 and maintained in colony form to confirm binding to each antigen by ELISA.
  • Colonies obtained by infecting the binder phage were inoculated into SB culture and then cultured to OD 600 up to 0.5. Subsequently, 0.5 mM IPTG was added and shaken at 30 ° C. to induce Fab protein overexpression.
  • Fab proteins were purified using TES buffer. Purified Fab protein was treated to plates coated with VEGFR2-ECD Fc protein. After treatment with the secondary antibody, color development was performed with Absignal (AbClon, cat. # AbC3001) to measure the OD 450 value using an ELISA reader (Victor X3 PerkinElmer).
  • Antibody clones selected for specific binding to VEGFR2 were sequenced using phagemid plasmids and known primer sets (Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press) The sequencing analysis confirmed the sequence of the variable region. IgG conversion was performed by selecting 1A10 having excellent binding ability to VEGFR2 among the selected antibodies, and the nucleotide sequences of the variable regions of the selected 1A10 antibody are shown in Table 1.
  • CDR complementarity determining region
  • IgG conversion 1A10 antibody binds to VEGFR2 was confirmed using ELISA. Dilutions were sequentially 1: 4 up to 800 ng / well (well) to confirm binding to VEGFR2 at 8 concentrations (FIG. 1).
  • VEGF-VEGFR2 The effect of the 1A10 antibody on the binding of VEGF-VEGFR2 was confirmed using ELISA. After VEGF was coated on 96-well plates, VEGFR2 and antibody were mixed and reacted for 1 hour. In order to detect the antibody bound to VEGF, anti-human IgG-Fc secondary antibody was reacted and then developed using TMB (FIG. 2A).
  • ELISA confirmed whether the binding of pre-formed VEGF-VEGFR2 is regulated by the 1A10 antibody.
  • VEGFR2 was pre-reacted with the coated VEGF.
  • the antibody which failed to bind was washed with PBS.
  • the bound antibody was reacted with anti-human IgG-Fab secondary antibody and then developed using TMB (FIG. 2B).
  • the 1A10 antibody binds to VEGFR2 and inhibits the binding of VEGF and VEGFR2, and also inhibits the binding of the already formed VEGF-VEGFR2.
  • Example 3 Comparison of vascular endothelial growth inhibition efficacy of 1A10 antibody
  • vascular endothelial cell proliferation inhibitory effect a cell viability assay was performed.
  • Cell viability analysis was performed on representative vascular endothelial cells (HUVECs) overexpressing VEGFR2 alone or in combination with ramusumab.
  • 1A10 antibody and ramusumab were mixed and used in a 1: 1 ratio (weight ratio).
  • HUVEC Longza, Cat No. CC-2519, 3,500 cells / well
  • cells were dispensed in 96-well plates and incubated for 24 hours.
  • the cells were reacted for 6 hours in 1% FBS, and the purified antibody was treated at 8 concentrations by diluting 1: 4 sequentially up to 40 ⁇ g / ml. After 1 hour of treatment, VEGF was treated to a final concentration of 50 ng / ml and after 72 hours, cell viability assay was performed. As shown in Figure 3a, it was confirmed that the 1A10 antibody inhibits the growth of vascular endothelial cells at the same level as ramuslumab when treated with a single antibody. However, it was not confirmed that the growth inhibitory activity specifically increased when co-administration of 1A10 antibody and ramusumab. In addition, it was confirmed that vascular endothelial cells cultured in normal medium without induction of VEGF did not induce growth inhibition in both 1A10 antibody and ramusumab antibody (FIG. 3B).
  • Vascular endothelial cells can be formed by forming the vascular capillary by the movement of endothelial cells. Therefore, the effect of 1A10 antibody on the capillary formation of endothelial cells was confirmed.
  • 150 ⁇ l of Matrigel was coated on a 48-well plate and polymerized at 37 ° C. for 2 hours.
  • HUVECs were inoculated into Matrigel and the antibody was extracted and 50 ng / ml of VEGF was added. Morphological changes of the cells were observed under a microscope and analyzed using Angiogenesis Analyzer of Image J (FIG. 4A).
