WO2017094705A1 - Ｇｍ３促進炎症抑制剤及び炎症性サイトカイン産生抑制剤 - Google Patents

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WO2017094705A1
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ganglioside
inflammation
promoted
fatty acid
lps
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仁一 井ノ口
裕考 狩野
サンドロ ソニーノ
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公益財団法人野口研究所
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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to a GM3-promoting inflammation inhibitor and an inflammatory cytokine production inhibitor.
  • inflammatory cytokines are secreted from activated tissue macrophages and act on nearby fat cells to express GM3 causing insulin resistance. It has been shown to be induced.
  • GM3 synthetase knockout mice in which GM3 production does not occur, not only insulin resistance is improved, but also production of inflammatory cytokines from macrophages located upstream is reduced, and chronicity in obesity It is clear that they are free from inflammatory conditions. This strongly suggests that GM3 is the main body of endogenous ligand that causes chronic inflammation in obesity.
  • gangliosides including GM3 have a large number of molecular species due to the diversity of ceramide structure and sugar chain portion, and many of them are expressed in the immune system.
  • GM3 various ganglioside molecular species have molecular mechanisms for inducing and suppressing chronic inflammation during obesity.
  • studies using various ganglioside molecular species have been attempted in many cell types, but there is a unified knowledge about the activation and suppression effects on inflammatory responses by gangliosides including GM3. Is hardly obtained. The cause is thought to be because the reports so far are a collection of knowledge obtained at the time when the ganglioside molecular species and true target cells that reflect the actual disease state are still unclear.
  • GM1, GD1a, GD1b Some gangliosides having a sugar chain structure higher than GM1 (GM1, GD1a, GD1b) have Toll-like receptor (TLR) due to various pathogen-related molecular patterns (PAMPs). It has an action of suppressing activation, and GM3 has neither an inhibitory effect nor an activation effect (Non-patent Document 1).
  • this report is based on an experiment using unfractionated human peripheral blood mononuclear cells, and it is not clear at all whether the contribution of innate immune system cells or lymphoid cells is caused. It is difficult to accurately define the interaction of the immune system and the extent of its effects.
  • Nonpatent literature 2 the result which shows a result completely opposite to nonpatent literature 1 is shown by I. Jou et al. (Nonpatent literature 2). According to this report, it was shown that some gangliosides (GM1, GD1a, GD1b, GT1b, GQ1b, and mixtures) having a sugar chain structure higher than GM1 activate TLR4 in rat brain nervous system-derived microglia. ing. However, the experimental system used in this report is primarily based on flow cytometric analysis that measures TLR4 internalization and does not directly reflect the actual activation of TLR4 signaling.
  • TNF- ⁇ Tumor Necrosis Factor-alpha
  • Patent Document 1 discloses a prostaglandin E 2 production inhibitor containing sphingolipids such as ganglioside.
  • Prostaglandin E 2 is an inflammatory factor having a fever during inflammation and a vascular permeability enhancing action, but no specific molecular species of ganglioside that has an anti-inflammatory effect is shown.
  • the present invention has been made in view of the background art described above, and an object thereof is to provide a novel anti-inflammatory agent containing a substance having an inflammation-inhibiting action as an active ingredient.
  • GM3 has not been clarified so far, by constructing a system that accurately reflects the activity of ganglioside present in serum. Has found a strong inflammation-inducing action. Furthermore, the strong inflammation suppression effect by serum ganglioside molecular species other than GM3 was discovered.
  • GM3 promotes an “inflammatory reaction caused by activation of macrophages by LPS (lipopolysaccharide)”, and GD3, GD1a having a specific sugar chain structure with respect to the sugar chain portion, It has also been found that GD1b, GT1b, GQ1b and the like have an anti-inflammatory action that antagonizes “GM3-dependent macrophage activation”.
  • GM3 having a specific structure with respect to the fatty acid of the ceramide moiety has an anti-inflammatory action that antagonizes the inflammatory reaction caused by activation of macrophages by LPS, thereby completing the present invention. It came.
  • a GM3-promoted inflammation inhibitor comprising a substance that suppresses inflammation promoted by GM3 as an active ingredient.
  • GM3-promoted inflammation inhibitor according to [1], wherein the substance that suppresses inflammation promoted by GM3 is a ganglioside having two or more sialic acids.
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3;
  • R 2 —C ( ⁇ O) — represents a fatty acid residue having 18 or less carbon atoms or an unsaturated fatty acid residue having 20 or more carbon atoms.
  • the ganglioside having two or more sialic acids is at least one ganglioside selected from the group consisting of GD1c, GD1a, GT1a, GD3, GD2, GD1b, GT1b, GQ1b, GT3, GT2, GT1c, GQ1c and GP1c.
  • the accelerated inflammation inhibitor as described in [2].
  • An inflammatory cytokine production inhibitor comprising a substance that suppresses the production of inflammatory cytokines promoted by GM3 as an active ingredient.
  • the ganglioside having two or more sialic acids is at least one ganglioside selected from the group consisting of GD1c, GD1a, GT1a, GD3, GD2, GD1b, GT1b, GQ1b, GT3, GT2, GT1c, GQ1c and GP1c.
  • the inflammatory cytokine production inhibitor according to [6].
  • the above-mentioned problems are solved and the above problems are solved, and the effect of suppressing inflammation promoted by GM3 is exhibited. It has the effect of improving sexual inflammatory conditions.
  • the GM3-promoting inflammation inhibitor and inflammatory cytokine production inhibitor of the present invention are safe for humans and the like, and have the effect of reducing burden and side effects on the subject.
  • GM3 is a ganglioside whose expression is increased during obesity, and the GM3-promoting inflammation inhibitor and inflammatory cytokine production inhibitor of the present invention have the effect of suppressing chronic inflammation during obesity.
  • FIG. 1 shows the biosynthetic pathway of the ganglioside molecular species in a mammal. It is a graph which shows the inhibitory effect of LPS dependent TNF- ⁇ production by serum ganglioside mimic. It is a graph which shows the potentiation effect of cooperative TNF- ⁇ production with GM3-specific LPS and the suppression effect by other serum gangliosides (GD1a, GD1b, GT1b, GQ1b, GD3). 2 is a graph showing the concentration-dependent inhibitory action of an inhibitory ganglioside in serum on LPS-dependent TNF- ⁇ production.
  • FIG. 1 shows the biosynthetic pathway of the ganglioside molecular species in a mammal. It is a graph which shows the inhibitory effect of LPS dependent TNF- ⁇ production by serum ganglioside mimic. It is a graph which shows the potentiation effect of cooperative TNF- ⁇ production with GM3-specific LPS and the suppression effect by other serum gan
  • 5 is a graph showing the concentration-dependent inhibitory action of serum-suppressing ganglioside on “cooperative TNF- ⁇ production by LPS and GM3”.
  • 2 is a graph showing the inhibitory effect of inhibitory ganglioside in serum on LPS-dependent TNF- ⁇ production in bone marrow-derived macrophages.
  • 2 is a graph showing the inhibitory action of serum-suppressing gangliosides on “cooperative TNF- ⁇ production by LPS and GM3 in bone marrow-derived macrophages”. It is a graph which shows the enhancement or suppression effect by the ganglioside molecular species with respect to LPS-dependent human IL-6 production.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a predicted enhancement or suppression mechanism of LPS-dependent inflammation by ganglioside molecular species.
  • the GM3-promoting inflammation inhibitor of the present invention comprises a substance that suppresses inflammation promoted by GM3 as an active ingredient. Since a strong inflammation-inducing action by GM3 has not been clarified so far, “an agent that suppresses“ inflammation promoted by GM3 ”” has been found for the first time in the present invention.
  • GM3-promoting inflammation inhibitor refers to an inhibitor having an action of suppressing “GM3-promoted / induced (GM3-dependent) inflammation”.
  • ganglioside refers to a glycosphingolipid having at least one sialic acid bonded to a sugar chain.
  • GM3 refers to “ganglioside GM3”, and in the case of humans, the sugar chain of glycosphingolipid is within the following “”.
  • ⁇ -Neu5Ac- (2-3) ⁇ -Gal- (1-4) - ⁇ -Glc- (1-1) -ceramide represents N-acetyl- ⁇ -neuraminic acid
  • ⁇ -Gal represents ⁇ -galactose
  • ⁇ -Glc represents ⁇ -glucose.
  • the inflammation is promoted by “GM3 in which the fatty acid residue is a saturated fatty acid residue having 20 or more carbon atoms”
  • the “inflammation promoted by GM3” means that “the fatty acid residue has 20 or more carbon atoms”
  • Inflammation promoted by GM3, which is a saturated fatty acid residue of GM3 ”(GM3 that promotes inflammation may be specified in parentheses“ ”).
