WO2017082430A1 - 高純度フルオレセインナトリウム - Google Patents

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sodium
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butanol
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敦嗣 大野
健二 川島
悟功 山本
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参天製薬株式会社
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
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    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
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    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
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    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/28—Pyronines ; Xanthon, thioxanthon, selenoxanthan, telluroxanthon dyes

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying sodium fluorescein, high-purity sodium fluorescein and a method for producing the same.
  • fluorescein sodium has been widely used as a diagnostic reagent in ophthalmology. Fluorescein eye drops are effective in diagnosing dry eye, corneal abrasions, ulcers, corneal herpes, etc., and fluorescein contrast agents are used to identify age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, intraocular inflammation, and the like.
  • fluorescein sodium has a low purity for use as a pharmaceutical product, and therefore it is required to increase the purity by purifying it to obtain a pharmaceutical grade.
  • Patent Document 1 commercial grade fluorescein sodium is converted to O, O'-diacetylfluorescein, then converted to O, O'-diacetylfluorescein and returned to fluorescein to form a sodium salt, and the final impurities Has been disclosed to prepare substantially pure fluorescein.
  • the method for preparing fluorescein disclosed in Patent Document 1 is a method for preparing fluorescein accompanied by a change in chemical structure, and is not a method for directly obtaining sodium fluorescein.
  • the present invention relates to a method for purifying fluorescein sodium, a method for producing fluorescein sodium or high purity fluorescein sodium substantially free of organic solvents, sodium fluorescein or high purity fluorescein sodium substantially free of organic solvents, and substantially
  • An object of the present invention is to provide an ophthalmic diagnostic reagent containing sodium fluorescein or high-purity sodium fluorescein that does not contain an organic solvent.
  • the present inventors added 2-propanol or 2-butanol to an aqueous solution in which sodium fluorescein to be used for purification was crystallized to crystallize sodium fluorescein, thereby containing substantially no organic solvent and having a purity of It has been found that fluorescein sodium exceeding 99.5% can be obtained, and the present invention has been completed. Specifically, the present invention provides the following.
  • the present invention is a method for purifying sodium fluorescein comprising adding 2-propanol or 2-butanol to an aqueous solution in which sodium fluorescein is dissolved to crystallize sodium fluorescein.
  • the present invention also relates to fluorescein sodium having a purity exceeding 99.5%, comprising adding 2-propanol or 2-butanol to an aqueous solution in which commercial grade sodium fluorescein is dissolved to crystallize fluorescein sodium. It is a method of manufacturing.
  • the present invention also provides a fluorescein containing substantially no organic solvent, comprising adding 2-propanol or 2-butanol to an aqueous solution in which commercial grade sodium fluorescein is dissolved to crystallize sodium fluorescein.
  • a method for producing sodium comprising adding 2-propanol or 2-butanol to an aqueous solution in which commercial grade sodium fluorescein is dissolved to crystallize sodium fluorescein.
  • the present invention is the method according to any one of (1) to (3), wherein the aqueous solution contains ethanol or methanol.
  • the present invention includes a step of adding methanol or ethanol to fluorescein sodium, a step of adding water to the solution obtained in the step to obtain an aqueous solution, a step of adding 2-propanol or 2-butanol to the aqueous solution, And crystallization of sodium fluorescein in the aqueous solution after addition of the 2-propanol or 2-butanol.
  • the present invention also includes a step of adding methanol or ethanol to commercial grade sodium fluorescein, a step of adding water to the solution obtained in the step to obtain an aqueous solution, and 2-propanol or 2-butanol in the aqueous solution.
  • the present invention also includes a step of adding methanol or ethanol to commercial grade sodium fluorescein, a step of adding water to the solution obtained in the step to obtain an aqueous solution, and 2-propanol or 2-butanol in the aqueous solution.
  • a method for producing sodium fluorescein substantially free of organic solvent comprising the steps of adding and crystallizing sodium fluorescein in the aqueous solution after adding the 2-propanol or 2-butanol.
  • the present invention provides the method according to any one of (1) to (7), wherein the temperature of the aqueous solution after adding 2-propanol or 2-butanol is 5 ° C. to 75 ° C. Is the method.
  • the present invention also includes operations / steps of separating the crystallized sodium fluorescein from the aqueous solution after adding the 2-propanol or 2-butanol and drying the solution. Any one of the methods.
  • the present invention is the method according to any one of (1) to (5), which involves a dust removal operation.
  • the present invention is sodium fluorescein having a purity exceeding 99.5%.
  • the present invention is sodium fluorescein substantially free of an organic solvent.
  • the diffraction angle (2 ⁇ ⁇ 0) is assumed when the peak intensity at the diffraction angle (2 ⁇ ⁇ 0.2 °) of 16.9 ° is 100%. .2 °) has a diffraction peak with a relative intensity of 25% or more at 26.4 °, and has a peak with a relative intensity of 25% or more at a diffraction angle (2 ⁇ ⁇ 0.2 °) of 7.0 ° or less. There is no fluorescein sodium.
  • the present invention is an ophthalmic diagnostic reagent comprising the fluorescein sodium according to any one of (11) to (13).
  • the present invention also relates to the use or application of sodium fluorescein according to any one of (11) to (13) for the manufacture of a reagent for ophthalmic diagnosis or diagnosis of an eye disease.
  • the present invention also relates to the use or application of fluorescein sodium according to any one of (11) to (13) for producing an ophthalmic diagnostic reagent or an eye disease diagnostic reagent.
  • the present invention is fluorescein sodium according to any one of (11) to (13) for use as an ophthalmic diagnostic reagent or an eye disease diagnostic reagent.
  • the present invention is the use or application of fluorescein sodium according to any one of (11) to (13) for ophthalmic diagnosis or diagnosis of an eye disease.
  • the present invention also relates to a method for making an ophthalmic diagnosis or a method for diagnosing an eye disease using the fluorescein sodium according to any one of (11) to (13).
  • the present invention also provides an ophthalmologic diagnosis by applying the fluorescein sodium according to any one of (11) to (13) to a subject in need of ophthalmic diagnosis or diagnosis of an eye disease. Or a method for diagnosing an eye disease.
  • the present invention is at least one diagnosis selected from the group consisting of keratoconjunctival disorder, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, and intraocular inflammation. , (14) to (20).
  • the present invention is the invention according to (21), wherein the keratoconjunctival disorder is at least one selected from the group consisting of dry eye, keratoconjunctival abrasion, ulcer, and corneal herpes.
  • the present invention is the invention according to any one of (14) to (17), wherein the reagent is an eye drop and / or a contrast agent.
