WO2017086725A1 - Fcho1 조절제를 포함하는 세포 분열 조절용 조성물 및 이를 이용한 세포 분열 조절 방법 - Google Patents

Fcho1 조절제를 포함하는 세포 분열 조절용 조성물 및 이를 이용한 세포 분열 조절 방법 Download PDF

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WO2017086725A1
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fcho1
cancer
cell division
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activity
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조명행
박성진
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서울대학교 산학협력단
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a composition for controlling cell division by promoting or inhibiting the activity of FCHo1 and a method using the same.
  • Cell division is an essential process performed to compensate for the growth and natural loss of life, and is a very important process for life sustaining. Therefore, cell division is performed through a very sophisticated and complicated process, and when an abnormality occurs in such cell division, diseases such as cancer may occur.
  • Cancer one of the important diseases that humans have to conquer, has the property of ideally proliferating cells that should be at rest due to cell division defects and destroying the cells around them. These cancers are known to arise from genetic variation of several factors involved in the signal transduction pathway that regulates cell growth and differentiation.
  • Eukaryotic cells proliferate along the cell cycle through a signaling system when they receive a signal for cell growth from the outside. Eukaryotic cells proliferate periodically during the process of DNA synthesis (called S phase) and mitosis phase (called M phase). G1- and G2 phases exist between S and M phases. Split through the cycles of S--G2--M. After cell division is completed, the cells enter the G1 phase, which is the most active period of intracellular metabolism, and most of the cells are in the G1 phase for many hours.
  • the cell In the G1 phase, the cell is in a diploid or 2N state, DNA replication occurs in S phase, and 2N becomes 4N (tetraploid), 4N splits into 2N during the short M phase through G 2 phase, and then returns to G1 phase. do.
  • Normal cells enter the S phase when there is a growth stimulus signal from G1 phase, proliferate by cell division through G2 phase, and when there is no external signal, the cell cycle stops and the G0 phase (pause) stops at G1 phase. .
  • Mitosis is divided into electric, middle, and late stages, and the chromosomes connected with spindles are arranged on the equator plane of the cell.
  • the middle, paired chromosomes are divided into two by splitting vertically. The upper body becomes the central body, and the nuclear membrane and phosphorus appear to form two new daughter nuclei.
  • Cancer cells proliferate as they continue DNA synthesis and cell division along the cell cycle, which are supposed to be at rest.
  • cell cycle factors of each phase must be present in the cell so that the cell cycle can be accurately executed and a receptor which receives an external signal must exist. Therefore, when the function of the receptor and cell cycle factors that determine the boundary between the resting phase and the cell division cycle is distorted, the cells grow abnormally and are transformed into cancer cells.
  • the present inventors are conducting research to develop new therapeutic agents by controlling cell division and further controlling cancer cell division, and the FCHo1 protein is an important factor involved in forming midbody during cell division. When it was found that the cell division can be effectively controlled and completed the present invention.
  • the present invention relates to a composition for regulating cell division comprising a FCHo1 activity regulator and a method for regulating cell division using the same.
  • the present invention provides a composition for regulating cell division, comprising an FCHo1 (FCH domain only 1) activity modulator.
  • FCHo1 FCH domain only 1
  • the present invention also provides a cell division regulator comprising a FCHo1 (FCH domain only 1) activity regulator.
  • FCHo1 FCH domain only 1
  • the present invention also provides a medium composition comprising a FCHo1 (FCH domain only 1) activity modulator.
  • FCHo1 FCH domain only 1
  • the present invention comprises the steps of detecting the FCHo1 (FCH domain only 1) in the cell; It provides a method for providing information on cell division capacity, including.
  • the present invention comprises the steps of regulating the activity of FCHo1 (FCH domain only 1); It provides a method for controlling the dividing capacity of animal cells, except human.
  • the present invention comprises the steps of regulating the activity of FCHo1 (FCH domain only 1) in vitro; It provides a method for controlling the division capacity of the cell comprising.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a FCHo1 (FCH domain only 1) activity modulator.
  • the present invention provides a cancer treatment agent comprising a FCH domain (FCH domain only 1) activity modulator.
  • the present invention provides a method for providing a degree for the diagnosis of cancer of a subject comprising the step of: detecting the FCH domain (FCH domain only 1) protein fragment.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer comprising a FCH domain (FCH domain only 1) protein fragment detection agent.
  • FCHo1 activity modulator of the present invention targets FCHo1, which functions as an important factor in cell division, and promotes or inhibits its activity, thereby promoting cell division or inhibiting cell division, thereby effectively utilizing the treatment of diseases related to cell division. Can be.
  • FCHo1 is a schematic diagram showing the structure of FCHo1 and its cleavage site.
  • Figure 2 shows the results confirming the site-specific cleavage of FCHo1 through the specific deletion form of FCHo1.
  • FCHo1 is a diagram showing the results of confirming the site-specific cleavage of FCHo1 through the specific deletion form of FCHo1. An asterisk indicates that the band is missing.
  • FCHo1 antibody 4 is a diagram showing the results of confirming the subcellular location of the cleaved FCHo1 protein fragment using the FCHo1 antibody.
  • Fig. 5 shows the results of confirming inhibition of FCHo1 cleavage by MG132 treatment. An asterisk indicates that the band is missing.
  • FIG. 6 is a diagram showing the result of predicting that MMP-9 (matrix metallopeptidase 9) cleaves FCHo1 at the Arg 563 (R563) position.
  • FIG. 7 shows immunoprecipitation results for wild type (wt) or FCHo1 ( ⁇ 563-564 or ⁇ 531-589).
  • FCHo1 and MMP-9 are diagrams showing the PLA results of FCHo1 and MMP-9 (scale bar, 5 ⁇ m.)
  • FIG 9 is a view showing the results of confirming the position of the FCHo1 and its fragments according to the cell division step (scale bar, 5 ⁇ m.)
  • FIG. 10 is a view showing FESEM results of a and b central bodies, a means a horizontal cut plane and b means a vertical cut plane, respectively.
  • Figure 10c, d is a diagram showing the results of detection of the presence of FCHo1 in the vehicle through immuno-gold labeling.
  • Figure 10 e is a diagram showing the results of confirming the FCHo1 position through SRM (Super-resolution microscopy) (Three-dimensional SIM, 3D-SIM; direct stochastic optical reconstruction microscopy, dSTORM. Scale bar, 1 ⁇ m).
  • FIG. 11 shows a CLSM image for confirming the location of FCHo1 during cell division.
  • FCHo1 is a diagram showing an Akt binding motif inside FCHo1.
  • FIG. 13 is a view showing the results of confirming the FCHo1 and Akt binding position.
  • Fig. 14 is a schematic diagram showing the position of Akt1 phosphorylation site and central body of FCHo1 and ICB.
  • FCHo1 is a diagram showing the results of confirming the self-binding of FCHo1 through the co-immunoprecipitation method.
  • Figure 16 shows the results of confirming the cleavage of the F-BAR fragment in the cell division step. An asterisk indicates that the band is missing.
  • 17 is a diagram showing the results confirmed by the immunofluorescence and PLA analysis of the cellular position of the F-BAR and CT fragments.
  • FCHo1 and 14-3-3 ⁇ are diagrams showing the results of confirming the binding of FCHo1 and 14-3-3 ⁇ .
  • 20 is a diagram showing the results confirmed by the coimmune sedimentation and PLA analysis of the binding site of 14-3-3 ⁇ .
  • 21 is a view showing the results confirming that the binding of FCHo1 and 14-3-3 ⁇ is essential for the formation of the centrosome.
  • Fig. 22 shows the results of confirming the SIM image of the central body image of wild-type FCHo1 or FCHo1 ⁇ 563-564 expressing A549 cells.
  • Figure 23 shows the results of proteomics analysis of changes in cell cycle-associated protein group in A549 cells overexpressing FCHo1 (a), confirming that the mediator position protein is regulated by overexpression of FCHo1 (b) The figure shown.
  • 24 is a diagram showing the result of quantifying the ratio of cells in late (central spindle) and terminal (central body) through CLSM image.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of confirming the lesions and the number of tumor cells in the FCHo1 wild type and its variant treatment group in lung cancer model mice.
  • FIG. 26 shows four shRNA sequence designs that act on mouse FCHo1.
  • FIG. 27 shows the results of confirming changes in FCHo1 cleavage in normal tissues and stage 1, 2, 3 lung cancer tissues.
  • Fig. 28 shows the results of confirming the binding affinity between the peptide derived from the FCHo1 amino acid sequence and Akt1.
  • Fig. 29 shows the results of confirming cellular uptake of peptides derived from the FCHo1 amino acid sequence.
  • FIG. 30 is a diagram showing the results of confirming the cell growth inhibitory effect of the peptide derived from the FCHo1 amino acid sequence.
  • the present invention relates to a composition for regulating cell division, comprising a FCHo1 (FCH domain only 1) activity modulator.
  • FCHo1 of the present invention is a protein involved in the formation of mediators through site-specific cleavage during cell division, and plays an essential role in cell division, particularly in the mitosis stage, and thus targets FCHo1 activity modulators.
  • Cell division can be regulated to effectively treat various diseases associated with cell division, particularly cancer.
  • the human FCHo1 is listed as Gene ID: 23149 for human FCHo1, FER / Cip4 homology Bin-Amphiphysin-Rvs (F-BAR) domain, proline-rich domain (PRD), and mu-homology domain (MHD). It is a protein composed of) and plays an important role in the formation of a central body located in the center of the intracellular cellular bridge (ICB) at the end of cytoplasmic division during cell division.
  • ICB intracellular cellular bridge
  • the midbody has a knee joint-like structure that connects two daughter cells in the last stage of cell division, and according to the present invention, it is regulated by FCHo1.
  • FCHo1 regulates the formation of mediators via site specific cleavage, and such cleavage sites may appear at positions between the PRD and MHD domains and at positions between F-BAR and PRD, which are located at MMP-9 It can be characterized by being cut by.
  • FCHo1 Location-specific cleavage of FCHo1 occurs as the cell progression progresses, and the cleaved C-terminal fragment remains in the median, while the N-terminal fragment is located in the intracellular cellular bridge (ICB) at the end of cell division. It shows the characteristic that each section moves after cutting.
  • the present invention relates to a composition for regulating cell division, wherein the FCHo1 activity modulator is for regulating the formation of a center.
  • the activity regulator of FCHo1 refers to a substance capable of promoting or inhibiting the activity of FCHo1, wherein the activity of FCHo1 means 'an activity that allows FCHo1 to form a mediator, and thus cell division normally.' do. Therefore, the FCHo1 activity promoter refers to a substance capable of promoting cell division by promoting the role that FCHo1 plays in the cell division stage.
  • the FCHo1 activity promoter consists of a substance that promotes site-specific cleavage of FCHo1 (MMP-9), a substance that promotes proper phosphorylation of FCHo1 (Akt1), and a substance that promotes binding of FCHo1 to 14-3-3 ⁇ .
  • FCHo1 activity inhibitor refers to a substance that prevents cell division from occurring normally by inhibiting or destroying the role of FCHo1 in the cell division stage.
  • the inhibitor of FCHo1 may be a substance that inhibits site specific cleavage of FCHo1, a phosphorylation inhibitor of FCHo1, a binding inhibitor between 14-3-3 ⁇ and FCHo1, and may be a variant of FCHo1 or a deletion sequence of FCHo1.
  • the variant or deletion sequence of FCHo1 is a mutation or deletion in the sequence cleaved by matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) in the sequence of FCHo1, it is impossible to position-specific cleavage of normal FCHo1, thereby inhibiting cell division
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • It may be a sequence that allows a mutation, or a deletion occurs in the phosphorylation site by Akt1 in the sequence of FCHo1, it may be a sequence that blocks the normal cleavage of FCHo1 by preventing Akt1 from binding normally to FCHo1, 14 of the sequence of FCHo1 Mutation or deletion at the binding site with -3-3 ⁇ interferes with the binding, thereby interrupting the formation of the central body.
  • Exemplary inhibitors of FCHo1 can include a variety of inhibitors by genetic engineering techniques that inhibit its protein expression, its gene expression, such as antisense nucleotides that bind complementarily to mRNA of the FCHo1 gene, short hairpin RNA (small hairpin RNA).
  • RNA, shRNA small interfering RNA
  • ribozymee ribozymee
  • substrate analogs that specifically bind to the FCHo1 protein It may be at least one selected from the group consisting of, aptamers, and antibodies.
  • the present invention relates to a composition for regulating cell division, wherein the activity inhibitor of FCHo1 inhibits site-specific cleavage of FCHo1.
  • the present invention also relates to a composition for regulating cell division, wherein the FCHo1 activity inhibitor is an FCHo1 phosphorylation inhibitor.
  • the FCHo1 activity inhibitor is a binding inhibitor between 14-3-3 ⁇ and FCHo1;
  • the FCHo1 activity inhibitor is a variant of FCHo1 or a deletion sequence of FCHo1;
  • the variant of FCHo1 or the deletion sequence of FCHo1 is a mutation in a sequence cleaved by matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) in the FCHo1 sequence;
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • a variant of FCHo1 or a deletion sequence of FCHo1 is a mutation or deletion at the phosphorylation site by Akt1 in the sequence of FCHo1;
  • the variant of FCHo1 or the deletion sequence of FCHo1 relates to a composition for regulating cell division, wherein the mutation or deletion occurs at a binding site with 14-3-3 ⁇ in the sequence of FCHo1.
  • a cell whose cell division is regulated is not limited but may be a cell having a disease associated with abnormal division of the cell, particularly preferably a cancer cell, for a particularly useful purpose.
  • the present invention also relates to a cell division regulator comprising a FCHo1 activity regulator.
  • the cell division regulator may be useful for the treatment of diseases and disorders associated with cell division by regulating cell division in an individual.
  • the disease associated with cell division may be a cell proliferative disease such as cancer characterized by abnormal cell division, various refractory diseases due to noncancerous abnormal proliferation-cell division, or various refractory diseases due to abnormally low level of cell division.
  • cell proliferative diseases include, but are not limited to, tumors, malignancies, blood vessel proliferative disorders, autoimmune diseases and fibrotic disorders.