  • the above “inflammation promoted by GM3” Is more preferably “inflammation promoted by GM3 which may have an OH group as a substituent and whose fatty acid residue is a saturated fatty acid residue having 24 carbon atoms” (GM3 which promotes inflammation). May be specified within parentheses "").
  • some GM3 molecular species include GM3 (fatty acid is a saturated fatty acid having 20 or more carbon atoms) that promotes inflammation, and GM3 (fatty acid that has 18 or less carbon atoms) that suppress inflammation.
  • Certain GM3 or fatty acid is an unsaturated fatty acid having 20 or more carbon atoms (especially an unsaturated fatty acid having 24 carbon atoms), and GM3 having one double bond in the hydrocarbon group of the unsaturated fatty acid. Became clear.
  • the substance that suppresses inflammation promoted by GM3, which is an active ingredient of the GM3-promoted inflammation inhibitor of the present invention, may be composed of one component or two or more components.
  • the substance that suppresses inflammation promoted by GM3 may be isolated or purified from a natural product, or may be synthesized.
  • the “synthesized” includes a composite of a substance (a derivative thereof) existing in nature and a composite of a substance that has not been confirmed to exist in nature.
  • the substance that suppresses inflammation promoted by GM3 is preferably a glycosphingolipid in which a sugar chain is glycosidically bound to ceramide in view of the effects of the present invention, and the sugar chain contains two sialic acids. It is more preferable to have the above.
  • the substance that suppresses inflammation promoted by GM3 may be a derivative of the glycosphingolipid having the same effect as the glycosphingolipid.
  • the substance that suppresses inflammation promoted by GM3 is preferably a ganglioside having two or more sialic acids from the viewpoint of exerting the effects of the present invention and safety.
  • the ganglioside having two or more sialic acids is GD1c, GD1a, GT1a, GD3, GD2, GD1b, GT1b, GQ1b, GT3, GT2, GT1c, GQ1c in terms of exhibiting the effects of the present invention and safety.
  • at least one ganglioside selected from the group consisting of GP1c more preferably at least one ganglioside selected from the group consisting of GD1a, GD3, GD1b, GT1b and GQ1b, and GD1b, GT1b and Particularly preferred is at least one ganglioside selected from the group consisting of GQ1b.
  • a schematic diagram of these gangliosides is shown in FIG. One selected from these can be used alone or in combination of two or more.
  • stimulated by the said GM3 is GM3 which has a structure represented by following formula (1).
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3;
  • R 2 —C ( ⁇ O) — represents a fatty acid residue having 18 or less carbon atoms or an unsaturated fatty acid residue having 20 or more carbon atoms.
  • GM3 having the structure represented by the above formula (1) is a GM3 in which the fatty acid is a hydrocarbon group having 16 to 18 carbon atoms, or a fatty acid in view of the effects of the present invention and safety. It is preferably a hydrocarbon group having 20 or more carbon atoms and GM3 having one double bond in the hydrocarbon group. Further, from the same point, GM3 in which the fatty acid residue has 16 or 18 carbon atoms, or the unsaturated fatty acid residue has 24 carbon atoms in the hydrocarbon group of the unsaturated fatty acid residue. GM3 having one double bond is preferred.
  • the GM3-promoted inflammation inhibitor of the present invention can contain “other ingredients” in addition to the active ingredient that suppresses inflammation promoted by GM3.
  • the “other component” in the GM3-promoted inflammation inhibitor is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose within a range not impairing the effects of the present invention.
  • carrier There is no restriction
  • carrier For example, according to the dosage form etc. which are mentioned later, it can select suitably.
  • the content of the “other components” in the GM3-promoted inflammation inhibitor is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • a dosage form of the GM3 promotion inflammation inhibitor of this invention can select suitably according to the desired administration method which is mentioned later.
  • oral solids tablettes, coated tablets, granules, powders, capsules, etc.
  • oral liquids internal solutions, syrups, elixirs, etc.
  • injections solvents, suspensions, etc.
  • Ointments patches, gels, creams, powders for external use, sprays, inhalation sprays and the like.
  • Examples of the oral solid preparation include, for example, excipients and further additives such as binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring and flavoring agents as necessary, in addition to the active ingredients.
  • Examples of the excipient include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid and the like.
  • Examples of the binder include water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl starch, methylcellulose, ethylcellulose, shellac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone and the like. It is done.
  • Examples of the disintegrant include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, and lactose.
  • Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, and polyethylene glycol.
  • Examples of the colorant include titanium oxide and iron oxide.
  • Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • the oral solution can be produced by a conventional method, for example, by adding additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer to the active ingredient.
  • additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer
  • the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • the buffer include sodium citrate.
  • the stabilizer include tragacanth, gum arabic, and gelatin.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a tonicity agent, a local anesthetic, etc. are added to the active ingredient, and subcutaneous, intramuscular, intravenous use are performed by a conventional method.
  • Etc. can be manufactured.
  • the pH adjusting agent and the buffering agent include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like.
  • the stabilizer include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid, and the like.
  • the isotonic agent include sodium chloride and glucose.
  • the local anesthetic include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
  • the content of the substance that suppresses inflammation promoted by GM3, which is an active ingredient in the GM3-promoted inflammation inhibitor of the present invention is not particularly limited and is appropriately selected according to the purpose.
  • the total amount of the GM3-promoting inflammation inhibitor is 100 parts by mass
  • the total amount of substances that suppress inflammation promoted by GM3 is preferably 0.001 to 100 parts by mass. More preferably, it can be blended in an amount of 0.01 to 99 parts by weight, particularly preferably 0.1 to 95 parts by weight, and still more preferably 1 to 90 parts by weight.
  • mice There are no particular restrictions on the animals to which the GM3-promoted inflammation inhibitor of the present invention is administered.
  • animals For example, humans; mice; rats; monkeys; horses; livestock such as cows, pigs, goats, and chickens; And the like.
  • the administration method of the said GM3 promotion inflammation inhibitor For example, according to the dosage form of the said GM3 promotion inflammation inhibitor, etc., it can select suitably, Oral administration, intraperitoneal administration, In blood Injection, intestinal injection and the like.
  • the dosage of the GM3-promoting inflammation inhibitor is not particularly limited and can be appropriately selected according to the age, weight, desired degree of effect, etc. of the individual to be administered.
  • the daily dose is preferably from 1 mg to 30 g, more preferably from 10 mg to 10 g, particularly preferably from 100 mg to 3 g as the amount of the active ingredient.
  • limiting in particular also as an administration time of the said GM3 promotion inflammation inhibitor According to the objective, it can select suitably, For example, it may administer prophylactically or may be administered therapeutically. .
  • the inflammatory cytokine production inhibitor of the present invention is characterized by containing, as an active ingredient, a substance that suppresses the production of inflammatory cytokines promoted by GM3.
  • the substance that suppresses the production of inflammatory cytokines promoted by GM3 is preferably a ganglioside having two or more sialic acids from the viewpoint of exerting the effects of the present invention and safety.
  • GD1c GD1a, GT1a, GD3, GD2, GD1b, GT1b, GQ1b, GT3, GT2, GT1c, GQ1c in that the ganglioside having two or more sialic acids exerts the effects of the present invention and is safe.
  • at least one ganglioside selected from the group consisting of GP1c more preferably at least one ganglioside selected from the group consisting of GD1a, GD3, GD1b, GT1b and GQ1b, and GD1b, GT1b and Particularly preferred is at least one ganglioside selected from the group consisting of GQ1b.
  • GQ1b is particularly preferred.
  • One selected from these can be used alone or in combination of two or more.
  • stimulated by the said GM3 is GM3 which has a structure represented by following formula (1).
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3;
  • R 2 —C ( ⁇ O) — represents a fatty acid residue having 18 or less carbon atoms or an unsaturated fatty acid residue having 20 or more carbon atoms.
  • GM3 having the structure represented by the above formula (1) is a GM3 having a fatty acid having 16 to 18 carbon atoms, or a fatty acid having 20 carbon atoms from the standpoint of exhibiting the effects of the present invention and safety. It is above, and it is preferable that it is GM3 which has one double bond in this hydrocarbon group. Further, from the same point, GM3 in which the fatty acid residue has 16 or 18 carbon atoms, or the unsaturated fatty acid residue has 24 carbon atoms in the hydrocarbon group of the unsaturated fatty acid residue. GM3 having one double bond is preferred.
  • the inflammatory cytokine production inhibitor of the present invention may contain “other components” in addition to the active ingredient within the range not impairing the effects of the present invention, like the GM3-promoted inflammation inhibitor.
  • the dosage form is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the desired administration method as described above, for example.
  • the method for suppressing or treating inflammation is a method for suppressing or treating inflammation promoted by GM3, and administering a glycosphingolipid in which “glycan having two or more sialic acids” is glycosidically bound to ceramide. Thereby increasing the blood concentration of the glycosphingolipid. Moreover, you may administer the derivative
  • the method for suppressing or treating inflammation according to the present invention is a method for suppressing or treating inflammation promoted by GM3, wherein the blood concentration of the ganglioside is administered by administering a ganglioside having two or more sialic acids. Including a step of raising.
