WO2016072364A1 - 疾患を検出する方法 - Google Patents

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WO2016072364A1
WO2016072364A1 PCT/JP2015/080801 JP2015080801W WO2016072364A1 WO 2016072364 A1 WO2016072364 A1 WO 2016072364A1 JP 2015080801 W JP2015080801 W JP 2015080801W WO 2016072364 A1 WO2016072364 A1 WO 2016072364A1
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ganglioside
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仁一 井ノ口
ルーカス ベイロン
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公益財団法人野口研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a specific disease or detecting the risk of developing the disease and a detection kit thereof, and more specifically, detecting a specific disease including a step of measuring ganglioside GM3 having a specific structure. Or a method for detecting the onset risk of the disease and a detection kit thereof.
  • Atherosclerosis a type of CVD, refers to a condition in which plaque is formed by the accumulation of cholesterol and fat in the lumen of a blood vessel. When this plaque ruptures, there is a risk that a blood clot will form, causing a stroke, a heart attack, etc. (Non-patent Document 1).
  • metabolic and behavioral risk factors cause atherosclerosis. Behavioral risk factors include lack of exercise, excessive calories, unhealthy diets such as salt and fat intake, tobacco and alcohol abuse. Conventional metabolic risk factors include hypertension, an increase in the concentration of lipids such as cholesterol in the blood, hyperglycemia, and the like. It has also been reported that carotid intima-media thickness (CIMT) is associated with CVD risk factors.
  • CIMT carotid intima-media thickness
  • diabetes includes type 1 diabetes and type 2 diabetes.
  • Type 2 diabetes is associated with excessive caloric intake, lack of exercise, obesity, and increased low density lipoprotein (LDL) concentration in blood, and is said to be a lifestyle-related disease.
  • LDL low density lipoprotein
  • type 2 diabetes insulin resistance and / or insulin secretion failure occur, resulting in a hyperglycemic state (Non-patent Document 2).
  • Disruption of adipocytokine secretion due to adipocyte dysfunction associated with excessive accumulation of visceral fat induces insulin resistance and clearly plays an important role as a factor in type 2 diabetes and arteriosclerotic diseases Has been.
  • Macrophages that are myeloid cells are always latent in the visceral adipose tissue, but an adipocytokine called MCP-1 is secreted from visceral adipocytes that are acquiring insulin resistance with enlargement, and further macrophages Is mobilized from surrounding blood vessels.
  • MCP-1 an adipocytokine
  • a large amount of free fatty acid secreted from enlarged adipose tissue also activates macrophages via Toll-like receptors and secretes inflammatory cytokines such as TNF ⁇ and IL-6.
  • TNF ⁇ and IL-6 secretes inflammatory cytokines
  • type 2 diabetes is generally diagnosed using blood glucose level, HbA1c, glycoalbumin level, etc. as an index, but in order to grasp the pathology of type 2 diabetes correctly, not only one index , Multiple indicators must be measured and evaluated.
  • ganglioside GM3 ( ⁇ -Neu5Ac- (2-3) ⁇ -Gal- (1-4) - ⁇ -Glc- (1-1), which is one of gangliosides, in blood.
  • -Ceramide was found to be able to detect a disease exhibiting an insulin resistance pathology selected from the group consisting of type 2 diabetes, hyperlipidemia, hypertension and obesity (Patent Document 1, Non-patent document 1) Patent Document 4).
  • Ganglioside is a general term for glycosphingolipids containing sialic acid.
  • Glycosphingolipids are produced by stepwise enzyme addition of ceramide to sugars such as glucose, galactose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, and sialic acid. It is a synthesized glycolipid and is expressed outside the cell membrane lipid bilayer. In addition, previous studies have shown that the total amount of GM3 is correlated with lipoprotein cholesterol (LDL-c) (Non-patent Document 4).
  • LDL-c lipoprotein cholesterol
  • ganglioside GM3 there are many molecular species of ganglioside GM3 in blood depending on the number of carbon atoms of the hydrocarbon group in the ceramide moiety, the number of double bonds, the type and number of substituents, and the like. It is said that biophysical characteristics and physiological functions differ depending on the molecular species, and it is considered that measuring ganglioside GM3 having a specific structure is more effective for detecting lifestyle-related diseases such as metabolic syndrome. So far, there has been no report on the structure of ganglioside GM3 which is effective by the detection.
  • the present invention has been made in view of the above-described background art, and the problem is that ganglioside GM3 having a specific structure correlated with many molecules related to lifestyle-related diseases (specific diseases) such as metabolic syndrome. It is to provide a method and kit for detecting a disease or detecting the risk of developing the disease, including a step of measuring.
  • specific diseases such as metabolic syndrome.
  • the present inventor measured visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension by measuring ganglioside GM3 in which the ceramide moiety was hydroxylated. And at least one disease selected from the group consisting of atherosclerosis or a disease in which two or more are combined, or the risk of developing the disease can be detected.
  • the ganglioside GM3 having the specific structure is at least one disease selected from the group consisting of visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis, or two
  • the present invention has been completed by finding that the above is correlated with markers related to the combined diseases.
  • the present invention is the following method.
  • a method for detecting at least one disease or a disease in which two or more are combined, or detecting the risk of developing the disease is a detection method characterized by having a structure represented by the following formula (1).
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3, and R 2 —C ( ⁇ O) — may have a double bond having an OH group as a substituent.
  • a fatty acid residue having 16 to 24 carbon atoms is shown.
  • R 2 —C ( ⁇ O) — has an OH group as a substituent, and may have a double bond or a C 22 or C 24 hydrocarbon group.
  • R 2 —C ( ⁇ O) — is a hydrocarbon group having 24 carbon atoms and a double bond having an OH group as a substituent [1] or [ [2] The detection method according to [2].
  • Markers relating to visceral fat type obesity, hyperglycemia, dyslipidemia and hypertension are autotaxin, HOMA-IR, HbA1c, aspartate aminotransferase, alanine-aminotransferase, low density lipoprotein cholesterol, fasting
  • the detection method according to [6] which is at least one selected from the group consisting of blood glucose and blood pressure.
  • the marker for atherosclerosis is at least one selected from the group consisting of sphingomyelin, lysophosphatidylcholine, C-reactive protein, and mean intima-media thickness, [6] or [7] The detection method described.
  • ganglioside GM3 Containing at least one disease or two or more selected from the group consisting of visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis, containing ganglioside GM3 as a standard substance
  • a kit for detecting a developed disease or detecting the risk of developing the disease The ganglioside GM3 has a structure represented by the following formula (1).
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3, and R 2 —C ( ⁇ O) — may have a double bond having an OH group as a substituent.
  • a fatty acid residue having 16 to 24 carbon atoms is shown.
  • the detection method of the present invention by solving the above problems and solving the above problems and measuring ganglioside GM3 having a specific structure in a blood sample, the state of the subject is compared with the conventional detection method, It is possible to grasp more accurately and more easily from a more basic viewpoint.
  • the specific ganglioside GM3 represented by the formula (1) it is possible to detect a specific disease more accurately or more accurately than the measurement of a general ganglioside GM3 (measurement of the entire ganglioside GM3).
  • the onset risk can be detected.
  • the state relevant to the lifestyle-related disease of a test subject can be grasped
  • the detection method of the present invention by measuring the ganglioside GM3 having a specific structure by the detection method of the present invention, compared with the conventional method, more accurately and more simply, “visceral fat type obesity” , Hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and at least one disease selected from the group consisting of atherosclerosis or a disease in which two or more are combined can be detected.
  • the above “” may be abbreviated as “specific disease”.
  • the risk of developing the specific disease can be predicted more accurately, simply and earlier from a more basic viewpoint, and measures should be taken early so as not to suffer from the specific disease. You can take it.
  • the specific disease can be detected or the risk of developing the specific disease can be detected. it can.
  • the detection method of the present invention it is possible to detect whether or not the subject is suffering from metabolic syndrome, and to determine the risk of developing the subject.
  • ganglioside GM3 having a specific structure is correlated with markers of visceral fat type obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension and atherosclerosis, and ganglioside having the specific structure.
  • diabetes such as myocardial infarction or angina pectoris caused by detecting a disease such as the specific disease, metabolic syndrome, lifestyle-related disease or the like, or detecting the risk of developing the disease, etc.
  • Cardiovascular disorders cerebrovascular disorders such as cerebral infarction; renal dysfunction; vascular disorders such as limb arterial occlusion;
  • Serum total GM3 level (A) total cholesterol level, (B) LDL-cholesterol (LDL-c) level, (C) autotaxin level, (D) mean intima media thickness (Mean IMT), ( E) A graph showing the correlation between fasting blood glucose level, (F) insulin, (G) HOMA-IR level, and (H) HbA1c level. It is a graph which shows the result of having measured the quantity of 12 GM3 molecular species in the serum of the healthy subject and the patient suffering from each disease.
  • GM3 [hC24: 1] GM3) having a specific structure in serum, (A) total cholesterol amount, (B) LDL-cholesterol (LDL-c) amount, (C) autotaxin amount, and (D (A) Mean intima-media thickness (Mean IMT), (E) fasting blood glucose level, (F) insulin, (G) HOMA-IR level, and (H) HbA1c level. It is the graph which measured the amount of [hC24: 1] which exists in GM3, sphingomyelin, and ceramide.
  • the vertical axis represents the ratio (%) when the [C24: 1] amount is 100.
  • A hydroxylated GM3 (“d18: 1-h24: 0”, “d18: 1-h24: 1”, “d18: 1-h22: 1” in serum of healthy subjects and patients suffering from each disease: 0 ”)
  • B Sum of non-hydroxylated GM3 (“ d18: 1-24: 0 ”,“ d18: 1-24: 1 ”,“ d18: 1-22: 0 ”) in serum It is a graph which shows the result of having measured quantity.
