WO2017047797A1 - 膵芽細胞の製造方法 - Google Patents

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健二 長船
太郎 豊田
東 木村
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing pancreatic blasts and a therapeutic agent for pancreatic diseases comprising pancreatic blasts produced by the method.
  • the present application further relates to a method for treating pancreatic disease using the pancreatic blast.
  • pancreas functions as an exocrine gland that secretes digestive enzymes such as pancreatic lipase, trypsin, elastase, pancreatic amylase, and an endocrine gland that secretes pancreatic hormones such as glucagon, insulin, somatostatin, and pancreatic polypeptide (PP).
  • pancreatic hormones such as glucagon, insulin, somatostatin, and pancreatic polypeptide (PP).
  • ghrelin a gastric secretion hormone
  • This pancreatic hormone is produced by a cell mass called a pancreatic islet composed of four types of cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells and PP cells in the pancreas.
  • insulin plays an important role in promoting glucose utilization, protein synthesis, neutral fat formation and storage, lowering blood glucose level, and maintaining blood sugar at the correct concentration.
  • Glucagon plays an important role in the regulation mechanism of glucose metabolism along with insulin as a blood glucose-elevating hormone through liver glycolysis and gluconeogenesis.
  • Somatostatin exerts its action through binding to the somatostatin receptor and suppresses the secretion of various hormones such as glucagon and insulin in the pancreas.
  • PP is a hormone secreted from cells of the islets of Langerhans in response to food intake, known as a satiety factor, and functions to suppress food intake and reduce weight gain.
  • Ghrelin is known to increase body weight by stimulating food intake and reducing fat oxidation.
  • Diabetes mellitus is a disease that develops when insulin is deficient or loses its function, and once it develops, it is difficult to cure. Diabetes can be broadly classified into two types: type 1 diabetes (insulin-dependent diabetes) and type 2 diabetes (non-insulin-dependent diabetes).
  • Type 2 diabetes is a chronic disease that develops by acquiring resistance to insulin, and is a diabetes whose lifestyle is considered to be an onset mechanism such as obesity and stress caused by overeating and lack of exercise. Type 2 diabetes often develops in middle and old age, and many diabetics suffer from type 2 diabetes.
  • type 1 diabetes is a disease caused by destruction of ⁇ cells (insulin producing cells) due to autoimmune diseases, viral infections, etc., and insulin is not secreted into the body.
  • Symptomatic treatment by insulin administration is mainly performed, but pancreas transplantation or islet transplantation is also performed as a treatment method that can automatically control blood glucose level constantly changing in the body and reduce the burden on the patient .
  • pancreas transplantation or islet transplantation is also performed as a treatment method that can automatically control blood glucose level constantly changing in the body and reduce the burden on the patient .
  • pancreas transplantation or islet transplantation is also performed as a treatment method that can automatically control blood glucose level constantly changing in the body and reduce the burden on the patient .
  • the current situation is that there is a lack of transplantable pancreas or islets.
  • the patient needs to continue to take the immunosuppressant throughout the life, and problems such as the risk of infection and side effects due to the immunosuppressant remain.
  • Insulin-producing cells can be obtained, for example, by taking a patient's pancreatic duct epithelium-derived cells out of the body and differentiating them.
  • Another method for obtaining insulin-producing cells is to induce differentiation of pluripotent stem cells such as embryonic stem (ES) cells and induced pluripotent stem (iPS) cells using activin or retinoic acid (RA).
  • the method to do is illustrated (patent document 1, nonpatent literature 1 to 5).
  • Patent Document 2 and Patent Document 3 a method of introducing PDX1 into pluripotent stem cells and culturing (Patent Document 2 and Patent Document 3), and a method of producing insulin-producing cells by acting on pluripotent stem cells by appropriately combining low molecular compounds (Patent Document) 4 and Non-Patent Document 6) are known.
  • Patent Document 4 and Non-Patent Document 6 a method of producing insulin-producing cells by acting on pluripotent stem cells by appropriately combining low molecular compounds
  • insulin-producing cells obtained in vitro in this way were administered in vivo to acquire glucose responsiveness.
  • pancreatic progenitor cells are produced and administered in vivo, it has been reported that insulin
  • JP 2009-225661 A US Pat. No. 7,534,608 JP 2006-075022 A WO2011 / 082122
  • the present application aims to provide a method for inducing differentiation of pancreatic blasts from PDX1-positive NKX6.1-negative cells. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for inducing differentiation of pancreatic blasts, including a step of further differentiating PDX1-positive NKX6.1-negative cells derived from pluripotent stem cells. Another object of the present invention is to provide a therapeutic agent for pancreatic disease and a method for treating pancreatic disease.