  • the abnormal proliferation may mean that cell division occurs at an inappropriately high level beyond the normal level of cell proliferation.
  • the invention also relates to a medium composition comprising a FCHo1 activity modulator.
  • the term 'media' refers to a culture medium capable of supporting the growth and survival of cells under in vitro culture conditions, and includes all conventional media used in the art suitable for culture.
  • the medium and the culture conditions can be selected according to the cell type.
  • the medium used for the culturing is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), and generally includes a carbon source, a nitrogen source and a trace element component.
  • CCMM cell culture minimum medium
  • Such cell culture minimal media include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI1640, F-10, F-12, Minimal Essential Medium (MEM), GMEM ( Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, but are not necessarily limited to these.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • RPMI1640 F-10, F-12, Minimal Essential Medium (MEM)
  • MEM Minimal Essential Medium
  • GMEM Glasgow's Minimal Essential Medium
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium but are not necessarily limited to these.
  • the present invention comprises the steps of detecting the FCHo1 (FCH domain only 1) in the cell; It relates to a method for providing information on cell division capacity, including.
  • the method of the present invention by detecting the intracellular FCHo1 and the activity thereof, it is possible to effectively provide information on cell division ability as to whether the formation of the median is normally performed and thereby cell division normally. If abnormal mutation occurs in the FCHo1 and the position-specific cleavage of the FCHo1 is not normally performed, the formation of the mediator in the cell division step may be abnormal, and thus the cell division ability may be inhibited.
  • the detection may include detecting one or more selected from the group consisting of cleavage of FCHo1, phosphorylation of FCHo1, migration of FCHo1 to the center, and the like.
  • FCHo1 plays an essential role in the formation of a midbody that appears during cell division
  • the information on the cell division ability may be information on the formation of the center body.
  • the present invention comprises the steps of regulating the activity of FCHo1 (FCH domain only 1); It relates to a method for controlling the dividing capacity of animal cells, except human.
  • FCHo1 of the present invention is essential for the formation of a mediator during cell division, by regulating its activity, the FCHo1 can effectively regulate cell division capacity.
  • the regulation refers to the regulation of cell division, such as inhibiting the formation of mediators by inhibiting the activity of FCHo1, so that cell division does not normally occur. Inhibition of the activity of FCHo1 can be performed through an inhibitor of FCHo1 activity.
  • the animal cell may be an animal cell other than a human or an animal cell including a human, and particularly a cell derived from an individual having a disease associated with cell division, such as cancer.
  • the present invention comprises the steps of regulating the activity of FCHo1 (FCH domain only 1) in vitro; It relates to a method for controlling the dividing capacity of the cell comprising.
  • cells isolated from an individual can regulate cell division ability by controlling the activity of FCHo1 in vitro, and can be usefully used for research on diseases or mechanisms related to cell division.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an FCHo1 (FCH domain only 1) activity modulator.
  • FCHo1 FCH domain only 1
  • FCHo1 shows high transcription in cancer tissues, especially B-lymphoblast, bone marrow, muscle, ovarian cancer tissues, bone, eye, lung, pancreas, High transcription has also been reported in the placenta, skin, colon, stomach and testis. Therefore, the FCHo1 of the present invention, which functions in mitosis and is present in more rapidly dividing cells, may be a target for treating diseases in various cancers, and by controlling its activity, preventing or preventing cancer due to various abnormal cell proliferation. It can be cured.
  • the cancer may include all cancers caused by abnormal cell division, mitosis, but not limited to, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or eyeball Melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, anal muscle cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, swelling Thyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocyte lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor , One selected from the group consisting of solid cancers, such as brainstem glioma and pituitary
  • the FCHo1 activity modulator can appropriately regulate aberrant cell division of cancer cells by controlling FCHo1 activity, for example, by inducing abnormal FCHo1 cleavage or inhibiting FCHo1 activity through the introduction of FCHo1 variants or deletion sequences, thereby dividing cancer cells. Can be suppressed.
  • the present invention therefore relates to a cancer therapeutic agent comprising a FCHo1 activity modulator.
  • the variant or deletion sequence of FCHo1 is a mutation or deletion in the sequence cleaved by matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) in the sequence of FCHo1, and can inhibit cell division by disabling normal site-specific cleavage of FCHo1. It may be a sequence that allows a mutation or deletion in the phosphorylation site by Akt1 in the sequence of FCHo1, it may be a sequence that blocks the normal cleavage of FCHo1 by preventing Akt1 from binding normally to FCHo1, the FCHo1 of the sequence of FCHo1 Mutation or deletion may occur at the binding site with 14-3-3 ⁇ in the sequence to prevent binding, thereby preventing the formation of a central body.
  • MMP-9 matrix metallopeptidase 9
  • sequence mutated or deleted the S570 position based on the human FCHo1 sequence the sequence mutated or deleted the S155 site, the sequence mutated or deleted the R563-564 site of FCHo1, the 407-421aa of FCHo1 mutated or deleted May be a sequence.
  • the introduction of the variant or deletion sequence of FCHo1 can be introduced by any method known in the art without limitation, and by introducing a variant or deletion sequence of FCHo1 into a suitable vector, such as a lentiviral vector, as in one embodiment of the present invention Can be introduced into an object with a suitable vector, such as a lentiviral vector, as in one embodiment of the present invention.
  • compositions of the present invention may be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods.
  • Representative formulations for parenteral administration may include aerosol formulations, injectable formulations.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient in the active ingredient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like. It is prepared by mixing. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, and the like, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository utopsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • a preferred formulation of the pharmaceutical composition of the invention may be a formulation for inhalation administration (aerosol formulation) formulated to be delivered to the target site via aerosol delivery.
  • Drug delivery through inhalation is one of the non-invasive methods of delivering drugs directly through the airways and through the mucous membranes of the lung to lung cells.
  • Nucleic acid delivery through aerosol delivery is particularly advantageous for the widespread treatment of lung disease. Can be used. This is because the anatomical structure and location of the lung allows for an immediate and non-invasive approach and can be subject to topical application of the nucleic acid delivery system without affecting other organs. Therefore, when the variant or deletion sequence of the FCHo1 of the present invention is combined with an appropriate carrier and delivered to the lesion site including the lung in an aerosol manner, a prophylactic or therapeutic effect on the disease can be expected.
  • the pharmaceutical composition may preferably contain other components or the like which can give a synergistic effect to the main effect within the range of not impairing the main effect of the present invention.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and diluent in addition to the active ingredient described above for administration.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, textose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil.
  • the effective dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age and gender of the patient, but may be administered at 0.0001 to 50 mg / kg, and preferably at 0.001 to 20 mg / kg.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, chemical therapy, radiotherapy, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention provides a method for providing a degree for the diagnosis of cancer of a subject comprising the step of: detecting the FCH domain (FCH domain only 1) protein fragment.
  • the subject is a mammal including a human
  • the method for providing information on diagnosis of cancer includes detecting and comparing the protein fragments of FCHo1 with each other so that the FCHo1 protein fragments are reduced compared to normal individuals. This is characterized in that it is diagnosed as an individual with cancer.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer comprising a FCH domain (FCH domain only 1) protein fragment detection agent.
  • the FCHo1 protein fragment refers to a fragment of FCho1 protein that is cleaved by site-specific cleavage of FCHo1 in the mitosis stage of cell division.
  • the site-specific cleavage occurs at Arg563. FCHo1 protein fragment.
  • FCHo1 protein fragment detection agent refers to an agent that can measure protein levels by contacting a biological sample from an individual using an antibody specific for the protein fragment to form an antigen-antibody complex, and a specific assay method for analyzing the FCHo1 protein fragment detection agent Examples include Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, and the like. It doesn't happen.
  • ELISA is a direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in a complex of antibody and antigen attached to a solid support, followed by reaction with another antibody that recognizes the antigen in a complex of antibody and antigen attached to a solid support.
  • Various ELISA methods such as indirect sandwich ELISA using the labeled secondary antibody which recognizes this antibody, are included.
  • A549 cells used in the experiment were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 conditions in DMEM / high glucose medium supplemented with 10% FBS and penicillin / streptomycin. Cells were transfected using the Neon® transfection system.
  • FCHo1-N-3xDDK FCHo1-N-3xDDK mutation ( ⁇ 273-294, S295A)
  • FCHo1-C-3xDDK FCHo1-C-3xDDK mutation ( ⁇ 150-155, ⁇ 480-561, ⁇ 531 -561, ⁇ 562-569, ⁇ 562-570, ⁇ 571-579, ⁇ 580-589, ⁇ 563-564, ⁇ 531-589, 407-421)
  • FCHo1-C-3xDDK double mutations ( ⁇ 150-155 and ⁇ 562-570) partial FCHo1 -C-3xDDK (562-889, 582-889, 1-268), partial FCHo1 (1-268) -C-3xDDK mutation ( ⁇ 150-155) and partial FCHo1 (562-889) -C-3xDDK mutation (R562N , R563N, L564G, S566A, R567N, K568N, V569G, S570A,
  • FCHo1 siRNA resistant clones siRNA resistant FCHo1-C-3xDDK and siRNA resistant FCHo1-C-3xHA.
  • the following pairs of RNA oligonucleotides were synthesized for target human FCHo1: AGACCUACUCGAAGGCGAU (dtdt), UCAAGGACGUUCUCCGCUA (dtdt), ACGUGGUGCUGCUGCGAUA (dtdt), UCUCAGUGGAGUACGGCUA (dtdt).
  • Nocodazole was purchased from Sigma-Aldrich and MG132 was purchased from MP Biomedicals.
  • A549 cells were placed in 8 well chamber cover glass or high precision cover glass and fixed with 3% paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature, 0.5% triton® X-100 was infiltrated for 5 minutes and blocked for 30 minutes. It was then incubated in blocking solution (PBS with 0.1% saponin and 3% BSA) with primary or secondary antibodies.
  • blocking solution PBS with 0.1% saponin and 3% BSA
  • dSTORM stochastic optical reconstruction microscopy
  • Alexa Fluor 647 conjugated anti-rabbit secondary antibody and oxygen scavenging system 0.5 mg / ml glucose oxidase, 40 ⁇ g / ml catalase, 10% glucose, pH 7.4
  • MES mercaptoethylamine
  • All dSTORM and SIM images were obtained from Carl Zeiss ELYRA PS.1 (super-resolution microscopy) and all CLSM images were obtained from Carl Zeiss LSM710 (Confocal Laser Scanning Microscope).
  • FCHo1 (NBP2-16458; 584-804aa) is Novus Biologicals; FCHo1 (SAB2100803; 468-517aa), FLAG-HRP (A8592) are Sigma-Aldrich; FCHo1 (HPA041653; 285-364aa) is Atlas Antibodies; Akt1 (LF-MA0245) is Abfrontier; Gamma-Tubulin (ab11316), Calmodulin 1 (ab106681), RACGAP1 (ab2270), FCHo1 (ab102994; 92-242aa), HA-HRP (ab1190) are Abcam; MKLP1 (sc-867), 14-3-3 ⁇ (sc-1019) is Santa Cruz, Phospho-Akt substrate (RXRXXS / Tp) (# 10001) is Cell signaling, 14-3-3 ⁇ (H00007534-M04), MMP -9 (H00004318-M03) was Abnova, and Alexa Fluor 488,
  • gelatin Zymography (Gelatin zymography )
  • IP immunoprecipitation
  • SDS-PAGE containing 0.1% gelatin.
  • IP samples were performed on SDS-PAGE gels and washed with 2.5% Triton X-100. It was then incubated for 3 days using collagenase buffer containing 50 mM TrisCl, pH 7.6, 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , and 0.2% Brij-35. Gels were stained with Coomassie Brilliant Blue and desalted.
  • PLA was performed using high-resolution fluorescence microscopy for SIM image protein-protein interactions. Proximity ligation was performed according to the manufacturer's manual using the Duolink detection kit. All PLA images were obtained with Carl Zeiss's ELYRA PS.1.
  • A549 cells were fixed in 2.5% glutaaldehyde for 1 hour in pH 7.2-7.4 0.1M cacodylate buffer, washed with distilled water and 0.5% osmium tetraoxide in 0.1M cacodylate buffer. ) And washed with distilled water again. En_bloc staining was then performed overnight with 0.1-0.5% uranyl acetate in 50% ethanol, followed by dehydration and infiltration. Images were obtained with FEI's Helios 650 (FIB-FESEM).
  • A549 cells were fixed in a mixture of 4% paraformaldehyde and 0.05% glutaaldehyde in 0.15 M Hepes, post-fixed and washed in 4% paraformaldehyde in 0.15 M Hepes. Samples were blocked, incubated with FCHo1 antibodies (584-804aa), washed, incubated with secondary antibodies with Nanogold (Nanoprobes, Yaphank, NY, USA) and washed again. After fixing again with 1% glutaaldehyde, it was washed with 50 mM glycine and then with 1% BSA.
  • Proteins were extracted from cell lines using RIPA buffer and protein concentrations were determined using bicinchoninic acid assay kit. Protein lysates were digested using a filtered-aided sample preparation (FASP). 200 ⁇ g of protein was denatured in SDT buffer ((4% SDS, 0.1 M DTT, and 0.1 M Tris / HCl; pH 7.6) and then reduced for 45 minutes at 37 ° C.
  • FASP filtered-aided sample preparation
  • the digested samples were labeled using TMT reagents according to the manufacturer's manual In this step, three samples for each of the two conditions were labeled using a channel; control set # 1, # 2, and # 3 to 126, 128, and 130 channels, FCHo1 overexpression sets # 1, # 2, and # 3 to 127, Labeled with 129, and 131 channels
  • control set # 1, # 2, and # 3 to 126, 128, and 130 channels FCHo1 overexpression sets # 1, # 2, and # 3 to 127, Labeled with 129, and 131 channels
  • the same amount of labeled peptide was pooled and fractionated using 3100 OFFGEL fractionator (Agilent Technologies, USA) After fractionation, each fraction was desalted using a C18 spin column. .