  • the total amount of non-hydroxylated GM3 (“d18: 1-24: 0”, “d18: 1-24: 1”, “d18: 1-22: 0”) in serum and (A) the total cholesterol level, (B) LDL-cholesterol (LDL-c) level, (C) autotaxin level, (D) mean intima-media thickness (Mean IMT), (E) fasting blood glucose level, (F) insulin, (G) It is a graph which shows the correlation with the amount of HOMA-IR and the amount of (H) HbA1c.
  • the detection method of the present invention includes (a) a step of measuring ganglioside GM3 in a blood sample derived from a subject, visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3, and R 2 —C ( ⁇ O) — may have a double bond having an OH group as a substituent.
  • a fatty acid residue having 16 to 24 carbon atoms is shown.
  • each disease is defined as follows. ⁇ 1> Visceral fat accumulation (hereinafter referred to as “VFA”) when the waist size at the navel position of the subject is 85 cm or more for a male and 90 cm or more for a female. ). ⁇ 2> When the subject's fasting blood glucose level is 126 mg / dL or more, it is determined that the patient has hyperglycemia.
  • VFA Visceral fat accumulation
  • the subject has a triglyceride (neutral fat) value of 150 mg / dL or more.
  • the subject's low density lipoprotein cholesterol (LDL-c) value is 140 mg / dL or more.
  • the subject has a high density lipoprotein cholesterol (HDL-c) value of less than 40 mg / dL.
  • systolic blood pressure (maximum blood pressure) of the subject is 140 mmHg or higher and / or the diastolic blood pressure (minimum blood pressure) is 90 mmHg or higher, it is determined that the patient has hypertension.
  • Atherosclerosis is also referred to as atherosclerosis, and the accumulation of fat and cholesterol in the intima of blood vessels results in the formation of plaques (species) on the intima of the blood vessels. The state that is.
  • Nephropathy is a disease in which renal function is reduced. There is nephropathy that occurs due to damage to the capillaries of the kidney due to continued high blood glucose levels due to hyperglycemia and the like. ⁇ 7> In addition, diseases considered to be caused by lifestyle such as VFA, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis may be abbreviated as “lifestyle-related diseases”.
  • At least one disease selected from the group consisting of visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis, or two or more are combined. It is a method for detecting a disease or detecting the risk of developing the disease. “Detecting a disease in which two or more are combined” means “at least 2 selected from the group consisting of visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis” It is to detect whether or not a subject has developed more than one disease.
  • Detecting the risk of developing a disease in which two or more are combined means “from visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis” It is determined whether or not the subject has a risk of developing at least two or more selected diseases.
  • the detection method of the present invention is a method for detecting a specific disease and a method for detecting the risk of developing a specific disease.
  • the detection method of the present invention is for detecting a lifestyle-related disease or the risk of developing the lifestyle-related disease. It is also a method of detecting.
  • the detection method of the present invention is also a method of detecting metabolic syndrome or detecting the risk of developing the metabolic syndrome.
  • metabolic syndrome refers to a state of developing visceral fat obesity and developing at least two diseases among “hyperglycemia, dyslipidemia and hypertension”. Therefore, the state of “metabolic syndrome” is included in the state of developing a specific disease.
  • a specific ganglioside GM3 having a structure represented by the following formula (1) in a blood sample derived from a subject is measured.
  • the “measurement” is a concept including confirming the presence of a specific ganglioside GM3 in the blood or quantifying the specific ganglioside GM3 in the blood.
  • the “measurement” may further include other steps as necessary.
  • ganglioside refers to a glycosphingolipid in which one or more sialic acids are bound to a sugar chain.
  • Ganglioside GM3 refers to a glycosphingolipid whose sugar chain is within the following “”.
  • ⁇ -Neu5Ac- (2-3) ⁇ -Gal- (1-4) - ⁇ -Glc- (1-1) -ceramide represents N-acetyl- ⁇ -neuraminic acid
  • ⁇ -Gal represents ⁇ -galactose
  • ⁇ -Glc represents ⁇ -glucose.
  • Ganglioside GM3 (hereinafter sometimes simply referred to as “GM3”) measured in the present invention has a structure represented by the following formula (1) among GM3.
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3, and R 2 —C ( ⁇ O) — may have a double bond having an OH group as a substituent. A fatty acid residue having 16 to 24 carbon atoms is shown.
  • R 1 which is a sugar chain constituting ganglioside GM3 in formula (1) means “ ⁇ -Neu5Ac”, “ ⁇ -Gal” and “ ⁇ -Glc”. Are linked as defined in the above “ganglioside GM3”.
  • GM3 having a structure represented by the above formula (1) may be simply abbreviated as “hydroxylated GM3”.
  • R 2 —C ( ⁇ O) — in the above formula (1) may have a double bond having an OH group as a substituent.
  • a good hydrocarbon group having 22 or 24 carbon atoms can more accurately detect a specific disease and more accurately detect the onset risk of the specific disease as compared to the whole GM3 measurement such as quantification of the total amount of GM3. It is preferable from the point.
  • R 2 has an OH group as a substituent, a hydrocarbon group having a carbon number of 23 with a double bond, and more preferably from the point.
  • the structure represented by the above formula (1) is a structure represented by the following formula (2).
  • R 1 represents a sugar chain constituting the ganglioside GM3.
  • GM3 having the structure represented by (2) may be abbreviated as “[hC24: 1] GM3”.
  • “[HC24: 1] GM3” is a fatty acid having 24 carbon atoms in which the fatty acid of GM3 has an OH group as a substituent (the carbon in which the oxygen of the carboxyl group of the fatty acid is bonded by a double bond is counted as one). Yes, meaning that it has one double bond in the hydrocarbon group.
  • the “subject” in the present invention refers to mammals such as humans, dogs, cats, horses, cows, pigs, sheep, monkeys, etc., but humans are preferred.
  • the “blood sample derived from the subject” used in the present invention includes whole blood, serum, plasma and the like.
  • the use of “subject-derived serum or plasma” is preferable in that highly accurate measurement is possible.
  • plasma can be collected by collecting whole blood collected from a subject into a blood collection tube to which an anticoagulant is added, mixing by inversion, and centrifuging.
  • serum can be collected by coagulating whole blood collected from a subject and then centrifuging it.
  • GM3 having a specific structure represented by Formula (1) As a method for extracting “GM3 having a specific structure represented by Formula (1)” from a blood sample, a known method can be used. More specifically, GM3 can be extracted from a blood sample by the method described in Examples described later.
  • the detection method of the present invention comprises: (B) The amount of ganglioside GM3 which is the structure represented by the above formula (2) measured in the above step (a) and the ganglioside which is the structure represented by the above formula (2) in a blood sample derived from a healthy person Comparing the amount of GM3; (C) From the group consisting of visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis when there is a significant difference in the step (b) It is preferable that the detection method further comprises a step of determining that the marker value relating to the selected at least one disease or a disease in which two or more are combined is abnormal compared to the healthy person.
  • Step (b)> the amount of ganglioside GM3, which is the structure represented by the formula (2) measured in the step (a), and the formula (2) in a blood sample derived from a healthy person are represented. The amount of the structure ganglioside GM3 is compared.
  • step (c) when there is a significant difference in step (b), visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis of the subject It is determined that the value of the marker relating to at least one disease selected from the group consisting of two or more diseases selected from the group consisting of the above group is abnormal as compared with the healthy person.
  • the “significant difference” is represented by the amount of ganglioside GM3 which is a structure represented by the above formula (2) in the blood sample derived from the subject and the above formula (2) in the blood sample derived from a healthy person.
  • the P value is 0.05 or less.
  • the amount of ganglioside GM3 having the structure represented by the above formula (2) in the blood sample derived from the subject is represented by the amount of ganglioside GM3 having the structure represented by the above formula (2) in the blood sample derived from a healthy subject. It is preferable to determine that the marker value of a specific disease is abnormal when the lower limit of the divided value (times) is in the range of 1.2 times to 2.5 times, and 1.4 times to 2. It is more preferable to determine that the abnormality is in the range of 3 times or more, and it is particularly preferable to determine that the abnormality is in the range of 1.6 to 2 times. If the lower limit of the lower limit of the divided value is too low, a healthy person may be determined to be abnormal. On the other hand, if the upper limit of the lower limit of the divided value is too high, it should not be determined to be abnormal even if abnormal. It may become.
  • a marker related to a disease in which two or more are combined means “at least two selected from the group consisting of visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis” This is a marker related to the above diseases.
  • GM3 which is a structure represented by the above formula (1) is ganglioside GM3 ([hC24: 1] GM3) which is a structure represented by the above formula (2) in particular.
  • a marker biomarker
  • This is based on finding that there is a correlation with a marker (biomarker) relating to a specific disease. That is, for example, by measuring one molecule called [hC24: 1] GM3, it is possible to predict a “marker value of a specific disease” correlated with [hC24: 1] GM3. It is possible to infer / determine whether or not the value is abnormal compared to healthy individuals, and based on such determination, a method for detecting a specific disease or detecting the risk of developing a specific disease is particularly preferable.
  • Markers relating to visceral fat type obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, and hypertension include autotaxin, HOMA-IR (Homeostasis model-Insulin Resistance), HbA1c (Hemoglobin A1c), aspartate aminotransferase (AST), alanine-aminotransferase (ALT), low density lipoprotein cholesterol (LDL-c), fasting blood glucose, and at least one marker selected from the group consisting of blood pressure.