  • vascular endothelial cells One of the other characteristics of vascular endothelial cells is that the movement of endothelial cells causes the destruction and penetration of their basement membrane. Therefore, the effect of the 1A10 antibody on the invasion of endothelial cells was investigated. Invasion of HUVECs was carried out in vitro using a transwell chamber system with a polycarbonate filter. The bottom of the filter was coated with gelatin and the top of the filter was coated with Matrigel. 50 ng / ml of VEGF and 1A10 antibody were added to the lower well containing 600 ⁇ l of the culture solution, and the chamber was placed therein, followed by incubation for 20 hours. Cells were fixed with 70% methanol, stained with hematoxylin / eosin, and the total cell in one filter was quantified under the microscope to determine the extent of cell invasion (FIG. 4B).
  • the 1A10 antibody inhibited angiogenesis by inhibiting tubulation and invasion, which are main characteristics of angiogenesis of HUVECs of vascular endothelial cells.
  • the signaling system was then activated with 50 ng / mL VEGF for 10 minutes, followed by cell extracts (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1 mM NaF, Cell extracts were obtained by adding 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM PMSF and protease inhibitor cocktail (Sigma).
  • the protein of the cell extract was then analyzed using Western blot method. PVEGFR2 (# 4991), VEGFR2 (# 2472), ERK (# 4695) and pERK (# 4370) antibodies (Cell Signaling Technology) were used for this analysis.
  • Actin (AbClon, # Abc-2002) was used as a loading control. Each protein was analyzed using HRP bound anti-rabbit antibody (Pierce, # 31463) and Absignal (AbClon, # AbC-3001) reagents.
  • p (phosphorylation) -VEGFR2 and p-ERK proteins were decreased when treated with 1A10 antibody alone.

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Abstract

본 발명은 혈관신생관련 질환인 황반변성 및 암 예방 또는 치료에 이용되는 신규한 VEGFR2 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 혈관내피세포에서 과발현되는 VEGFR2에 특이적으로 결합하는 항체이다. 본 발명의 항체는 종래의 VEGFR2 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다. 본 발명의 항체는 단독처리 시 기존에 사용되고 있는 라무시루맙과 동등한 혈관내피세포 성장 저해 능력을 갖기 때문에, 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.

Description

VEGFR2에 특이적으로 결합하는 항체
본 발명은 대한민국 산업통상자원부의 지원 하에서 과제번호 1415118385에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국산업기술진흥원, 연구사업명은 "국제공동기술개발사업", 연구과제명은 "혁신 에피톱 발굴플랫폼기술 기반 글로벌 항체 신약 개발", 주관기관은 앱클론(주), 연구기간은 2011.11.01-2014.10.31이다.
본 특허출원은 2015년 11월 30일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허 출원 제10-2015-0168859호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 인간 VEGFR2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2) 관련 질환, 특히 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 VEGFR2 항체에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)은 내피세포의 성장, 분열, 이동 등에 의하여 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작으로, 상처의 치유나 여성의 생리주기를 포함하는 정상적인 성장과정에서 중요한 역할을 담당하고 있다. 하지만 비정상적인 혈관신생은 황반변성(macular degeneration; MD), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 암의 성장과 전이(metastasis), 건선(psoriasis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 만성염증(chronic inflammation) 등의 질환에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Risau. Nature. 386(6626):671-674 (1997), Carmeliet and Jain. Nature. 407(4801):249-257 (2000)).
이러한 혈관신생의 유발인자는 대표적으로 혈관내피세포 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)가 있다. VEGF는 성체에서의 혈관신생(angiogenesis) 뿐만 아니라, 배아 발생에서의 혈관발달(vasculogenesis)을 조절하는 기능을 하는 중요한 인자이다. 현재 다섯 종류의 VEGF(VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PLGF)가 밝혀져 있으며, 이들은 VEGF 수용체(VEGFR) 1, 2 및 3과 헤파린 설페이트 프로테오클리칸(heparin sulphate proteoglycans; HSPGs) 및 뉴로필린(NRPs) 등의 보조 수용체에 결합하는 것으로 알려져 있다.
여러 종류의 수용체 중에서, VEGF는 VEGFR1과 VEGFR2에 매우 높은 친화도로 결합하며, 주로 VEGFR2를 통하여 혈관내피세포의 증식과 이동 등의 혈관신생 작용 기작을 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 VEGF 및 VEGFR2는 혈관신생관련 질환을 억제하기 위한 주요 표적이 되어왔다(Ellis and Hicklin. Nat Rev Cancer. 8(8):579-591 (2008); Youssoufian et al. Clin Cancer Res. 13(18Pt2):5544s-5548s. (2007)).