  • the present inventors have cultivated PDX1-positive NKX6.1-negative cells in a medium containing KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor, thereby producing pancreatic buds.
  • a medium containing KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor thereby producing pancreatic buds.
  • cells can be induced to differentiate efficiently.
  • an Akt inhibitor has a function of specifically proliferating PDX1-positive cells.
  • the present invention has been completed based on such knowledge.
  • the present invention has the following features: [1] A method for producing pancreatic blasts, comprising culturing PDX1-positive NKX6.1-negative cells in a medium containing KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor. [2] The method according to [1], wherein the culture is performed under adhesion culture conditions. [3] The method according to [1] or [2], wherein the Akt inhibitor is AT7867. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the PDX1-positive NKX6.1-negative cell is a cell produced from a pluripotent stem cell by a method comprising the following two steps.
  • step (1) a step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing activin, and (2) a step of culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing KGF.
  • step (1) is a step of culturing in a medium containing activin without containing a GSK3 inhibitor after culturing in a medium containing activin and a GSK3 inhibitor.
  • step (2) further comprises a step of culturing in a medium containing KGF, a BMP inhibitor, a retinoic acid derivative and a hedgehog pathway inhibitor.
  • step (2) After the step (2) is cultured in a medium containing KGF, a BMP inhibitor, a retinoic acid derivative and a hedgehog pathway inhibitor, the cells are dissociated, and the KGF, BMP inhibitor, retinoic acid derivative and hedgehog
  • the method according to [6] comprising a step of adhesion culture in a medium containing a pathway inhibitor.
  • the BMP inhibitor is LDN193189.
  • the GSK3 inhibitor is CHIR99021.
  • the retinoic acid derivative is TTNPB.
  • a method for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells comprising the following steps (i) to (iii): (I) culturing pluripotent stem cells in a medium containing activin, (Ii) culturing the cells obtained in step (i) in a medium containing KGF; (Iii) A step of culturing the cells obtained in step (ii) in a medium containing KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor. [15] The method according to [14], wherein the culture is performed under adhesion culture conditions.
  • step (i) is a step of culturing in a medium containing activin not containing a GSK3 inhibitor after culturing in a medium containing activin and a GSK3 inhibitor.
  • Method. [17] The method according to any one of [14] or [16], wherein the step (ii) further comprises a step of culturing in a medium containing KGF, a BMP inhibitor, a retinoic acid derivative and a hedgehog pathway inhibitor. The method described.
  • step (ii) is cultured in a medium containing KGF, a BMP inhibitor, a retinoic acid derivative and a hedgehog pathway inhibitor
  • the cells are dissociated, and the KGF, BMP inhibitor, retinoic acid derivative and hedgehog
  • the method according to [17] comprising a step of adhesion culture in a medium containing a pathway inhibitor.
  • the BMP inhibitor is LDN193189.
  • the GSK3 inhibitor is CHIR99021.
  • PDX1-positive NKX6.1-negative cells can be efficiently induced into pancreatic blasts.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a protocol for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells.
  • FIG. 2 shows the results of counting the number of cells obtained when each concentration of AT7867 was added in the third step (stage 3).
  • FIG. 3 shows the contents of PDX1-positive cells (left figure), PDX1-positive Ki67-positive cells (middle figure), and PDX1-negative Ki67-positive cells (middle figure) in each day of the third step (stage 3).
  • FIG. 4A shows an immunostained image (upper figure) and a nuclear stained image (lower figure) of the NKX6.1 antibody after the third step (stage 3). White indicates the stained part.
  • FIG. 4B shows the content of NKX6.1-positive cells when using AT7867 at each concentration.
  • FIG. 5A shows the results of flow cytometry of a group of cells stained with PDX1 antibody and NKX6.1 antibody after the third step (stage 3).
  • FIG. 5B shows the content of PDX1-positive NKX6.1-negative cells and PDX1-positive NKX6.1-positive cells obtained from the results of the flow cytometry.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the expression levels of PDX1, PTF1A and NKX6.1 by performing daily quantitative PCR in the period from the start to the end of the third step (stage 3) (0-4 days).
  • the solid line represents the transition of gene expression when AT7867 is added and the dotted line is the control group DMSO.