  • the ganglioside having two or more sialic acids is GD1c, GD1a, GT1a, GD3, GD2, GD1b, GT1b, GQ1b, It is preferably at least one ganglioside selected from the group consisting of GT3, GT2, GT1c, GQ1c and GP1c, and is at least one ganglioside selected from the group consisting of GD1a, GD3, GD1b, GT1b and GQ1b. More preferred is at least one ganglioside selected from the group consisting of GD1b, GT1b and GQ1b. One selected from these can be used alone or in combination of two or more.
  • the method for suppressing or treating inflammation according to the present invention is a method for suppressing or treating inflammation promoted by GM3, wherein the ganglioside having the structure represented by the following formula (1) is administered, It includes a step of increasing the blood concentration of ganglioside having the structure represented by formula (1). Moreover, if it has the same effect as the ganglioside having the structure represented by the formula (1), a ganglioside derivative having the structure represented by the formula (1) may be administered.
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3
  • R 2 —C ( ⁇ O) — represents a fatty acid residue having 18 or less carbon atoms or an unsaturated fatty acid residue having 20 or more carbon atoms.
  • GM3 having the structure represented by the above formula (1) is a GM3 in which the fatty acid is a hydrocarbon group having 16 to 18 carbon atoms, or a fatty acid in view of the effects of the present invention and safety. It is preferably a hydrocarbon group having 20 or more carbon atoms and GM3 having one double bond in the hydrocarbon group. Further, from the same point, GM3 in which the fatty acid residue has 16 or 18 carbon atoms, or the unsaturated fatty acid residue has 24 carbon atoms in the hydrocarbon group of the unsaturated fatty acid residue. GM3 having one double bond is preferred.
  • the method for suppressing or treating inflammation of the present invention is a method for suppressing or treating inflammation promoted by GM3, wherein the GM3-promoted inflammation inhibitor is administered by administering the GM3-promoted inflammation inhibitor. It includes a step of increasing blood concentration.
  • means for administering the glycosphingolipid, ganglioside, or GM3-promoting inflammation inhibitor can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the dosage of the glycosphingolipid (ganglioside or GM3-promoting inflammation inhibitor) may be appropriately selected in consideration of symptoms, age, sex, dosage form, administration method, number of administrations per day, and the like.
  • Example 1 [Inflammation-inhibiting action of serum gangliosides other than GM3]
  • Table 1 shows the ganglioside composition in human serum based on the report of Non-Patent Document 3.
  • Human serum mainly contains GM3, followed by GD3, GM2, GD1a, GD1b, GT1b, and “complex ganglioside of GQ1b or higher”.
  • a macrophage-like cultured cell line RAW264.7 cells (0.5% fetal calf-derived serum) from which serum in the medium was removed / reduced was treated. Then, the effect of TLR4 ligand (LPS) stimulation on actual TNF- ⁇ production was examined.
  • TLR4 ligand (LPS) stimulation was examined.
  • the result of the ELISA method is shown in FIG.
  • the leftmost column shows the control
  • the middle column shows the result of adding LPS to the medium
  • the rightmost column shows the result of adding LPS and serum canglioside mimic to the medium.
  • the inflammation by a macrophage activity is promoted, so that the numerical value of a vertical axis
  • serum ganglioside mimic treatment almost completely suppressed TNF- ⁇ production from macrophages by LPS. This result suggests that the ganglioside composition in serum is intended to suppress inadvertent activation of macrophage cells (mainly monocytes and the like) in the circulating blood.
  • FIG. 3 The results are shown in FIG. In FIG. 3, the leftmost column shows the control, and the second column from the left shows the result of adding only LPS to the medium.
  • treatment with GM3 alone significantly increased TNF- ⁇ production by LPS.
  • serum ganglioside molecular species other than GM3 showed an action of strongly suppressing TNF- ⁇ production by LPS.
  • LacCer and GM1 were TNF- ⁇ equivalent to the result of adding LPS alone.
  • GD1a, GD1b, GT1b, GQ1b and GD3 having two or more sialic acids strongly suppressed TNF- ⁇ production by LPS.
  • GD1b, GT1b, and GQ1b remarkably strongly suppressed TNF- ⁇ production by LPS.
  • Example 2 [Inflammation-inhibiting action of various gangliosides in RAW264.7 cells]
  • concentration dependence of the inhibitory action of the complex ganglioside molecular species on the production of inflammatory cytokines induced by LPS and GM3 was examined.
  • mouse macrophage-like RAW264.7 cells produce large amounts of TNF- ⁇ against LPS, which is an E. coli-derived component, and GM3, whose expression is increased during obesity.
  • FIG. 4 The results are shown in FIG. In FIG. 4, the leftmost column shows the control, and the second column from the left shows the result of adding only LPS to the medium. It was found that the inflammation promoted by LPS was suppressed in a concentration-dependent manner by adding each ganglioside (GD1a, GD1b, GT1b and GQ1b).
  • the leftmost column is a control, showing the result of adding only LPS to the medium
  • the second column from the left shows the result of adding only LPS and GM3 to the medium.
  • the 50% inhibitory concentrations for cooperative activation of LPS and GM3 were GD1a: 0.5 ⁇ M, GD1b: 0.5 ⁇ M, GT1b: 0.25 ⁇ M, GQ1b: 0.125 ⁇ M (FIG. 4). 5). It was found that ganglioside molecules having two or more of these sialic acids in the molecule have a large inhibitory effect on cooperative activation by LPS and GM3.
  • Example 3 [Inflammation-inhibiting action of various gangliosides in mouse bone marrow-derived macrophages]
  • the inhibitory effect of serum-suppressing ganglioside on LPS-dependent TNF- ⁇ production in bone marrow-derived macrophages was examined.
  • Bone marrow-derived cells collected from the femur and tibia of C57 / BL6 mice were induced to differentiate for 1 week using 20 ng / mL recombinant macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • BMDM bone marrow-derived macrophage
  • FIG. 6 The results are shown in FIG. In FIG. 6, the leftmost column shows the control, and the second column from the left shows the result of adding only LPS to the medium. It was found that LPS-dependent TNF- ⁇ production (promotion of inflammation) in bone marrow-derived macrophages was suppressed by adding each ganglioside (GD1a, GD1b, GT1b and GQ1b).
  • Bone marrow-derived cells collected from the femur and tibia of C57 / BL6 mice were induced to differentiate for 1 week using 20 ng / mL recombinant macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • Bone marrow-derived maurophage (BMDM) was cultured overnight in DMEM containing 0.5% fetal bovine serum, and then co-administered with LPS (0.5 ng / mL), GM3 (10 ⁇ M), and each glycosphingolipid (10 ⁇ M). Stimulation was performed, and TNF- ⁇ in the culture supernatant after 18 hours was quantified by ELISA.
  • FIG. 7 The results are shown in FIG. In FIG. 7, the leftmost column is a control, showing the result of adding only LPS to the medium, and the second column from the left shows the result of adding only LPS and GM3 to the medium.
  • GD1a, GD1b, GT1b and GQ1b each ganglioside
  • FIG. 6 the inflammation suppression effect by each ganglioside (GD1a, GD1b, GT1b and GQ1b) is more powerful against the macrophage activation induced by GM3 that is up-regulated during obesity. It was suggested that it was played.
  • Example 4 [Formulation of GM3-promoted inflammation inhibitor] ⁇ Tablet >> After uniformly mixing GD1b 20.0 mg, lactose 40 mg, starch 20 mg, and low-substituted hydroxypropylcellulose 5 mg, granules for tableting were produced by a wet granulation method using a hydroxypropylmethylcellulose 8 mass% aqueous solution as a binder. After adding 0.5 mg to 1.5 mg of magnesium stearate necessary to give lubricity to the tableting granules, the tablets were compressed using a tableting machine to obtain tablets.
  • Example 5 [Increasing or suppressing action of various gangliosides in humans] Human peripheral blood-derived monocytes (CD14-positive cells) were mixed with 0.125 ng / mL E. coli lipopolysaccharide (LPS, E) in 0.5% FCS and 25 ng / mL granulocyte / macrophage colony stimulating factor-containing DMEM (Low Glucose). E. coli O111: B4) and 1.25, 2.5, 5.0 ⁇ M N-mix (neutral glycosphingolipid mixture (Glc-Cer, Lac-Cer, Gb3, Gb4))) or each ganglioside molecular species Costimulated. After 18 hours, inflammatory cytokines (IL-6, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ ) secreted into the culture supernatant were quantified using an ELISA method. The results are shown in FIGS.
  • GM3C16 indicates that the fatty acid of GM3 is a hydrocarbon group having 16 carbon atoms.