  • HOMA-IR Homeostasis model-Insulin Resistance
  • HbA1c Hemoglobin A1c
  • aspartate aminotransferase AST
  • ALT alanine-aminotransferase
  • LDL-c low density lipoprotein cholesterol
  • the marker for atherosclerosis is at least one marker selected from the group consisting of sphingomyelin, lysophosphatidylcholine, C-reactive protein, and mean intima-media thickness (IMT). Preferably there is.
  • the method for measuring the specific ganglioside GM3 is not particularly limited, but a method of allowing an antibody to act on the GM3, a high performance liquid chromatography method, a mass spectrometry method, or a liquid chromatography / mass spectrometry method may be used. preferable. You may use combining these methods.
  • the method for causing the antibody to act on the GM3 is not particularly limited, and examples thereof include an ELISA method.
  • HPLC high performance liquid chromatography method
  • HPLC normal phase chromatography, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography and the like can be used. .
  • the mass spectrometry method is not particularly limited, for example, a MALDI method, an ESI method, an APCI method, or the like can be used as an ionization method.
  • a time-of-flight type TOF type
  • a double focusing type a quadrupole focusing type
  • an ion trap type or the like.
  • Liquid chromatography / mass spectrometry (LC / MS) is an analysis method combining the above high performance liquid chromatography method and the above mass spectrometry.
  • the present invention further includes at least one disease selected from the group consisting of visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis, which contains ganglioside GM3 as a standard substance.
  • a detection kit can be provided.
  • R 1 represents a sugar chain constituting ganglioside GM3, and R 2 —C ( ⁇ O) — may have a double bond having an OH group as a substituent.
  • a fatty acid residue having 16 to 24 carbon atoms is shown.
  • the detection kit of the present invention is used, the above-described effects can be more suitably exhibited. That is, if the detection kit of the present invention is used, at least one selected from the group consisting of hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis can be easily performed using the detection method of the present invention. It is possible to detect one disease or a disease in which two or more are combined, or to detect the risk of developing the disease. Further, by using the detection kit of the present invention, it is possible to detect whether the subject suffers from a specific disease such as lifestyle-related disease or has a risk of developing a specific disease such as lifestyle-related disease. Yes, the state of the subject can be grasped more accurately.
  • a specific disease such as lifestyle-related disease or has a risk of developing a specific disease such as lifestyle-related disease.
  • VFA visceral fat obesity
  • 15 have VFA and hyperglycemia
  • 28 have VFA and dyslipidemia. Had occurred at the same time.
  • the remaining 17 people developed VFA, hyperglycemia and dyslipidemia, that is, metabolic syndrome. Informed consent was obtained from all subjects.
  • LC-MS / MS ionization method: electrospray method, anion mode, multiple reaction monitoring
  • LC used Accela 1250 Pump (Thermo Fisher Scientific) and mass spectrometer Vantage AM (quadrupole type, Thermo Fisher Scientific).
  • the mass spectrometer was calibrated using a mixture of GM3 species extracted from milk.
  • the lipid extracted from the above 50 ⁇ L of serum was dissolved in 50 ⁇ L of methanol, and then 6 ⁇ L was subjected to LC-MS / MS.
  • the 6 ⁇ L contained 12 ng of internal standard d18: 1- [ 13 C] 16: 0.
  • the amount of each GM3 species was quantified based on the internal standard (d18: 1- [ 13 C] 16: 0). The total amount of GM3 was calculated from the total amount of 23 types of GM3 detected.
  • body mass index BMI
  • abdominal circumference rib bone density
  • diastolic blood pressure systolic blood pressure
  • Brinkman index ejection fraction
  • HOMA-IR hemoglobin
  • HbA1c platelet
  • AST Glutamate oxaloacetate transaminase
  • ALT glutamate pyruvate transferase
  • ⁇ -GTP ⁇ -glutamyl transpeptidase
  • triglyceride creatinine, uric acid, high density lipoprotein cholesterol (HDL-c), C-reactive protein, LDL-c, free fatty acid, total adiponectin, autotaxin, sphingomyelin, phosphatidylcholine, lysophosphatidylcholine, and IMT were examined.
  • XLSTAT version 2014.4.02, Addinsoft
  • Example 1 Correlation with marker and each disease> (1) healthy individuals (26), (2) patients with only VFA (39), (3) patients with VFA and hyperglycemia (15), (4) VFA and lipids In patients (28) who have comorbid abnormalities, and (5) patients who have comorbid VFA, hyperglycemia and dyslipidemia (ie patients who have developed metabolic syndrome) (17) Markers (indexes) related to specific diseases such as metabolic syndrome were measured. The results are shown in Table 1.
  • (1) to (5) in Table 1 are (1) healthy subjects, (2) patients with only visceral fat-type obesity, (3) visceral fat-type obesity and hyperglycemia (4) patients with visceral fat obesity and dyslipidemia, and (5) patients with visceral fat obesity, hyperglycemia and dyslipidemia.
  • Example 2 ⁇ Comparison of total amount of GM3 in each disease> (1) healthy individuals (26), (2) patients with only VFA (39), (3) patients with VFA and hyperglycemia (15), (4) VFA and lipids In patients (28) who have comorbid abnormalities, and (5) patients who have comorbid VFA, hyperglycemia and dyslipidemia (ie patients who have developed metabolic syndrome) (17)
  • the total amount of GM3 was measured. The results are shown in FIG.
  • the vertical axis in FIG. 1 represents the total GM3 amount (%) when the amount of the internal standard (“d18: 1- [ 13 C] 16: 0”) contained in the serum sample is 100%. Further, “*” in the figure represents P ⁇ 0.05.
  • the total GM3 amount was significantly different from that in healthy individuals when (2) only VFA developed, but (3) when both VFA and hyperglycemia occurred. (4) When VFA and dyslipidemia were combined, and (5) When VFA, hyperglycemia and dyslipidemia were combined, there was no significant difference compared with healthy individuals.
  • Example 3 Correlation with total GM3 and markers of each disease> Correlation with total GM3 and each disease marker (total cholesterol, LDL-c, autotaxin, mean IMT, fasting blood glucose, insulin, HOMA-IR, HbA1c) was analyzed using Spearman rank correlation. The results are shown in FIG.
  • the total amount of GM3 was correlated with total cholesterol, LDL-c, mean IMT, fasting blood glucose, and HbA1c, but not with autotaxin, insulin, and HOMA-IR. It was.
  • Example 4 ⁇ Relationship with each GM3 type and lifestyle-related diseases>
  • GM3 There are many molecular species in GM3 depending on the number of carbon atoms of the hydrocarbon group in the ceramide moiety in GM3, the number of double bonds, the presence or absence of substituents, and the type.
  • it is possible to obtain more accurate information on the subject regarding lifestyle-related diseases and specific diseases by measuring specific GM3 molecular species, instead of measuring the total amount of GM3. The possibility of being able to do it was examined, and the correlation with each GM3 kind and each disease was investigated.
  • Example 1 As in Example 1, (1) healthy individuals (26), (2) patients with only VFA (39), (3) patients with VFA and hyperglycemia (15) (4) Patients with VFA and dyslipidemia (28 patients), and (5) Patients with VFA, hyperglycemia and dyslipidemia (ie, patients with metabolic syndrome) ) (17 people), the amount of each GM3 species was measured. The results are shown in FIGS. 3A and B.
  • the horizontal axis in FIG. 3A is arranged in descending order of content from “d18: 1-24: 0”, which is the GM3 species most abundant in GM3 in serum.
  • the horizontal axis of FIG. 3B is arranged in descending order of content from “d18: 1-16: 1”, which is the GM3 species that is the 13th most abundant in GM3 in serum.
  • d18: 1 means that the sphingomyelin portion of GM3 is a hydrocarbon group having 18 carbon atoms, It means having one double bond.
  • “24: 0” means that the fatty acid of GM3 is a hydrocarbon group having 24 carbon atoms, and no double bond exists in the hydrocarbon group. For example, when “d18: 1-24: 0” has an OH group as a substituent on a fatty acid, it is expressed as “d18: 1-h24: 0”.
  • the vertical axis in FIG. 3 is the amount (%) of each GM3 species when the amount of the internal standard (“d18: 1- [ 13 C] 16: 0”) contained in the serum sample is 100%. is there.
  • “*” is P ⁇ 0.05
  • “**” is P ⁇ 0.01
  • “***” is P ⁇ 0.001
  • “***” is P Indicates that ⁇ 0.0001. All numbers in the table are mean ⁇ standard deviation. Mann-Whitney U test was used.
  • GM3 hydroxylated GM3 having an OH group as a substituent on the fatty acid of GM3 is effective for detection of specific diseases such as metabolic syndrome and lifestyle-related diseases.
  • Example 5 Correlation with each GM3 species and disease marker> Correlation between GM3 species (12 species shown on the horizontal axis in FIG. 3A) and a disease marker, which were abundantly contained in serum GM3, was analyzed using multivariate analysis. The results are shown in Table 2.
  • the disease markers are as follows.
  • Obesity marker BMI
  • Markers of metabolic syndrome LDL-c, autotaxin (abbreviated as “ATX” in Table 2), HOMA-IR, AST, ALT, HbA1c
  • Markers of atherosclerosis lysophosphatidylcholine (abbreviated as “LPC” in Table 2), sphingomyelin (abbreviated as “SM” in Table 2), ejection fraction (in Table 2, “ EF ”), C-reactive protein (abbreviated as“ CRP ”in Table 2), platelets, triglycerides (4) hypertension marker: blood pressure (5) nephropathy marker: creatinine (6) other Marker: Age
  • hC24: 0, hC24: 1, hC22: 0 hydroxylated GM3 correlates with more specific disease-related markers than non-hydroxylated GM3 It was.