  • a method for producing pancreatic blast cells comprising a step of culturing PDX1-positive NKX6.1-negative cells in a medium containing KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor.
  • Pancreatoblasts are cells that can be induced to differentiate into cells that form the pancreas, such as endocrine cells, pancreatic duct cells, and exocrine cells, and examples include cells expressing at least PDX1 and NKX6.1. In addition, cells expressing a gene marker such as SOX9 or GATA4 may be used.
  • the pancreatic blast cells produced according to the present embodiment may be provided as a cell population containing other cell types or may be a purified population.
  • the cell population includes 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, or 80% or more pancreatic cells.
  • the PDX1-positive NKX6.1-negative cells may be adherently cultured in a medium containing KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor.
  • the adhesion culture means culturing in a coated culture dish.
  • the coating agent include Matrigel (BD Biosciences), Synthemax (Corning), gelatin, extracellular protein (eg, collagen, laminin (eg, laminin 111, 411 or 511), heparan sulfate proteoglycan, and entactin), or Examples thereof include fragments of the extracellular protein, and combinations thereof.
  • pancreatic blasts from PDX1-positive NKX6.1-negative cells it is preferable to perform adhesion culture for ease of handling, but suspension culture in which cell aggregates are formed may also be performed.
  • Suspension culture means culturing cells in a non-adherent state on a culture dish.
  • it is not artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion with cells, or artificially suppresses adhesion (for example, poly
  • This can be carried out using hydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA) or 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer (Lipidure).
  • the medium used for the culture process of pancreatic blasts from PDX1-positive NKX6.1-negative cells should be prepared by appropriately adding KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor to the basal medium used for animal cell culture. Can do.
  • basal media include MEM Zinc Option, IMEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12, Examples include 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin, transferrin, KnockOutKSerum Replacement (KSR) (serum substitute for ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor
  • KSR KnockOutKSerum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • collagen precursor May contain one or more serum substitutes such as trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins It may also contain one or more substances such as, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • the basal medium is IMEM Zinc Option medium with B27 supplement.
  • the Akt inhibitor may be any drug that suppresses the activity of Akt. , Ipatasertib (GDC-0068), AZD5363, SC79, Afuresertib (GSK2110183), AT13148, TIC10, Triciribine, CCT128930, PHT-427, Palomid 529, PF-04691502, Honokiol, Miltefosine, Deguelin, A-674563, sc-221226, Examples include anti-Akt antibodies, dominant negative mutants of Akt, and the like. These drugs are commercially available or can be appropriately produced based on known techniques.
  • the concentration is 0.01 ⁇ M to 4 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 1 ⁇ M, more preferably 0.5 ⁇ M.
  • KGF is a protein called Keratinocyte® Growth Factor and is sometimes called FGF-7.
  • FGF-7 Commercially available products such as R & DRsystems can be used as KGF.
  • the concentration of KGF is 1 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, preferably 5 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably 10 ng / ml to 200 ng / ml.
  • EGF is a protein called epidermal growth factor or Epidermal® Growth Factor.
  • EGF commercially available products such as R & D systems can be used.
  • the concentration of EGF is 1 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, preferably 5 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably 10 ng / ml to 100 ng / ml.
  • BMP inhibitors include proteinaceous inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsomorphin (ie 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl-pyrazolo (1,5-a) pyrimidine), its derivatives (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; PB Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33 -41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3 (8): e2904) and LDN-193189 (i.e.
  • the concentration is 0.01 ⁇ M to 5 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 1 ⁇ M, more preferably 0.2 ⁇ M.
  • the medium used for the culture process of PDX1-positive NKX6.1-negative cells to pancreatic blasts further comprises at least one compound selected from the group consisting of ROCK inhibitors, non-muscle myosin II inhibitors and TGF ⁇ inhibitors. May be.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK).
  • ROCK Rho-kinase
  • Y-27632 eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000) Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)
  • Fasudil / HA1077 eg, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • SR3677 eg, Feng Y et al. , J Med Chem. 51: 6642-6645 (2008)
  • GSK269962 eg, Stevenger RA et al., J Med Chem.
  • ROCK inhibitors may be used.
  • Preferred ROCK inhibitors used in this step include Y-27632, Fasudil / HA1077, SR3677, GSK269962 and H-1152.
  • the concentration in the medium is 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 500 ⁇ M, and more preferably 10 ⁇ M to 200 ⁇ M.