  • the present invention is the invention according to any one of (14) to (22), wherein the sodium fluorescein is contained in an eye drop and / or a contrast medium.
  • a method of purifying fluorescein sodium a method of producing fluorescein sodium or high purity fluorescein sodium substantially free of organic solvent, fluorescein sodium or high purity fluorescein sodium substantially free of organic solvent, and There is an excellent effect that an ophthalmic diagnostic reagent containing sodium fluorescein substantially free of an organic solvent or high-purity sodium fluorescein can be provided.
  • a fluorescein sodium substantially free of an organic solvent or high purity fluorescein sodium may include high purity fluorescein sodium substantially free of an organic solvent.
  • Example 1 of this invention It is an external appearance photograph of the pharmaceutical grade fluorescein sodium obtained in Example 1 of this invention. It is an external appearance photograph of the reagent A (commercial grade sodium fluorescein) used in Example 1 of this invention.
  • the method for purifying sodium fluorescein of the present invention comprises adding 2-propanol or 2-butanol to an aqueous solution in which sodium fluorescein is dissolved to crystallize sodium fluorescein.
  • water is added to sodium fluorescein for purification to obtain an aqueous solution in which sodium fluorescein is dissolved, and 2-propanol or 2-butanol is added to the aqueous solution.
  • fluorescein sodium to be used for purification to obtain an aqueous solution in which sodium fluorescein is dissolved.
  • the fluorescein sodium dissolved in the aqueous solution is typically fluorescein sodium used for purification (usually a fluorescein sodium composition used for purification. The same applies hereinafter), which is expressed as follows.
  • Fluorescein sodium to be used for purification may be commercially available sodium fluorescein containing by-products, isomers, etc. generated during the synthesis of fluorescein, oxidation products, decomposition products, etc. in addition to fluorescein sodium, Purity is 99.5% or less, for example, 99.3% or less, 99.2% or less, usually about 90 to 97%, which is common in commercial products, specifically, 90.0% or more and 99.5% or less. 93.0% to 99.0%, 96.0% to 98.5%, more specifically 93.0% to 94.0% or 97.0% to 98.0%.
  • fluorescein sodium having a normal purity of 93.0% to 93.9% or 97.0% to 97.9%.
  • these commercially available sodium fluoresceins usually pure fluorescein sodium, are collectively referred to as “commercial grade fluorescein sodium”.
  • fluorescein sodium composition what contains sodium fluorescein as a compound and components other than this fluorescein sodium may be called "fluorescein sodium composition.”
  • the components other than the sodium fluorescein include impurities such as the above-mentioned by-products, isomers, oxidation products, and decomposition products, and also include water used for purification, 2-propanol, 2-butanol and the like. A solvent etc. are mentioned.
  • the purity of sodium fluorescein is the content of sodium fluorescein in the sodium fluorescein composition, and is obtained from analysis results analyzed under the conditions described later using high performance liquid chromatography (HPLC).
  • fluorescein sodium having a purity of more than 99.5% may be referred to as “high-purity fluorescein sodium”.
  • High purity fluorescein sodium typically includes pharmaceutical grade fluorescein sodium (usually a fluorescein sodium composition).
  • pharmaceutical grade fluorescein sodium means fluorescein sodium (usually a fluorescein sodium composition) with a purity of greater than 99.5%.
  • high purity fluorescein sodium substantially free of organic solvent can be obtained from commercial grade fluorescein sodium.
  • substantially no organic solvent means that the organic solvent contained in fluorescein sodium (usually a sodium fluorescein composition) is 0.5% by mass or less.
  • the content of the remaining organic solvent can be quantified based on the measurement result of nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR). In the nuclear magnetic resonance spectrum, heavy water is used as a solvent.
  • the mass% of ethanol and 2-propanol are calculated as follows: It can be calculated by a formula.
  • the step of obtaining the above-mentioned aqueous solution in which sodium fluorescein used for purification is dissolved is obtained by adding water and at least one selected from the group consisting of methanol and ethanol to sodium fluorescein used for purification.
  • the step of obtaining an aqueous solution in which is dissolved is preferable.
  • At least one selected from the group consisting of methanol and ethanol and water may be added substantially simultaneously to fluorescein sodium to be purified, but after adding the former, adding the latter water.
  • the step of obtaining the aqueous solution more specifically, after fluorescein sodium used for purification is dissolved in methanol or ethanol, the solution is filtered using a filter medium such as a glass filter, and preferably, the methanol or ethanol used earlier is used.
  • Water may be added to the filtrate obtained by washing with (1) or the filtrate concentrate (may be a wet solid), or the filtrate concentrate (may be a wet solid) or to a dry solid.
  • water may be added to the solution.
  • fluorescein sodium can be purified by adding 2-propanol or 2-butanol, which is a poor solvent, to this aqueous solution, aging and recrystallization.
  • the aging temperature is preferably 5 ° C. or higher and 75 ° C. or lower, more preferably 65 ° C. or higher (and 75 ° C. or lower) and then cooling to 15 ° C.
  • the aging time is preferably 1 hour or more, more preferably 3 hours or more and 24 hours or less, although it depends on the recovered amount.
  • the amount of 2-propanol or 2-butanol, which is a poor solvent, is preferably 5 v / w or more and 20 v / w or less, and more preferably 8 v / w or more and 10 v / w or less with respect to sodium fluorescein used for purification.
  • the addition amount of methanol or ethanol, which is a good solvent, is preferably 0 v / w or more and 3 v / w or less, more preferably 0.1 v / w or more and 2.0 v / w or less, with respect to sodium fluorescein used for purification.
  • the good solvent is not limited to methanol alone or ethanol alone, but may be a mixed solvent of methanol and ethanol.
  • the poor solvent is not limited to 2-propanol alone or 2-butanol alone, and may be a mixed solvent of 2-propanol and 2-butanol.
  • the amount of water (H 2 0) added is preferably 0.3 v / w or more and 2.0 v / w or less, and more preferably 1.3 v / w or more and 1.8 v / w or less.
  • the “solvent amount (v / w)” represents the volume (mL) of the solvent relative to the mass (g) of sodium fluorescein used for purification.
  • the dust removal operation is not particularly limited as long as the operation satisfies the production management and quality control standards (Good Manufacturing Practice), but rough filtration using a filter paper or microfiltration using a glass filter is more preferable.
  • the dust removal operation is preferably performed before or after recrystallization of sodium fluorescein prior to solid-liquid separation, and more preferably after aging and before recrystallization.
  • the above-described purification method is not limited to once, and the above-described purification method may be repeated twice or more in order to further increase the purity.