  • Peptide samples were analyzed by nano-LC-MS / MS using Q-exactive (Thermo Fisher Scientific, Germany).
  • the peptide samples were analyzed by nano-LC-MS / MS.
  • the peptides were placed in a trap column (PepMap, 2 cm * 75 ⁇ m, 3 ⁇ m particle size, Thermo Scientific) and 0.3 ⁇ l using solvent A (0.1% formic acid aqueous solution) and solvent B (0.1% formic acid in acetonitrile). Separation was carried out by EASY-Spray column (PepMap, 50 cm * 75 ⁇ m, 2 ⁇ m particle size, Thermo Scientific) at / min, then the separation gradient program was set as follows: linear 5-40% B for 160 min.
  • Raw data was retrieved against the human database (uniprot / swissprot, release-Apr_2014, 89601 entries) using SEQUEST® search engine on Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific). The search was performed on the following parameters; Tolerance set to 10 ppm for precursor ions and 0.8 Da for fragment ions; The maximum allowable number of false cuts is 1; TMT modification of lysine and free amine at the amino acid terminus and carbamidomethylation of cysteine were set as fixed modifications; Oxidation of methionine was set up in various variants.
  • FCHo1 is present inside the median located at the center of the intracellular cellular bridge (ICB), which is known to be associated with an early working protein on the cladrin surface assembled with a nucleic acid coat nucleator.
  • FCHo1 is composed of the FER / Cip4 homology Bin-Amphiphysin-Rvs (F-BAR) domain, the proline-rich domain (PRD), and the mu-homology domain (MHD) as shown in FIG.
  • the F-BAR domain forms a crescent shaped antiparallel dimer structure that binds to PtdIns (4,5) P 2 -enriched membranes.
  • the underline at the bottom of the sequence of FIG. 1 is the sequence corresponding to the position recognized by the various FCHo1 antibodies, wherein the vertically indicated sites in the sequence represent potential cleavage sites of FCHo1.
  • FCHo1 cleavage site of FCHo1 was first identified. Immunoblot analysis was performed using anti-FLAG antibodies from cells transfected with full-length wild-type, ⁇ 273-294, or S295A fused FCHo1 N-terminus to 3xFLAG in A549 cells, and C-terminus in A549 cells. Immunoblot with representative anti-FLAG antibody after transfection of full length wild type or FCHo1 protein with 3 ⁇ FLAG tag fusion ( ⁇ 480-561, ⁇ 531-561, ⁇ 562-569, ⁇ 562-570, or ⁇ 571-579) The analysis was performed. The immunoblot analysis results are shown in FIGS. 2 and 3.
  • FCHo1 was also cleaved at the position between the PRD and MHD domains and at the position between the F-BAR and PRD. That is, the sites of FCHo1 divided by putative cleavage sites are F-BAR domain (F-BAR), PRD (proline-rich domain), mu homology domain (MHD).
  • FCHo1 FCHo1 protein fragment had different subcellular positions.
  • Microscopic images of FCHo1 were obtained using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Mitosis-synchronized A549 cells were stained using four different FCHo1 antibodies and Hoechst 33342 (DNA staining). The results are shown in FIG.
  • ⁇ 584-804 stained a median such as a knee joint-like structure that connects two daughter cells at the end of cell division, while other FCHo1 antibodies ( ⁇ 92-242 and ⁇ 468-517) ICB was stained. That is, the FCHo1 was site-specific cleavage, and it was confirmed that fragments containing 584-804aa among the cleavage sites are fragments that are specifically located in the central body.
  • FCHo1 amino acid sequence was then analyzed using PROSPER (https://prosper.erc.monash.edu.au). Impressively, the analytical results predicted that MMP-9 (matrix metallopeptidase 9) could cleave FCHo1 at the Arg 563 (R563) position (FIG. 6).
  • FCHo1 antibodies ⁇ 468-517 or ⁇ 584-804 were used to determine the cleaved N-terminus (NT) or C-terminus (CT) of FCHo1 at the R563 position. Used to observe. The location of the FCHo1 fragments was determined at the end of mitosis and at the end of the formation of the median for the purpose of identifying the location associated with the formation of the median. Structured-illumination (SIM) images were obtained via immunostaining at the end of cell division.
  • SIM Structured-illumination
  • FCHo1 is located in the central spindle during late stages, but as cell division progresses, R563 of FCHo1 is cleaved during medial formation by MMP-9, while CT fragments remain in the median, whereas NT fragments remain. It shows that it is located in the ICB.
  • FCHo1 antibody ⁇ 584-804
  • SRM super-resolution microscopy
  • FCHo1 antibody ⁇ 584-804
  • calmodulin antibody ⁇ 584-804
  • Hoechst 33342 DNA staining
  • the electron condensation structure the medial
  • ⁇ 584-804-gold was stained a lot at the border of the median (c, Post-embedding), and stained the cell membrane of the vehicle (d, Pre-embedding).
  • SRM Super-resolution microscopy
  • FCHo1 gathers at the border of the median (e).
  • FCHo1 detected by the antibody ⁇ 584-804 appeared strongly during the formation of the median during cell division, and continued to exist in the medial until the moment when the cellular division occurred and cleavage.
  • Akt1 binding motifs such as Ser155 (S155) and Ser570 (S570), inside FCHo1 which have been shown to be conserved sites in mouse FCHo1.
  • S155 Ser155
  • S570 Ser570
  • FLAG antibodies for anti-3xFLAG-fused partial FCHo1 construct (562-889 or 582-889) expression.
  • F-BAR ⁇ 150-155 the binding site of Akt1 was confirmed by co-immunoprecipitation for the 150-155 deletion mutation (F-BAR ⁇ 150-155) of FCHo1. The results are shown in FIG.
  • FCHo1-HA or FCHo1-FLAG FLAG-fusion FCHo1
  • FCHo1 siRNA FCHo1 siRNA
  • anti-FLAG antibody against FCHo1-FLAG Co-IP of FCHo1-HA was carried out using the result shown in FIG. 15.
  • FCHo1-FLAG bound to full-length FCHo1-HA, while FCHo1-FLAG did not bind to CT-fragment (564-889aa) of FCHo1-1HA. Therefore, these results show that NT fragments related to the F-BAR domain are important for the dimer or multimerization of FCHo1.
  • Immunofluorescence and PLA assays confirmed whether the F-BAR domain binds to Akt1 in the ICB and on the plasma membrane and the interactions in the mediators of FCHo1 and Akt1.
  • SIM images of FCHo1 and Akt1 were confirmed in the central body, and the central body was enlarged and observed.
  • Interactions in the mediators of FCHo1 and Akt1 were confirmed via PLA, and calmodulin 1 was used as ICB marker. The results are shown in FIG.
  • FCHo1 S 570A mutant constructs were prepared to disrupt the phosphorylation of FCHo1 in S570. SIM images of these S570A mutant constructs were confirmed by staining at the median with FCHo1 antibody ( ⁇ 468-517). A549 cells were observed for wild type FCHo1 or FCHo1 mutations (S570A). The results are shown in FIG.
  • the S570A mutation changed the staining of the FCHo1 antibody from ICB to median.
  • NT fragment of FCHo1 cleaved at R563 was detected. This change is similar to the ⁇ 563-564 identified in previous Example 3 inhibiting cleavage of FCHo1 at 563R. Therefore, cleavage at the R563 site of FCHo1 is thought to be Akt1 dependent.
  • 14-3-3 ⁇ is a heterotetramer consisting of MKLP1 kinesin-6 and CYK4 RhoGAP, which are known as homologous molecules of human MKLP1 and RACGAP1, respectively. Central spindles function for the formation and maintenance of medial bodies. 14-3-3 ⁇ is a dispersed protein of the median-derived RACGAP1 / MKLP1 complex.
  • FCHo1 FCHo1 ⁇ 407-421 structure was prepared and co-immunoprecipitation of 14-3-3 ⁇ and Akt1 using anti-FLAG antibody was performed. It was. Transfected cells were observed during mitosis. PLA analysis also confirmed the interaction of FCHo1 (584-804) with 14-3-3 ⁇ in the median. The results are shown in FIG. 20.
  • FCHo1 Proteins markedly up or down regulated by overexpression of FCHo1 were analyzed by mass spectrometry. Changes in cell cycle-associated protein groups in A549 cells overexpressing FCHo1 were confirmed by proteomic analysis, and the results are shown in FIG. 23.
  • FCHo1 causes down-expression of cell cycle-associated protein groups and, conversely, upregulation of proteins in the mitochondrial electron transfer-related protein group (a). All mediator position proteins were regulated by overexpression of FCHo1 (b). This confirmed that FCHo1 regulates the mediator associated protein.
  • ⁇ 563-564 protein inhibited the formation of the median as compared to wild-type FCHo1 protein.
  • FCHo1 was newly identified as a new mediator regulator.
  • FCHo1 is site-specifically cleaved by proteolytic enzymes, and fragments of site-specific cleavage migrate differently to the median or ICB.
  • Akt1 known as a kinase, phosphorylates FCHo1 at S155 and S570.
  • Phosphorylation at S570 is important for cleaving FCHo1
  • phosphorylation of S570 is phosphorylated by Rkt3 cleavage dependent Akt1.
  • R563-564 deletion mutations inhibit central formation and unstable formation of RACGAP1 and MKLP1, known as components of centralspindlin. Cleavage of FCHo1 induces the accumulation of 14-3-3 ⁇ in the median.
  • FCHo1 This maintains the stability of the MKLP1 / RACGAP1 complex through which FCHo1 regulates mediator formation.
  • the 407-421aa deletion mutant abolished the formation of mediators, indicating that binding of 14-3-3 ⁇ and FCHo1 is essential for mediator formation.
  • the mediator protein FCHo1 is essential for mediator function and can effectively regulate mediator formation through regulation of site specific cleavage of FCHo1.
  • Lentiviral vectors for the full-length, mutant and deletion forms of FCHo1 were constructed and delivered to lung cancer model mice in a non-invasive aerosol manner to confirm their anticancer effects.
  • Example 8 a portion involved in cutting of FCHo1 in human cells hayeoteumeuro FCHo1 S570A and FCHo1 del563 -564 Im check, it was found the corresponding position in the mouse FCHo1, S570A S554A is, del563-564 the check corresponds to del544-545 It was. Based on this, a lentiviral vector was prepared, and anti-cancer effects were compared when inhaled exposure to 9-week-old K-ras female mice for 4 weeks in total, and the results are shown in FIG. 25.
  • FCHo1 S554A observing the tumor volume was showed a significant reduction in volume in comparison with FCHo1 wt
  • FCHo1 del544 -545 was also confirmed that the volume is reduced. Based on these results, it can be seen that tumors can be suppressed through the inhibition of the formation of a mediator in the case of mutations and deletions of FCHo1.
  • H & E slides were fabricated and confirmed whether adenoma and hyperplasia were reduced.
  • the results are shown in Table 1.
  • ShFCHo1 was used for FCHo1 cleavage inhibition, and its sequence is shown in SEQ ID NOS: 1 to 4 based on FIG. 26, and among these, shmFCHo1 of SEQ ID NO: 2 had the largest FCHo1 inhibitory effect.
  • FCHo1 As shown in Table 1, in the deletion and mutation groups of FCHo1, a significant level of inhibition of adenoma and hyperplasia was observed compared to the control. Through this, it was confirmed that normal cleavage inhibition of FCHo1 causes abnormality in cell division and anti-cancer effect can be obtained by inhibiting differentiation through this.
  • FCHo1 cleavage Changes in FCHo1 cleavage were confirmed in normal tissues of human samples and in stage 1, 2 and 3 lung cancer tissues.
  • the expression level of FCHo1 was detected using an antibody that targets 584-804aa including a part of the MHD domain region of FCHo1. The results are shown in FIG. 27.
  • Akt1 binding affinity was greatly increased in peptides 562-571 (RRLRSRKVSC) of FCHo1 and 560-571 (PPRRLRSRKVSC) of FCHo1. These contain the Akt1 binding motifs.
  • the aim of the development of peptide therapeutics is to discover antagonists that compete with FCHo1 binding partners for short peptides derived from FCHo1 binding sites for Akt1, MMP9, 14-3-3. Therefore, they are expected to inhibit the cleavage of FCHo1, to inhibit phosphorylation, or to inhibit the binding of the binding partner, which can be used in the development of peptide anti-cancer therapeutics.
  • Biotin-conjugated peptides were treated to cells, the cells were fixed, and reacted with a straptavidin-488 fluorescent die, followed by CLSM observation. The results are shown in FIG. 29.
  • the peptide No. 560-571 (PPRRLRSRKVSC) was found to increase intracellular uptake in a concentration-dependent manner.
  • the limitation of peptide therapy is that the peptide's properties such as the peptide's polarity and hydrophilicity can make it difficult to absorb it into the cell. Therefore, carriers or Myristic acid must be conjugated to the peptide.
  • the 560-571 peptide since the peptide itself is well absorbed by the cell, there is an advantage of overcoming the limitation of the peptide therapeutic agent. This demonstrates that the peptide itself can penetrate the cell membrane without requiring a separate CPP (Cell Penetrating Peptide-Cell Penetrating Peptide) and carrier, and is valuable as an effective therapeutic agent.
  • Xcelligence was used to measure cell viability in real time, and peptides were treated with 10 ⁇ M. The inhibitory effect of cell growth on 560-567, 562-571 and 560-571 peptides was confirmed and the results are shown in FIG. 30.
  • peptides 560-567, 562-571, and 560-571 showed inhibitory effect on cell growth, and in particular, the 560-571 (PPRRLRSRKVSC) peptide had good binding affinity and intracellular uptake with Akt1. Reflecting the cell growth inhibition effect was confirmed to be excellent. Accordingly, it was confirmed that the Akt1 binding motif and 14-3-3 binding site of FCHo1 would be a good target site for the development of peptide anticancer agents and chemicals.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare tablets.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • Purified water was added to adjust the total volume to 1,00 ml. According to the conventional method for preparing a liquid, the above components are mixed, and then filled into a brown bottle and sterilized to prepare a liquid.