  • GM3hC24 indicates that the fatty acid of GM3 is a hydrocarbon group having 24 carbon atoms, and the fatty acid has an OH group as a substituent.
  • GM3C24: 1 indicates that the fatty acid of GM3 is a hydrocarbon group having 24 carbon atoms and has one double bond in the hydrocarbon group.
  • GM3C16 As a result of FIGS. 8 to 10, surprisingly, among the GM3 molecular species, “GM3C16”, “GM3C18” and “GM3C24: 1” inhibit the production of IL-6, IL-1 ⁇ and TNF- ⁇ by LPS. The effect was shown. On the other hand, among GM3 molecular species, “GM3C22”, “GM3C24” having no OH group in the fatty acid and having no double bond in the hydrocarbon group, and “GM3hC24” having an OH group in the fatty acid are: IL-6, IL-1 ⁇ and TNF- ⁇ production by LPS was significantly increased.
  • Example 6 [Inflammatory inhibitory action of GM3C16, GM3C18 and GM3C24: 1 in humans]
  • fatty acid has no OH group and does not have a double bond in the hydrocarbon group, and promotes TLR4-selective inflammatory cytokine production caused by “GM3C22” and “GM3C24”
  • TLR4-selective inflammatory cytokine production caused by “GM3C22” and “GM3C24”
  • GM3C22 or “GM3C24” that promotes inflammation is added to monocytes in combination with “GM3C16”, “GM3C18”, or “GM3C24: 1” that suppresses inflammation.
  • TLR4 activator was stimulated with 0.06 ng / mL LPS.
  • the inflammatory cytokine IL-6 secreted into the culture supernatant was quantified using an ELISA method. The results are shown in FIG.
  • GM3C16”, “GM3C18”, and “GM3C24: 1” are not only stimulated by LPS stimulation but also stimulated by the addition of “GM3C22” and “GM3C24”. 6 production was strongly suppressed.
  • “GM3C16”, “GM3C18” and “GM3C24: 1” are more potent during TLR4 activation promoted by the addition of “GM3C22” and “GM3C24” compared to TLR4 activation by LPS alone. It strongly suppressed the production of IL-6.
  • Example 7 [Toll-like receptor selective pro-inflammatory and anti-inflammatory effects by GM3] Inflammation associated with activation of human monocytes is known to be caused by activation of Toll-like receptors (TLRs) on human monocytes.
  • TLRs Toll-like receptors
  • LPS which is an activator for TLR4
  • other TLRs are also used. There are various activators for.
  • TLR4 activator 0.125 ng / mL LPS as TLR4 activator, 5.0 ⁇ g / mL High Mobility Group Box 1 (HMGB1), TLR1 as TLR4 and TLR2 activators, and TLR1 And TLR2 activator 20 ng / mL Pam3Csk4, TLR2 and TLR6 activator 1.0 ng / mL MALP-2, TLR5 activator 50 ng / mL Flagellin, and TLR7 and TLR8 Human monocytes were stimulated with any of the activators 250 ng / mL R-848 and 5 ⁇ M GM3 molecular species. After 18 hours, the inflammatory cytokine IL-6 secreted into the culture supernatant was quantified using an ELISA method. The results are shown in FIGS. 12A and B.
  • the fatty acid has no OH group and the hydrocarbon group does not have a double bond, “GM3C22”, “GM3C24”, and the fatty acid has an OH group.
  • GM3hC24 selectively increased IL-6 production by LPS and HMGB1, which are factors that activate TLR4.
  • other TLR activators did not increase IL-6 production.
  • “GM3C16”, “GM3C18” and “GM3C24: 1” showed an effect of suppressing IL-6 production by LPS and HMGB1 which are factors that activate TLR4 (FIG. 12A). .
  • This inhibitory effect was also observed for IL-6 production by Pam3Csk4, which is a factor that activates TLR2, but the inhibitory effect on IL-6 production by LPS and HMGB1, which are factors that activate TLR4, was better. Was more prominent.
  • GD1a, GD1b and GT1b are contained in an amount of about 0.5 to 1.0 ⁇ M with respect to the most dominant GM3 (5 ⁇ M) (Table 1). From this, in human blood containing GM3 and complex ganglioside, it is considered that the activation of innate immune cells by LPS is subjected to very strong suppression.
  • GD1b, GT1b, and GQ1b which were very potent in suppressing TNF- ⁇ production by LPS in Examples, are common in that they are biosynthesized from GD3 in mammals (FIG. 1).
  • innate immune cells that circulate in the blood are activated only after reaching the infected tissue or target organ to cause an immune response.
  • careless innate immune activation in the blood is considered to be one of the factors that cause systemic immune dysfunction such as septic shock and chronic inflammatory diseases.
  • Blood gangliosides are thought to play a role in preventing the activation of circulating innate immune cells, and by artificial administration of these, uncontrolled chronic inflammatory diseases and systemic Can deal more effectively with inflammatory conditions.
  • gangliosides such as GD3, GD1a, GD1b, GT1b, and GQ1b inhibit macrophage activation by LPS of GM3.
  • Pathogen-associated molecular patterns GD1a, GD1b, GT1b, and GQ1b inhibit macrophage activation by LPS of GM3.
  • DAMPs damage-associated molecular patterns
  • GM3C16 In particular, in human monocytes, “GM3C16”, “GM3C18” and “GM3C24: 1” show an inflammation-inhibiting effect (FIGS. 8 to 10), and more than “GM3C22” and “GM3C24” than TLR4 activation by LPS alone. It was found that TLR4 activation promoted by GM3 molecular species was more strongly suppressed (FIG. 11). Furthermore, it became clear that GM3 molecular species acted selectively on TLR4 to cause inflammation promotion and inflammation suppression (FIGS. 12A and B).
  • inflammation inhibitors based on GM3 and GM3 structures can selectively and strongly suppress TLR4 activation caused by sepsis, chronic inflammation, metabolic syndrome, and the like, and TLR4 activation promoted by GM3. It has the characteristics. Furthermore, since it is difficult to inhibit the activation of other TLRs, it is difficult to cause side effects such as immunodeficiency associated with the suppression of the entire immune system, as is noticeable with known immunosuppressive agents. Combines technological characteristics.
  • FIG. 13 shows the mechanism of enhancement or suppression of LPS-dependent inflammation of each ganglioside molecular species predicted from the results of this Example.
  • “GM3C24” and “GM3hC24” act directly or indirectly on the TLR4 / MD2 complex to enhance NF- ⁇ B activation due to the binding of the TLR4 / MD2 complex, and promote inflammatory cytokines (IL-6, IL -1 ⁇ , TNF- ⁇ ) production.
  • GM3C16”, “GM3C18” and “GM3C24: 1” suppress the activation of NF- ⁇ B by acting directly or indirectly with the TLR4 / MD2 complex or other TLR (Toll-like receptor).
  • inflammatory cytokines IL-6, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇
  • Gangliosides having two or more sialic acids GD1a, GD1b, GT1b, GQ1b, GD3, etc.
  • Siglecs a sialic acid-binding globulin-like lectin.
  • the GM3-promoted inflammation inhibitor of the present invention suppresses inflammation promoted by GM3, is safe, and is expected to have an effect on chronic inflammatory diseases, systemic inflammatory conditions, etc. It can be widely used in various fields.