  • the number of repetitions is not particularly limited as long as it is within the above range, but is preferably 10 times or less, more preferably 8 times or less, and further preferably 5 times or less in terms of industrial properties and efficiency. preferable.
  • the sample wet solid that has been solid-liquid separated and washed (hereinafter referred to as the sample) into a container, leave it under humidification and heating, and then reduce the pressure. It may be dried.
  • the thickness of the sample is preferably 0.5 mm to 4 cm
  • the temperature is preferably 15 ° C. to 80 ° C.
  • the humidity is preferably 30% RH to 100% RH.
  • the standing time is preferably 5 hours to 48 hours, more preferably 10 hours to 20 hours.
  • the reduced pressure is preferably 0.01 MPa or less, and more preferably 0.005 MPa or less.
  • the drying temperature is preferably 30 ° C. or higher and 100 ° C. or lower, and more preferably 70 ° C. or higher and 90 ° C. or lower.
  • the method of producing sodium fluorescein or high-purity sodium fluorescein substantially free of an organic solvent according to the present invention is obtained by adding 2-propanol or 2-butanol to an aqueous solution in which commercial grade sodium fluorescein is dissolved to crystallize fluorescein sodium. Including.
  • This method is a method for producing fluorescein sodium or high-purity fluorescein which does not substantially contain an organic solvent under the same conditions as described in the above-described method for purifying fluorescein sodium.
  • pharmaceutical grade sodium fluorescein or high-purity sodium fluorescein substantially free of organic solvents can be produced from commercial grade fluorescein sodium.
  • Fluorescein sodium is represented by the following formula.
  • the purity of fluorescein sodium is quantified from the area percentage of the fluorescein sodium component (hereinafter sometimes referred to as HPLC purity) when analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Apparatus Waters HPLC (Waters 2998 Photodiode Array Detector, Waters e2695 Separations Module, SMC Column Heater) Column: XBridge C8 4.6 ⁇ 150 mm, 3.5 ⁇ m Column temperature: 45 ° C Detection wavelength: UV 280nm
  • Mobile phase A 1% aqueous acetic acid solution (pH 2.8)
  • Mobile phase B Methanol flow rate: 1.0 mL / min Clandent conditions: as shown in Table 1 below.
  • the high-purity fluorescein sodium of the present invention is characterized by containing substantially no organic solvent.
  • the content of the remaining organic solvent can be determined by measuring a nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR) and quantifying the content based on the measured nuclear magnetic resonance spectrum.
  • the amount of the organic solvent contained in fluorescein sodium (usually a fluorescein sodium composition) has been intensively studied by the present inventors, and as a result, has been found to depend on the crystal form of fluorescein sodium.
  • the crystalline form of high-purity sodium fluorescein that does not substantially contain an organic solvent of the present invention (hereinafter referred to as crystalline form A) has a crystalline form that hardly contains an organic solvent.
  • This crystal form A has a diffraction angle (2 ⁇ ⁇ 0.2 °) when the peak intensity at a diffraction angle (2 ⁇ ⁇ 0.2 °) of 16.9 ° is 100% in powder X-ray diffraction using CuK ⁇ radiation.
  • the value of the diffraction angle causes a measurement error of ⁇ 0.2 °.
  • the relative intensity of the diffraction peak at the diffraction angle (2 ⁇ ⁇ 0.2 °) of 26.4 ° may be 50% or more, or 70% or more.
  • the fluorescein sodium having the crystalline form A was subjected to X-ray diffraction under the following measurement conditions using a powder X-ray diffraction apparatus (RINT-Ultima III: manufactured by Rigaku Corporation).
  • Table 2 shows the powder X-ray diffraction data of crystal form A.
  • the aforementioned fluorescein sodium or high-purity sodium fluorescein substantially free of an organic solvent can be used as an ophthalmic examination reagent.
  • An ophthalmic examination reagent is usually a reagent for diagnosing an eye disease, and is also referred to as an ophthalmic diagnostic reagent.
  • the ophthalmic solution is effective for diagnosing keratoconjunctival disorders, such as dry eye, keratoconjunctival scratches, ulcers, and corneal herpes.
  • a contrast agent it is also effective in identifying age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, intraocular inflammation, and the like.
  • a method for making an ophthalmic diagnosis or a method for diagnosing an eye disease using fluorescein sodium or high-purity sodium fluorescein substantially free of an organic solvent is also one aspect of the present invention.
  • an ophthalmic diagnostic reagent containing fluorescein sodium or high-purity sodium fluorescein substantially free of an organic solvent is usually dropped onto the eye as an eye drop, and, for example, keratoconjunctive disorder is caused by staining yellowish green If it can be diagnosed as a contrast agent and dropped into the eye, for example, the state of a blood vessel can be grasped, and a lesion can be detected, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, intraocular inflammation, etc. Can be diagnosed.
  • Example 1 1 g of a commercially available sodium fluorescein reagent [reagent A] was added to 2 mL of special grade ethanol (concentration 99.5% by volume) and dissolved with stirring over 1 hour, and 1.4 mL of water was added and heated to 75 ° C. After adding 10 mL of special grade 2-propanol (concentration 99.7% by volume), it was stirred and cooled to 12 ° C. over about 18 hours. The precipitated solid was separated into solid and liquid under reduced pressure and washed 3 times with 1 mL of special grade 2-propanol. The resulting wet solid was dried at 80 ° C. under reduced pressure to obtain pharmaceutical grade sodium fluorescein (Crystal Form A, yield 35.7%). Depressurization was performed within the range of 0.1 kPa to 1 kPa (hereinafter the same).
  • Example 2 Pharmaceutical grade fluorescein sodium (Crystal Form A, Yield) was carried out in the same manner as in Example 1, except that a commercially available sodium fluorescein reagent [Reagent B] was used instead of [Reagent A] in Example 1. 44.1%) was obtained.
  • Example 3 Pharmaceutical grade fluorescein sodium (Crystal Form A, Yield) was carried out in the same manner as in Example 1, except that a commercially available sodium fluorescein reagent [Reagent C] was used instead of [Reagent A] in Example 1. 42.1%).
  • FIG. 1 shows a photograph of the pharmaceutical grade fluorescein sodium obtained in Example 1
  • FIG. 2 shows a photograph of commercial grade fluorescein sodium of Reagent A.
  • Example 4 A mixed solution of 20 g of commercially available sodium fluorescein (reagent D: purity 99.2%) and 200 mL of special grade ethanol (concentration 99.5% by volume) was stirred for 1 hour 15 minutes at room temperature, and then filtered with a glass filter filled with a filter aid. Filter and wash 4 times with 20 mL of special grade ethanol. The operation of concentrating and drying the filtrate under reduced pressure, adding 40 mL of special grade 2-propanol (concentration 99.7% by volume) and concentrating under reduced pressure were repeated three times.