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Abstract

본 발명은 FCHo1의 활성을 촉진 또는 억제하여 세포 분열을 조절하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 FCHo1 활성 조절제는 세포 분열에서 중요한 인자로 기능하는 FCHo1을 타깃으로 하여 이의 활성을 촉진 또는 억제시킴으로써, 세포 분열을 촉진하거나 세포 분열을 억제할 수 있으므로 세포 분열과 관련된 질병의 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

FCHO1 조절제를 포함하는 세포 분열 조절용 조성물 및 이를 이용한 세포 분열 조절 방법
본 발명은 FCHo1의 활성을 촉진 또는 억제하여 세포 분열을 조절하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
세포분열은 생명체의 성장과 자연적인 손실을 보충하기 위해 수행되는 필수적인 과정으로, 생명체 유지에 있어서 매우 중요한 과정이다. 따라서 세포 분열을 매우 정교하고 복잡한 과정을 통해 수행되게 되며 이와 같은 세포 분열에 이상이 발생하면 암과 같은 질병이 발생될 수 있다.
인류가 정복해야 할 중요한 질병중의 하나인 암은 세포분열상의 결함으로 인하여 휴지기 상태에 있어야 할 세포가 이상적으로 증식하여 그 주변의 세포를 파괴하는 특성을 갖는다. 이러한 암은 세포의 성장 및 분화를 조절하는 신호전달체계 (signal transduction pathway) 에 관여하는 여러 인자들의 유전적 변이로 발생한다고 알려져 있다.
진핵세포는 외부에서 세포성장에 대한 신호를 받으면 신호전달체계를 통하여 세포주기에 따라 증식하게 된다. 진핵세포는 DNA 합성 (synthesis phase; S기 라고함) 과 유사분열(mitosis phase; M기 라고 함)의 과정을 주기적으로 거치면서 증식하는데, S기와 M기 사이에는 G1기와 G2기가 있으므로 G1-- S--G2--M기의 주기를 차례로 돌면서 분열한다. 세포분열이 완결된 후에 세포는 다시 G1기로 들어가는데 이 G1 기는 세포내 대사가 가장 활발한 시기로 대부분 의 세포는 많은 시간을 G1 기의 상태로 존재한다. G1 기에서 세포는 디플로이드 (diploid) 즉 2N 상태이고, S기에서 DNA 복제가 일어나 2N이 4N (tetraploid)으로 되며, G 2 기를 거쳐 짧은 M기 동안 4N이 2N으로 분열하고 다시 G1 기로 돌아가게 된다. 정상세포는 G1 기에서 외부로부터 성장 자극 신호가 있으면 S기로 진입하여 G2 기를 거쳐 세포분열을 일으켜 증식하고, 외부신호가 없으면 세포주기의 진행이 중단되어 G1 기에서 멈추어진 G0 기 (휴지기)로 존재한다.
유사분열은 활발히 분열하는 세포에서 다수 관찰되며, 염색질이 응축하여 염색체가 형성되는 동시에 미소관을 골격으로 하는 방추사 또는 분열장치가 생기는 것, 염색체가 방추체 상에서 양극으로 2분하여 핵분열이 완료되는 것을 특징으로 한다. 유사분열은 전기, 중기, 후기로 나뉘며 방추사가 연결된 염색체들이 세포의 적도면에 배열되는 것이 중기, 쌍으로 된 염색체가 세로로 갈라져 둘로 분리되며 방추사에 의해 양극으로 이동하는 것이 후기, 방추사가 소실되고 성상체가 중심체로 되며 핵막과 인이 나타나 두개의 새로운 딸핵을 형성하는 것이 말기에 해당한다.
반면, 암세포는 외부신호와 상관없이 휴지기에 있어야 할 세포들이 세포주기를 따라 DNA합성과 세포분열을 계속하면서 증식한다. 이와 같이 휴지기와 세포분열주기를 결정하기 위해서는 각 기의 세포주기인자들이 세포 내에 존재하여 정확하게 세포주기가 수행되도록 하여야 하며 외부신호를 받아들이는 수용체가 존재하여야 한다. 따라서 휴지기와 세포분열주기의 경계를 결정하는 수용체 및 세포주기인자들의 기능이 왜곡되면 세포가 비정상적으로 성장하게 되어 암세포로 형질 전환되게 된다.
따라서 특히 암세포의 치료에 있어 암세포의 세포분열을 조절하는 것은 매우 흥미로운 주제이나, 아직까지 중앙체 형성의 조절을 통한 암세포 분열의 조절에 관해서는 널리 알려진 바 없다.
본 발명자들은 세포 분열을 조절하고, 더 나아가 암세포 분열의 조절을 통해 새로운 치료제를 개발하기 위한 연구를 수행하던 중, FCHo1 단백질이 세포 분열 중 중앙체(midbody) 형성에 관여하는 중요한 인자이며, 이를 타깃으로 하는 경우 세포 분열을 효과적으로 조절할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 FCHo1 활성 조절제를 포함하는 세포 분열 조절용 조성물 및 이를 이용한 세포 분열능 조절 방법에 관한 것이다.
본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 세포 분열 조절용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 세포 분열 조절제를 제공한다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는 배지 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 세포 내 FCHo1 (FCH domain only 1) 를 검출하는 단계; 를 포함하는 세포 분열능에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 의 활성을 조절하는 단계; 를 포함하는 인간의 제외한 동물 세포의 분열능을 조절하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 생체 외(in vitro)에서 FCHo1 (FCH domain only 1) 의 활성을 조절하는 단계; 를 포함하는 세포의 분열능을 조절하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 암 치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 단백질 절편을 검출하는 단계;를 포함하는 개체의 암 진단에 대한 정도를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 단백질 절편 검출 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 FCHo1 활성 조절제는 세포 분열에서 중요한 인자로 기능하는 FCHo1을 타깃으로 하여 이의 활성을 촉진 또는 억제시킴으로써, 세포 분열을 촉진하거나 세포 분열을 억제할 수 있으므로 세포 분열과 관련된 질병의 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 FCHo1의 구조 및 이의 절단 부위를 나타낸 모식도이다.
도 2는 FCHo1의 부위 특이적 절단을 FCHo1의 특이적 결실 형태를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 FCHo1의 부위 특이적 절단을 FCHo1의 특이적 결실 형태를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 별표는 밴드가 사라진 것을 나타낸다.
도 4는 절단된 FCHo1 단밸질 절편의 서브 세포성 위치를 FCHo1 항체를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 MG132 처리에 의한 FCHo1 절단 억제를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 별표는 밴드가 사라진 것을 나타낸다.
도 6은 MMP-9 (matrix metallopeptidase 9) 가 Arg 563(R563) 위치에서 FCHo1을 절단함을 예측한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 야생형(wt), 또는 FCHo1 (Δ563-564 또는 Δ531-589) 에 대한 면역 침강 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 FCHo1 및 MMP-9의 PLA 결과를 나타낸 도이다(스케일바, 5 μm.)
도 9는 세포 분열 단계에 따른 FCHo1 및 이의 절편의 위치를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (스케일바, 5 μm.)
도 10의 a, b 중앙체의 FESEM 결과를 나타낸 도이며, a는 수평 절단면, b는 수직 절단면을 각각 의미한다.
도 10의 c, d는 면역-골드 라벨링을 통한 비히클 내 FCHo1 존재 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 10의 e는 SRM(Super-resolution microscopy)을 통한 FCHo1 위치를 확인한 결과를 나타낸 도이다(Three-dimensional SIM, 3D-SIM; direct stochastic optical reconstruction microscopy, dSTORM. Scale bar, 1 μm).
도 11은 세포분열 동안에 FCHo1 의 위치를 확인하기 위한 CLSM 이미지를 나타낸 도이다.
도 12는 FCHo1 내부의 Akt 결합 모티프를 나타낸 도이다.
도 13은 FCHo1과 Akt 결합 위치를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 FCHo1 의 Akt1 인산화 부위 및 중앙체 및 ICB에서의 위치를 나타낸 모식도이다.
도 15는 FCHo1의 자가 결합을 공동 면역침강법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 세포 분열 단계에서 F-BAR 절편의 절단을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 별표는 밴드가 사라짐을 나타낸다.
도 17은 F-BAR 및 CT 절편의 세포성 위치를 면역형광법 및 PLA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 S570A 돌연변이 구조체에서의 FCHo1 절단 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 FCHo1 및 14-3-3ζ 의 결합을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 14-3-3ζ 의 결합부위를 공동면역 침강 및 PLA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 FCHo1 및 14-3-3ζ 의 결합이 중앙체형성에 필수적임을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 야생형 FCHo1 또는 FCHo1 Δ563-564 발현 A549 세포의 중앙체 이미지의 SIM 이미지를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 FCHo1을 과다발현시킨 A549 세포에서 세포 주기-연관 단백질 군의 변화를 프로테오믹스 분석을 통해 확인한 결과(a), 중앙체 위치 단백질이 FCHo1의 과다발현에 의해 조절되는 것을 확인한 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 24는 후기 (중앙 방추사) 및 말기(중앙체) 의 세포의 비율을 CLSM 이미지를 통해 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 25은 폐암 모델 마우스에서 FCHo1 야생형, 이의 변이체 처리군에서의 종양세포의 병변, 수를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 마우스 FCHo1에 작용하는 4가지 shRNA 서열 디자인을 나타낸 도이다.
도 27은 인간시료의 정상 조직 및 1,2,3기 폐암 조직에서 FCHo1 절단의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 FCHo1 아미노산 서열 유래의 펩타이드와 Akt1의 결합 친화도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 FCHo1 아미노산 서열 유래의 펩타이드의 세포 내 흡수를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 30은 FCHo1 아미노산 서열 유래의 펩타이드의 세포 생장 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 세포 분열 조절용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 FCHo1은 세포 분열 동안 위치 특이적인 절단을 통해 중앙체 형성에 관여하는 단백질로, 세포 분열, 특히 유사분열(mitosis) 단계에 있어서 필수적인 역할을 수행함으로, 이를 타깃으로 한 FCHo1 활성 조절제를 통해 세포 분열을 조절하여 세포 분열과 관련된 다양한 질환, 특히 암을 효과적으로 치료할 수 있다.
상기 FCHo1은 인간 FCHo1의 경우 Gene ID: 23149 로 등재되어 있으며, F-BAR(FER/Cip4 homology Bin-Amphiphysin-Rvs) 도메인, 프롤린 풍부 도메인 (proline-rich domain; PRD) 및 MHD(mu-homology domain)로 구성되는 단백질로, 세포 분열 시 세포질 분열의 마지막에 ICB(intracellular cellular bridge)의 중앙에 위치하는 중앙체의 형성에 중요한 역할을 하는 단백질이다.
중앙체(midbody)란, 세포 분열의 마지막 단계에서 두개의 딸 세포를 연결하고 있는 무릎관절 유사 구조를 갖는 것으로 본 발명에 따르면 FCHo1 에 의해서 조절되는 것을 특징으로 한다.
상기 FCHo1은 위치 특이적 절단을 통해 중앙체의 형성을 조절하며, 이와 같은 절단 위치는 PRD 및 MHD 도메인 사이의 위치 및 F-BAR 및 PRD 사이의 위치에서 나타날 수 있으며, 해당 위치는 MMP-9에 의해서 절단되는 것을 특징으로 할 수 있다.
FCHo1의 위치 특이적 절단은 세포 분열의 단계의 진행에 따라 일어나게 되며, 이의 절단된 C-말단 절편은 중앙체에 남아있게 되나, N 말단 절편은 세포 분열의 말기에는 ICB(intracellular cellular bridge)에 위치하는 특성을 나타내어 절단 후 각각의 절편들이 이동하는 양상을 나타낸다.
따라서 본 발명은 상기 FCHo1활성 조절제는 중앙체 형성 조절용인, 세포 분열 조절용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, FCHo1의 활성 조절제란, FCHo1의 활성을 촉진하거나 억제시킬 수 있는 물질을 말하며, 여기서 FCHo1의 활성이란 'FCHo1이 중앙체 형성, 나아가 세포 분열이 정상적으로 일어날 수 있도록 하는 활성'을 의미한다. 따라서 FCHo1의 활성 촉진제란, FCHo1 가 세포 분열 단계에서 하는 역할을 촉진함으로써, 세포 분열을 촉진할 수 있는 물질을 말한다. 예컨대 FCHo1의 활성 촉진제는 FCHo1의 위치 특이적 절단을 촉진하는 물질 (MMP-9), FCHo1의 적절한 인산화를 촉진하는 물질 (Akt1), FCHo1과 14-3-3ζ과의 결합을 촉진하는 물질로 구성될 수 있으며, FCHo1 특이적 전사 또는 발현을 촉진시킬 수 있는 FCHo1 특이적 프로모터와 같은 당 분야에 알려진 유전자 전사, 발현 조절 물질을 제한없이 포함할 수 있다. 또한 FCHo1 활성 억제제는 FCHo1가 세포 분열 단계에서 하는 역할을 억제 또는 파괴함으로써 세포 분열을 정상적으로 일어날 수 없도록 하는 물질을 말한다. 예컨대 FCHo1의 활성 억제제는 FCHo1의 위치 특이적 절단을 억제하는 물질, FCHo1의 인산화 억제제, 14-3-3ζ 과 FCHo1사이의 결합 억제제일 수 있으며, FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열일 수 있다.
특히 FCHo1의 변이체 또는 결실 서열은 FCHo1의 서열 중 MMP-9(matrix metallopeptidase 9)에 의해 절단되는 서열에 변이 또는 결실이 일어난 것으로, 정상적인 FCHo1의 위치 특이적 절단을 불가능하게 함으로써, 세포 분열을 억제할 수 있도록 하는 서열일 수 있고, FCHo1의 서열 중 Akt1에 의한 인산화 부위에 변이 또는 결실이 일어나, Akt1이 FCHo1에 정상적으로 결합하지 못하게 함으로써 FCHo1의 정상적인 절단을 차단하는 서열일 수 있고, FCHo1의 서열 중 14-3-3ζ 과의 결합 부위에 변이 또는 결실이 일어나 결합을 방해함으로써, 중앙체의 형성을 방해하는 서열일 수 있다.