  • “hC24: 1” ([hC24: 1] GM3) having the structure of the following formula (2) is an age, autotaxin, sphingomyelin, blood pressure, HOMA-IR, lysophosphatidylcholine, HbA1c, AST, ALT, C It was correlated with many markers called reactive proteins, suggesting that it is effective to use for detection and diagnosis of specific diseases.
  • Table 2 shows that hydroxylated GM3 (hC24: 0, hC24: 1, hC22: 0) correlates with more specific disease-related markers than non-hydroxylated GM3 It was.
  • “hC24: 1” [hC24: 1] GM3) having the structure of the following formula (2) is an age, autotaxin, sphingomyelin, blood pressure,
  • the total amount of GM3 may increase as the number of molecular species that are not closely related to the specific disease increases. Therefore, using the total GM3 amount as a marker for detection / diagnosis of a specific disease is a false positive or false This suggests that it may lead to detection and diagnosis.
  • R 1 represents a sugar chain constituting the ganglioside GM3.
  • Example 6 Correlation with [hC24: 1] GM3 and markers of each disease> The results of Example 5 suggested that it is effective to use [hC24: 1] GM3 as a marker for specific diseases such as metabolic syndrome, and as a marker for lifestyle-related diseases and specific diseases.
  • the correlation between [hC24: 1] GM3 and each disease marker total cholesterol, LDL-c, autotaxin, IMT, fasting blood glucose, insulin, HOMA-IR, HbA1c
  • the results are shown in FIG.
  • the amount of [hC24: 1] GM3 was correlated with total cholesterol, LDL-c, autotaxin, IMT, fasting blood glucose, insulin, HOMA-IR, and HbA1c.
  • Example 7 ⁇ Measurement of [hC24: 1] Content> The amount of [hC24: 1] relative to [C24: 1] contained in the whole serum of GM3, sphingomyelin, and ceramide was measured. The results are shown in FIG.
  • the vertical axis in FIG. 5 represents “the number of carbon atoms of fatty acid relative to the amount of“ the fatty acid has 24 carbon atoms and one double bond exists in the fatty acid ”(abbreviated as [C24: 1]).
  • Is 24, has a hydroxyl group, and one fatty acid is present in the fatty acid ”(abbreviated as [hC24: 1]).
  • GM3 As a result, assuming that GM3 is abundant in patients with a specific disease, “a fatty acid having 24 carbon atoms having an OH group as a substituent and one double bond” is particularly in GM3.
  • [HC24: 1] GM3 proved to be particularly suitable as a marker for specific diseases. From the result of FIG. 5, the reason / mechanism that GM3 represented by the formula (1) such as [hC24: 1] GM3 is suitable as a detection method of a specific disease and a detection method of the onset risk of the specific disease is clarified. became.
  • Example 8 ⁇ Comparison of the amount of hydroxylated GM3 in each disease> (1) healthy individuals (26), (2) patients with only VFA (39), (3) patients with VFA and hyperglycemia (15), (4) VFA and lipids In patients (28) who have comorbid abnormalities, and (5) patients who have comorbid VFA, hyperglycemia and dyslipidemia (ie patients who have developed metabolic syndrome) (17) Hydroxylated GM3 (“d18: 1-h24: 0”, “d18: 1-h24: 1”, “d18: 1-h22: 0”) and non-hydroxylated GM3 (“d18: 1-24: 0”), The amount of “d18: 1-24: 1” and “d18: 1-22: 0”) was measured.
  • FIG. “*” In the figure represents P ⁇ 0.01.
  • the vertical axis of FIG. 6A represents the total amount (ng / ⁇ L) of three hydroxylated GM3s (“d18: 1-h24: 0”, “d18: 1-h24: 1”, “d18: 1-h22: 0”).
  • the vertical axis of FIG. 6B represents the total amount of three non-hydroxylated GM3 (“d18: 1-24: 0”, “d18: 1-24: 1”, “d18: 1-22: 0”) ( ng / ⁇ L).
  • the total amount of hydroxylated GM3 (“d18: 1-h24: 0”, “d18: 1-h24: 1”, “d18: 1-h22: 0”) is (5) VFA, When hyperglycemia and dyslipidemia occurred together, there was a significant difference compared with healthy individuals.
  • the total amount of non-hydroxylated GM3 (“d18: 1-24: 0”, “d18: 1-24: 1”, “d18: 1-22: 0”) is In any of 2) to (5), there was no significant difference compared with healthy individuals.
  • Example 9 ⁇ Correlation with hydroxylated GM3 and markers of each disease> Spearman's rank correlation with hydroxylated GM3 or non-hydroxylated GM3 and markers of each disease (total cholesterol, LDL-c, autotaxin, IMT, fasting blood glucose, insulin, HOMA-IR, HbA1c) And analyzed. The results are shown in FIGS. FIG. 7 shows the total amount (ng / ⁇ L) of three hydroxylated GM3 (“d18: 1-h24: 0”, “d18: 1-h24: 1”, “d18: 1-h22: 0”) and each disease.
  • FIG. 7 shows the total amount (ng / ⁇ L) of three hydroxylated GM3 (“d18: 1-h24: 0”, “d18: 1-h24: 1”, “d18: 1-h22: 0”) and each disease.
  • FIG. 7 shows the total amount (ng / ⁇ L) of three hydroxylated GM3 (“d18: 1-h24:
  • the total amount of hydroxylated GM3 (“d18: 1-h24: 0”, “d18: 1-h24: 1”, “d18: 1-h22: 0”) was calculated as total cholesterol, LDL-c , Autotaxin, IMT, fasting blood glucose, insulin, HOMA-IR, HbA1c.
  • the total amount of non-hydroxylated GM3 (“d18: 1-24: 0”, “d18: 1-24: 1”, “d18: 1-22: 0”)
  • LDL-c and fasting blood glucose but there was no correlation with autotaxin, IMT, insulin, HOMA-IR, and HbA1c.
  • the present invention In the detection method of the present invention, at least one disease selected from the group consisting of visceral fat obesity, hyperglycemia, dyslipidemia, hypertension, and atherosclerosis, or two or more are combined.
  • the disease can be detected or the risk of developing the disease can be detected, and the condition of the subject can be grasped more accurately. Therefore, the present invention can be used in the fields of diagnostic agents, research reagents, clinical tests, and the like.

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Abstract

　本発明は、（ａ）被験者由来の血液試料中のガングリオシドＧＭ３を測定する工程を含む、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法であって、該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出方法に関する。［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］

Description

疾患を検出する方法
　本発明は、特定の疾患を検出する又は該疾患の発症リスクを検出する方法及びそれらの検出キットに関し、更に詳しくは、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定する工程を含む、特定の疾患を検出する又は該疾患の発症リスクを検出する方法及びそれらの検出キットに関するものである。
　糖尿病及び循環器病（ＣＶＤ；ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅ）は肥満、高血圧及び身体活動の低下を含む多くの危険因子が重複し、互いに関連性がある。ＣＶＤの１つであるアテローム性動脈硬化症は、コレステロール及び脂肪が血管の内腔に蓄積することによって、プラークが形成された状態をいう。このプラークが破裂すると、血栓ができ、脳卒中、心臓発作等を引き起こす危険性がある（非特許文献１）。