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Abstract

本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする。上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、シアル酸を２個以上有するガングリオシドであることが好ましい。上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドは、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが好ましい。また、上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、下記式（１）で表される構造を有することが好ましい。［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］

Description

ＧＭ３促進炎症抑制剤及び炎症性サイトカイン産生抑制剤
　本発明は、ＧＭ３促進炎症抑制剤及び炎症性サイトカイン産生抑制剤に関するものである。
　これまでに、高脂肪食マウスおよび遺伝子改変による肥満モデルマウスでは、活性化した組織マクロファージから炎症性サイトカインが分泌され、近傍の脂肪細胞に作用することによって、インスリン抵抗性の原因となるＧＭ３が発現誘導されることが示されている。その一方で、ＧＭ３の産生が起こらないＧＭ３合成酵素ノックアウトマウスでは、インスリン抵抗性が改善されるだけでなく、上流に位置するマクロファージからの炎症性サイトカインの産生までもが低下し、肥満時の慢性炎症状態から解放されていることが明らかとなっている。このことから、ＧＭ３は、肥満時における慢性炎症を惹起する内因性リガンドの主本体であることが強く示唆される。
　また、ＧＭ３を含むガングリオシドには、セラミド構造と糖鎖部分の多様性によって非常に多くの分子種が存在し、それらの多くが免疫系において発現している。これらのことは、ＧＭ３だけでなく、さまざまなガングリオシド分子種においても、肥満時における慢性炎症の惹起および抑制の分子メカニズムが存在することを示唆している。実際、これまでに、数多くの細胞種において、さまざまなガングリオシド分子種を用いた検討が試みられてきているが、ＧＭ３も含めたガングリオシドによる、炎症応答に対する活性化および抑制効果について、統一的な知見はほとんど得られていない。その原因は、これまでの報告が、実際の病態を反映するガングリオシド分子種や真の標的細胞が未解明である時点で得られた、知見の集合であるためと考えられる。
　例えば、W. Shenらの報告によると、ＧＭ１以上の糖鎖構造をもつ一部のガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ）は、さまざまな病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）によるToll-like receptor（ＴＬＲ）の活性化を抑制する作用を持ち、ＧＭ３は抑制効果も活性化効果も持たないとされる（非特許文献１）。
　しかしながら、この報告は、分画されていないヒト末梢血単核球を用いた実験に基づいており、自然免疫系細胞又はリンパ系細胞の何れの寄与によるものかは全く明らかではないため、ガングリオシドと免疫系の相互作用とその影響の程度について正確に規定することが難しい。
　また、非特許文献１と全く反対の結果を示す結果がI. Jouらによって示されている（非特許文献２）。この報告によれば、ラット脳神経系由来ミクログリアにおいて、ＧＭ１以上の糖鎖構造をもつ一部のガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、および混合物）は、ＴＬＲ４を活性化することが示されている。
　しかしながら、この報告で用いられた実験系は、主にＴＬＲ４の内在化を測定するフローサイトメトリー解析に終始しており、実際のＴＬＲ４シグナル伝達の活性化を直接反映したものではない。一部のガングリオシドについては、ＴＬＲ４活性化によって産生されるTumor Necrosis Factor-alpha（ＴＮＦ－α）のｍＲＮＡの増加が示されているが、ＲＴ－ＰＣＲ法によって微弱な増加を非定量的解析によって捉えた結果に終始しており、ミクログリア活性化を実際に証明するＴＮＦ－αの分泌を示すデータは確認されていない。
　更に、HJ. Sennらの報告では、哺乳動物の血清中には、生理活性を発揮するに十分な量のガングリオシドが存在していることを示している（非特許文献３）。I. Jouらの報告は、５％以上のウシ胎児由来血清の存在下において種々のガングリオシドを添加しているため、個々のガングリオシドの生理活性を正確に反映した結果ではなく、血清由来のガングリオシドの持ち込みの背景が付与された結果であると考えられる。そのため、ガングリオシドの生理活性とその作用濃度についての正確なデータを示した報告としてみなすには疑問を呈するものであり、それゆえの相反する結果であるとも考えられる。
　以上のように、多くの報告はガングリオシドの生物活性について矛盾した結果を示しているのが現状である。
　また、特許文献１には、ガングリオシド等のスフィンゴ脂質を含むプロスタグランジンＥ２産生抑制剤が開示されている。プロスタグランジンＥ２は、炎症時の発熱や、血管透過性亢進作用を有する炎症性因子であるが、炎症抑制効果があったガングリオシドの具体的な分子種等は示されていない。
特開２００５－１８７３４１号公報
Shen, W. et al., J Immunol., 180:4425-32, 2008 Jou, I. et al., Am J Pathol., 168:1619-30, 2006 Senn, HJ. et al., Eur J Biochem., 181: 657-62, 1989
　本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、炎症抑制作用を有する物質を有効成分として含有する新規の抗炎症剤を提供することにある。
　本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、血清中に存在するガングリオシドについて正確にその活性を反映させた系を構築することで、これまで明らかになっていなかったＧＭ３による強力な炎症惹起作用を見出した。また更に、ＧＭ３以外の血清ガングリオシド分子種による強力な炎症抑制作用を見出した。
　また、発明者らのこれまでの研究（Tagami S. et al., J. Biol. Chem., 277:3085-92, 2002; Kabayama K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 104:13678-83, 2007; Nagafuku M. et al., Glycobiology, 25:303-318, 2015; Veillon L. et al., Plos One, 2015）によって明らかとなってきた肥満時におけるガングリオシドを介した慢性炎症状態の発症メカニズムに焦点を当て、ＧＭ３を含む多様なガングリオシドによる、マクロファージ細胞における慢性炎症の惹起と抑制のメカニズムを検証した。
　その結果、ＧＭ３は、「ＬＰＳ（lipopolysaccharide；リポ多糖）によるマクロファージの活性化が惹起する炎症反応」を促進することを初めて見出し、そして、糖鎖部分に関し特定の糖鎖構造を有するＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ等は、「ＧＭ３依存性のマクロファージ活性化」に拮抗する抗炎症作用を有することも見出した。
　また、意外なことに、セラミド部分の脂肪酸に関し特定の構造を有するＧＭ３が、ＬＰＳによるマクロファージの活性化が惹起する炎症反応に拮抗する抗炎症作用を有することも見出して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ３促進炎症抑制剤。
［２］上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、シアル酸を２個以上有するガングリオシドである［１］に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
［３］上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、下記式（１）で表される構造を有する［１］に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
［４］上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドである［２］に記載の促進炎症抑制剤。
［５］ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤。
［６］上記ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質が、シアル酸を２個以上有するガングリオシドである［５］に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
［７］上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドである［６］に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
［８］上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、下記式（１）で表される構造を有する［５］に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
　本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤や炎症性サイトカイン産生抑制剤によれば、前記問題点を解消し前記課題を解決し、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する効果を有し、慢性炎症疾患や全身性炎症状態を改善する効果を有する。
　また、本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤や炎症性サイトカイン産生抑制剤は、ヒト等に対して安全であり、対象者にとって負担や副作用が少ないという効果を奏する。
　また、ＧＭ３は肥満時に発現上昇するガングリオシドであり、本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤や炎症性サイトカイン産生抑制剤は、肥満時における慢性炎症を抑制する効果を奏する。
哺乳動物におけるガングリオシド分子種の生合成経路を示す図である。 血清ガングリオシドミミックによるＬＰＳ依存性ＴＮＦ－α産生の抑制効果を示すグラフである。 ＧＭ３特異的なＬＰＳとの協調的なＴＮＦ－α産生の増強効果と、その他の血清ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＤ３）による抑制効果を示すグラフである。 ＬＰＳ依存的なＴＮＦ－α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる濃度依存的な抑制作用を示すグラフである。 「ＬＰＳとＧＭ３による協調的なＴＮＦ－α産生」に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる濃度依存的な抑制作用を示すグラフである。 骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳ依存的なＴＮＦ－α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる抑制作用を示すグラフである。 「骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳとＧＭ３による協調的なＴＮＦ－α産生」に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる抑制作用を示すグラフである。 ＬＰＳ依存的なヒトＩＬ－６産生に対するガングリオシド分子種による亢進又は抑制作用を示すグラフである。 ＬＰＳ依存的なヒトＩＬ－１β産生に対するガングリオシド分子種による亢進又は抑制作用を示すグラフである。 ＬＰＳ依存的なヒトＴＮＦ－α産生に対するガングリオシド分子種による亢進又は抑制作用を示すグラフである。 ＧＭ３及び／又はＬＰＳ依存的なヒトＩＬ－６産生に対する、ガングリオシド分子種による抑制作用を示すグラフである。 ＧＭ３によるＴｏｌｌ様受容体選択的な炎症促進および炎症抑制効果を示すグラフである。 ＧＭ３によるＴｏｌｌ様受容体選択的な炎症促進および炎症抑制効果を示すグラフである。 ガングリオシド分子種による、ＬＰＳ依存的な炎症の予想される亢進又は抑制メカニズムを示す模式図である。
　以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、本発明の範囲内で任意に変形することができる。
＜ＧＭ３促進炎症抑制剤＞
　本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする。ＧＭ３による強力な炎症惹起作用は、これまで明らかになっていなかったので、「『ＧＭ３により促進された炎症』を抑制する剤」は、本発明において初めて見出された。
　本明細書において、「ＧＭ３促進炎症抑制剤」とは、「ＧＭ３により促進・誘導される（ＧＭ３依存性）炎症」を抑制する作用を有する抑制剤のことをいう。
　一般に「ガングリオシド（Ganglioside）」とは、糖鎖上に少なくとも１つのシアル酸が結合しているスフィンゴ糖脂質のことをいう。
　本明細書において、「ＧＭ３」とは、「ガングリオシドＧＭ３」のことをいい、ヒトの場合には、スフィンゴ糖脂質の糖鎖が、下記「　　」内であるものをいう。