예시적인 FCHo1의 억제제는 이의 단백질 발현, 이의 유전자 발현을 억제하는 유전 공학적 기법에 의한 억제제를 다양하게 포함할 수 있으며, 예컨대 FCHo1유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 및 리보자임(ribozymee)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, FCHo1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질 유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
따라서 본 발명은 FCHo1의 활성 억제제는 FCHo1의 위치 특이적 절단을 억제하는 것인, 세포 분열 조절용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 FCHo1 활성 억제제는 FCHo1 인산화 억제제인, 세포 분열 조절용 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 FCHo1 활성 억제제는 14-3-3ζ 과 FCHo1사이의 결합 억제제인; 또는 상기 FCHo1 활성 억제제는 FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열인; 또는 상기 FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열은 FCHo1 서열 중 MMP-9(matrix metallopeptidase 9) 에 의해 절단되는 서열에 변이가 일어난 것인; 또는 FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열은 FCHo1의 서열 중 Akt1에 의한 인산화 부위에 변이 또는 결실이 일어난 것인; 또는 상기 FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열은 FCHo1의 서열 중 14-3-3ζ 과의 결합 부위에 변이 또는 결실이 일어난 서열인, 세포 분열 조절용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 세포 분열이 조절되는 세포는 그 종류가 제한되지 않으나 특별히 유용한 목적을 위하여 세포의 이상 분열과 관련된 질환을 갖는 세포, 특히 바람직하게는 암세포일 수 있다.
또한 본 발명은 FCHo1 활성 조절제를 포함하는 세포 분열 조절제에 관한 것이다.
상기 세포 분열 조절제는 개체에서의 세포 분열을 조절함으로써, 세포 분열과 관련된 질병, 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 세포 분열과 관련된 질환은 세포 증식성 질환, 예컨대 비정상적인 세포 분열을 특징으로 하는 암, 비암성 이상 증식-세포분열에 의한 각종 난치성 질환, 또는 비정상적으로 낮은 수준의 세포 분열에 의한 각종 난치성 질환일 수 있다. 상기 세포증식성 질환은, 이에 한정하는 것은 아니지만, 종양, 악성종양, 혈관증식성질환(blood vessel proliferative disorders), 자가면역질환 및 섬유증질환(fibrotic disorders)을 포함한다.
상기 이상 증식은 일반적인 수준의 세포 증식 수준을 벗어나 부적절하게 높은 수준으로 세포 분열이 일어나는 것을 것을 의미할 수 있다.
또한 본 발명은 FCHo1 활성 조절제를 포함하는 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, '배지(media)'는 체외배양 조건에서 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 또한, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 세포 내 FCHo1 (FCH domain only 1) 를 검출하는 단계; 를 포함하는 세포 분열능에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 세포 내 FCHo1을 검출하고, 이의 활성을 검출함으로써 중앙체의 형성이 정상적으로 이루어지는지 여부 및 이에 따른 세포 분열이 정상적으로 이루어지는지에 관한 세포 분열능에 대한 정보를 효과적으로 제공할 수 있다. 만약 FCHo1에서 비정상적인 변이가 일어나 FCHo1의 위치 특이적 절단이 정상적으로 이루어지지 않는다면, 세포 분열 단계에서 중앙체의 형성이 비정상적으로 이루어질 수 있으며, 이에 따라 세포 분열능이 저해될 수 있다.
따라서 상기 검출은 FCHo1의 절단, FCHo1의 인산화, FCHo1의 중앙체로의 이동 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
특히 FCHo1은 세포 분열 중 나타나는 중앙체(midbody) 형성에 필수적인 역할을 수행함으로, 상기 세포 분열능에 대한 정보는 중앙체 형성능에 관한 정보일 수 있다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 의 활성을 조절하는 단계; 를 포함하는 인간의 제외한 동물 세포의 분열능을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 FCHo1은 세포 분열 중 중앙체 형성에 필수적이므로, 이의 활성을 조절함으로써, 세포의 분열능을 효과적으로 조절할 수 있다.
상기 조절은 예컨대 FCHo1의 활성을 억제함으로써 중앙체 형성 억제를 유도하여 세포 분열이 정상적으로 일어나지 않도록 조절하는 것을 말하며, FCHo1의 활성 억제는 FCHo1의 활성 억제제를 통해 수행할 수 있다.
상기 동물 세포는 인간을 제외한 동물 세포 또는 인간을 포함하는 동물 세포일 수 있으며, 특히 세포 분열과 관련된 질병, 예컨대 암을 가진 개체로부터 유래된 세포 일 수 있다.
또한 본 발명은 생체 외(in vitro)에서 FCHo1 (FCH domain only 1) 의 활성을 조절하는 단계; 를 포함하는 세포의 분열능을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 개체로부터 분리된 세포를 생체 외에서 FCHo1의 활성을 조절하여, 세포 분열능을 조절할 수 있으며, 이를 세포 분열과 관련된 질병 또는 기전 연구에 유용하게 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
다양한 암 조직에서 FCHo1 의 전사 정도를 분석한 EST 결과 FCHo1이 암 조직 중 특히 B-림프아구(B-lymphoblast), 골수, 근육, 난소암 조직에서 높은 전사를 나타내며, 골, 안구, 폐, 췌장, 태반, 피부, 대장, 위, 정소에서도 높은 전사를 나타냄이 보고되어 있다. 따라서 유사분열에 기능하고, 분열이 빠른 세포에 더 많이 존재하는 본 발명의 FCHo1은 각종 암에서 질병 치료를 위한 타깃이 될 수 있으며, 이의 활성을 조절함으로써, 각종 이상 세포 증식에 의한 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 암은 세포분열, 유사분열(mitosis)에 이상이 생겨 유발되는 암을 모두 제한없이 포함할 수 있으나, 폐암, 위암, 대장암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종과 같은 고형암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종, 바람직하게는 B-림프아구(B-lymphoblast), 골수암, 근육암, 난소암, 골암, 안암, 폐암, 췌장암, 태반암, 피부암, 대장암, 위암 및 정소암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 FCHo1 활성 조절제는 암 세포의 이상 세포 분열을 FCHo1 활성 조절을 통해 적절하게 조절할 수 있으며, 예컨대 FCHo1의 활성을 비정상적인 FCHo1 절단을 유도하거나, FCHo1 변이체 또는 결실 서열의 도입을 통해 억제함으로써, 암세포의 분열을 억제하도록 할 수 있다.
따라서 본 발명은 FCHo1 활성 조절제를 포함하는 암 치료제에 관한 것이다.
FCHo1의 변이체 또는 결실 서열은 FCHo1의 서열 중 MMP-9(matrix metallopeptidase 9)에 의해 절단되는 서열에 변이 또는 결실이 일어난 것으로, 정상적인 FCHo1의 위치 특이적 절단을 불가능하게 함으로써, 세포 분열을 억제할 수 있도록 하는 서열일 수 있고, FCHo1의 서열 중 Akt1에 의한 인산화 부위에 변이 또는 결실이 일어나, Akt1이 FCHo1에 정상적으로 결합하지 못하게 함으로써 FCHo1의 정상적인 절단을 차단하는 서열일 수 있고, FCHo1의 서열 중 FCHo1의 서열 중 14-3-3ζ 과의 결합 부위에 변이 또는 결실이 일어나 결합을 방해함으로써, 중앙체의 형성을 방해하는 서열일 수 있다. 보다 구체적으로 인간 FCHo1 서열을 기준으로 S570 위치를 변이 또는 결실시킨 서열, S155 부위를 변이 또는 결실시킨 서열, FCHo1의 R563-564 부위가 변이 또는 결실된 서열, FCHo1의 407-421aa가 변이 또는 결실된 서열일 수 있다.
상기 FCHo1의 변이체 또는 결실 서열의 도입은 당 분야에 공지된 방법으로 제한없이 도입될 수 있으며, 본 발명의 일 구현예와 같이 적절한 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터에 FCHo1의 변이체 또는 결실 서열을 도입하여 암을 가진 개체에 도입할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 에어로졸 제형, 주사용 제형이 있을 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효 성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
특히 본 발명 약학적 조성물의 바람직한 제형은 에어로졸 전달을 통해 표적 부위에 전달되도록 제제화된 흡입 투여용 제형(에어로졸 제형) 일 수 있다.
흡입을 통한 약물 전달은 기도를 통과하여 폐의 점막을 통하여 직접 폐세포로 약물을 전달하는 비침습적(non-invasive) 방법 중 하나로, 특히 폐 질환의 광범위한 치료에 에어로졸 전달을 통한 핵산 전달이 유리하게 이용될 수 있다. 이는 폐의 해부학적 구조 및 위치가 즉각적이고 비 침습적인 접근을 가능케 하고, 다른 기관에는 영향을 미치지 않으면서 핵산 전달 시스템의 국소 적용을 받을 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 FCHo1의 변이체 또는 결실 서열을 적절한 전달체와 결합하여 에어로졸 방식으로 폐 등을 포함하는 병변 부위에 전달하면, 상기 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
예를 들어 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 체중에 따라 달라질 수 있으나 0.0001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 20mg/kg으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성 물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 화학적 치료, 방사성 치료, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절 제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 단백질 절편을 검출하는 단계;를 포함하는 개체의 암 진단에 대한 정도를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 인간을 포함하는 포유류인 것이 바람직하며, 상기 암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법은, FCHo1의 단백질 절편을 검출하여 이를 상호 비교함으로써, FCHo1 단백질 절편이 정상 개체와 비교하여 감소되어 있는 경우, 이를 암을 가진 개체로 진단하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 FCHo1 (FCH domain only 1) 단백질 절편 검출 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 FCHo1 단백질 절편은 세포 분열의 유사분열 단계에서 FCHo1의 위치특이적 절단에 의해 절단된 FCho1 단백질의 일부 단편을 말하며, 바람직하게는 개체가 인간인 경우, Arg563 위치에서 위치 특이적 절단이 일어나 생성되는 FCHo1 단백질의 절편을 의미한다.
FCHo1 단백질 절편 검출 제제는 단백질 절편에 특이적인 항체를 사용하여 개체 유래의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 방법으로 단백질 수준을 측정할 수 있는 제제를 말하며, 이를 분석하기 위한 구체적인 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등의 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.
세포 배양 및 형질감염
실험에 사용된 A549 세포는 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/고 글루코오스 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 세포들은 Neon® 형질감염 시스템을 이용하여 형질감염되었다.
플라스미드, siRNA 및 화합물
모든 플라스미드 구조들은 In-fusion® HD 클로닝 키트(Clontech® Laboratories) 에 의해서 클로닝하였다. 인간 FCHo1 cDNA 클론, pCMV6-N-3xDDK 벡터 및 pCMV6-C-3xDDK 벡터는 Origene에서 구입하여 사용하였다. 생성된 클론들은 다음과 같다: FCHo1-N-3xDDK, FCHo1-N-3xDDK 돌연변이 (Δ273-294, S295A), FCHo1-C-3xDDK, FCHo1-C-3xDDK 돌연변이 (Δ150-155, Δ480-561, Δ531-561, Δ562-569, Δ562-570, Δ571-579, Δ580-589, Δ563-564, Δ531-589, 407-421), FCHo1-C-3xDDK 이중 돌연변이 (Δ150-155 및 Δ562-570) 부분 FCHo1-C-3xDDK (562-889, 582-889, 1-268), 부분 FCHo1 (1-268)-C-3xDDK 돌연변이 (Δ150-155) 및 부분 FCHo1 (562-889)-C-3xDDK 돌연변이 (R562N, R563N, L564G, S566A, R567N, K568N, V569G, S570A, C571N). FCHo1 siRNA 저항성 클론: siRNA 저항성 FCHo1-C-3xDDK 및 siRNA 저항성 FCHo1-C-3xHA. 하기 RNA 올리고뉴클레오티드의 쌍은 표적 인간 FCHo1에 대하여 합성되었다: AGACCUACUCGAAGGCGAU (dtdt), UCAAGGACGUUCUCCGCUA (dtdt), ACGUGGUGCUGCUGCGAUA (dtdt), UCUCAGUGGAGUACGGCUA (dtdt). 노코다졸(Nocodazole)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였으며, MG132 은 MP　Biomedicals에서 구입하여 사용하였다.
면역 형광법 ( Immunofluorescence )
A549 세포를 8 웰 챔버 커버글라스 또는 고정밀 커버글라스에 위치시키고 3% 파라포름알데하이드로 10분 동안 실온에서 고정시켰으며, 0.5% triton® X-100 를 5분 동안 침투시키고 30분 동안 차단하였다. 이 후 1차 또는 2차 항체와 함께 차단 용액 (0.1% 사포닌 및 3% BSA 를 갖는 PBS)에서 배양하였다. dSTORM(stochastic optical reconstruction microscopy) 이미징을 위하여, Alexa Fluor 647 접합 항-래빗 이차 항체 및 산소 소거 시스템(0.5mg/ml 글루코오스 옥시다아제, 40μg/ml 카탈라아제, 10% 글루코오스, pH 7.4)을 이용하였으며, 이미징 전에 최종 티올 농도 10-200mM를 달성하기 위하여 30mM 머캅토에틸아민(MES; 시그마) 을 첨가하였다. 모든 dSTORM 및 SIM 이미지는 Carl Zeiss ELYRA PS.1 (super-resolution microscopy)에서 얻었으며, 모든 CLSM 이미지는 Carl Zeiss LSM710 (Confocal Laser Scanning Microscope) 에서 얻었다.
항체
FCHo1 (NBP2-16458; 584-804aa) 은 Novus Biologicals; FCHo1 (SAB2100803; 468-517aa), FLAG-HRP (A8592) 은 Sigma-Aldrich; FCHo1 (HPA041653; 285-364aa) 은 Atlas Antibodies; Akt1 (LF-MA0245) 은 Abfrontier; 감마-튜불린(Gamma-Tubulin) (ab11316), 칼모듈린 1 (Calmodulin1) (ab106681), RACGAP1 (ab2270), FCHo1 (ab102994; 92-242aa), HA-HRP (ab1190) 은 Abcam; MKLP1 (sc-867), 14-3-3ζ (sc-1019) 은 Santa Cruz, Phospho-Akt 기질 (RXRXXS/T-p) (#10001) 은 Cell signaling, 14-3-3ζ (H00007534-M04), MMP-9 (H00004318-M03) 은 Abnova, 및 Alexa Fluor 488, 555, 또는 647 표지된 항-마우스 또는 래빗 항체는 Life Technologies로부터 구입하여 사용하였다.