VEGFR2를 표적하는 항체들 중에서 승인되어 사용되고 있는 항체는 라무시루맙(ramucirumab)으로, 시람자(cyramza)로 상업화되어 이에 대한 연구가 많이 이루어져 있다. 라무시루맙은 완전 인간 Fab 라이브러리로부터 선별된 단일클론항체로서 대장암, 비소성폐암 및 위암에 이용이 승인되어 이용되고 있다(Spratlin et al. J Clon Oncol. 28(5):780-787 (2010); Spratlin et al. Future Oncol . 6(7):1085-1094 (2010); Aprile et al. Drugs. 73(18);2003-2015 (2013); Chan et al. Biologics. 22(9):93-105 (2015)).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 VEGFR2를 표적하여 혈관신생을 저해하는 항암 치료제인 라무시루맙보다 우수하거나 또는 동등한 활성을 보이는 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 항체가 VEGFR2에 대한 우수한 결합능을 나타내면서도, 라무시루맙과 동등한 혈관내피세포 성장 억제능을 가지며, 혈관신생 및 혈관내피세포 침입 저해능을 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생관련 질환 진단 및 의약 반응성(drug responsiveness) 분석 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생관련의 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 CDRH3, 및
(b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3.
본 발명자들은 VEGFR2를 표적하여 혈관신생을 저해하는 항암 치료제인 라무시루맙보다 우수하거나 또는 동등한 활성을 보이는 항체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 항체가 VEGFR2에 대한 우수한 결합능을 나타내면서도, 라무시루맙과 동등한 혈관내피세포 성장 억제능을 가지며, 혈관신생 및 혈관내피세포 침입 저해능을 가짐을 확인하였다.
본 명세서에서, 용어 “라무시루맙(Ramucirumab)”은 미국 특허 제7,498,414 B2호에 개시된 항체를 의미한다.
본 발명의 항체는 VEGFR2 발현의 세포에 대하여 우수한 살상능 또는 증식 억제능을 갖는다. 본 명세서에서, 혈관신생관련 질환 저해효과를 언급하면서 사용되는 용어 “살상” 또는 “증식 억제”는 동일한 의미로 혼용된다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이고, 다른 구현예에 따르면, 감마 1(IgG1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 일 구현예에 따르면, 카파형이다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 Fab 형태 또는 IgG1 형태이다.
본 명세서에서, 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄 및 경쇄에는 각각 3개의 CDR(중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3))이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 VEGFR2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, VEGFR2를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제 4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
*분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 중쇄 가변영역은 서열목록 제8서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 경쇄 가변영역은 서열목록 제10서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 항체 CDR 서열은 종래 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성(similarity)이 매우 낮아, 상기 서열의 독특함이 있다. 예를 들어, BLSAT 검색(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 상동성이 가장 높은 것으로 조사된 미국 특허 제7,947,809호에 개시된 단백질은 본 발명의 항체와 CDRH3 서열 상동성은 71%로 낮고, CDRL3의 서열 상동성은 거의 없으며, 전체 CDR 서열 상동성이 50% 미만이다. 더욱이 미국 특허 제7,947,809호에 기재된 항체는 글루카곤 수용체(glucagon receptor)를 인지하는 항체로서, 본 발명의 항체와 그 타겟이 상이하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제8서열의 아미노산 서열을 포함하는 VEGFR2에 대한 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제10서열의 아미노산 서열을 포함하는 혈관내피세포에 대한 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
VEGFR2 항체를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 80%, 90% 또는 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵 세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 VEGFR2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 VEGFR2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서, 용어 “혈관신생관련 질환”은 혈관의 생성으로부터 야기되는 질환을 의미한다. 본 발명의 혈관신생관련 질환은 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 암, 건선, 류마티스성 관절염, 만성염증, 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병 및 신경퇴행성 질환 등을 포함하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 VEGFR2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 혈관내피세포의 성장을 저해하고, 혈관 형성 및 혈관내피세포의 침입을 저해하는바(도 3 및 4), 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 암의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생관련의 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 상기 조성물을 필요로 하는 대상체(개체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
조성물의“치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다. 본 명세서에서 사용된 용어, "대상체"는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명인 혈관신생관련의 질환의 예방 또는 치료방법의 경우, 본 발명의 일 양태인 혈관신생관련의 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 항체는 진단, 예컨대 혈관신생관련 질환, 질병(diseases) 또는 상태(conditions)를 진단하는 데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 혈관신생관련 질환, 질병 또는 상태의 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는 상술한 본 발명의 VEGFR2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 본 발명의 약제학적 조성물과 동일한 질환을 진단하는바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 항체는, 본 발명의 항체가 환자에게 의약 반응성(drug responsiveness)이 있는지 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 의약 반응성(drug responsiveness) 분석 키트를 제공한다.