  • Table 4 shows the mass of residual solvent quantified by nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR), purity quantified by high performance liquid chromatography (HPLC), and yield in Examples 4-1 to 4-17. Show.
  • 2-propanol is represented as “IPA”, ethanol as “EtOH”, and undetectable as “ND”.
  • Example 4-18 A 5 mL vial was filled with 0.59 g of the crystalline form A fluorescein sodium obtained in Example 4-4, and it was confirmed that the depth was about 1.5 cm. The vial was allowed to stand in a dryer at 50 ° C. and 100% RH for 15 hours. When 1 mass% of 2-propanol was confirmed by 1 H-NMR, it was reduced to 0.028%. This was dried under reduced pressure at 80 ° C., and 0.52 g was recovered (recovery rate: 88.1%).
  • Example 5 A mixed solution of 1 g of commercially available sodium fluorescein (reagent F: purity 93.7%, brown) and 10 mL of special grade ethanol (concentration 99.5% by volume) was stirred at room temperature for 1 hour, and then filtered with a glass filter filled with a filter aid. Filter and wash 4 times with 1 mL of special grade ethanol. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 2.3 g of concentrated residue. To this residue, 0.47 mL of special grade ethanol and 1.4 mL of water were added, and 9.5 mL of special grade 2-propanol (concentration 99.7% by volume) was added and dissolved at an external temperature of 75 ° C. Then, the external temperature was 12.5 ° C.
  • Example 6 A mixed solution of 0.98 g of commercially available sodium fluorescein (reagent E: purity 99.4%) and 10 mL of special grade ethanol (concentration 99.5% by volume) was stirred at room temperature for 2 hours, and then filtered with a glass filter filled with a filter aid. Filter and wash 4 times with 1 mL of special grade ethanol. The filtrate was concentrated under reduced pressure. After confirming the residual amount of ethanol by nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H-NMR), ethanol was added so as to be 3 v / w.
  • reagent E purity 99.4%
  • special grade ethanol concentration 99.5% by volume

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Abstract

フルオレセインナトリウムを精製する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウム、及び実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを含む眼科用診断試薬を提供すること。フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法。

Description

高純度フルオレセインナトリウム
　本発明は、フルオレセインナトリウムの精製方法、高純度フルオレセインナトリウム及びその製造方法に関する。
　従来より、フルオレセインナトリウムは、眼科学における診断試薬として広く使われている。フルオレセイン点眼剤はドライアイ、角膜の擦過傷、潰瘍、角膜ヘルペスなどの診断に効果的であり、フルオレセイン造影剤は加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、眼内の炎症などの識別に利用されている。
　市販されている商用グレードのフルオレセインナトリウムは、医薬品として用いるには純度が低いので、医薬品グレードとするためには精製するなどして純度を高めることが求められる。
　特許文献１には、商用グレードのフルオレセインナトリウムをＯ，Ｏ’－ジアセチルフルオレセインに転化させ、次に、当該Ｏ，Ｏ’－ジアセチルフルオレセインに転化させてフルオレセインに戻し、ナトリウム塩を形成し、最終不純物を除去して、実質的に純粋なフルオレセインを調製する方法が開示されている。
特許第５３８４３６３号公報
　特許文献１に開示されるフルオレセインの調製方法は、化学構造の変化を伴うフルオレセインの調製方法であり、フルオレセインナトリウムを直接的に得る調製方法ではない。
　フルオレセインナトリウムの純度を高めるために、再結晶化する手法が考えられる。しかしながら、従来からのフルオレセインナトリウムの再結晶化方法では、再結晶化したフルオレセインナトリウムに有機溶媒が残留し、有機溶媒を除去することが困難であった。
　本発明は、フルオレセインナトリウムを精製する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウム、及び実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを含む眼科用診断試薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは、精製に供するフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えてフルオレセインナトリウムを結晶化させることにより、実質的に有機溶媒を含有せず、かつ、純度が９９．５％を超える、フルオレセインナトリウムが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
　（１）本発明は、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法である。
　（２）また、本発明は、商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムを製造する方法である。
　（３）また、本発明は、商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムを製造する方法である。
　（４）また、本発明は、前記水溶液は、エタノール又はメタノールを含む、（１）～（３）の何れか１項に記載の方法である。
　（５）また、本発明は、フルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えるステップ、及び、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法である。
　（６）また、本発明は、商用グレードのフルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えるステップ、及び、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムを製造する方法である。