면역침강 , 면역블랏팅
세포들은 IP 용해 완충액에서 30분 동안 4℃에서 용해되었다. 17,000 x g에서 30분 동안 원심분리한 후, 상기 단백질의 농도를 측정하고, 용해물의 동일한 양을 면역 침강에 사용하였다. 면역침강은 항-flag M2 affinity gel (Sigma-Aldrich)을 이용하여 4℃에서 하룻밤동안 수행하였다. 침강물은 3회 세척용액으로 세척하고 침강된 단백질들은 SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. 특이항체 및 2차 항-마우스 IgG Veriblot 또는 홀스라다시 페록시다아제가 접합된 항-래빗 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 결과물은 chemiluminescence detector (Atto Ez-Capture MG)를 이용하여 시각화하였다.
젤라틴 자이모그래피 (Gelatin zymography )
젤라틴 자이모그래피를 0.1% 젤라틴을 함유하는 10% SDS-PAGE 에 대한 면역침강(IP) 에서 수행하였다. IP 시료는 SDS-PAGE 겔에서 수행되었고 2.5% Triton X-100으로 세척하였다. 그 후 50mM TrisCl (pH 7.6), 0.2M NaCl, 5mM CaCl2, 및 0.2% Brij-35 를 함유하는 콜라게나아제 완충액을 이용하여 3일동안 배양하였다. 겔을 Coomassie Brilliant Blue 로 염색하고 탈염하였다.
In situ PLA (proximity ligation assay)
PLA를 SIM 이미지 단백질-단백질 상호작용에 대하여 고-해상도 형광 현미경을 이용하여 수행하였다. 근접성 라이게이션(Proximity ligation)은 Duolink detection kit를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 모든 PLA 이미지는 Carl Zeiss's ELYRA PS.1로 얻었다.
FIB- FESEM
A549 세포를 2.5% 글루타알데하이드로 1시간동안 pH 7.2-7.4 0.1M 카코딜산(cacodylate) 완충액에서 고정시켰으며, 증류수로 세척하고 0.1M 카코딜산(cacodylate) 완충액에서 0.5% 사산화 오스뮴(osmium tetraoxide) 으로 고정시키고, 다시 증류수로 세척하였다. 그 후 50% 에탄올 내 0.1-0.5% 아세트산 우라닐로 하룻밤동안 En_bloc 염색을 수행한 후, 탈수화 하고 침윤시켰다. FEI's Helios 650 (FIB-FESEM)로 이미지를 얻었다.
Pre-embedding Immuno -gold TEM (gold enhancement)
A549 세포를 0.15M Hepes 내 4% 파라포름알데하이드 및 0.05% 글루타알데하이드의 혼합물 내에서 고정시키고, 0.15M Hepes 내 4% 파라포름알데하이드 내에서 후-고정시키고 세척하였다. 시료를 차단하고, FCHo1 항체 (584-804aa) 와 함께 배양하였으며, 세척하고 나노금(Nanoprobes, Yaphank, NY, USA)을 갖는 이차 항체와 함께 배양하고 다시 세척하였다. 1% 글루타알데하이드를 이용하여 다시 고정시킨 후 50mM 글리신으로 세척하였으며 이후 1% BSA 로 세척하였다. 다음 시료는 2% 사산화오스뮴(osmium tetraoxide) 및 3% 페로시안화칼륨(potassium ferrocyanide)의 1:1 혼합물로 고정하였고, 탈수시킨 후 침윤시켰다. 이미지들은 JEOL's JEM1010 (80 kV가속전압에서의 TEM)을 이용하여 얻었다.
프로테오믹스 분석을 위한 시료의 준비
RIPA 완충액을 이용하여 세포주들에서 단백질을 추출하였으며 단백질 농도를 bicinchoninic acid assay kit를 이용하여 결정하였다. 단백질 용해물을 FASP (filtered-aided sample preparation) 를 이용하여 소화시켰다. 200μg 의 단백질을 SDT 완충액((4 % SDS, 0.1 M DTT, 및 0.1 M Tris/HCl; pH 7.6)에서 변성시켰으며 그 후 45 분 동안 37℃에서 환원시켰다. 단백질 알킬화를 위하여 실온, 암 조건에서 30분 동안 50mM의 IAA(iodoacetamide) 를 첨가하였다. 시약 등을 제거하기 위하여 시료들을 UA 완충액 (8 M urea, 0. 1 M Tris-HCl; pH 8.5) 을 이용하여 원심분리하였으며, 그 후 UA 완충액을 TEAB 완충액 (100 mM; pH 8.5) 으로 교환하였다. 연속적 구배 트립신 (Promega, USA)을 첨가(100 mM TEAB 내 트립신: 단백질= 1 : 50 [w/w])하고 그 후 12시간동안 37℃에서 배양하였다. 분해된 시료들을 TMT 시약을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 표지하였다. 이 단계에서, 두개의 조건에 대한 3개의 시료들을 각각 채널을 이용하여 표지하였다; 대조군(control) 셋트 #1, #2, 및 #3을 126, 128 및 130 채널로, FCHo1 과다발현 셋트 #1, #2, 및 #3를 127, 129, 및 131 채널로 표지하였다. 동일한 양의 표지된 펩타이드를 모은 후 3100 OFFGEL fractionator (Agilent Technologies, USA) 을 이용하여 분획화하였다. 분획 이후, 각각의 분획물은 C18 스핀 컬럼을 이용하여 탈염화하였다.
LC-MS/MS 분석
펩티드 시료를 Q-exactive (Thermo Fisher Scientific, Germany)를 이용한 나노- LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 상기 펩타이드 시료들을 나노-LC-MS/MS 에 의해 분석하였다. 상기 펩타이드들을 트랩 컬럼 (PepMap, 2 cm * 75 μm, 3 μm 입자크기, Thermo Scientific) 에 위치시키고, 용매 A (0.1 % 포름산 수용액) 및 용매 B (아세토니트릴 내 0.1 % 포름산) 를 이용하여 0.3μl/min에서 EASY-Spray column (PepMap, 50 cm * 75 μm, 2 μm 입자크기, Thermo Scientific)에 의해 분리하였으며, 그 후 분리 구배 프로그램을 하기와 같이 셋팅하였다: 160 분동안 linear 5-40% B, 2분 동안 linear 40-80% B, 10분 동안 등용매 80%, 2분동안 linear 80-5% B, 및 15분 동안 등용매 5% B. 컬럼의 온도는 60℃로 유지되도록 하였다. 전구체 이온 스캔을 3*106 의 AGC 타깃값, m/z 200에서의 70K 고분해능(mass resolution) 을 갖는 프로필 모드에서 얻었다. MS 스캔에서의 상위 10 전구체 이온들을 orbitrap analyzer로 선택하였다. NCE (normalized collision energy)를 갖는 HCD fragmentation에 의해서 이온 산물들이 생산되었다.
TMT 데이터 분석
인간 데이터베이스(uniprot/swissprot, release-Apr_2014, 89601 entries) 에 대하여 로우 데이터를 SEQUEST® search engine on Proteome Discoverer 1.4 (Thermo Scientific)을 이용하여 검색하였다. 검색은 하기와 같은 파라미터에서 수행되었다; 전구체 이온에 대해서 10ppm 으로 설정된 tolerance 및 프래그먼트 이온에 대해서 0.8Da; 최대 허용가능한 수의 잘못된 절단은 1이며; 리신의 TMT 변형 및 아미노산 말단의 자유 아민 그리고 시스테인의 카르바비도메틸레이션(carbamidomethylation)이 고정 변형으로 설정되었다; 메티오닌의 산화는 다양한 변형으로 설정되었다. 펩타이드 및 단백질 동정을 입증하기 위하여, Scaffold Q+ (version 4.3.3, Proteome Software Inc., USA)를 이용한 Peptide Prophet 및 Protein Prophet algorithms을 적용하였다. 펩타이드 가능성(peptide probability)의 역치는 >95% 이고, 단백질 가능성의 역치는 >99% 로 사용되었으며, 동정 단백질을 만약 그들이 2개 이상의 특이적 펩타이드에서 나타난다면, 그것은 정확한 것으로 간주하였다. TMT 리포터 이온의 피크 강도는 Scaffold Q+를 이용한 탠덤 질량 스펙트럼에서 추출하였다. 연속적으로, 다량의 단백질의 상대적인 비율 및 모든 p-값(sample p-value, ratio p-value)을 Isobar (R software package)를 이용한 두개의 군 (126/127, 128/129, 130/131) 사이에서 계산하였다. FCHo1 과다 발현 세포에서 시료 p-값 및 비율 p-값(ratio p-value) 이 모두 <0.05 인 단백질을 선택하였다. GO(Gene ontology) 분석을 DAVID 바이오인포매틱스 리소스를 이용하여 유의적인 단백질에서 수행하였다.
실시예 1. FCHo1 절단 위치의 확인
세포질 분열의 마지막에 ICB (intracellular cellular bridge) 의 중앙에 위치하는 중앙체 내부에는 FCHo1이 존재하며, FCHo1은 핵산 coat nucleator 로 조립되는 클라드린 표면에서 초기 워킹 단백질과 연관된 것으로 알려져있다. FCHo1은 도 1에 나타낸 바와 같이 F-BAR(FER/Cip4 homology Bin-Amphiphysin-Rvs) 도메인, 프롤린 풍부 도메인 (proline-rich domain; PRD) 및 MHD(mu-homology domain)로 구성된다. F-BAR 도메인은 초승달 형태의 역평행 다이머 구조를 형성하고 이 것은 PtdIns(4,5)P2-enriched membranes 에 결합한다. 도 1의 서열 하단의 밑줄은 다양한 FCHo1 항체에 의해 인식되는 위치에 해당되는 서열이며, 서열 내의 수직으로 표시된 부위는 잠재적인 FCHo1의 절단 부위를 나타낸다.
FCHo1의 부위 특이적 절단이 중앙체의 형성을 조절하는지 여부를 확인하기 위하여, 먼저 FCHo1의 절단 부위를 확인하였다. A549 세포 내에서 FCHo1 N-말단이 3xFLAG와 융합된 전장 길이의 야생형, Δ273-294, 또는 S295A 로 형질감염 세포로부터 항-FLAG 항체를 이용하여 면역블랏 분석을 수행하였으며, A549 세포 내에서 C-말단3xFLAG 태그 융합을 갖는 전장 야생형 또는 FCHo1 단백질의 부위 특이적 결실(Δ480-561, Δ531-561, Δ562-569, Δ562-570, 또는 Δ571-579) 의 형질감염 후 대표적인 항-FLAG 항체를 이용한 면역블랏 분석을 수행하였다. 면역블랏 분석결과를 도 2 및 도 3 에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Δ273-294 에서 밴드가 사라진 것이 뚜렷하게 확인되었다. 또한 도 3에서는 Δ562-569, Δ562-570 에서 밴드가 사라지는 것을 확인하였다. 이에 따라, FCHo1 은 PRD 및 MHD 도메인 사이의 위치 및 F-BAR및 PRD 사이의 위치에서도 절단되는 것을 확인하였다. 즉 추정되는 절단 위치에 의해 나뉘는 FCHo1의 부위는 F-BAR 도메인 (F-BAR), PRD (프롤린-풍부 도메인(proline-rich domain)), mu 상동 도메인 (mu homology domain; MHD)이다.
실시예 2. 중앙체에 특이적으로 위치하는 FCHo1 단백질 절편확인
절단된 FCHo1 단밸질 절편이 다른 서브 세포성 위치를 갖는지 여부를 확인하기 위하여 FCHo1 에 대한 다른 위치를 표적화하는 4개의 항체 (92-242aa, 285-364aa, 468-517aa, 또는 584-804aa) 를 사용하였고, CLSM(confocal laser scanning microscopy)을 이용하여 FCHo1의 현미경 이미지를 얻었다. Mitosis-synchronized A549세포를 4개의 다른 FCHo1 항체 및 Hoechst 33342 (DNA 염색)을 이용하여 염색하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, α584-804는 세포 분열의 마지막 단계에서 두개의 딸세포를 연결하는 무릎 관절-유사 구조와 같은 중앙체를 염색시킨 반면, 다른 FCHo1 항체(α92-242 및 α468-517)는 ICB를 염색시켰다. 즉 FCHo1은 위치 특이적 절단이 이루어지며 절단 부위 중 584-804aa 를 포함하는 절편들이 중앙체에 특이적으로 위치하는 절편임을 확인하였다.
실시예 3. FCHo1을 절단하는 단백질 분해 효소의 확인
특이적 단백질 분해 효소가 FCHo1을 절단하는지 여부를 확인하기 위하여, 단백질 분해효소 억제제인 1 μM 의 MG132를 16시간 동안 처리하였다. MG132 분해효소 억제제의 존재 또는 부존재 하에서 A549 세포 추출물의 면역블랏을 수행하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, MG132 처리군은 완벽하게 FCHo1 절단 형태가 사라지도록 하였으며, 이는 FCHo1의 절단이 특이적 단백질 분해효소에 의해 영향을 받는다는 것을 의미한다. 그 후 FCHo1 아미노산 서열을 PROSPER(https://prosper.erc.monash.edu.au)를 이용하여 분석하였다. 인상적이게도 분석 결과는 MMP-9 (matrix metallopeptidase 9) 가 Arg 563(R563) 위치에서 FCHo1을 절단할 수 있음을 예측하였다 (도 6). 이러한 결과에 입각하여 MMP-9이 FCHo1의 R563 위치에 결합하고 활성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 야생형(wt), 또는 563-564 또는 531-589aa 가 결실된 FCHo1 (Δ563-564 또는 Δ531-589) 에 대하여 유사분열 시 FLAG 항체를 이용한 면역침강을 수행하였다. 그후 MMP-9에 대하여 자이모그래피(zymography)를 수행하였으며 그 결과를 도 7에 나타내었다. 또한 중앙체 형성에서 FCHo1(584-804) 및 MMP-9의 PLA(proximity ligation assay) 를 수행하였으며 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 자이모그래피(Zymography) 는 FCHo1 의 결실 돌연변이 Δ563-564 및 Δ531-589 에서 MMP-9의 활성이 야생형과 비교하여 억제되어 나타난다는 것을 입증한다. 또한 도 8에 나타낸 바와 같이 중앙체에서 FCHo1 및 MMP-9는 서로 분명하게 상호작용함을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 FCHo1의 R563 위치가 MMP-9 단백질 분해효소에 의해 절단됨을 나타낸다.