　これまでにメタボリック及び行動リスク因子がアテローム性動脈硬化症を引き起こす原因となっていることが報告されている。行動リスク因子には、運動不足、過剰なカロリー、塩及び脂肪摂取等の不健康な食事、タバコ、及びアルコールの乱用等が含まれる。従来のメタボリックリスク因子には、高血圧、血中におけるコレステロール等の脂質濃度の増加、及び高血糖等が含まれる。また、頸動脈内膜中膜肥厚（ＣＩＭＴ）がＣＶＤ危険因子と関連があることが報告されている。
　一方、糖尿病には、１型糖尿病と２型糖尿病がある。２型糖尿病は、過剰なカロリー摂取、運動不足、肥満及び血中における低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）濃度増加等と関連があり、生活習慣病と言われている。２型糖尿病では、インスリン抵抗性及び／又はインスリン分泌不全となり、高血糖状態となっている（非特許文献２）。内臓脂肪の過剰蓄積に伴う脂肪細胞の機能異常によるアディポサイトカインの分泌バランスの破綻が、インスリン抵抗性を惹起し、２型糖尿病や動脈硬化性疾患の要因として重要な役割を果たしていることが明らかにされている。
　内臓脂肪組織中には常時、骨髄性細胞であるマクロファージが潜在しているが、肥大化に伴いインスリン抵抗性を獲得しつつある内臓脂肪細胞からはＭＣＰ－１というアディポサイトカインが分泌され、更にマクロファージが周辺血管より動員される。また、肥大化した脂肪組織から分泌される多量の遊離脂肪酸もＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒを介してマクロファージを活性化し、ＴＮＦαやＩＬ－６等の炎症性サイトカインを分泌する。これらの炎症性サイトカインが脂肪細胞に作用し、脂肪細胞のインスリン抵抗性を増悪する。その結果、アディポサイトカインの分泌異常が亢進する。この脂肪細胞の慢性炎症状態が、全身性のインスリン抵抗性を惹起することが見出され、脂肪組織の病態生理が注目されている（非特許文献３）。
　現在２型糖尿病の血液診断は、一般的に血糖値、ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミン値等を指標に診断されているが、２型糖尿病の病状を正解に把握するためには、１つの指標だけではなく、複数の指標を測定し、評価しなければならない。
　これまでに、発明者らは、血液中の、ガングリオシドの１つであるガングリオシドＧＭ３（α－Ｎｅｕ５Ａｃ－（２－３）β－Ｇａｌ－（１－４）－β－Ｇｌｃ－（１－１）－セラミド）を定量することによって、２型糖尿病、高脂血症、高血圧及び肥満からなる群から選択されるインスリン抵抗性病態を示す疾患を検出することができることを見出した（特許文献１、非特許文献４）。ガングリオシドはシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称であり、スフィンゴ糖脂質は、セラミドにグルコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、シアル酸等の糖や硫酸の段階的な酵素付加によって生合成された糖脂質であり、細胞膜脂質二重層の外側に発現している。
　また、これまでの研究により、総ＧＭ３量は、リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）と相関関係があることがわかっている（非特許文献４）。
　また、血液中のガングリオシドＧＭ３には、セラミド部分の炭化水素基の炭素数や二重結合の数、置換基の種類や数等により、多くの分子種が存在している。分子種によって、生物物理学的特性や生理学的機能が異なると言われ、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定することが、メタボリックシンドローム等の生活習慣病の検出に更に有効であると考えられるが、これまでのところ、当該検出により有効であるガングリオシドＧＭ３の構造については報告がなされていない。
国際公開第２００７／１３９２２４号
Kwon，G．P．et al.，Circulation， 117（2008）2919-2927 Chen，L．et al.，Nat rev Endocrinol.， 8（2012）228-236 Katada，H．et al.，Chem Bio Chem.， 10（2009）1279 Sato，T．et al.，Obe Res Clin Pract., 2（2008）Ｉ-II
　本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、メタボリックシンドローム等の生活習慣病（特定疾患）に関与する多くの分子と相関性がある、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定する工程を含む、疾患を検出する又は該疾患の発症リスクを検出する方法及びキットを提供することにある。
　本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、セラミド部分がヒドロキシル化されたガングリオシドＧＭ３を測定することにより、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出できることを見出した。
　また、該特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３は、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーと相関関係があることを見出して本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の方法である。
［１］
（ａ）被験者由来の血液試料中のガングリオシドＧＭ３を測定する工程
を含む、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法であって、
　該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
［２］
　上記疾患がメタボリックシンドロームである［１］に記載の検出方法。
［３］
　上記式（１）で表される構造は、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数２２又は２４の炭化水素基である［１］又は［２］に記載の検出方法。
［４］
　上記式（１）で表される構造は、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有する炭素数２４の炭化水素基である［１］又は［２］に記載の検出方法。
［５］
　上記式（１）で表される構造が下記式（２）で表される構造である［１］又は［２］に記載の検出方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式（２）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示す。］
［６］
　（ｂ）上記（ａ）工程で測定した上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を比較する工程と、
　（ｃ）上記（ｂ）工程で有意な差があった場合に、上記被験者の、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーの値が、上記健常人と比較して異常であると判定する工程
を更に含む、［５］に記載の検出方法。
［７］
　上記内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、及び、高血圧症に関するマーカーは、オートタキシン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニン－アミノトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質コレステロール、空腹時血糖、及び、血圧よりなる群から選択される少なくとも１つである、［６］に記載の検出方法。
［８］
　上記アテローム性動脈硬化症に関するマーカーは、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、Ｃ反応性タンパク質、及び、平均内膜中膜肥厚よりなる群から選択される少なくとも１つである、［６］又は［７］に記載の検出方法。
［９］
　上記ガングリオシドＧＭ３の測定を、上記ガングリオシドＧＭ３に対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法、質量分析法、又は液体クロマトグラフィー／質量分析法によって行う、［１］ないし［８］の何れかの請求項に記載の検出方法。
［１０］
　標準物質としてガングリオシドＧＭ３を含有する、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出するキットであり、
　該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
　本発明の検出方法によれば、前記問題点を解消し前記課題を解決し、血液試料中の特定構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定することにより、従来の検出方法と比べて、被験者の状態を、より基本的見地から、より正確に、より簡便に把握することができる。
　式（１）で表される特定のガングリオシドＧＭ３を測定することにより、一般的ガングリオシドＧＭ３の測定（ガングリオシドＧＭ３全体の測定）に比べて、更に的確に、特定疾患の検出ができたり、特定疾患の発症リスクの検出ができたりする。
　また、従来の生活習慣病の検出方法と比べて、被験者の生活習慣病に関連する状態をより正確に把握することができる。
　具体的には、本発明の検出方法により、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定することで、従来法に比べ、より基本的見地から、より正確に、より簡便に、「内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患」を検出することができる。
　本明細書では、上記「　　」内（合併された疾患も含む）を、「特定疾患」と略記することがある。
　また、従来法に比べ、上記特定疾患の発症リスクを、より基本的見地から、より正確に、より簡便に、より早期に予測することができて、該特定疾患に罹患しないよう早めに対策を講じること等ができる。
　また、本発明の検出方法により、総ＧＭ３量を測定することでは特定疾患を検出することができない場合であっても、特定疾患を検出したり、特定疾患の発症リスクを検出したりすることができる。
　特に、本発明の検出方法により、被験者がメタボリックシンドロームに罹患しているか否かを検出したり、該発症リスクを判断したりすることができる。
　また、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３は、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症のマーカーと相関性があり、該特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定するという簡便な操作により、上記特定疾患に罹患しているかを検出する又は上記特定疾患を発症するリスクがあるかを予測することができる。
　本発明によれば、前記特定疾患、メタボリックシンドローム、生活習慣病等の疾患を検出すること又は該疾患の発症リスクを検出することによって、それらによって引き起こされる、糖尿病；心筋梗塞、狭心症等の心臓血管障害；脳梗塞等の脳血管障害；腎機能障害；四肢動脈閉塞等の血管障害；等の循環器系疾患の検出・予防が容易になる。
健常人及び各疾患に罹患している患者の血清中の総ＧＭ３量を測定した結果を示すグラフである。 血清中の総ＧＭ３量と、（Ａ）総コレステロール量、（Ｂ）ＬＤＬ－コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）量、（Ｃ）オートタキシン量、（Ｄ）平均内膜中膜肥厚（Ｍｅａｎ　ＩＭＴ）、（Ｅ）空腹時血糖値、（Ｆ）インスリン、（Ｇ）ＨＯＭＡ－ＩＲ量、及び（Ｈ）ＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。 健常人及び各疾患に罹患している患者の血清中の、１２個のＧＭ３分子種の量を測定した結果を示すグラフである。 健常人及び各疾患に罹患している患者の血清中の、１１個のＧＭ３分子種の量を測定した結果を示すグラフである。 血清中の特定の構造を有するＧＭ３（［ｈＣ２４：１］ＧＭ３）量と、（Ａ）総コレステロール量、（Ｂ）ＬＤＬ－コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）量、（Ｃ）オートタキシン量、及び（Ｄ）平均内膜中膜肥厚（Ｍｅａｎ　ＩＭＴ）、（Ｅ）空腹時血糖値、（Ｆ）インスリン、（Ｇ）ＨＯＭＡ－ＩＲ量、及び（Ｈ）ＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。 ＧＭ３、スフィンゴミエリン、セラミドに存在する［ｈＣ２４：１］量を測定したグラフである。縦軸は、［Ｃ２４：１］量を１００としたときの割合（％）である。 健常人及び各疾患に罹患している患者の、（Ａ）血清中のヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」）の合計量、（Ｂ）血清中の非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－２４：０」、「ｄ１８：１－２４：１」、「ｄ１８：１－２２：０」）の合計量を測定した結果を示すグラフである。 血清中のヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」）の合計量と、（Ａ）総コレステロール量、（Ｂ）ＬＤＬ－コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）量、（Ｃ）オートタキシン量、（Ｄ）平均内膜中膜肥厚（Ｍｅａｎ　ＩＭＴ）、（Ｅ）空腹時血糖値、（Ｆ）インスリン、（Ｇ）ＨＯＭＡ－ＩＲ量、及び（Ｈ）ＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。 血清中の非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－２４：０」、「ｄ１８：１－２４：１」、「ｄ１８：１－２２：０」）の合計量と、（Ａ）総コレステロール量、（Ｂ）ＬＤＬ－コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）量、（Ｃ）オートタキシン量、（Ｄ）平均内膜中膜肥厚（Ｍｅａｎ　ＩＭＴ）、（Ｅ）空腹時血糖値、（Ｆ）インスリン、（Ｇ）ＨＯＭＡ－ＩＲ量、及び（Ｈ）ＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