　「α－Ｎｅｕ５Ａｃ－（２－３）β－Ｇａｌ－（１－４）－β－Ｇｌｃ－（１－１）－セラミド」
　ここで、「α－Ｎｅｕ５Ａｃ」は、Ｎ－アセチル－α－ノイラミン酸；「β－Ｇａｌ」は、β－ガラクトース；「β－Ｇｌｃ」は、β－グルコースを示す。
　また、「脂肪酸残基が炭素数２０以上の飽和脂肪酸残基であるＧＭ３」で上記炎症は促進されるので、上記「ＧＭ３により促進された炎症」とは、「脂肪酸残基が炭素数２０以上の飽和脂肪酸残基であるＧＭ３により促進された炎症」であることが好ましい（炎症を促進するＧＭ３が括弧「　　」内に特定される場合がある）。
　また、「置換基としてＯＨ基を有していてもよい、脂肪酸残基が炭素数２４の飽和脂肪酸残基であるＧＭ３」で上記炎症は促進されるので、上記「ＧＭ３により促進された炎症」とは、「置換基としてＯＨ基を有していてもよい、脂肪酸残基が炭素数２４の飽和脂肪酸残基であるＧＭ３により促進された炎症」であることがより好ましい（炎症を促進するＧＭ３が括弧「　　」内に特定される場合がある）。
　本実施例により初めて、ＧＭ３分子種の中には、炎症を亢進するＧＭ３（脂肪酸が炭素数２０以上の飽和脂肪酸であるＧＭ３）と、炎症を抑制するＧＭ３（脂肪酸が炭素数１８以下の脂肪酸であるＧＭ３、又は脂肪酸が炭素数２０以上の不飽和脂肪酸（特に炭素数２４の不飽和脂肪酸）であり、該不飽和脂肪酸の炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３）が存在することが明らかになった。
　本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤の有効成分である、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、１種の成分から成っていても、２種以上の成分から成っていてもよい。
　また、該ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、天然物から単離・精製されたものでもよく、合成されたものであってもよい。該「合成されたもの」には、自然界に存在する物質（の誘導体）の合成物、自然界に存在が確認されていない物質の合成物が含まれる。
　上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、本発明の効果を発揮する点等で、セラミドに糖鎖がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質であることが好ましく、該糖鎖がシアル酸を２個以上有するものであることがより好ましい。
　また、該ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、前記スフィンゴ糖脂質と同様の効果を有する、前記スフィンゴ糖脂質の誘導体であってもよい。
　また、上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、シアル酸を２個以上有するガングリオシドであることが好ましい。
　上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドは、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが好ましく、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることがより好ましく、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが特に好ましい。これらのガングリオシドの模式図を図１に示す。
　これらから選ばれる１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
　また、上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、下記式（１）で表される構造を有するＧＭ３であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
　上記式（１）で表される構造を有するＧＭ３は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、脂肪酸が炭素数１６以上１８以下の炭化水素基であるＧＭ３、又は脂肪酸が炭素数２０以上の炭化水素基であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
　また、同様の点から、該脂肪酸残基の炭素数が１６又は１８であるＧＭ３、又は、該不飽和脂肪酸残基の炭素数が２４であり、該不飽和脂肪酸残基の炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
　本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤は、有効成分である、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質に加えて、「その他の成分」を含有することができる。
　前記ＧＭ３促進炎症抑制剤における、上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。
　かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤中の前記「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
　具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。
　前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
　前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
　前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
　前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
　前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
　前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
　前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
　前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
　前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
　前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。
　本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤中の有効成分である、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質の、ＧＭ３促進炎症抑制剤全体に対する含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＧＭ３促進炎症抑制剤全体を１００質量部としたときに、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質の合計量として、０．００１～１００質量部の含量で配合することが好ましく、より好ましくは０．０１～９９質量部、特に好ましくは０．１～９５質量部、更に好ましくは１～９０質量部の含量で配合することができる。
　本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；ラット；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。
　また、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤の剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。
　また、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与量は、有効成分の量として、１ｍｇ～３０ｇが好ましく、１０ｍｇ～１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ～３ｇが特に好ましい。
　また、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
＜炎症性サイトカイン産生抑制剤＞
　本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤は、ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする。
　上記ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、シアル酸を２個以上有するガングリオシドであることが好ましい。
　上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが好ましく、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることがより好ましく、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが特に好ましい。
　これらから選ばれる１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
　また、上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、下記式（１）で表される構造を有するＧＭ３であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
　上記式（１）で表される構造を有するＧＭ３は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等から、脂肪酸の炭素数が１６以上１８以下であるＧＭ３、又は脂肪酸が炭素数２０以上であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
　また、同様の点から、該脂肪酸残基の炭素数が１６又は１８であるＧＭ３、又は、該不飽和脂肪酸残基の炭素数が２４であり、該不飽和脂肪酸残基の炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
　本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤は、上記ＧＭ３促進炎症抑制剤と同様に、本発明の効果を損なわない範囲内で、有効成分に加えて「その他の成分」を含有していてもよい。
　また、その剤型も特に制限はなく、例えば、前述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
＜炎症を抑制又は治療する方法＞
　本発明の他の態様は「炎症を抑制又は治療する方法」に係るものである。本発明の炎症を抑制又は治療する方法は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制又は治療する方法であって、セラミドに「シアル酸を２個以上有する糖鎖」がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質を投与することによって、該スフィンゴ糖脂質の血中濃度を上昇させる工程を含むことを特徴とする。
　また、前記スフィンゴ糖脂質と同様の効果を有すれば、前記スフィンゴ糖脂質の誘導体を投与してもよい。
　また、本発明の炎症を抑制又は治療する方法は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制又は治療する方法であって、シアル酸を２個以上有するガングリオシドを投与することによって、該ガングリオシドの血中濃度を上昇させる工程を含むことを特徴とする。
　本発明の炎症を抑制又は治療する方法において、本発明の効果を発揮する点等で、上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが好ましく、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることがより好ましく、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが特に好ましい。
　これらから選ばれる１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
　また、本発明の炎症を抑制又は治療する方法は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制又は治療する方法であって、下記式（１）で表される構造を有するガングリオシドを投与することによって、該式（１）で表される構造を有するガングリオシドの血中濃度を上昇させる工程を含むことを特徴とする。
　また、前記式（１）で表される構造を有するガングリオシド同様の効果を有すれば、前記式（１）で表される構造を有するガングリオシドの誘導体を投与してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
　上記式（１）で表される構造を有するＧＭ３は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、脂肪酸が炭素数１６以上１８以下の炭化水素基であるＧＭ３、又は脂肪酸が炭素数２０以上の炭化水素基であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