본 발명의 분석 키트는, 특정의 환자가 본 발명의 항체에 대하여 의약 반응성이 있는지 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 환자의 세포에 본 발명의 항체를 처리한 경우, 본 발명의 항체가 결합하는 것으로 결과가 나오면, 이 환자는 본 발명의 항체에 대하여 의약 반응성이 있는 것으로 판정할 수 있다.
상술한 키트는 항체를 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 암세포를 둘러싸고 있는 혈관내피세포 표면에 있는 수용체를 검출하는 데 이용될 수 있다. 본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차항체로서의 VEGFR2 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 VEGFR2 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 VEGFR2 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.
상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4,γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 그 단독으로도 혈관신생관련 질환을 치료하는 데 이용될 수 있지만, VEGFR2-발현 세포를 타겟팅 할 수 있기 때문에 다른 약물에 결합시켜 ADC(antibody drug conjugate) 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 약물을 포함하는 항체 의약 컨쥬게이트(ADC)를 제공한다.
본 발명의 항체에 결합되는 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 화학물질, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토카인, 케모카인, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질을 포함하며, 보다 구체적으로 다음과 같은 항암제이다: 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 디에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5’-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파아지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴,파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁소텔 및 탁솔.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 신규한 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 신규한 아미노산 서열을 포함하는 VEGFR2에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 각각의 핵산 분자, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료방법, 진단 키트 및 의약 반응성 분석 키트에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 항체는 본 발명의 항체는 혈관내피세포에서 과발현되는 VEGFR2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 라무시루맙과는 서로 상이한 에피토프에 결합하는 항체이며, 종래의 VEGFR2 타겟 항체들의 CDR 서열과 비교하여 상동성이 매우 낮아, 그 서열의 독특함이 있다.
(c) 본 발명의 항체는 라무시루맙과 동등한 활성으로, 혈관신생관련 세포의 성장 저해, 혈관 형성 저해 및 혈관내피세포의 침입 저해 활성이 있는바, 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.
(d) 본 발명의 항체의 혈관내피세포의 성장 저해 활성에 의해, 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
(e) 본 발명의 항체는 혈관신생관련 질환 치료제로서 뿐만 아니라, 진단, 의약 반응성 분석, 이미징 및 ADC(antibody drug conjugate)로서도 이용될 수 있다.
도 1은 1A10 항체가 인간 VEGFR2에 결합하는 결합능을 보여주는 그래프이다. RAMU(라무시루맙) 및 hIgG(인간 IgG)를 각각 양성대조군 및 음성대조군으로 이용하였다.
도 2a 및 도 2b는 1A10 항체가 VEGF-VEGFR2 결합을 저해하는 효능을 보여주는 그래프이다. 도 2a는 1A10 항체가 VEGFR2와 결합하여 VEGF-VEGFR2 결합을 저해하는 효능을 나타내며, 도 2b는 1A10 항체가 이미 형성된 VEGF-VEGFR2 결합을 저해하는 효능을 나타낸다. RAMU(라무시루맙) 및 hIgG(인간 IgG)를 각각 양성대조군 및 음성대조군으로 이용하였다.
도 3a 및 도 3b는 혈관내피세포인 HUVEC에 대한 1A10 항체의 단독처리 및 1A10 항체와 라무시루맙의 병용처리에 의한 증식 억제 효능을 보여주는 그래프이다. 도 3a는 VEGF로 세포성장을 유도하였으며, 도 3b는 VEGF에 의한 세포성장의 유도가 없이 실험을 실시하였다. RAMU(라무시루맙) 및 hIgG(인간 IgG)를 각각 양성대조군 및 음성대조군으로 이용하였다.