  • the concentration in the medium when Fasudil / HA1077 is used as the ROCK inhibitor is 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 0.5 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • the concentration in the medium when GSK269962 is used as the ROCK inhibitor is 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.005 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 0.05 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is 5 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • Non-muscle myosin II inhibitor is an inhibitor of ATPase activity of the heavy chain subunit of non-muscle myosin IIA or non-muscle myosin IIB, one of the heavy chain isoforms of non-muscle myosin II, an inhibitor of myosin light chain kinase Is exemplified.
  • Examples of such drugs include blebbistatin A3, CalphostinphosC, Goe6976, Goe7874, Fasudil / HA1077, Hypericin, K-252a, KT5823, ML-7, ML-9, Picatannol, Staurosporine, W-5, Examples thereof include, but are not limited to, W-7, W-12, W-13, Wortmannin and the like.
  • Preferred non-muscle myosin II inhibitors used in this step include blebbistatin and Fasudil / HA1077.
  • the concentration in the medium is 1 ⁇ M to 200 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • a TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits the signal transduction from binding of TGF ⁇ to the receptor to SMAD, and inhibits the binding of the receptor to the ALK family, or the phosphorylation of SMAD by the ALK family.
  • Lefty-1 NCBI Accession No., mouse: NM_010094, human: NM_020997 is exemplified
  • SB431542, SB202190 above, RKLindemann et al., Mol.
  • ALK5 inhibitor II (2 -[3- [6-Methylpyridin-2-yl] -1H-pyrazol-4-yl] -1,5-naphthyridine), TGF ⁇ RI kinase inhibitor VIII (6- [2-tert-butyl-5- [6 -Methyl-pyridin-2-yl] -1H- Midazoru 4-yl] - quinoxaline) and their derivatives are exemplified.
  • it may be ALK5 inhibitor II.
  • the concentration in the medium when ALK5 inhibitor II is used as the TGF ⁇ inhibitor is 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 50 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • culture temperature but are not limited to, about 30 ⁇ 40 ° C., preferably about 37 ° C., is cultured in an atmosphere of CO 2 containing air Performed, the CO 2 concentration is preferably about 2-5%.
  • PDX1-positive NKX6.1-negative cells are not particularly limited as long as they express PDX1, but do not express NKX6.1.
  • Expressing PDX1 means that the PDX1 gene or gene product can be detected by a known method, and not expressing NKX6.1 means that the NKX6.1 gene or gene product cannot be detected. Meaning and examples of the detection method include immunostaining.
  • a method for growing PDX1-positive cells comprising a step of culturing PDX1-positive cells in a medium containing KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor.
  • PDX1-positive cells mean cells positive for PDX1, and the expression of other marker genes, particularly NKX6.1 is not particularly limited, but is preferably NKX6.1-negative cells.
  • Proliferating PDX1-positive cells means that at least PDX1-positive cells increase by cell division. For example, the proliferation can also be confirmed by confirming that the number of cells stained with Ki67 antibody increases. .
  • the conditions for the growth of PDX1-positive cells can be performed by using the same conditions as those in the above-described step of culturing pancreatic blasts from PDX1-positive NKX6.1-negative cells.
  • PDX1-positive NKX6.1-negative cells may be isolated from the living body, and may be produced from other cell types such as pluripotent stem cells by a known method.
  • the PDX1-positive NKX6.1-negative cell may be a cell produced from a pluripotent stem cell by a method comprising the following steps: (Step 1) A step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing activin, and (Step 2) a step of culturing the cells obtained in Step 1 in a medium containing KGF.
  • a method for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells including the following steps: (Step 1) culturing pluripotent stem cells in a medium containing activin, (Step 2) culturing the cells obtained in Step 1 in a medium containing KGF; (Step 3) A step of separating the cells (PDX1-positive NKX6.1-negative cells) obtained in Step 2 into single cells and then culturing them in a medium containing KGF, EGF, BMP inhibitor and Akt inhibitor.
  • the medium used in the step of culturing the pluripotent stem cells of these aspects in a medium containing activin can be prepared by appropriately adding activin to the basal medium used for culturing animal cells.
  • basal media include MEM Zinc Option, IMEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12, Examples include 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin, transferrin, KnockOutKSerum Replacement (KSR) (serum substitute for ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor
  • KSR KnockOutKSerum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • collagen precursor May contain one or more serum substitutes such as trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins It may also contain one or more substances such as, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • the basal medium is RPMI 1640 medium with B27 supplement.