　（７）また、本発明は、商用グレードのフルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えるステップ、及び、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムを製造する方法である。
　（８）また、本発明は、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液の温度が５℃～７５℃である、（１）～（７）の何れか１項に記載の方法である。
　（９）また、本発明は、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液から結晶化したフルオレセインナトリウムを分離し、乾燥させる操作／ステップを伴う、（１）～（８）の何れか１項記載の方法である。
　（１０）また、本発明は、除塵操作を伴う、（１）～（５）の何れか１項に記載の方法である。
　（１１）また、本発明は、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムである。
　（１２）また、本発明は、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムである。
　（１３）また、本発明は、ＣｕＫα放射線を使用する粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ±０．２°）１６．９°のピーク強度を１００％とした場合、回折角（２θ±０．２°）２６．４°に相対強度が２５％以上の回折ピークを有し、回折角（２θ±０．２°）７．０°以下には相対強度が２５％以上のピークを有さない、フルオレセインナトリウムである。
　（１４）また、本発明は、（１１）～（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムを含む、眼科用診断試薬である。
　（１５）また、本発明は、眼科用診断ないし眼疾患の診断のための試薬の製造のための（１１）～（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムの使用又は応用である。
　（１６）また、本発明は、眼科用診断試薬ないし眼疾患診断試薬を製造するための、（１１）～（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムの使用又は応用である。
　（１７）また、本発明は、眼科用診断試薬ないし眼疾患診断試薬としての使用のための（１１）～（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムである。
　（１８）また、本発明は、眼科用診断ないし眼疾患の診断のための（１１）～（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムの使用又は応用である。
　（１９）また、本発明は、（１１）～（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムを用いて眼科用診断を行う方法又は眼疾患を診断する方法である。
　（２０）また、本発明は、眼科用診断ないし眼疾患の診断を必要とする対象に（１１）～（１３）の何れか１項に記載のフルオレセインナトリウムを適用することにより、眼科用診断を行う方法又は眼疾患を診断する方法である。
　（２１）また、本発明は、前記眼科用診断ないし眼疾患の診断が角結膜障害、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、及び眼内の炎症からなる群より選択される少なくとも１つの診断である、（１４）～（２０）の何れか１項に記載の発明である。
　（２２）また、本発明は、前記角結膜障害がドライアイ、角結膜の擦過傷、潰瘍、及び角膜ヘルペスからなる群より選択される少なくとも１つである（２１）に記載の発明である。
　（２３）また、本発明は、前記試薬が点眼剤及び／又は造影剤である、（１４）～（１７）の何れか１項に記載の発明である。
　（２４）また、本発明は、前記フルオレセインナトリウムが点眼剤及び／又は造影剤に含まれる、（１４）～（２２）の何れか１項に記載の発明である。
　本発明によれば、フルオレセインナトリウムを精製する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウム、及び実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを含む眼科用診断試薬を提供できるという優れた効果がある。本明細書において、「実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウム」は、実質的に有機溶媒を含有しない高純度フルオレセインナトリウムを含んでもよい。
本発明の実施例１で得られた医薬品グレードのフルオレセインナトリウムの外観写真である。 本発明の実施例１で用いた試薬Ａ（商用グレードのフルオレセインナトリウム）の外観写真である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
＜フルオレセインナトリウムを精製する方法＞
　本発明のフルオレセインナトリウムを精製する方法は、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む。具体的には、本発明のフルオレセインナトリウムを精製する方法は、精製に供するフルオレセインナトリウムに水を加えて、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液を得る工程、前記水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加える工程、及び、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させる工程を含む。精製に供するフルオレセインナトリウムにメタノール及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１つと水とを加えて、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液を得る工程を含む。上記水溶液に溶解させるフルオレセインナトリウムは、典型例としては、精製に供するフルオレセインナトリウム（通常、精製に供するフルオレセインナトリウム組成物である。以下、同様。）であり、これは下記のように表される。
　精製に供するフルオレセインナトリウムは、フルオレセインナトリウム以外に、フルオレセインの合成時に生じる副生成物、異性体など、また、酸化生成物、及び分解生成物などを含有する市販のフルオレセインナトリウムであってもよいし、純度が９９．５％以下、例えば、９９．３％以下、９９．２％以下、通常、市販品によくある９０～９７％程度、具体的には、９０.０％以上９９．５％以下、９３．０％以上９９．０％以下、９６．０％以上９８．５％以下、より具体的には、９３．０％以上９４．０％以下又は９７．０％以上９８．０％以下、さらに具体的には９３．０％以上９３．９％以下又は９７．０％以上９７．９％以下である通常純度のフルオレセインナトリウムであってもよい。本明細書において、これらの市販のフルオレセインナトリウム、通常純度のフルオレセインナトリウムを「商用グレードのフルオレセインナトリウム」と総称する。本明細書において、化合物としてのフルオレセインナトリウムと、該フルオレセインナトリウム以外の成分とを含むものを「フルオレセインナトリウム組成物」ということがある。該フルオレセインナトリウム以外の成分としては、例えば、上述の副生成物、異性体、酸化生成物、分解生成物などの不純物が挙げられ、また、精製に用いる水、２－プロパノール、２－ブタノールなどの溶媒などが挙げられる。
　フルオレセインナトリウムの純度とは、かかるフルオレセインナトリウム組成物中のフルオレセインナトリウムの含有率であり、高速液体クロマドグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて後述する条件により分析した分析結果から得られるものである。本明細書において、純度が９９．５％を超えるフルオレセインナトリウム（具体的には、フルオレセインナトリウム組成物である。）を「高純度フルオレセインナトリウム」ということがある。通常、高純度フルオレセインナトリウムは、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物である。）を含む。本明細書において、「医薬品グレードのフルオレセインナトリウム」とは、純度が９９．５％を超えるフルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物である。）を意味する。
　本発明によれば、商用グレードのフルオレセインナトリウムから、実質的に有機溶媒を含有しない、高純度フルオレセインナトリウムを得ることができる。