도 4a 및 도 4b는 1A10 항체가 혈관내피세포의 관형성 및 침입을 저해하는 활성을 보여준다.
도 5는 1A10 항체가 VEGFR2 세포 신호전달을 억제하는 효능을 보여준다. 1A10 항체, 라무시루맙 및 베바시주맙에 의한 VEGFR2 다운스트림 시그널링의 감소를 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: VEGFR2에 대한 항체 개발
항체 개발을 위해 VEGFR2 단백질의 세포 외부 도메인(extracellular domain, ECD) 부위를 동물세포를 이용하여 생산한 후 항원으로 이용하였다. ECD의 C-말단에 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 부위(CH2-CH3)가 결합된 형태의 DNA를 pCEP4 벡터(Invitrogen, Cat. No. V044-50)에 클로닝하였다. 이어서, FreeStyleTM 293F(Invitrogen, Cat. No. R790-07) 세포에 상기 클로닝된 벡터를 일시적으로 형질전환시켜, VEGFR2-ECD Fc 융합 단백질을 확보하였다. 상기 VEGFE2-ECD Fc 융합 단백질과 오팔 라이브러리를 이용하여 파지 바이오-패닝(bio-panning)을 실시하였다. 항체 라이브러리는 VCSM13 헬퍼 파지(helper phage)를 이용하여 파지 형태로 수득하여 패닝에 이용하였다. 처음 항원과 결합시키는 라이브러리 파지의 수는 1012을 이용하였다. 패닝 라운드(panning round)는 4 라운드까지 실시하였으며, 친화도가 높은 파지가 선택적으로 잘 선별될 수 있는 패닝 전략으로 패닝 라운드 횟수가 늘어감에 따라 항원의 양을 줄이고 세척 횟수는 늘리는 방법을 적용하였다. 타겟 항원에 결합한 파지의 수는 ER2537 이. 콜라이(E. coli)를 이용하여 하기와 같이 적정하였다. 바이오-패닝 각 라운드에서 얻은 바인더 파지(binder phage)를 pH2.5 글라이신 완충액으로 용출하였다. SB 배양액에서 하룻밤동안 배양한 ER2537을 새로운 SB 배양액을 이용하여 1/200으로 희석하여 계대하였다. 이어서, 3시간 동안 37℃에서 추가 배양하여 로그 파지(log phage)에 도달하도록 하였다. 100 ㎕의 신선한 ER2537과 10 ㎕의 희석된 파지를 1.5 ㎖ 튜브에서 혼합한 다음, 30분 동안 배양한 후 암피실린(ampicillin) LB 플레이트에 도말하였다. 이어서, 37℃에서 하룻밤동안 배양하여 생성된 콜로니(colony) 수와 희석 인자를 적용하여 파지 수를 측정하였다. 바이오-패닝 각 라운드에서 얻은 바인더 파지는 ER2537에 감염시켜 콜로니 형태로 유지한 상태에서 ELISA 방법으로 각 항원에 대한 결합여부를 확인하였다. 바인더 파지를 감염시켜 얻은 콜로니를 SB 배양액에 접종한 다음 OD600에서 0.5가 될 때까지 배양하였다. 이어서, 0.5 mM의 IPTG를 넣고 30℃에서 셰이킹(shaking) 배양하여 Fab 단백질이 과발현되도록 하였다. TES 완충액을 이용하여 Fab 단백질을 정제하였다. 정제된 Fab 단백질을 VEGFR2-ECD Fc 단백질이 코팅된 플레이트에 처리하였다. 2차 항체를 처리한 후, 앱시그널(Absignal)(AbClon, cat. #. AbC3001)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3 PerkinElmer)를 이용하여 OD450 값을 측정하였다. VEGFR2에 특이적으로 결합하는 것으로 선별된 항체 클론은 파지미드(phagemid) 플라스미드와 공지된 프라이머 세트(Phage display: a laboratory manual, Carlos Barbas III, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press)를 이용하여 시퀀싱(sequencing) 분석을 통해 가변부위의 염기서열을 확인하였다. 선별된 항체 중 VEGFR2에 대한 결합능이 우수한 1A10를 선별하여 IgG 전환(conversion)을 실시하였으며, 선별된 1A10 항체의 가변부위의 염기서열은 표 1과 같다.