실시예 4. 세포 분열 단계에 따른 FCHo1 및 이의 절편의 위치 확인
절단된 FCHo1 절편의 위치를 중앙체 형성 중간에 확인하기 위해서, 두개의 FCHo1 항체들 (α468-517 또는 α584-804)을 R563 위치에서 FCHo1의 절단된 N 말단(NT) 또는 C 말단(CT) 을 관찰하기 위하여 사용하였다. 중앙체 형성과 관련된 위치를 확인하기 위한 목적으로 유사분열의 후기 및 중앙체가 형성된 이후인 말기에서 FCHo1 절편의 위치를 확인하였다. SIM(Structured-illumination) 이미지를 세포 분열의 말기에 면역염색을 통해 얻었다. 또한 세포 분열의 말기 및 후기로 진행하며 각각의 절편이 위치 및 이동을 확인하기 위하여 siRNA 저항성 FCHo1 구조체인 이소성의 Δ563-564 단백질을 발현시키고 이소성의 FCHo1 에서 α468-517 또는 α584-804에 의한 FCHo1 절편의 위치를 확인하였다. 이와 같은 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 유사분열의 후기 단계에서, α468-517 및 α584-804는 모두 중심 방추사를 염색시켰다, 반면 중앙체가 형성된 이후인 말기에서는 α584-804가 중앙체를 염색하는 반면, α468-517는 ICB를 염색시켰다. 흥미롭게도, α468-517 는 정상 FCHo1을 갖는 세포의 후기에서는 ICB를 염색시켰음에도 이소성 Δ563-564 발현의 말기에서는 중앙체 영역을 염색시켰다. 그러나, α584-804 의 경우, 정상 FCHo1과 동일하게 이소성의 FCHo1 Δ563-564에도 변화없이 중앙체에 남아있었다. 이와 같은 결과는 FCHo1이 말기 동안에는 중심방추사에 위치하지만 세포 분열이 진행되면서 FCHo1 의 R563가 MMP-9에 의하여 중앙체 형성 동안에 절단되며, 이에 따라 CT 절편은 중앙체에 남아있게 되는 반면, NT 절편은 ICB 에 위치한다는 점을 보여준다.
실시예 5. FCHo1의 중앙체 특이적 위치 및 세포분열 진행에 따른 위치 확인
FCHo1이 위치하고 있는 중앙체의 나노 구조를 분석하기 위하여, FESEM (Field emission scanning electron microscopy) 및 TEM 분석을 수행하였고 그 결과를 도 10에 나타내었다. TEM에서 FCHo1 항체(α584-804) 가 면역-골드 라벨링을 통한 비히클 내 FCHo1 존재 검출을 위해 사용되었다. 또한 FCHo1 항체 (α584-804) 또는 칼모듈린 1을 이용한 SRM(Super-resolution microscopy)을 수행하여, FCHo1의 위치를 추가적으로 확인하였으며, 세포 분열 동안 대표적인 CLSM 이미지를 도 11에 나타내었다. A549세포는 FCHo1 항체(α584-804), 칼모듈린 항체, 및 Hoechst 33342 (DNA 염색)을 통해 염색되었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 전자 응축 구조인 중앙체는 어둡게 염색되었으며, 중앙체 및 ICB에 비히클이 풍부하게 존재한다는 것을 나타내었다(a, b). 또한 α584-804-골드는 중앙체의 경계에서 다수 염색되었으며(c, Post-embedding), 비히클의 세포막을 염색하였다(d, Pre-embedding). SRM(Super-resolution microscopy) 은 또한 FCHo1이 중앙체의 경계에 모인다는 것을 보여준다(e).
도 11에 나타낸 바와 같이, 항체 α584-804에 의해 검출되는 FCHo1은 세포 분열이 진행되는 동안 중앙체가 형성되는 동안 강하게 나타나고 세포질 분열이 일어나 절단이 되는 순간까지 중앙체에 지속적으로 존재한다는 것을 확인하였다.
실시예 6. FCHo1의 Akt1 기질 모티프 확인 및 절단 특성
도 12에 나타낸 바와 같이, FCHo1 내부에는 Ser155 (S155) 및 Ser570 (S570) 와 같은 2개의 Akt1 결합 모티프가 존재하며 이는 마우스 FCHo1에서 보존 부위인 것으로 나타났다. Akt1이 s570의 RxRxxS 모티프에 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 내생적 Akt1 의 공동-면역침강법을 항-3xFLAG-융합된 부분적 FCHo1 구조체(562-889 또는 582-889) 발현에 대한 FLAG 항체를 이용하여 수행하였으며, 추가적으로 FCHo1의 150-155 결실 돌연변이(F-BAR Δ150-155)에 대한 공동 면역침강법을 이용하여 Akt1 의 결합 부위를 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 562-889 는 Akt1에 결합하였으나, RxRxxS 가 결실된 582-889는 Akt1에 결합하지 않았고, 이는 FCHo1의 565-570aa 부위 (RSRKVS)가 Akt1 기질의 모티프에 해당됨을 나타낸다(a). 또한 F-BAR Δ150-155를 이용한 공동-면역침강 결과 Akt1이 F-BAR 도메인 (1-268aa) 에 결합한다는 것을 확인하였고, 이의 결실 F-BAR Δ150-155에서도 Akt1 결합이 약하게 관찰됨으로써, F-BAR 도메인의 Akt1 결합 모티프가 제거될지라도 Akt1 은 F-BAR Δ150-155와 어느정도는 상호작용을 하며, 이는 F-BAR 도메인이 호모다이머를 가지고 있음을 나타낸다(b). FCHo1 의 Akt1 인산화 부위 및 중앙체 및 ICB에서의 위치를 도 14 에 나타내었다.
FCHo1이 자가 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, C-말단 HA-융합 또는 FLAG-융합 FCHo1 (FCHo1-HA 또는 FCHo1-FLAG), FCHo1 siRNA 를 공동 형질감염시키고, FCHo1-FLAG에 대한 항-FLAG 항체를 이용하여 FCHo1-HA의 co-IP를 수행하였으며, 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 흥미롭게도 FCHo1-FLAG 는 전장 FCHo1-HA와 결합한 반면, FCHo1-FLAG는 FCHo1-1HA의 CT-절편(564-889aa)과 결합하지 않았다. 그러므로 이러한 결과는 F-BAR 도메인에 관련된 NT 절편이 FCHo1의 이량체 또는 다량체화에 중요하다는 것을 보여준다.
항-FLAG 항체를 이용한 Akt1 의 공동-면역 침강을 수행하였다. A549 세포가 전장-FCHo1, 절단된75kDa CT 절편, 절단된 38kDa CT 절편으로 형질감염되었으며, 분석 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 38kDa-CT 절편은 간기 동안에 풍부하게 관찰되었으나, 세포 분열(mitosis) 동안에는 약하게 검출되고 새로운 절단된 75kDa CT 절편이 세포 분열 동안에 더욱 분명하게 나타나는 것을 확인하였다. 도면 내 붉은 별표는 75kDa의 C-말단 절편(F-BAR 절단)이 검출되지 않음을 나타낸다.
이러한 결과는 세포분열 동안에 R563의 절단이 간기 동안에 더 적게 발생한다는 것 및 75kDa CT-절편 밴드가 관찰된다는 것을 나타낸다. Glu269 (E269)에서 FCHo1이 절단되었다면, 3xFLAG (3kDa) 를 포함하는 CT 절편은 약 74kDa이다. 상기 74kDa는 F-BAR 도메인이 없는 269-889-3xFLAG 의 75kDa 밴드와 유사한 것으로 확인하였으며, 이는 F-BAR 도메인이 유사분열 동안에 절단됨을 나타낸다.
실시예 7. FCHo1 및 Akt1의 중앙체에서의 위치 및 상호작용
면역형광법 및 PLA 분석법에 의해, F-BAR 도메인이 ICB 내 및 원형질막의 Akt1 에 결합하는지 여부 및 FCHo1 및 Akt1의 중앙체에서의 상호작용을 확인하였다. 중앙체에서 FCHo1 및 Akt1 의 SIM 이미지를 확인하였으며, 중앙체를 확대하여 관찰하였다. FCHo1 및 Akt1의 중앙체에서의 상호작용은 PLA를 통해 확인하였으며, 칼모듈린1을 ICB 마커로 사용하였다. 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, α-192-242는 ICB를 염색하는 반면, α-584-804는 중앙체에서 염색되는 것으로 나타났다. 즉 Akt1 과 F-BAR가 함께 위치하고 있으나, CT-절편은 중앙체에서 Akt1과 결합한다는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 F-BAR 및 CT 절편이 다른 세포 위치, 즉 ICB 또는 중앙체에 위치하여 작용한다는 점을 나타내며 Akt1은 ICB 또는 중앙체에 위치하는 두 개의 F-Bar 또는 CT 절편의 각각의 Akt1 모티프에 각각 결합할 수 있음을 확인하였다. 그러므로, F-BAR 도메인(1-268)이 FCHo1 (1-889) 로부터 절단되고 F-BAR(1-268) 가 유사분열 동안에 ICB에 위치할 것으로 생각하였다. F-BAR 도메인은 유사분열 동안의 PM(Pleckstrin homology) 내의 Akt1과 관련이 있을 것으로 보이며, 기능은 세포내 분열 경로와 관련이 있을 것을 생각된다.
실시예 8. FCHo1 S570A 돌연변이에 의한 FCHo1의 절단 억제
FCHo1의 R563 절단 부위를 발견하였고, 이것은 FCHo1의 Akt1 결합 모티프(565-570aa)과 인접하게 위치하고 있다. S570 에서 FCHo1의 인산화를 파괴하기 위하여 FCHo1 S 570A 돌연변이 구조체를 제조하였다. 이와 같은 S570A 돌연변이 구조체에 대한 SIM 이미지는 FCHo1 항체 (α468-517)로 중앙체에서 염색하여 확인하였다. A549 세포는 야생형 FCHo1 또는 FCHo1 돌연변이(S570A)에 대하여 관찰하였다. 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, S570A 돌연변이는 FCHo1 항체의 염색을 ICB에서 중앙체로 변경시켰다. R563에서 절단된 FCHo1의 NT 절편을 검출하였다. 이러한 변화는 이전 실시예 3 에서 확인된 Δ563-564가 563R에서 FCHo1의 절단을 억제하는 것과 유사하다. 그러므로 FCHo1의 R563 부위에서의 절단은 Akt1 의존적인 것으로 생각된다.
실시예 9. FCHo1와 14-3- 3ζ 의 상호 결합 및 중앙체 형성에 대한 영향 확인
14-3-3ζ는 MKLP1 kinesin-6 및 CYK4 RhoGAP로 구성된 헤테로테트라머이며, 이들은 각각 인간 MKLP1 및 RACGAP1의 상동분자로 알려져 있다. 중앙 방추사는 중앙체의 형성 및 유지를 위해 기능한다. 14-3-3ζ 는 중앙체 유래 RACGAP1/MKLP1 복합체의 분산 단백질이다.
FCHo1의 상호작용 파트너가 14-3-3ζ 인지 여부를 확인하기 위하여 항-FLAG항체를 이용하여 공동-면역침강법을 수행하였다. A549 세포는 전장 FCHo1, 절단된 FCHo1, 14-3-3ζ로 형질감염되었다. 형질감염된 세포들은 유사분열 또는 간기에서 확인하였으며, 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, FCHo1와 14-3-3ζ 의 결합이 확인되었으며, 이러한 결합은 간기보다 유사분열(mitosis) 단계에서 증가하였다. 또한 PLA 분석을 통해 중앙체에서 FCHo1에 14-3-3ζ이 결합한다는 것을 입증하였다.
FCHo1에 대한 14-3-3ζ의 추정적 결합 부위인 407-421aa를 검증하기 위하여, FCHo1 Δ407-421 구조를 제조하고 항-FLAG 항체를 이용한 14-3-3ζ 및 Akt1의 공동-면역 침강을 수행하였다. 형질감염 세포를 유사분열 시기에 관찰하였다. 또한 PLA 분석을 통해 중앙체에서 FCHo1(584-804)와 14-3-3ζ의 상호작용을 확인하였다. 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, Δ407-421는 FCHo1 에 대한 14-3-3ζ 의 결합을 억제하였다(a). 또한 PLA 실험결과는 중앙체에서 FCHo1(584-804)와 14-3-3ζ가 결합함을 나타냈다(b).
또한 도 21에 나타낸 바와 같이 Δ407-421 은 유사분열에서 중앙체의 형성을 강력하게 파괴하였다. 이는 14-3-3ζ이 FCHo1의 407-421aa와 결합하고 이 결합은 중앙체 형성에 필수적이라는 것을 나타낸다.
야생형 FCHo1 또는 FCHo1 Δ563-564 발현 A549 세포의 중앙체 이미지의 SIM 이미지를 추가적으로 확인하였다. 세포를 FCHo1 (α584-804), 14-3-3ζ, MKLP1, 및 RACGAP1 항체로 염색하였다. 중앙체 영역을 확대하여 관찰하고 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 중앙체에서 α14-3-3 ζ 가 Δ563-564을 FCHo1보다 더 강하게 염색시킨다는 것을 확인하였다. 또한 Δ563-564 는 중앙체의 MKLP1/RACGAP1의 안정한 클러스터링을 격리시켰다. 이러한 결과는 R563 부위에서의 FCHo1 절단의 손상이 중앙체에서 14-3-3ζ의 축적을 유발하며 14-3-3ζ 의 축적이 MKLP1/RACGAP1 복합체의 비정상적인 클러스터링을 막도록 이끈다는 것을 나타낸다.