　ここで、「実質的に有機溶媒を含有しない」とは、フルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物である。）に含有される有機溶媒が０．５質量％以下であることをいう。残留する有機溶媒の含有量は核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）の測定結果に基づいて定量することができる。核磁気共鳴スペクトルでは、溶媒として重水を用い、例えばエタノールは、フルオレセイン由来の７．８ｐｐｍ付近のピークの積分値を１としたとき、３．６５ｐｐｍ付近のピークの積分値をＡとし、また、２－プロパノールは、フルオレセイン由来の７．８ｐｐｍ付近のピークの積分値を１としたとき、１．１７ｐｐｍ付近のピークの積分値をＢとすると、エタノールと２－プロパノールの質量％はそれぞれ、以下の計算式で算出できる。
　エタノールの質量％＝（Ａ÷２×４６．０７）÷（Ａ÷２×４６．０７＋　Ｂ÷６×６０．１０＋３７６．２７）×１００
　２－プロパノールの質量％　＝（Ｂ÷６×６０．１０）÷（Ａ÷２×４６．０７＋Ｂ÷６×６０．１０＋３７６．２７）×１００
　次に、フルオレセインナトリウムを精製する方法の好ましい例について具体的に説明する。
　実製造における現実的な量でフルオレセインナトリウムを溶解できる有機溶媒としては、メタノール、エタノールなどが好ましい。具体的には、上述の、精製に供するフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液を得る工程は、精製に供するフルオレセインナトリウムにメタノール及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１つと水とを加えて、フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液を得る工程であることが好ましい。かかる工程において、精製に供するフルオレセインナトリウムに対し、メタノール及びエタノールからなる群より選択される少なくとも１つと水とは実質的に同時に加えてもよいが、前者を加えた後、後者の水を加えることが好ましく、具体的には、まず初めに、精製に供するフルオレセインナトリウムを少量の良溶媒となるメタノール又はエタノールに溶解させた後、水を加えて水溶液とすることが好ましい。該水溶液を得る工程において、より具体的には、精製に供するフルオレセインナトリウムをメタノール又はエタノールに溶解させた後、ガラスフィルターなどの濾材を用いて濾過し、好ましくはさらに、先に用いたメタノール又はエタノールで洗浄して得られる濾液又は該濾液の濃縮物（湿固体であってもよい）に水を加えてもよいし、該濾液の濃縮物（湿固体であってもよい）若しくは乾固物に対し、先に用いたメタノール又はエタノールを加えてフルオレセインナトリウムの溶液を得た後、該溶液に水を加えてもよい。そして、この水溶液に貧溶媒となる２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて熟成し、再結晶化させることによってフルオレセインナトリウムを精製することができる。
　熟成温度は、５℃以上７５℃以下が好ましく、６５℃以上（かつ７５℃以下）に加温した後、１５℃以下（かつ５℃以上）まで冷却（自然冷却も含む）することがより好ましい。熟成時間は、回収量にもよるが、１時間以上が好ましく、３時間以上２４時間以内がより好ましい。上記条件で熟成することにより、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム、又は高純度フルオレセインナトリウムを得ることが可能となる。
　また、精製に供するフルオレセインナトリウムに対し、貧溶媒である２－プロパノール又は２－ブタノールの添加量は、５ｖ／ｗ以上２０ｖ／ｗ以下が好ましく、８ｖ／ｗ以上１０ｖ／ｗ以下がより好ましい。精製に供するフルオレセインナトリウムに対し、良溶媒であるメタノール又はエタノールの添加量は、０ｖ／ｗ以上３ｖ／ｗ以下が好ましく、０．１ｖ／ｗ以上２．０ｖ／ｗ以下がより好ましい。良溶媒としては、メタノール単独又はエタノール単独に限られず、メタノールとエタノールの混合溶媒であってもよい。貧溶媒としては、２－プロパノール単独又は２－ブタノール単独に限られず、２－プロパノールと２－ブタノールとの混合溶媒であってもよい。水（Ｈ２０）の添加量は、０．３ｖ／ｗ以上２．０ｖ／ｗ以下が好ましく、１．３ｖ／ｗ以上１．８ｖ／ｗ以下がより好ましい。なお、「溶媒量（ｖ／ｗ）」は、精製に供するフルオレセインナトリウムの質量（ｇ）に対する溶媒の体積（ｍＬ）を表す。溶媒を上記範囲の添加量とすることにより、フルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物であってもよい。）に含まれる有機溶媒を実質的になくすことが可能となり、後述するように、所望の結晶形態を有する、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを得ることができる。
　熟成後、再結晶化して析出したフルオレセインナトリウムを固液分離で取り出し、先に使用した２－プロパノール又は２－ブタノールにより洗浄して湿固体を取り出し、乾燥させることにより、所望の実質的に有機溶媒を含有しない、高純度フルオレセインナトリウムを得ることができる。固液分離や乾燥は、効率良く溶媒を除去するために、減圧下で行うことが好ましい。減圧する場合は、０．０１ＭＰａ以下が好ましく、０．００５ＭＰａ以下がより好ましい。乾燥温度は、３０℃以上１００℃以下が好ましく、８０℃程度がより好ましい。また、乾燥温度が２－プロパノール又は２－ブタノールの沸点を超える場合には、常圧で乾燥してもよい。
　上記固液分離の際には、得られるフルオレセインナトリウムを医薬品として用いる場合、前処理として、除塵操作を行う必要がある。除塵操作は、製造管理及び品質管理基準（Ｇｏｏｄ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）を満たす操作であれば特に限定されないが、濾紙を用いた粗濾過若しくはガラスフィルターを用いた精密濾過がより好ましい。除塵操作は、固液分離に先立ち、フルオレセインナトリウムの再結晶化又はそれ以前において行うことが好ましく、熟成後かつ再結晶化以前において行うことがより好ましい。
　なお、上述した精製方法は、１回に限らず、さらに純度を上げるために、上述した精製方法を２回以上繰り返してもよい。上述した精製方法を繰り返す場合、繰り返す回数は、上記範囲内であれば特に限定されないが、工業性、効率などの点で、１０回以下が好ましく、８回以下がより好ましく、５回以下がさらに好ましい。
　フルオレセインナトリウムの純度が上がりにくい場合や、さらに純度を上げたい場合には、固液分離され洗浄された湿固体（以下、試料という）を容器に入れ、加湿・加温下静置した後、減圧乾燥してもよい。試料の厚みは、０．５ｍｍ～４ｃｍが好ましく、温度は１５℃～８０℃が好ましく、湿度は３０％ＲＨ～１００％ＲＨが好ましい。静置時間は、５時間～４８時間が好ましく、１０時間～２０時間がより好ましい。減圧は、０．０１ＭＰａ以下が好ましく、０．００５ＭＰａ以下がより好ましい。乾燥温度は、３０℃以上１００℃以下が好ましく、７０℃以上９０℃以下がより好ましい。
＜実質的に有機溶媒を含有しない高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法＞
　本発明の実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造する方法は、商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む。当該方法は、上述したフルオレセインナトリウムを精製する方法で説明した条件と同様の条件により、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインを製造する方法である。
　本発明によれば、商用グレードのフルオレセインナトリウムから、医薬品グレードの実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムを製造することができる。
＜実質的に有機溶媒を含有しない高純度フルオレセインナトリウム＞
　フルオレセインナトリウムは、下記の式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明においてフルオレセインナトリウムの純度は、高速液体クロマドグラフィ（ＨＰＬＣ）により下記の条件により分析した時のフルオレセインナトリウム成分の面積百分率（以下、ＨＰＬＣ純度ということがある）から定量したものである。
　装置：Ｗａｔｅｒｓ製ＨＰＬＣ　（Ｗａｔｅｒｓ　２９９８　Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ　Ａｒｒａｙ　Ｄｅｔｅｃｔｅｒ，　Ｗａｔｅｒｓ　ｅ２６９５　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｍｏｄｕｌｅ、ＳＭＣ　Ｃｏｌｕｍｎ　Ｈｅａｔｅｒ）
　カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　Ｃ８　４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ
カラム温度：４５℃
検出波長：ＵＶ　２８０ｎｍ
移動相Ａ：１％酢酸水溶液（ｐＨ２．８）
移動相Ｂ：メタノール
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
クランジェント条件：下記の表１の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、本発明の高純度フルオレセインナトリウムは、実質的に有機溶媒を含有しないことを特徴とする。残留する有機溶媒の含有量は、上述したように、核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）を測定し、測定した核磁気共鳴スペクトルに基づいて含有量を定量することができる。
　フルオレセインナトリウム（通常、フルオレセインナトリウム組成物である。）が含有する有機溶媒の量は、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、フルオレセインナトリウムの結晶形態に依存していることがわかった。本発明の実質的に有機溶媒を含有しない、高純度フルオレセインナトリウムの結晶形態（以下、結晶形態Ａという）は、有機溶媒を含有しにくい結晶形態を有している。
　この結晶形態Ａは、ＣｕＫα放射線を使用する粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ±０．２°）１６．９°のピーク強度を１００％とした場合、回折角（２θ±０．２°）２６．４°に相対強度が２５％以上の回折ピークを有し、回折角（２θ±０．２°）７．０°以下には相対強度が２５％以上の回折ピークを有さないことによって特徴付けられる。さらに、結晶形態Ａを特徴付ける相対強度が２５％以上の回折ピークとして、回折角（２θ±０．２°）９．７°、１４．０°の回折ピークが挙げられ、さらに、回折角（２θ±０．２°）２２．６°の回折ピークが挙げられる。なお、粉末Ｘ線回折においては、回折角の値は±０．２°の測定誤差を生じる。回折角（２θ±０．２°）２６．４°の回折ピークの相対強度は、５０％以上であってよく、７０％以上であってもよい。
　結晶形態Ａを有するフルオレセインナトリウムは、粉末Ｘ線回析装置（ＲＩＮＴ－ＵｌｔｉｍａＩＩＩ：リガク社製）を用いて下記の測定条件でＸ線回析した。結晶形態Ａの粉末Ｘ線回析データを表２に示す。
（測定条件）
Ｘ線源：　Ｃｕ
電圧：　４０ｋＶ
電流：　４０ｍＡ
発散スリット：　１．０ｍｍ
発散縦制限スリット：　１０ｍｍ
散乱スリット：　開放
受光スリット：　開放
第１スリット：　なし
第２スリット：　なし
入射スリット：　なし
受光スリット：　なし
走査モード：　連続
サンプリング幅：　０．０２００°
走査範囲：　５．００００°－４０．００００°
積算回数：　１
スキャンスピード：　４．０００°／ｍｉｎ．
走査軸：　２θ／θ
θオフセット：　０．００００°
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜眼科用診断試薬＞
　上述した実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム又は高純度フルオレセインナトリウムは、眼科用検査用試薬として用いることができる。眼科用検査用試薬は、通常、眼疾患の診断のための試薬であり、眼科用診断試薬ともいう。具体的には、点眼剤として、角結膜障害の診断、例えばドライアイ、角結膜の擦過傷、潰瘍、角膜ヘルペスなどの診断に有効である。また、造影剤として、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、眼内の炎症などの識別にも有効である。
　実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム若しくは高純度フルオレセインナトリウムを用いて眼科用診断を行う方法又は眼疾患を診断する方法もまた、本発明の一つである。かかる診断方法は、通常、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム若しくは高純度フルオレセインナトリウムを含む眼科用診断試薬を点眼剤として眼に滴下し、例えば、黄緑色に染色すれば角結膜障害があると診断することができ、また、造影剤として眼に滴下し、例えば、血管の状態を把握することができ、病変を検出できれば加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、眼内の炎症などであると診断することができる。
　以下、実施例を基に本発明をさらに詳細に説明する。
［実施例１］
　市販のフルオレセインナトリウム試薬［試薬Ａ］１ｇを特級エタノール（濃度９９．５体積％）２ｍＬに加えて１時間かけて撹拌溶解させ、水１．４ｍＬを加えて、７５℃まで加熱した。特級２－プロパノール（濃度９９．７体積％）１０ｍＬを加えた後、約１８時間かけて撹拌冷却して１２℃とした。析出した固体を減圧下で固液分離し、特級２－プロパノール１ｍＬで３回洗浄した。得られた湿固体を減圧下８０℃で乾燥し、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（結晶形態Ａ、収率３５．７％）を得た。減圧は０．１ｋＰａ以上、１ｋＰａ以下の範囲内で行った（以下、同様）。
［実施例２］
　実施例１の［試薬Ａ］の代わりに市販のフルオレセインナトリウム試薬［試薬Ｂ］を用いること以外は、実施例１と同様な操作を行うことにより、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（結晶形態Ａ、収率４４．１％）を得た。
［実施例３］
　実施例１の［試薬Ａ］の代わりに市販のフルオレセインナトリウム試薬［試薬Ｃ］を用いること以外は、実施例１と同様な操作を行うことにより、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（結晶形態Ａ、収率４２．１％）を得た。
　実施例１～３で得た各フルオレセインナトリウムの純度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量し、残留溶媒の質量を核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）を用いて定量した。結果を表３に示す。表中の％は、質量％を示す。また、図１に実施例１で得られた医薬品グレードのフルオレセインナトリウムの写真を示し、図２に試薬Ａの商用グレードのフルオレセインナトリウムの写真を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［結果・考察］
　図２に示す試薬Ａの商用グレードのフルオレセインナトリウムの茶褐色の粉末は、図１に示す高純度フルオレセインナトリウムの橙色の粉末に精製された。他の実施例でも同様であった。表３から明らかなように、商用グレードのフルオレセインナトリウム（試薬Ａ～Ｃ）から、残留溶媒が０．２％以下である、高純度フルオレセインナトリウムを得られることが確認された。したがって、実施例１～実施例３により得られるフルオレセインナトリウムは医薬品グレードのフルオレセインナトリウムとして適用できる。
［実施例４］
　市販のフルオレセインナトリウム（試薬Ｄ：純度９９．２％）２０ｇと特級エタノール（濃度９９．５体積％）２００ｍＬの混合溶液を室温で１時間１５分間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール２０ｍＬで４回洗浄した。濾液を減圧下濃縮・乾固し、特級２‐プロパノール（濃度９９．７体積％）４０ｍＬを加えて減圧下濃縮する操作を３回繰り返した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）にてエタノール、２－プロパノールの残存量を確認後、これらの有機溶媒が含まれるフルオレセインナトリウムを原料として使用し、添加する各有機溶媒の総量が表４中にあるエタノール量、２－プロパノール量となるようにした。そして、表４に示すように原料１ｇとエタノールの混合液に水を加え、各温度で、特級２－プロパノールを加えて数時間～２４時間撹拌した。析出した各固体を減圧濾過し、特級２－プロパノール１ｍＬで数回洗浄し、得られた湿固体を８０℃で減圧乾燥して乾燥固体を得た。
　実施例４－１～実施例４－１７における、核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）により定量された残留溶媒の質量、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により定量した純度、及び収率を表４に示す。表中、２－プロパノールを「ＩＰＡ」、エタノールを「ＥｔＯＨ」、また検出不能なものを「Ｎ．Ｄ．」と表記する。
［実施例４－１８］