1A10 항체의 CDR(complementarity determining region)의 아미노산 서열
경쇄 중쇄
CDR1 TGSSSNIGNYYVY DYDMS
CDR2 ANSHRPS SIYPGDSSTYYADSVKG
CDR3 ATWDASLSGYV EEVAFDY
실시예 2: 1A10 항체가 VEGF-VEGFR2 결합에 미치는 영향 검증
IgG 전환(conversion) 1A10 항체가 VEGFR2에 결합하는지 여부를 ELISA를 이용하여 확인하였다. 최대 800 ng/웰(well)부터 순차적으로 1:4로 희석하여 8개의 농도에서 VEGFR2와의 결합 여부를 확인하였다(도 1).
상기 1A10 항체가 VEGF-VEGFR2의 결합에 미치는 영향을 ELISA를 이용하여 확인하였다. VEGF를 96-웰 플레이트에 코팅한 후, VEGFR2와 항체를 혼합하여 1시간 동안 반응시켰다. VEGF에 결합한 항체를 검출하기 위하여, 항-인간 IgG-Fc 2차 항체를 반응시킨 후 TMB를 이용하여 발색하였다(도 2a).
미리 형성되어 있는 VEGF-VEGFR2의 결합이 상기 1A10 항체에 의해 조절가능한지 여부를 ELISA를 이용하여 확인하였다. VEGF를 96-웰 플레이트에 코팅한 후, VEGFR2를 코팅된 VEGF와 미리 반응시켰다. VEGF-VEGFR2 복합체가 형성된 웰에 상기 항체를 반응시킨 후, 결합하지 못한 항체를 PBS로 세척하였다. 결합한 항체를 항-인간 IgG-Fab 2차 항체와 반응시키고 이어서, TMB를 이용하여 발색하였다(도 2b).
그 결과, 1A10 항체는 VEGFR2와 결합하여 VEGF와 VEGFR2의 결합을 저해하며, 이미 형성된 VEGF-VEGFR2의 결합 또한 저해하는 것을 확인하였다.
*실시예 3: 1A10 항체의 혈관내피세포 성장 억제 효능 비교
혈관내피세포 증식 억제 효능을 확인하기 위하여 세포 생존율 분석(cell viability assay)을 실시하였다. 세포 생존능 분석은 VEGFR2가 과발현되는 대표적인 혈관내피세포(HUVEC)를 대상으로 단독 혹은 라무시루맙과 병용처리하여 실시하였다. 병용처리의 경우 1A10 항체와 라무시루맙을 1:1 비율(중량비)로 혼합하여 이용하였다. 96-웰 플레이트에 HUVEC(Lonza, Cat No. CC-2519, 3,500 세포/웰) 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. VEGF에 의해 유도되는 세포 성장을 확인하기 위하여, 1% FBS에서 6시간동안 반응시키고 정제된 항체를 최대 40 ㎍/㎖부터 순차적으로 1:4로 희석하여 8개 농도로 처리하였다. 1시간 처리 후, 최종 농도가 50 ng/㎖이 되도록 VEGF를 처리하고 72시간 후 세포 생존능 분석을 실시하였다. 도 3a에서 보여주는 바와 같이, 1A10 항체는 단일항체 처리 시 라무시루맙과 동등한 수준으로 혈관내피세포의 성장을 저해하는 것을 확인하였다. 하지만 1A10 항체와 라무시루맙의 병용투여 시 특이적으로 성장 저해 활성이 증가하는 것은 확인할 수 없었다. 또한 VEGF에 의한 유도 없이 정상 배지에서 배양한 혈관내피세포에서는 1A10 항체와 라무시루맙 항체 모두에서 성장 저해를 유도하지 않는 것을 확인하였다(도 3b).
*실시예 4: 1A10 항체의 혈관내피세포의 관형성 및 침입에 대한 영향
혈관내피세포는 내피 세포의 이동에 의한 혈관형태의 모세관 형성이 이루어져야 신생 혈관이 형성될 수 있다. 따라서 1A10 항체가 내피 세포의 모세관 형성에 미치는 영향을 확인하였다. 48-웰 플레이트에 150 ㎕의 마트리겔을 코팅하고, 37℃에서 2시간 동안 중합시켰다. HUVEC을 마트리겔에 접종시키고 상기 항체를 추기한 후, 50 ng/㎖의 VEGF를 더하였다. 세포의 형태학적 변화를 현미경 하에서 관찰하였고, 이미지 J의 혈관신생 분석기(Angiogenesis Analyzer)를 이용하여 분석하였다(도 4a).