　また、同様の点から、該脂肪酸残基の炭素数が１６又は１８であるＧＭ３、又は、該不飽和脂肪酸残基の炭素数が２４であり、該不飽和脂肪酸残基の炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
　また、本発明の炎症を抑制又は治療する方法は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制又は治療する方法であって、前記のＧＭ３促進炎症抑制剤を投与することによって、該ＧＭ３促進炎症抑制剤の血中濃度を上昇させる工程を含むことを特徴とする。
　本発明の炎症を抑制又は治療する方法において、上記スフィンゴ糖脂質、ガングリオシド、又はＧＭ３促進炎症抑制剤を投与する手段は、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、注射投与；経口投与；腹腔内投与；腸内投与等が挙げられる。
　上記スフィンゴ糖脂質（ガングリオシド、又はＧＭ３促進炎症抑制剤）の投与量は、症状、年齢、性別、剤形、投与方法、１日の投与回数等を考慮して適宜選択すればよい。
　以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。実施例中の「％」は、特に断りのない限り「質量％」を示す。
実施例１
［ＧＭ３以外の血清ガングリオシドの炎症抑制作用］
　非特許文献３の報告に基づくヒト血清中のガングリオシド組成を表１に示す。ヒト血清中には主にＧＭ３が含まれており、続いてＧＤ３、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、「ＧＱ１ｂ以上の複合ガングリオシド」の順で含まれている。
　上記これらのガングリオシド組成を模した血清ガングリオシドミミックを用いて、培地中血清を除去・低減したマクロファージ様培養細胞株：ＲＡＷ２６４．７細胞（０．５％ウシ胎児由来血清）を処理した。そして、ＴＬＲ４リガンド（ＬＰＳ）刺激による実際のＴＮＦ－α産生に対する影響を検討した。
　０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、０．５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（lipopolysaccharide；リポ多糖）と血清ガングリオシド組成を模した濃度のガングリオシド（血清ガングリオシドミミック）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ＥＬＩＳＡ法の結果を図２に示す。図２中、一番左のカラムはコントロール、中央のカラムは培地にＬＰＳを添加した結果、一番右のカラムは培地にＬＰＳ及び血清カングリオシドミミックを添加した結果を示す。縦軸の数値が大きくなるほど、マクロファージ活性による炎症が促進されていることを示す。
　血清ガングリオシドミミック処理によって、ＬＰＳによるマクロファージからのＴＮＦ－α産生は、ほぼ完全に抑制されることが分かった。この結果は、血清中のガングリオシド組成は、循環血液中におけるマクロファージ系細胞（主に単球等）の不用意な活性化を抑制するためのものであることを示唆している。
　更に、血清中の個々のガングリオシド（ＬａｃＣｅｒ、ＧＭ３、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ及びＧＤ３）によるＴＮＦ－α産生への影響を評価した。
　０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、ＬＰＳ（０．５ｎｇ／ｍＬ）と各スフィンゴ糖脂質（１．０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。
　結果を図３に示す。図３中、一番左のカラムはコントロール、左から２番目のカラムはＬＰＳのみを培地に添加した結果を示す。
　驚くべきことに、ＧＭ３単独による処理は、ＬＰＳによるＴＮＦ－α産生を著しく増大させることが分かった。
　その一方で、ＧＭ３以外の血清ガングリオシド分子種は、ＬＰＳによるＴＮＦ－α産生を強力に抑制する作用を示した。ＬａｃＣｅｒとＧＭ１は、ＬＰＳのみを添加した結果と同等のＴＮＦ－αであった。
　シアル酸を２個以上有する、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ及びＧＤ３は、ＬＰＳによるＴＮＦ－α産生を強力に抑制していた。特に、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂは著しく強力にＬＰＳによるＴＮＦ－α産生を抑制していた。
　以上の血清ガングリオシドの個々の作用は、培地中血清を低減した環境下で観測・評価されたものである。これらの結果は、これまで全く明らかとなっていなかったＧＭ３単独の炎症促進作用と、ＧＭ３以外の血清ガングリオシドの炎症抑制作用を初めて明確に規定したものであると言える。
　また、以上の結果は、健常人の循環血液中では、ＧＭ３及びＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂが共存することで、血中におけるマクロファージの好ましくない炎症反応が抑制されていることを強く示唆した。
実施例２
［ＲＡＷ２６４．７細胞における各種ガングリオシドの炎症抑制作用］
　次に、ＬＰＳ及びＧＭ３によって誘導される炎症性サイトカインの産生に対する、複合型ガングリオシド分子種による抑制作用における濃度依存性を検討した。上記に示したように、マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞は、大腸菌由来成分であるＬＰＳ及び肥満時に発現上昇するＧＭ３に対して多量のＴＮＦ－αを産生する。
　まず、ＬＰＳ依存的なＴＮＦ－α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる濃度依存的な抑制作用を検討した。
　０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、ＬＰＳ（２．０ｎｇ／ｍＬ）と各スフィンゴ糖脂質（０．２５～２．０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。
　結果を図４に示す。図４中、一番左のカラムはコントロール、左から２番目のカラムはＬＰＳのみを培地に添加した結果を示す。
　ＬＰＳにより促進された炎症が、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）を添加することにより、濃度依存的に抑制されることが分かった。
　また、ＬＰＳとＧＭ３による協調的なＴＮＦ－α産生に対する血清中の、ＧＭ３以外のガングリオシドによる濃度依存的な抑制作用を検討した。
　０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、各スフィンゴ糖脂質（０．２５～１．０μＭ）、ＬＰＳ（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＧＭ３（５．０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。
　結果を図５に示す。図５中、一番左のカラムはコントロールであり、ＬＰＳのみを培地に添加した結果を示し、左から２番目のカラムはＬＰＳとＧＭ３のみを培地に添加した結果を示す。
　ＧＭ３及びＬＰＳによる相乗的なＴＮＦ－αの産生増加（炎症促進）が、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）を添加することにより、濃度依存的に抑制されることが分かった。
　また、１μＭ（ＧＭ３比１０：１）以下の複合型ガングリオシドＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂを添加することによって、どちらのＴＮＦ－α産生もほぼ完全に抑制されることが分かった（図４、５）。
　各複合型ガングリオシドの抑制効果を比較した結果、ＬＰＳ刺激に対する各ガングリオシドの５０％阻害濃度は、ＧＤ１ａ：０．５μＭ、ＧＤ１ｂ：０．５μＭ、ＧＴ１ｂ：０．５μＭ、ＧＱ１ｂ：０．２５μＭであるのに対し（図４）、ＬＰＳとＧＭ３の協調的活性化に対する５０％阻害濃度は、ＧＤ１ａ：０．５μＭ、ＧＤ１ｂ：０．５μＭ、ＧＴ１ｂ：０．２５μＭ、ＧＱ１ｂ：０．１２５μＭであった（図５）。これらのシアル酸を２個以上その分子内に有するガングリオシド分子は、ＬＰＳとＧＭ３による協調的活性化に対しての抑制作用が大きいことが分かった。
　以上の結果から、ＧＭ３以外のガングリオシドによる炎症抑制効果は、肥満時に発現上昇するＧＭ３によって惹起されたマクロファージ活性化に対して、より強力に作用することが示唆された。また、本実施例で初めて、生理的環境下の濃度又はそれ以下のガングリオシド濃度で、炎症を抑制することを見出した（表１、図４、図５）。
実施例３
［マウス骨髄由来マクロファージにおける各種ガングリオシドの炎症抑制作用］
　次に、骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳ依存的なＴＮＦ－α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる抑制作用について検討した。
　Ｃ５７／ＢＬ６マウスの大腿骨および脛骨より採取した骨髄由来細胞に対し、２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマクロファージコロニー刺激因子（recombinant macrophage colony-stimulating factor（Ｍ－ＣＳＦ））を用いて１週間分化誘導した。得られた骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ、bone marrow-derived macrophage）を、０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したのち、ＬＰＳ（０．５ｎｇ／ｍＬ）と各スフィンゴ糖脂質（１０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。
　結果を図６に示す。図６中、一番左のカラムはコントロール、左から２番目のカラムはＬＰＳのみを培地に添加した結果を示す。
　骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳ依存的なＴＮＦ－α産生（炎症促進）が、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）を添加することにより抑制されることが分かった。
　また、骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳとＧＭ３による協調的なＴＮＦ－α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる抑制作用を検討した。
　Ｃ５７／ＢＬ６マウスの大腿骨および脛骨より採取した骨髄由来細胞に対し、２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマクロファージコロニー刺激因子（recombinant macrophage colony-stimulating factor（Ｍ－ＣＳＦ））を用いて１週間分化誘導して得た骨髄由来マウロファージ（ＢＭＤＭ）を、０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したのち、ＬＰＳ（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＧＭ３（１０μＭ）、各スフィンゴ糖脂質（１０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ－αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。
　結果を図７に示す。図７中、一番左のカラムはコントロールであり、ＬＰＳのみを培地に添加した結果を示し、左から２番目のカラムはＬＰＳとＧＭ３のみを培地に添加した結果を示す。
　骨髄由来マクロファージにおける「ＬＰＳ及びＧＭ３による協調的なＴＮＦ－α産生（炎症促進）」が、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）を添加することにより強力に抑制されることが分かった（図７）。
　また、図６と図７を比較すると、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）による炎症抑制効果は、肥満時等に発現上昇するＧＭ３によって惹起されたマクロファージ活性化に対して、より強力に奏されることが示唆された。
実施例４
［ＧＭ３促進炎症抑制剤の製剤化］
＜＜錠剤＞＞
　ＧＤ１ｂ２０．０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した。該打錠用顆粒に滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５ｍｇ～１．５ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し錠剤とした。
＜＜液剤＞＞
　ＧＴ１ｂ１０．０ｍｇを、２質量％の２－ヒドロキシプロピル－β－サイクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し注射用液剤とした。
実施例５
［ヒトにおける各種ガングリオシドの炎症亢進又は抑制作用］
　ヒト末梢血由来単球（ＣＤ１４陽性細胞）を、０．５％ＦＣＳ及び２５ｎｇ／ｍＬ顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子含有ＤＭＥＭ（Low Glucose）中、０．１２５ｎｇ／ｍＬ大腸菌由来リポ多糖（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１１１：Ｂ４）、及び、１．２５、２．５、５．０μＭのＮ－ｍｉｘ（中性スフィンゴ糖脂質混合物（Ｇｌｃ－Ｃｅｒ、Ｌａｃ－Ｃｅｒ、Ｇｂ３、Ｇｂ４））又は各ガングリオシド分子種を用いて共刺激した。１８時間後にＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中に分泌された炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）を定量した。結果を図８～１０に示す。