　実施例４‐４で得られた結晶形態Ａのフルオレセインナトリウム０．５９ｇを５ｍＬのバイアル管に充填し、深さ１．５ｃｍ程度であることを確認した。５０℃、１００％ＲＨにした乾燥機内へ、このバイアルを１５時間静置した。１Ｈ－ＮＭＲにて２－プロパノールの質量％を確認したところ、０．０２８％に低減できた。これを８０℃で減圧乾燥し、０．５２ｇ回収した（回収率：８８．１％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［結果・考察］
　表４の結果から明らかなように、実施例４－１～実施例４－１７におけるフルオレセインナトリウムは、何れも純度が９９．５％を超え、残留溶媒の含有量も極めて少ない。さらに、実施例４－１８の操作を加えたフルオレセインナトリウムは、さらに残留溶媒の含有量を低減させることができた。また、実施例４－１～実施例４－１８におけるフルオレセインナトリウムは、粉末Ｘ線回折の分析結果から、表２に示す特有のピークを有する、結晶形態Ａであることが確認された。
［実施例５］
　市販のフルオレセインナトリウム（試薬Ｆ：純度９３．７％、茶褐色）１ｇと特級エタノール（濃度９９．５体積％）１０ｍＬの混合溶液を室温で１時間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール１ｍＬで４回洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、濃縮残渣２．３ｇを取得した。この残渣に特級エタノール０．４７ｍＬ、水１．４ｍＬを加え、外温７５℃で、特級２－プロパノール（濃度９９．７体積％）９．５ｍＬを加えて溶解した後、外温１２．５℃で１５時間３７分間撹拌した。析出した各固体を減圧濾過し、特級２－プロパノール１ｍＬで３回洗浄し、得られた湿固体を８０℃で減圧乾燥し、医薬品グレードのフルオレセインナトリウム（結晶形態Ａ、収率４７．３％、純度９９．６％、エタノール含有量：検出されず、２－プロパノール含有量：０．２１質量％）を得た。
［結果・考察］
　実施例５におけるフルオレセインナトリウムは、何れも純度が９９．５％を超え、残留溶媒の含有量も極めて少ない。実施例５におけるフルオレセインナトリウムは、粉末Ｘ線回折の分析結果から、表２に示す特有のピークを有する、結晶形態Ａであることが確認された。
［実施例６］
　市販のフルオレセインナトリウム（試薬Ｅ：純度９９．４％）０．９８ｇと特級エタノール（濃度９９．５体積％）１０ｍＬの混合溶液を室温で２時間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール１ｍＬで４回洗浄した。濾液を減圧下濃縮した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）にてエタノールの残存量を確認後、３ｖ／ｗになるようにエタノールを添加した。この混合液に水１．５ｍＬを加え、内温７５度まで加熱し、特級２－ブタノール９．８０ｍＬを加えた後、１２．５℃へ冷却し、１４時間撹拌した。析出した固体を減圧濾過し、特級２－ブタノール２ｍＬで４回洗浄し、得られた湿固体を８０℃で減圧乾燥して結晶形態Ａとして０．７６ｇ（収率：７６．３％、純度９９．６％、エタノール含有量：０．０４４質量％、２－ブタノール含有量：０．３１質量％）を得た。
［比較例１］
　フルオレセインナトリウム試薬［試薬Ｄ］５ｇと特級エタノール（濃度９９．５体積％）５０ｍＬの混合溶液を室温で１時間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール５ｍＬで４回洗浄した。濾液を１１．４ｇになるまで濃縮し、特級２－プロパノール（濃度９９．７％）５０ｍＬを加え、５分割した後、８０℃で２４時間撹拌した。析出した各固体を減圧濾過し、特級２－プロパノール１ｍＬで２回洗浄し、湿固体を８０℃で減圧乾燥して乾燥固体を得た。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　結晶形態Ｂを有するフルオレセインナトリウムのＸ線回析データを表６に示す、
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［結果・考察］
　表５及び表６の結果から明らかなように、再結晶化の際に、フルオレセインナトリウム水溶液を用いない比較例１では、残留溶媒の含有量が多く、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムは得られなかった。
［比較例２］
　フルオレセインナトリウム［試薬Ｄ］５gと特級エタノール５０ｍＬの混合溶液を室温で１時間撹拌した後、濾過補助剤を充填したガラスフィルターでろ過し、特級エタノール５ｍＬで４回洗浄した。濾液を１３．０ｇになるまで濃縮し、特級２－ブタノール５０ｍＬを加え、５分割した後、１５℃、９５℃の各温度で２２時間撹拌した。析出した各固体を減圧濾過し、特級２－ブタノール２ｍＬで２回洗浄し、湿固体を８０℃で減圧乾燥して乾燥固体を得た。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　結晶形態Ｃを有するフルオレセインナトリウムのＸ線回析データを表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［結果・考察］
　表７及び表８の結果から明らかなように、再結晶化の際に、フルオレセインナトリウム水溶液を用いない比較例２では、何れの温度においても、残留溶媒の含有量が多く、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムは得られなかった。

Claims (14)

  1. 　フルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法。
  2. 　商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムを製造する方法。
  3. 　商用グレードのフルオレセインナトリウムを溶解させた水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えて、フルオレセインナトリウムを結晶化させることを含む、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムを製造する方法。
  4. 　前記水溶液は、エタノール又はメタノールを含む、請求項１～３の何れか１項記載の方法。
  5. 　フルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えるステップ、及び、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、フルオレセインナトリウムを精製する方法。
  6. 　商用グレードのフルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えるステップ、及び、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウムを製造する方法。
  7. 　商用グレードのフルオレセインナトリウムにメタノール又はエタノールを加えるステップ、前記ステップで得られた溶液に水を加えて水溶液を得るステップ、前記水溶液に２－プロパノール又は２－ブタノールを加えるステップ、及び、前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液中のフルオレセインナトリウムを結晶化させるステップを含む、実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウムを製造する方法。
  8. 　前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液の温度が５℃～７５℃である、請求項１～７の何れか１項記載の方法。
  9. 　前記２－プロパノール又は２－ブタノールを加えた後の前記水溶液から結晶化したフルオレセインナトリウムを分離し、乾燥させる操作／ステップを伴う、請求項１～８の何れか１項記載の方法。
  10. 　除塵操作を伴う、請求項１～９の何れか１項記載の方法。
  11. 　純度９９．５％を超えるフルオレセインナトリウム。
  12. 　実質的に有機溶媒を含有しないフルオレセインナトリウム。
  13. 　ＣｕＫα放射線を使用する粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ±０．２°）１６．９°のピーク強度を１００％とした場合、回折角（２θ±０．２°）２６．４°に相対強度が２５％以上の回折ピークを有し、回折角（２θ±０．２°）７．０°以下には相対強度が２５％以上のピークを有さない、フルオレセインナトリウム。
  14. 　請求項１１～１３の何れか１項記載のフルオレセインナトリウムを含む、眼科用診断試薬。
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