실시예 10. FCHo1의 과발현에 의한 중앙체 연관 단백질 발현 변화
FCHo1의 과다발현에 의하여 뚜렷하게 상향 또는 하향으로 조절되는 단백질을 질량 분석을 통해 분석하였다. FCHo1을 과다발현시킨 A549 세포에서 세포 주기-연관 단백질 군의 변화를 프로테오믹스 분석을 통해 확인하였으며, 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23에 나타낸 바와 같이, FCHo1의 과다발현은 세포주기 연관 단백질 군을 하향 발현되도록 하며, 반대로 미토콘드리아 전자전달-관련 단백질 군의 단백질을 상향 조절 시킨다는 것을 보여준다(a). 모든 중앙체 위치 단백질은 FCHo1의 과다발현에 의해 조절되었다(b). 이를 통해 FCHo1이 중앙체 연관 단백질을 조절한다는 것을 확인하였다.
동기화 방법(synchronization method)을 이용한 분석에서 세포들은 중앙 방추사 또는 중앙체 형태 분석을 위하여 MKLP1 항체로 염색되었다. 후기 (중앙 방추사) 및 말기(중앙체) 의 세포의 비율은 CLSM 이미지를 통해 정량화 하였다: FCHo1 siRNA (n=318), wt FCHo1 (n=702), FCHo1 Δ563-564 (n=756), FCHo1 Δ531-589 (n=1952). 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타낸 바와 같이, Δ563-564 단백질은 야생형 FCHo1 단백질과 비교하여 중앙체의 형성을 억제하였다.
상기와 같은 결과를 토대로 FCHo1은 새로운 중앙체 조절자임을 새롭게 확인하였다. FCHo1은 단백질 분해 효소에 의해 위치 특이적으로 절단되며, 위치 특이적 절단의 단편들은 중앙체 또는 ICB로 다르게 이동한다. 키나아제로 알려진 Akt1은 FCHo1을 S155 및 S570에서 인산화시킨다. S570에서 인산화는 FCHo1을 절단하기 위해 중요하며, S570의 인산화는 R563 절단 의존적인 Akt1 에 의해 인산화된다. R563-564 결실 돌연변이는 중앙체 형성이 억제되고, 중심방추사(centralspindlin)의 구성요소로 알려진 RACGAP1 및 MKLP1을 불안정하게 형성한다. FCHo1의 절단은 중앙체에서 14-3-3ζ 의 축적을 막도록 유도한다. 이것은 MKLP1/RACGAP1 복합체의 안정성을 유지시키며 이를 통해 FCHo1은 중앙체 형성을 조절한다. 407-421aa 결실 돌연변이는 중앙체 형성을 폐치하였으며, 이는 14-3-3ζ와 FCHo1의 결합이 중앙체 형성에 필수적임을 의미한다. 중앙체 단백질 FCHo1은 중앙체 기능에 있어서 필수적이며, FCHo1의 위치 특이적 절단의 조절을 통해 중앙체 형성을 효과적으로 조절할 수 있다.
실시예 11. FCHo1 조절을 통한 항암 효과 확인
11.1 FCHo1 결실 및 돌연변이형에 의한 종양 크기, 부피 감소 확인
FCHo1의 전장, 돌연변이 형태 및 결실 형태에 대한 렌티바이러스 벡터를 제작하고, 비침습적인 에어로졸 방식으로 폐암 모델 마우스에 전달한 후 이의 항암 효과를 확인하였다. 실시예 8에서 인간세포에서 FCHo1의 절단에 관여하는 부위가 FCHo1S570A 및 FCHo1del563 -564임 확인하였으므로, 마우스 FCHo1 에서 대응 위치를 확인하였으며, S570A 는 S554A, del563-564 는 del544-545에 해당됨을 확인하였다. 이를 토대로 렌티바이러스 벡터를 제작하였으며 9주령 K-ras 암컷 마우스에 4주간 총 8회를 흡입 노출을 하였을 때 항암 효과를 비교하였고, 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타낸 바와 같이 총 종양의 수는 FCHo1S554A, FCHo1del544 -545에서 유의성 있게 감소하였다 (n=7). 또한 종양 부피를 관찰한 결과, FCHo1S554A은 FCHo1wt과 비교하여 유의성 있는 부피의 감소를 나타냈으며, FCHo1del544 -545 역시 부피가 감소되었음을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 FCHo1 의 돌연변이 및 결실형태의 경우 중앙체 형성의 억제 등을 통해 종양이 억제될 수 있음을 알 수 있다.
11.2 FCHo1 절단억제에 따른 병리분석
H&E 슬라이드를 제작하고, 아데노마(adenoma)와 과형성(hyperplasia)이 감소되는지 여부를 확인하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. FCHo1 절단 억제를 위하여 shFCHo1을 이용하였으며 이의 서열은 도 26에 기초하여 서열번호 1 내지 4에 나타내었고, 이 중 서열번호 2의 shmFCHo1이 가장 FCHo1 억제 효과가 크므로 이를 이용하여 실험을 수행하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2016013304-appb-I000001
표 1에 나타낸 바와 같이, FCHo1의 결실형 및 돌연변이 군에서는 대조군과 비교하여 유의성있는 수준의 아데노마 및 과형성의 억제가 관찰되었다. 이를 통해 FCHo1의 정상적인 절단 억제가 세포 분열에 이상을 유발하고 이를 통해 분화가 억제 되어서 항암 효과가 나타날 수 있음을 확인하였다.
11.3. 폐암 조직에서 FCHo1 절단 감소 확인
인간시료의 정상 조직 및 1,2,3기 폐암 조직에서 FCHo1 절단의 변화를 확인하였다. FCHo1의 발현양은 FCHo1의 MHD 도메인 부위를 일부 포함하는 584-804aa를 타깃으로 검출하는 항체를 이용하여 검출하였다. 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타낸 바와 같이, 폐암 조직에서는 정상 폐 조직과 비교하여 FCHo1의 25kDa 이하의 절편이 눈에 띄게 감소되거나 사라지는 것을 확인하였다. 이 절편을 질량분석기로 분석하여 FCHo1의 642-665aa를 포함하고 있는 결과를 얻었다. 이는 Arg563이 절단되어 생긴 것이다. 이러한 결과는 폐암조직이 유사 분열 시기에 있기 때문임을 반영하며, FCHo1의 절편이 정상 개체와 비교하여 보이지 않거나 적은 것은 이용하여 FCHo1 의 절편을 암의 마커로 사용할 수 있음을 의미한다.
실시예 12. FCHo1 결합 사이트를 이용한 펩타이드 항암 치료제 개발
Akt1의 모티프를 가진 FCHo1 아미노산 서열 유래의 펩타이드들과 Akt1과의 결합 친화도를 확인하기 위해 펩타이드들에 바이오틴을 접합하여 합성하였다. 스트랩타비딘이 접합된 플레이트에 펩타이드들을 반응시켜 붙인뒤 세포의 lysate를 처리한 후 Akt1 항체로 펩타이드와 Akt1의 결합 친화도를 확인하였다. FCHo1 결합 사이트에서 유래된 각 펩타이드에 따른 in vitro 수준의 Akt1 결합 친화도를 확인한 결과 및 과정을 도 28에 나타내었다.
도 28에 나타낸 바와 같이, FCHo1의 562-571번 (RRLRSRKVSC)과 FCHo1의 560-571번 (PPRRLRSRKVSC) 펩타이드들에서 Akt1 결합친화도가 크게 상승했다. 이들은 Akt1 바인딩 모티프를 포함하고 있다. 펩타이드 치료제 개발의 목적은 Akt1, MMP9, 14-3-3에 대한 FCHo1 결합사이트 유래 짧은 펩타이드들로 하여금 FCHo1 결합파트너에 경쟁하는 안타고니스트 (Antagonist)를 발굴하는 것이다. 따라서 이들은 FCHo1의 절단을 억제하거나 인산화를 억제하거나 결합파트너의 결합을 억제할 것으로 예상되어 펩타이드 항암 치료제 개발에 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.
실시예 13. 펩타이드의 세포내 흡수 확인
바이오틴이 접합된 펩타이드들을 세포에 처리하고 세포를 고정시켜 스트랩타비딘-488 형광다이를 반응시킨후 CLSM으로 관찰하였으며 그 결과를 도 29에 나타내었다.
도 29에 나타낸 바와 같이 560-571번 (PPRRLRSRKVSC) 펩타이드는 농도 의존적으로 세포내 흡수가 증가하는 것을 확인하였다. 펩타이드 치료제의 한계점은 펩타이드의 극성 (chrage), 친수성과 같은 펩타이드의 성질에 의해 세포내 흡수가 잘 되지 않을 수 있어 캐리어를 쓰거나 Myristic acid를 펩타이드에 접합시켜야 한다는 것이다. 그러나 560-571 펩타이드의 경우 펩타이드 자체가 세포에 흡수가 잘 되기 때문에 펩타이드 치료제의 한계를 극복할 수 있는 장점이 있다. 이는 별도의 CPP(Cell Penetrating Peptide- 세포 투과 펩타이드) 와 캐리어의 접합을 요구하지 않고 펩타이드 자체가 세포막을 투과할 수 있다는 것을 보여주는 것이며, 효율성 높은 치료제로서 가치가 있음을 나타낸다.
실시예 14. 펩타이드에 의한 세포 생장률 변화 확인
세포생존률을 실시간으로 관찰하기 위해 Xcelligence를 사용하여 측정하였으며, 펩타이드들은 10μM로 처리되었다. 560-567, 562-571, 560-571 펩타이드에서 세포생장의 억제 효과를 확인하였으며 그 결과를 도 30에 나타내었다.
도 30에 나타낸 바와 같이, 560-567, 562-571, 560-571 펩타이드 모두 세포 생장의 억제 효과를 나타냈으며 특히 560-571 (PPRRLRSRKVSC) 펩타이드는 Akt1과의 결합친화력과 세포내 흡수력이 동시에 좋은 결과를 반영하듯 세포 생장 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다. 이에 따라 FCHo1의 Akt1 결합모티프와 14-3-3 결합사이트는 펩타이드 항암제 및 케미칼의 개발을 위한 좋은 타겟사이트가 될 것으로 확인하였다.
제제예 1. 의약품의 제조
1.1 산제의 제조
FCHO1 활성 조절제 100mg
유당 100mg
탈 10mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1.2 정제의 제조
FCHO1 활성 조절제 100mg
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1.3 캡슐제의 제조
FCHO1 활성 조절제 100mg
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 정제를 제조한다.
1.4 주사제의 제조
FCHO1 활성 조절제 100mg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1.5 액제의 제조
FCHO1 활성 조절제 100mg
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1,00ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims (26)

  1. FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 세포 분열 조절용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 활성 조절제는 FCHo1의 활성 촉진제 또는 활성 억제제인, 세포 분열 조절용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제는 중앙체(midbody)의 형성 조절용인, 세포 분열 조절용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 FCHo1의 활성 억제제는 FCHo1의 위치 특이적 절단을 억제하는 것인, 세포 분열 조절용 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 FCHo1 활성 억제제는 FCHo1 인산화 억제제인, 세포 분열 조절용 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 FCHo1 활성 억제제는 14-3-3ζ 과 FCHo1사이의 결합 억제제인, 세포 분열 조절용 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 FCHo1 활성 억제제는 FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열인, 세포 분열 조절용 조성물.
  8. 제7항에 있어서 상기 FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열은 FCHo1 서열 중 MMP-9(matrix metallopeptidase 9) 에 의해 절단되는 서열에 변이가 일어난 것을 특징으로 하는, 세포 분열 조절용 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열은 FCHo1의 서열 중 Akt1에 의한 인산화 부위에 변이 또는 결실이 일어난 것인, 세포 분열 조절용 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 FCHo1의 변이체 또는 FCHo1의 결실 서열은 FCHo1의 서열 중 14-3-3ζ 과의 결합 부위에 변이 또는 결실이 일어난 서열인, 세포 분열 조절용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 세포는 암 세포인, 세포 분열 조절용 조성물.
  12. FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 세포 분열 조절제.
  13. FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는 배지 조성물.
  14. 세포 내 FCHo1 (FCH domain only 1) 를 검출하는 단계; 를 포함하는 세포 분열능에 대한 정보를 제공하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 검출은 FCHo1의 절단, FCHo1의 인산화 및 FCho1 절편의 중앙체로의 이동으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하는 것인, 세포 분열능에 대한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 세포 분열능에 대한 정보는 중앙체 형성능에 관한 것인, 세포 분열능에 대한 정보를 제공하는 방법.
  17. FCHo1 (FCH domain only 1) 의 활성을 조절하는 단계; 를 포함하는 인간의 제외한 동물 세포의 분열능을 조절하는 방법.
  18. 생체 외(in vitro)에서 FCHo1 (FCH domain only 1) 의 활성을 조절하는 단계; 를 포함하는 세포의 분열능을 조절하는 방법.
  19. FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암은 B-림프아구(B-lymphoblast), 골수암, 근육암, 난소암, 골암, 안암, 폐암, 췌장암, 태반암, 피부암, 대장암, 위암 및 정소암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서 상기 FCHo1 활성 조절제는 암세포의 세포 분열을 억제하는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. FCHo1 (FCH domain only 1) 활성 조절제를 포함하는, 암 치료제.
  23. FCHo1 (FCH domain only 1) 단백질 절편을 검출하는 단계;를 포함하는 개체의 암 진단에 대한 정도를 제공하는 방법.
  24. FCHo1 (FCH domain only 1) 단백질 절편 검출 제제를 포함하는 암 진단용 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 FCHo1 단백질 절편 검출 제제는 FCHo1 단백질 절편 특이적 항체인, 암 진단용 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 FCHo1 단백질 절편은 Arg 563 위치가 절단되어 형성된 것인, 암 진단용 조성물.
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