혈관내피세포의 다른 특성 중 하나는 내피 세포의 이동에 의해 자신의 기저막(basement membrane)의 파괴 및 관통이 이루어진다는 것이다. 따라서 상기 1A10 항체가 내피 세포의 침입에 미치는 효과를 조사하였다. HUVEC의 침입은 폴리카보네이트 필터가 있는 트랜스웰 챔버 시스템을 이용하여 인 비트로에서 실시하였다. 상기 필터의 하부를 젤라틴으로 코팅하고, 필터의 상부를 마트리겔로 코팅하였다. 600 ㎕의 배양액이 포함된 하부 웰에 50 ng/㎖의 VEGF 및 1A10 항체를 첨가한 후 챔버를 넣고 상부에 HUVEC을 넣어준 후 20시간 동안 항온 처리하였다. 70%의 메탄올로 세포를 고정시키고, 헤마톡실린/에오신으로 염색한 다음, 현미경 하에서 하나의 필터 내의 전체 세포를 수치화하여 세포 침입 정도를 결정하였다(도 4b).
상기 결과를 통해 1A10 항체가 혈관내피세포의 HUVEC의 혈관신생작용의 주요 특성인 관형성과 침입을 저해함으로써 혈관신생작용을 저해함을 확인하였다.
실시예 5: 1A10 항체의 VEGFR2 세포 신호전달 억제 효능
1A10 항체가 VEGFR2 과발현 혈관내피세포에 대해 나타나는 성장 저해 효능의 작용기전을 분석하기 위해서 VEGFR2의 세포 내 신호전달계 억제 효능을 분석하였다. 혈청이 없는 배양액에서 6시간 배양한 HUVEC 세포에 10 ㎍/㎖의 1A10 항체 더하여 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 50 ng/㎖의 VEGF로 신호전달계를 10분 동안 활성화시킨 후, 세포 추출액(50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4 , 1 mM PMSF 및 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma))을 추가하여 세포 추출물을 확보하였다. 이어서, 웨스턴 블롯(Western blot) 방법을 이용하여 세포 추출물의 단백질을 분석하였다. 상기 분석을 위해서 pVEGFR2(#4991), VEGFR2(#2472), ERK(#4695) 및 pERK(#4370) 항체(Cell Signaling Technology)를 이용하였다. 로딩 컨트롤로 액틴(actin)(AbClon, #Abc-2002)을 이용하였다. HRP가 결합된 항-래빗 항체(Pierce, #31463)와 앱시그널(AbClon, #AbC-3001) 시약을 이용하여 각 단백질을 분석하였다.
도 5에서 보여주는 바와 같이, 1A10 항체를 단독 처리하였을 때 p(인산화)- VEGFR2 및 p-ERK 단백질이 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과는 1A10 항체를 단독처리 시 라무시루맙과 동등하게 VEGFR2의 인산화를 조절하여, 하위 신호전달 체계가 억제됨 확인하였다. 특히, 세포 성장에 관여하는 ERK의 인산화에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 다음을 포함하는 VEGFR2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor2)에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    (a) 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열목록 제1서열의 CDRH1, 서열목록 제2서열의 CDRH2 및 서열목록 제3서열의 CDRH3, 및
    (b) 다음의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 서열목록 제4서열의 CDRL1, 서열목록 제5서열의 CDRL2 및 서열목록 제6서열의 CDRL3.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열목록 제8서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열목록 제10서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 서열목록 제8서열의 아미노산 서열을 포함하는 VEGFR2에 대한 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  6. 서열목록 제10서열의 아미노산 서열을 포함하는 VEGFR2에 대한 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  8. 상기 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 상기 제 8 항의 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포.
  10. (a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 혈관신생관련 질환은 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 암, 건선, 류마티스성 관절염, 만성염증, 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생관련 질환의 예방 또는 치료방법.
  13. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 VEGFR2에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 혈관신생관련 질환 진단 또는 의약 반응성(drug responsiveness) 분석 키트.
PCT/KR2016/013735 2015-11-30 2016-11-25 Vegfr2에 특이적으로 결합하는 항체 WO2017095088A1 (ko)

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