　以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。
　本発明の検出方法は、（ａ）被験者由来の血液試料中のガングリオシドＧＭ３を測定する工程を含む、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法であって、該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
　本明細書中において、各疾患を以下のように定義する。
＜１＞被験者のへその位置でのウエストサイズが男性の場合は８５ｃｍ以上、女性の場合は９０ｃｍ以上のときに、内臓脂肪型肥満症（ｖｉｓｃｅｒａｌ　ｆａｔ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ、以下「ＶＦＡ」と略記する場合がある）であると判断する。
＜２＞被験者の空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上であるときに、高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）であると判断する。
＜３＞次の（１）から（３）の条件のうち、少なくとも１つの条件に当てはまるときに、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）であると判断する。
（１）被験者のトリグリセライド（中性脂肪）値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上。
（２）被験者の低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）値が１４０ｍｇ／ｄＬ以上。
（３）被験者の高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－ｃ）値が４０ｍｇ／ｄＬ未満。
＜４＞被験者の収縮期血圧（最高血圧）が１４０ｍｍＨｇ以上、及び／又は、拡張期血圧（最低血圧）が９０ｍｍＨｇ以上であるときに、高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｔｉｏｎ）であると判断する。
＜５＞アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）とは、粥状動脈硬化とも言われ、血管の内膜に脂肪やコレステロールが蓄積することにより、プラーク（粥種）が該血管の内膜に形成されている状態をいう。
＜６＞腎症（Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）は、腎機能が低下する病気である。高血糖症等により血糖値が高い状態が続いたことにより、腎臓の毛細血管に障害が起きて発生する腎症がある。
＜７＞また、上記ＶＦＡ、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、アテローム性動脈硬化症等、生活習慣に起因すると考えられる疾患を「生活習慣病」と略記する場合がある。
　本発明の検出方法は、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法である。
　「２つ以上が合併された疾患を検出する」とは、「内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも２つ以上の疾患を被験者が発症しているか否かを検出する」ということである。
　また、「２つ以上が合併された疾患の発症リスクを検出する」とは、「内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも２つ以上の疾患の発症リスクを被験者が有しているか否かを検出する」ということである。
　本発明の検出方法は、特定疾患の検出方法、特定疾患の発症リスクの検出方法であるが、また、本発明の検出方法は、生活習慣病を検出する、又は、該生活習慣病の発症リスクを検出する方法でもある。
　また、本発明の検出方法は、メタボリックシンドロームを検出する、又は、該メタボリックシンドロームの発症リスクを検出する方法でもある。
　本明細書において、「メタボリックシンドローム」とは、内臓脂肪型肥満症であると共に、「高血糖症、脂質異常症及び高血圧症」のうち少なくとも２つの疾患を発症している状態を言う。従って、「メタボリックシンドローム」の状態は、特定疾患を発症している状態に含まれる。
＜工程（ａ）＞
　工程（ａ）においては、被験者由来の血液試料中の、下記式（１）で表される構造を有する特定のガングリオシドＧＭ３を測定する。該「測定」とは、特定のガングリオシドＧＭ３の存在を血液中に確認したり、血液中の特定のガングリオシドＧＭ３を定量したりすることを含む概念である。該「測定」は、必要に応じて、更にその他の工程を含んでいてもよい。
　一般に「ガングリオシド（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）」とは、糖鎖上に１つ以上のシアル酸が結合しているスフィンゴ糖脂質を言う。
　「ガングリオシドＧＭ３」とは、スフィンゴ糖脂質の糖鎖が、下記「　　」内であるものを言う。
「α－Ｎｅｕ５Ａｃ－（２－３）β－Ｇａｌ－（１－４）－β－Ｇｌｃ－（１－１）－セラミド」
　ここで、「α－Ｎｅｕ５Ａｃ」は、Ｎ-アセチル－α－ノイラミン酸、「β－Ｇａｌ」は、β－ガラクトース、「β－Ｇｌｃ」は、β－グルコースを示す。
　本発明で測定するガングリオシドＧＭ３（以下、単に「ＧＭ３」と略記する場合がある）は、ＧＭ３の中でも特に下記式（１）で表される構造を有するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
　ここで、「ガングリオシドＧＭ３」の定義から、式（１）中の「ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖であるＲ１」とは、「α－Ｎｅｕ５Ａｃ」、「β－Ｇａｌ」及び「β－Ｇｌｃ」が、前記「ガングリオシドＧＭ３」の定義のように結合したものである。
　以下、「上記式（１）で表される構造を有するＧＭ３」を、単に「ヒドロキシル化ＧＭ３」と略記する場合がある。
　上記式（１）で表される構造については、上記式（１）中の「Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－」が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数２２又は２４の炭化水素基であることが、ＧＭ３総量の定量等のＧＭ３全体の測定に比べ、より的確に特定疾患の検出ができ、より的確に該特定疾患の発症リスクを検出できる点から好ましい。
　また、Ｒ２が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有する炭素数２３の炭化水素基であることが、上記点からより好ましい。
　更に、上記式（１）で表される構造が下記式（２）で表される構造であることが、上記点から特に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式（２）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示す。］
　以下、「上記（２）で表される構造を有するＧＭ３」を、「［ｈＣ２４：１］ＧＭ３」と略記する場合がある。「［ｈＣ２４：１］ＧＭ３」は、ＧＭ３の脂肪酸が、置換基としてＯＨ基を有する、炭素数２４の脂肪酸（脂肪酸のカルボキシル基の酸素が二重結合で結合した炭素も１つと数える。）であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有することを意味する。
　本発明における「被験者」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル等の哺乳動物を示すが、ヒトが好ましい。
　本発明において用いられる「被験者由来の血液試料」は、全血液、血清、血漿等が挙げられる。「被験者由来の血清又は血漿」を用いることが、高精度な測定が可能となる点で好ましい。
　例えば、被験者から採取した全血液を抗凝固剤が添加された採血管に採取し、転倒混和後、遠心分離することによって、血漿を回収することができる。また、被験者から採取した全血液を凝固させた後、遠心分離することによって、血清を回収することができる。
　血液試料中の「式（１）で表される特定の構造を有するＧＭ３」の抽出方法は、公知の方法を用いることができる。より具体的には、後述する実施例に記載の方法等によって、血液試料中からＧＭ３を抽出することができる。
　また、本発明の検出方法は、
　（ｂ）上記（ａ）工程で測定した上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を比較する工程と、
　（ｃ）上記（ｂ）工程で有意な差があった場合に、上記被験者の、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーの値が、上記健常人と比較して異常であると判定する工程
を更に含む検出方法であることが好ましい。
＜工程（ｂ）＞
　工程（ｂ）においては、上記（ａ）工程で測定した上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を比較する。
＜工程（ｃ）＞
　工程（ｃ）においては、上記（ｂ）工程で有意な差があった場合に、上記被験者の、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーの値が、上記健常人と比較して異常であると判定する。
　「有意な差」とは、被験者由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を、例えば、マン・ホイットニーのＵ検定、２標本ｔ検定等を用いて統計解析を行った結果、Ｐ値が０．０５以下であることを言う。
　被験者由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量で割った値（倍）の下限が、１．２倍以上～２．５倍以上の範囲のときに特定疾患のマーカー値が異常であると判断することが好ましく、１．４倍以上～２．３倍以上の範囲のときに異常であると判断することがより好ましく、１．６倍以上～２倍以上の範囲のときに異常であると判断することが特に好ましい。該割った値の下限の下限が低過ぎると、健常人を異常と判定してしまう場合があり、一方、該割った値の下限の上限が高過ぎると、異常な場合でも異常と判定しないことになってしまう場合がある。
　「２つ以上が合併された疾患に関するマーカー」とは、「内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも２つ以上の疾患に関するマーカー」ということである。
　上記工程（ｃ）は、上記式（１）で表される構造であるＧＭ３が、特に上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３（［ｈＣ２４：１］ＧＭ３）であるときに、特定疾患に関するマーカー（バイオマーカー）と相関関係があったことを見出したことに基づいている。
　すなわち、例えば、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３という１つの分子を測定等することにより、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３と相関性がある「特定疾患のマーカーの値」についても予測することができ、該マーカーの値が健常人と比較して異常か否かを推測・判定することができ、そのような判定を基に、特定疾患を検出したり、特定疾患の発症リスクを検出したりする方法が特に好ましい。
　上記内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、及び、高血圧症に関するマーカーとは、オートタキシン、ＨＯＭＡ－ＩＲ（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ｍｏｄｅｌ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ－Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、ＨｂＡ１ｃ（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ａ１ｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニン－アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）、空腹時血糖、及び、血圧よりなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであることが好ましい。
　上記アテローム性動脈硬化症に関するマーカーは、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、Ｃ反応性タンパク質（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、及び、平均内膜中膜肥厚（ＩＭＴ）よりなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであることが好ましい。
　上記特定のガングリオシドＧＭ３の測定方法は、特に限定はないが、上記ＧＭ３に対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法、質量分析法、又は、液体クロマトグラフィー／質量分析法を用いることが好ましい。これらの方法を組み合わせて使用してもよい。
　上記ＧＭ３に対して抗体を作用させる方法としては、特に限定されないが、例えば、ＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。
　上記高速液体クロマトグラフィー法（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する場合がある）としては、特に限定されないが、例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を使用することができる。