　図８～１０中、一番左のカラムはコントロール、左から２番目のカラムはＬＰＳのみを培地に添加した結果を示す。
　各ＧＭ３種の構造について、例えば「ＧＭ３Ｃ１６」の場合、ＧＭ３の脂肪酸が炭素数１６の炭化水素基であることを示す。また、「ＧＭ３ｈＣ２４」は、ＧＭ３の脂肪酸が炭素数２４の炭化水素基であり、該脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有することを示す。また、「ＧＭ３Ｃ２４：１」は、ＧＭ３の脂肪酸が炭素数２４の炭化水素基であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有することを示す。
　図８～１０の結果、驚くべきことに、ＧＭ３分子種のうち、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」が、ＬＰＳによるＩＬ－６、ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α産生を抑制する作用を示した。
　一方、ＧＭ３分子種のうち、脂肪酸にＯＨ基を有さず、炭化水素基中に二重結合を有さない、「ＧＭ３Ｃ２２」、「ＧＭ３Ｃ２４」、及び脂肪酸にＯＨ基を有する「ＧＭ３ｈＣ２４」は、ＬＰＳによるＩＬ－６、ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α産生を著しく増大させた。
実施例６
［ヒトにおける、ＧＭ３Ｃ１６、ＧＭ３Ｃ１８及びＧＭ３Ｃ２４：１の炎症抑制作用］
　次に、ＧＭ３分子種のうち、脂肪酸にＯＨ基を有さず、炭化水素基中に二重結合を有さない、「ＧＭ３Ｃ２２」及び「ＧＭ３Ｃ２４」によって生じるＴＬＲ４選択的な炎症性サイトカイン産生の促進に対して、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び、炭化水素基中に二重結合を有する「ＧＭ３Ｃ２４：１」が拮抗的に炎症抑制作用を示すかどうかを、ヒト単球において調べた。
　実施例５と同様の培養条件下、炎症を促進する「ＧＭ３Ｃ２２」又は「ＧＭ３Ｃ２４」に対して、炎症を抑制する「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」又は「ＧＭ３Ｃ２４：１」を組み合わせて単球に添加し、さらにＴＬＲ４活性化因子である０．０６ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。１８時間後にＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中に分泌された炎症性サイトカインＩＬ－６を定量した。結果を図１１に示す。
　図１１の結果中、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」は、ＬＰＳ刺激に対してだけでなく、「ＧＭ３Ｃ２２」及び「ＧＭ３Ｃ２４」の添加によって促進した刺激に対しても、ＩＬ－６の産生を強力に抑制した。興味深いことに、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」は、ＬＰＳ単独によるＴＬＲ４活性化時と比べて、「ＧＭ３Ｃ２２」および「ＧＭ３Ｃ２４」の添加によって促進されたＴＬＲ４活性化時において、より強力にＩＬ－６の産生を抑制した。
実施例７
[ＧＭ３によるＴｏｌｌ様受容体選択的な炎症促進および炎症抑制効果]
　ヒト単球の活性化に伴う炎症は、ヒト単球上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化によって生じることが知られており、ＴＬＲ４に対する活性化因子であるＬＰＳ以外にも、その他のＴＬＲに対する様々な活性化因子が存在する。
 そこで、実施例５と同様の培養条件下、ＴＬＲ４活性化因子である０．１２５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２活性化因子である５．０μｇ／ｍＬのHigh Mobility Group Box 1（ＨＭＧＢ１）、ＴＬＲ１及びＴＬＲ２活性化因子である２０ｎｇ／ｍＬのＰａｍ３Ｃｓｋ４、ＴＬＲ２及びＴＬＲ６活性化因子である１．０ｎｇ／ｍＬのＭＡＬＰ－２、ＴＬＲ５活性化因子である５０ｎｇ／ｍＬのフラジェリン（Flagellin）、並びにＴＬＲ７及びＴＬＲ８活性化因子である２５０ｎｇ／ｍＬのＲ－８４８のいずれかと、５μＭのＧＭ３分子種を用いて、ヒト単球を刺激した。１８時間後にＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中に分泌された炎症性サイトカインＩＬ－６を定量した。結果を図１２Ａ及びＢに示す。
　図１２Ａ及びＢの結果中、ＧＭ３分子種のうち、脂肪酸にＯＨ基を有さず、炭化水素基中に二重結合を有さない、「ＧＭ３Ｃ２２」、「ＧＭ３Ｃ２４」、及び脂肪酸にＯＨ基を有する「ＧＭ３ｈＣ２４」は、ＴＬＲ４を活性化する因子であるＬＰＳ及びＨＭＧＢ１によるＩＬ－６産生を選択的に増大させた。一方、その他のＴＬＲ活性化因子については、ＩＬ－６産生の増大は見られなかった。
　さらに、ＧＭ３分子種のうち、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」が、ＴＬＲ４を活性化する因子であるＬＰＳおよびＨＭＧＢ１によるＩＬ－６産生を抑制する作用を示した（図１２Ａ）。この抑制作用は、ＴＬＲ２を活性化する因子であるＰａｍ３Ｃｓｋ４によるＩＬ－６産生に対しても見られたが、ＴＬＲ４を活性化する因子であるＬＰＳ及びＨＭＧＢ１によるＩＬ－６産生に対する抑制作用の方が、より顕著であった。
［実施例のまとめ］
　ヒト血清中のガングリオシド組成に注目すると、最も優勢なＧＭ３（５μＭ）に対して、およそ０．５～１．０μＭのＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂが含まれることが報告されている（表１）。このことから、ＧＭ３及び複合体ガングリオシドを含むヒト血液中では、ＬＰＳによる自然免疫細胞の活性化は、非常に強力な抑制を受けていると考えられる。
　また、実施例で非常に強力にＬＰＳによるＴＮＦ－α産生を抑制していた、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂは、哺乳動物において、ＧＤ３から生合成される点で共通している（図１）。
　血中を循環する多くの自然免疫細胞は、感染組織や標的臓器に到達して初めて活性化され、免疫応答を起こす。一方、血中における不用意な自然免疫活性化は、敗血性ショックや慢性的炎症疾患等に代表される、全身性の免疫機能不全を引き起こす要因の一つと考えられる。血中のガングリオシドは、循環中の自然免疫細胞が活性化するのを未然に防ぐ役割を持つと考えられ、これらを人為的に投与することによっても、コントロール不良な慢性炎症疾患や、全身性の炎症状態に対して、より効果的に対処できる。
　ＧＭ３のＬＰＳによるマクロファージ活性化を、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ等の特定のガングリオシドが抑制することが確認されたが、ＬＰＳ以外の、飽和脂肪酸（パルミチン酸）、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ、pathogen-associated molecular patterns）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ、damage-associated molecular patterns）等によるＧＭ３依存性マクロファージ活性化の抑制も可能である。
　特に、ヒト単球においては、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」が炎症抑制効果を示し（図８～１０）、ＬＰＳ単独によるＴＬＲ４活性化よりも、「ＧＭ３Ｃ２２」及び「ＧＭ３Ｃ２４」といったＧＭ３分子種によって促進されたＴＬＲ４活性化をより強力に抑制することがわかった（図１１）。さらに、ＧＭ３分子種はＴＬＲ４に対して選択的に作用することで、炎症促進と炎症抑制を生じることが明らかとなった（図１２Ａ及びＢ）。
　これらの結果から、ＧＭ３及びＧＭ３構造をもとにした炎症抑制剤は、敗血症、慢性炎症及びメタボリックシンドローム等で生じるＴＬＲ４活性化や、ＧＭ３によって促進されたＴＬＲ４活性化を選択的かつ強力に抑制できるという特性をもつ。さらに、その他のＴＬＲの活性化を阻害しにくいことから、これまでに知られている免疫抑制剤で顕著に見られるような、免疫系全体に対する抑制に伴う免疫不全等の副作用を生じにくいという、画期的な特性を併せ持つ。
　本実施例の結果から予想される、各ガングリオシド分子種のＬＰＳ依存的な炎症の亢進又は抑制メカニズムを図１３に示す。
　「ＧＭ３Ｃ２４」や「ＧＭ３ｈＣ２４」は、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体と直接又は間接に作用することにより、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体の結合によるＮＦ－κＢ活性化を亢進し、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）の産生を促進していると考えられる。
　一方、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」は、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体又は他のＴＬＲ（Toll-like receptor）と直接又は間接に作用することにより、ＮＦ－κＢ活性化を抑制し、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）の産生を抑制していると考えられる。
　また、シアル酸を２個以上有するガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＤ３等）は、シアル酸結合グロブリン様レクチンであるシグレック（Siglecs, sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin）と直接又は間接に作用することにより、ＮＦ－κＢ活性化を抑制し、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）の産生を抑制していると考えられる。
　本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制し、安全であり、慢性炎症疾患、全身性炎症状態等に対して効果を奏することが期待されるので、医薬品分野、医療分野等で広く利用が可能である。
　本願は、２０１５年１１月３０日に出願した日本の特許出願である特願２０１５－２３２５６４、及び２０１６年６月８日に出願した日本の特許出願である特願２０１６－１１４１８８に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
 

Claims (8)

  1. 　ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ３促進炎症抑制剤。
  2. 　上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、シアル酸を２個以上有するガングリオシドである請求項１に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
  3. 　上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドである請求項２に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
  4. 　上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、下記式（１）で表される構造を有する請求項１に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
    Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
  5. 　ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤。
  6. 　上記ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質が、シアル酸を２個以上有するガングリオシドである請求項５に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
  7. 　上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドである請求項６に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
  8. 　上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、下記式（１）で表される構造を有する請求項５に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
    Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
     
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