　質量分析法としては、特に限定されないが、例えば、イオン化法として、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法、及びＡＰＣＩ法等を使用することができる。また、分離部として、飛行時間型（ＴＯＦ型）、二重収束型、四重極収束型、イオントラップ型等を使用することができる。特定の構造を有するＧＭ３の測定（検出、定量）においては、イオン化法として、ＥＳＩ法又はＡＰＣＩ法、分離部として四重極収束型を使用することが好ましい。
　「液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）」とは、上記の高速液体クロマトグラフィー法及び上記質量分析法を組み合わせた分析法である。
＜検出キット＞
　本発明は、更に、標準物質としてガングリオシドＧＭ３を含有する、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出するキットであり、該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される特定の構造であることを特徴とする検出キットを提供することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
　本発明の上記検出キットを用いれば、前記した効果をより好適に発揮することができる。すなわち、本発明の検出キットを用いれば、上記本発明の検出方法を用いて、容易に高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出することが可能である。
　また、本発明の検出キットを用いれば、被験者が生活習慣病等の特定疾患に罹患しているか、又は、生活習慣病等の特定疾患を発症するリスクを有しているか検出することが可能であり、被験者の状態をより正確に把握することができる。
　以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。
＜被験者＞
　合計１２５人の日本人を被験者とした。その１２５人のうち、２６人は健常人であり、３９人は内臓脂肪型肥満症（ＶＦＡ）のみを有し、１５人はＶＦＡ及び高血糖症を併発し、２８人はＶＦＡ及び脂質異常症を併発していた。そして、残りの１７人は、ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発、すなわち、メタボリックシンドロームを発症していた。
　なお、被験者全員にインフォームドコンセントを行い同意が得られた。
＜脂質の抽出＞
　５０μＬの血清に、１００ｎｇの１３Ｃで標識したＧＭ３（以下、「ｄ１８：１－［１３Ｃ］１６：０」と略記する）を内部標準として加え、凍結乾燥後、クロロホルム及びメタノールを１：１で混合した溶液５ｍＬに溶解した。得られた混合物を超音波処理し、４０℃で１時間保温後、４℃で３０分間遠心分離した（１５，０００×ｇ）。遠心分離後、上清を回収し、ペレットは上記と同じ抽出工程に供した。得られた上清を混合後、蒸発させて、血清から脂質を抽出した。
＜質量分析＞
　各ＧＭ３種の測定は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（イオン化法：エレクトロスプレー法、陰イオンモード、多重反応モニタリング）を用いた。ＬＣはＡｃｃｅｌａ　１２５０　Ｐｕｍｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、質量分析装置はＶａｎｔａｇｅ　ＡＭ（四重極型、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用した。牛乳から抽出したＧＭ３種の混合物を用いて、質量分析装置のキャリブレーションを行った。
　上記５０μＬの血清から抽出した脂質を５０μＬのメタノールに溶解後、６μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳに供した。該６μＬ中、内部標準であるｄ１８：１－［１３Ｃ］１６：０は１２ｎｇ含まれていた。
　ＬＣの設定条件を以下に示す。
（１）カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　Ｃ３０－ＵＧ－１（長さ５０ｍｍ、野村化学）
（２）流速：５０μＬ／ｍｉｎ
（３）移動相：（ｉ）０．１％酢酸及び０．１％アンモニアを含む、Ｈ２Ｏ（２０％）／２－プロパノール（５０％）／メタノール（３０％）混合溶液（以下、「溶媒Ａ」とする）。（ｉｉ）０．１％酢酸及び０．１％アンモニアを含む、Ｈ２Ｏ（２％）／２－プロパノール（５０％）／メタノール（４８％）混合溶液（以下、「溶媒Ｂ」とする）。
（４）溶出条件：溶媒Ａの濃度を０分（分析開始時）から５分間１００％で送液し、その後３０分間で０％（溶媒Ｂの濃度を１００％）まで直線的に低下させた。その後４分間０％（溶媒Ｂの濃度を１００％）で送液し、１分後に１００％まで上昇させ、その後１０分間溶媒Ａの濃度を１００％で送液した。
　質量分析装置の設定条件を以下に示す。
（１）ニードル電圧：－２５００Ｖ
（２）キャピラリー温度：２０４℃
（３）ペーパライザー温度：３７３℃
（４）シースガス圧（窒素ガス）：５０（任意単位）
（５）イオンスイーブガス圧：０（任意単位）
（６）補助ガス圧（窒素ガス）：１５（任意単位）
（７）ＳレンズＲＦ振幅：２７６
（８）イオン源解離 （ＣＩＤ） 衝突エネルギー：０
（９）衝突圧力：１．０ｍＴｏｒｒ
（１０）衝突エネルギー：５３ｅＶ
（１１）スキャン時間：０．０１秒
　各ＧＭ３種の量は、内部標準（ｄ１８：１－［１３Ｃ］１６：０）を基に定量した。総ＧＭ３量は、検出された２３種のＧＭ３の合計量から計算した。
＜統計解析＞
　定量解析の結果は、平均標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）で表した。すべての統計解析において、Ｐ≦０．０５の場合、統計的に有意差があると判断した。統計解析には、マン・ホイットニーのＵ検定又は２標本ｔ検定を用い、スピアマンの順位相関係数を求めた。
　また、実施例５において、全てのＧＭ３種について、多変量解析を行った。説明変数として、肥満度指数（ＢＭＩ；Ｂｏｄｙ　Ｍａｓｓ　Ｉｎｄｅｘ）、腹囲、踵骨骨密度、弛緩期血圧、収縮期血圧、ブリンクマン指数、駆出率、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、血小板、ＡＳＴ（グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ））、ＡＬＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスフェラーゼ（ＧＰＴ））、γ－グルタミルトランスペプチターゼ（γ－ＧＴＰ）、トリグリセライド、クレアチニン、尿酸、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－ｃ）、Ｃ反応性タンパク質、ＬＤＬ－ｃ、遊離脂肪酸、総アディポネクチン、オートタキシン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、及び、ＩＭＴを調べた。多変量解析ではＸＬＳＴＡＴ（ｖｅｒｓｉｏｎ　２０１４．４．０２、Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ社）を用い、それ以外の統計解析にはＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｉｎｃ．）を用いた。
実施例１
＜マーカー及び各疾患との相関性＞
　（１）健常人（２６人）、（２）ＶＦＡのみ発症している患者（３９人）、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している患者（１５人）、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している患者（２８人）、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者（すなわち、メタボリックシンドロームを発症している患者）（１７人）における、メタボリックシンドローム等の特定疾患と関連があるマーカー（指標）を測定した。結果を、表１に示す。表１中の（１）～（５）は、（１）健常人、（２）内臓脂肪型肥満症のみ発症している患者、（３）内臓脂肪型肥満症及び高血糖症を併発している患者、（４）内臓脂肪型肥満症及び脂質異常症を併発している患者、及び（５）内臓脂肪型肥満症、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者である。
　また、表中、「ｎｓ」は、Ｐ＞０．０５、「＊」は、Ｐ≦０．０５、「＊＊」は、Ｐ≦０．０１、「＊＊＊」は、Ｐ≦０．００１、「＊＊＊＊」は、Ｐ≦０．０００１であることを示す。表中の数字は、何れも平均±標準偏差である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例２
＜各疾患における総ＧＭ３量の比較＞
　（１）健常人（２６人）、（２）ＶＦＡのみ発症している患者（３９人）、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している患者（１５人）、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している患者（２８人）、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者（すなわち、メタボリックシンドロームを発症している患者）（１７人）における、総ＧＭ３量を測定した。結果を、図１に示す。図１中の縦軸は、血清サンプル中に含まれる内部標準（「ｄ１８：１－［１３Ｃ］１６：０」）の量を１００％としたときの、総ＧＭ３量（％）である。また、図中の「＊」は、Ｐ≦０．０５を表す。
　図１の結果より、総ＧＭ３量は、（２）ＶＦＡのみを発症している場合、健常人と比べて有意な差があったが、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している場合、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している場合、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合は、健常人と比べて有意な差はなかった。
実施例３
＜総ＧＭ３及び各疾患のマーカーとの相関性＞
　総ＧＭ３及び各疾患のマーカー（総コレステロール、ＬＤＬ－ｃ、オートタキシン、平均ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ）との相関関係を、スピアマンの順位相関を用いて解析した。結果を、図２に示す。
　図２の結果、総ＧＭ３量は、総コレステロール、ＬＤＬ－ｃ、平均ＩＭＴ、空腹時血糖、及びＨｂＡ１ｃとは相関性があったが、オートタキシン、インスリン、及びＨＯＭＡ－ＩＲとは相関性がなかった。
＜実施例２及び３の結果＞
　実施例２及び３の結果より、総ＧＭ３量を測定・比較により、患者がメタボリックシンドローム等の特定疾患である又はメタボリックシンドローム等の特定疾患になる可能性があるか否かを正確には判断できないことが示唆された。
実施例４
＜各ＧＭ３種及び生活習慣病との関連性＞
　ＧＭ３には、ＧＭ３中のセラミド部分の炭化水素基の炭素数、二重結合の数、置換基の有無や種類等により、多くの分子種が存在している。実施例２及び３の結果を受け、総ＧＭ３量を測定するのではなく、特定のＧＭ３分子種を測定することにより、生活習慣病や特定疾患に関する、より正確な被験者の情報を取得することができるのでないかと考え、各ＧＭ３種及び各疾患との相関性を調べた。
　実施例１と同様に、（１）健常人（２６人）、（２）ＶＦＡのみ発症している患者（３９人）、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している患者（１５人）、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している患者（２８人）、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者（すなわち、メタボリックシンドロームを発症している患者）（１７人）における、各ＧＭ３種の量を測定した。結果を、図３Ａ及びＢに示す。
　図３Ａの横軸は、血清中のＧＭ３に最も多く含まれているＧＭ３種である、「ｄ１８：１－２４：０」から、含有量が多い順に並べた。図３Ｂの横軸は、血清中のＧＭ３に１３番目に多く含まれているＧＭ３種である、「ｄ１８：１－１６：１」から、含有量が多い順に並べた。
　各ＧＭ３種の構造について、例えば「ｄ１８：１－２４：０」の場合、「ｄ１８：１」は、ＧＭ３のスフィンゴミエリン部分が、炭素数１８の炭化水素基であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有することを意味する。「２４：０」は、ＧＭ３の脂肪酸が、炭素数２４の炭化水素基であり、該炭化水素基中に二重結合が存在しないことを意味する。例えば、「ｄ１８：１－２４：０」が、脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有する場合は、「ｄ１８：１－ｈ２４：０」と表記する。
　図３中の縦軸は、血清サンプル中に含まれる内部標準（「ｄ１８：１－［１３Ｃ］１６：０」）の量を１００％としたときの、各ＧＭ３種の量（％）である。また、図中の「＊」は、Ｐ≦０．０５、「＊＊」は、Ｐ≦０．０１、「＊＊＊」は、Ｐ≦０．００１、「＊＊＊＊」は、Ｐ≦０．０００１であることを示す。表中の数字は、何れも平均±標準偏差である。マン・ホイットニーのＵ検定を用いた。
　図３の結果、ＧＭ３の脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有する、多くのＧＭ３種（「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」、「ｄ１８：１－ｈ２０：０」、「ｄ１８：１－ｈ２１：０」、「ｄ１８：１－ｈ１８：１」）において、（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合に、健常人と比べて有意な差があった。また、「ｄ１８：１－２０：０」及び「ｄ１８：１－２１：１」においても、（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合に、健常人と比べて有意な差があった。
　特に「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」において、（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合に、健常人と比べて、有意に１．７倍以上増加していた。
　以上の結果から、ＧＭ３の脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有するＧＭ３（ヒドロキシル化ＧＭ３）が、メタボリックシンドローム等の特定疾患や生活習慣病の検出に有効であることが示唆された。
実施例５
＜各ＧＭ３種及び疾患のマーカーとの相関性＞
　血清中のＧＭ３に多く含まれていたＧＭ３種（図３Ａの横軸に記載された１２種）及び疾患のマーカーとの相関関係を、多変量解析を用いて解析した。結果を表２に示す。
　上記疾患マーカーは以下の通りである。
（１）肥満のマーカー：ＢＭＩ
（２）メタボリックシンドロームのマーカー：ＬＤＬ－ｃ、オートタキシン（表２中、「ＡＴＸ」と略記する）、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＨｂＡ１ｃ
（３）アテローム性動脈硬化症のマーカー：リゾホスファチジルコリン（表２中、「ＬＰＣ」と略記する）、スフィンゴミエリン（表２中、「ＳＭ」と略記する）、駆出率（表２中、「ＥＦ」と略記する）、Ｃ反応性タンパク質（表２中、「ＣＲＰ」と略記する）、血小板、トリグリセライド
（４）高血圧症のマーカー：血圧
（５）腎症のマーカー：クレアチニン
（６）その他のマーカー：年齢
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表２中の「Ｃ２４：０」は、図３Ａの「ｄ１８：１－２４：０」に該当する。図３Ａと同様に、血清中のＧＭ３に含まれる量が多い順に並べた。
　表２より、ヒドロキシル化ＧＭ３（ｈＣ２４：０、ｈＣ２４：１、ｈＣ２２：０）が、ヒドロキシル化されていないＧＭ３と比べて、より多くの特定疾患に関連があるマーカーと相関性があることがわかった。特に、下記式（２）の構造を有する「ｈＣ２４：１」（［ｈＣ２４：１］ＧＭ３）は、年齢、オートタキシン、スフィンゴミエリン、血圧、ＨＯＭＡ－ＩＲ、リゾホスファチジルコリン、ＨｂＡ１ｃ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ｃ反応性タンパク質という多くのマーカーと相関性があり、特定疾患の検出・診断に用いることが有効であると示唆された。
　また、表２の結果より、すべてのＧＭ３種が特定疾患に関与する分子と相関性があるわけではないこともわかった。特定疾患とあまり関連性がない分子種の増加に伴い、総ＧＭ３量は増加する場合も考えられるので、総ＧＭ３量を、特定疾患の検出・診断のマーカーとして用いることは、偽陽性又は誤った検出・診断を導くおそれがあることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式（２）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示す。］
実施例６
＜［ｈＣ２４：１］ＧＭ３及び各疾患のマーカーとの相関性＞
　実施例５の結果より、メタボリックシンドローム等の特定疾患のマーカーとして、また生活習慣病や特定疾患のマーカーとして、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３を用いることが有効であることが示唆された。次に、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３及び各疾患のマーカー（総コレステロール、ＬＤＬ－ｃ、オートタキシン、ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ）との相関関係を、スピアマンの順位相関を用いて解析した。結果を図４に示す。
　図４の結果、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３量は、総コレステロール、ＬＤＬ－ｃ、オートタキシン、ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＨｂＡ１ｃと相関性があった。
実施例７
＜［ｈＣ２４：１］の含有量の測定＞
　血清中のＧＭ３全体、スフィンゴミエリン全体、セラミド全体に含まれる、［Ｃ２４：１］に対する［ｈＣ２４：１］量を測定した。結果を図５に示す。
　図５の縦軸は、「脂肪酸の炭素数が２４であり、該脂肪酸中に二重結合が１つ存在するもの」（［Ｃ２４：１］と略記する）の量に対する、「脂肪酸の炭素数が２４であり、水酸基を有し、該脂肪酸中に二重結合が１つ存在するもの」（［ｈＣ２４：１］と略記する）の割合を示している。
　図５の結果、ＧＭ３に含まれる［Ｃ２４：１］の２８．３１％が、［ｈＣ２４：１］であった。
　一方、スフィンゴミエリンに含まれる［Ｃ２４：１］の０．６７％が、［ｈＣ２４：１］であり、セラミドに含まれる［Ｃ２４：１］の０．４５％が［ｈＣ２４：１］であった。
　これより、ＧＭ３が特定疾患の患者で多いことを前提にすると、「置換基としてＯＨ基を有し、かつ二重結合を１つ有している炭素数２４の脂肪酸」が、特にＧＭ３の中に集中して結合していた（存在していた）ことから、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３が、特に特定疾患に関するマーカーとして好適であることの立証が得られた。
　図５の結果より、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３等の式（１）で表されるＧＭ３が、特定疾患の検出方法、特定疾患の発症リスクの検出方法として好適である理由・機序が明らかになった。
実施例８
＜各疾患におけるヒドロキシル化ＧＭ３量の比較＞
　（１）健常人（２６人）、（２）ＶＦＡのみ発症している患者（３９人）、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している患者（１５人）、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している患者（２８人）、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者（すなわち、メタボリックシンドロームを発症している患者）（１７人）における、ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」）と非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－２４：０」、「ｄ１８：１－２４：１」、「ｄ１８：１－２２：０」）の量をそれぞれ測定した。結果を、図６に示す。図中の「＊」は、Ｐ≦０．０１を表す。
　図６Ａの縦軸は、３つのヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」）の合計量（ｎｇ／μＬ）、図６Ｂの縦軸は、３つの非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－２４：０」、「ｄ１８：１－２４：１」、「ｄ１８：１－２２：０」）の合計量（ｎｇ／μＬ）を示す。
　図６Ａの結果より、ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」）の合計量は、（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合、健常人と比べて有意な差があった。
　一方、図６Ｂの結果より、非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－２４：０」、「ｄ１８：１－２４：１」、「ｄ１８：１－２２：０」）の合計量は、上記（２）～（５）何れの場合でも、健常人と比べて有意な差はなかった。
実施例９
＜ヒドロキシル化ＧＭ３及び各疾患のマーカーとの相関性＞
　ヒドロキシル化ＧＭ３又は非ヒドロキシル化ＧＭ３、及び各疾患のマーカー（総コレステロール、ＬＤＬ－ｃ、オートタキシン、ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ）との相関関係を、スピアマンの順位相関を用いて解析した。結果を図７及び８に示す。
　図７は３つのヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」）の合計量（ｎｇ／μＬ）と各疾患のマーカーとの相関関係を示し、図８は３つの非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－２４：０」、「ｄ１８：１－２４：１」、「ｄ１８：１－２２：０」）の合計量（ｎｇ／μＬ）と各疾患のマーカーとの相関関係を示す。
　図７の結果、ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－ｈ２４：０」、「ｄ１８：１－ｈ２４：１」、「ｄ１８：１－ｈ２２：０」）の合計量は、総コレステロール、ＬＤＬ－ｃ、オートタキシン、ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＨｂＡ１ｃと相関性があった。
　一方、図８の結果、非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１－２４：０」、「ｄ１８：１－２４：１」、「ｄ１８：１－２２：０」）の合計量は、総コレステロール、ＬＤＬ－ｃ、空腹時血糖とは相関性があったが、オートタキシン、ＩＭＴ、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＨｂＡ１ｃとは相関性がなかった。
＜実施例８及び９の結果＞
　実施例８及び９の結果から、ＧＭ３の脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有するＧＭ３（ヒドロキシル化ＧＭ３）が、メタボリックシンドローム等の特定疾患や生活習慣病の検出に有効であることが分かった。
　本発明の検出方法は、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出、又は、該疾患の発症リスクを検出することができ、被験者の状態をより正確に把握することができる。従って、本発明は、診断薬、研究用試薬、及び臨床検査の分野等で利用が可能である。
　本願は、２０１１年１１月５日に出願した日本の特許出願である特願２０１４－２２４８１１に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。

Claims (10)

  1. 　（ａ）被験者由来の血液試料中のガングリオシドＧＭ３を測定する工程
    を含む、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法であって、
    　該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
  2. 　上記疾患がメタボリックシンドロームである請求項１に記載の検出方法。
  3. 　上記式（１）で表される構造は、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数２２又は２４の炭化水素基である請求項１又は請求項２に記載の検出方法。
  4. 　上記式（１）で表される構造は、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有する炭素数２４の炭化水素基である請求項１又は請求項２に記載の検出方法。
  5. 　上記式（１）で表される構造が下記式（２）で表される構造である請求項１又は請求項２に記載の検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（２）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示す。］
  6. 　（ｂ）上記（ａ）工程で測定した上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を比較する工程と、
    　（ｃ）上記（ｂ）工程で有意な差があった場合に、上記被験者の、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーの値が、上記健常人と比較して異常であると判定する工程
    を更に含む、請求項５に記載の検出方法。
  7. 　上記内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、及び、高血圧症に関するマーカーは、オートタキシン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニン－アミノトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質コレステロール、空腹時血糖、及び、血圧よりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の検出方法。
  8. 　上記アテローム性動脈硬化症に関するマーカーは、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、Ｃ反応性タンパク質、及び、平均内膜中膜肥厚よりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６又は請求項７に記載の検出方法。
  9. 　上記ガングリオシドＧＭ３の測定を、上記ガングリオシドＧＭ３に対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法、質量分析法、又は、液体クロマトグラフィー／質量分析法によって行う、請求項１ないし請求項８の何れかの請求項に記載の検出方法。
  10. 　標準物質としてガングリオシドＧＭ３を含有する、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出するキットであり、
    　該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２－Ｃ（＝Ｏ）－は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
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