  • the pluripotent stem cells may be cultured as a single cell by being substantially separated (or dissociated) by any method, or a cell aggregate in which cells adhere to each other You may culture in the state of this. More preferably, the cells are cultured in a single cell state.
  • the separation method include mechanical separation and separation solution having protease activity and collagenase activity (for example, trypsin and collagenase-containing solution Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc) ) Or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • Pluripotent stem cells can be adherently cultured using a coated culture dish.
  • a ROCK inhibitor may be added to the basal medium for the purpose of suppressing apoptosis when pluripotent stem cells are separated into single cells.
  • the same ROCK inhibitor as that described above can be used, and Y-27632 is preferable.
  • the addition period is not particularly limited, but is exemplified by 1 day or more, or 2 days or more, and preferably 1 day.
  • the adhesion culture in step 1 of this embodiment can be performed by the same method as described above.
  • Activins may be any of activins A, B, C, D, and AB, but activin A is particularly preferably used.
  • activin activin derived from any mammal such as human and mouse can be used.
  • activin used in the present invention it is preferable to use activin derived from the same animal species as the pluripotent stem cell used for differentiation. For example, when human-derived pluripotent stem cell is used as a starting material, human-derived activin is used. It is preferable to use it.
  • These activins are commercially available.
  • the concentration in the medium is usually 0.1 to 200 ng / ml, preferably 5 to 150 ng / ml, particularly preferably 10 to 100 ng / ml.
  • Step 1 may be a step of culturing in a medium containing activin without containing a GSK3 inhibitor after culturing in a medium containing activin and a GSK3 inhibitor.
  • a GSK3 inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK-3 ⁇ protein (for example, phosphorylation ability for ⁇ -catenin), and many are already known.
  • BIO indirubin derivative BIO (also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin 3′-oxime), a maleimide derivative SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl) -4- (1-methyl-1H-indol-3-yl) ) -1H-pyrrole-2,5-dione), SB415286 (3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl) amino] -4- (2-nitrophenyl) -1H-pyrrole-2,5-dione) , GSK-3 ⁇ inhibitor VII (4-dibromoacetophenone), a phenyl ⁇ bromomethyl ketone compound, L803-mts (also known as GSK-3 ⁇ peptide inhibitor; Myr-N-GKE
  • the concentration in the medium is usually 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 5 ⁇ M.
  • the concentration may be appropriately changed. For example, the concentration may be changed to 1 ⁇ M after 3 ⁇ M.
  • a GSK inhibitor When culturing in a medium containing activin and a GSK3 inhibitor, it is desirable to add at the start of pluripotent stem cell culture.
  • the addition period of a GSK inhibitor is not specifically limited, 1 day or more, 2 days or more, or 3 days or more are illustrated, Preferably it is 1 to 3 days. Then, it culture
  • the number of days in Step 1 is, for example, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, or 7 days or more. There is no upper limit because there is no particular influence on the production efficiency of pancreatic blasts by culturing for a long period of time, but from the viewpoint of efficiency, it is 10 days or less, preferably 8 days or less. More preferably, the number of days in Step 1 is 4 days.
  • pluripotent cells are cultured for 1 day in a medium containing GSK3 inhibitor and ROCK inhibitor added to activin A, and then cultured for 2 days in a medium containing activin A and GSK3 inhibitor but not ROCK inhibitor. Then, an embodiment is further exemplified in which the cells are further cultured for 1 day in a medium containing activin A but not containing a GSK3 inhibitor and a ROCK inhibitor.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is preferably about 2 ⁇ 5%.
  • the medium used in the step of culturing the cells obtained in step 1 in a medium containing KGF can be prepared by appropriately adding KGF to a basal medium used for culturing animal cells.
  • basal media include MEM Zinc Option, IMEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12, Examples include 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • albumin, transferrin, KnockOutKSerum Replacement (KSR) (serum substitute for ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor
  • KSR KnockOutKSerum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • collagen precursor May contain one or more serum substitutes such as trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins It may also contain one or more substances such as, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • the basal medium is IMEM Zinc Option medium with B27 supplement.
  • the KGF used in step 2 can be the same as described above, and the KGF concentration is preferably lower than that described above, for example, 1 ng / ml to 500 ng / ml, preferably 10 ng. / ml to 100 ng / ml.
  • Step 2 may further include a step of culturing in a medium containing BMP inhibitor, retinoic acid derivative and hedgehog pathway inhibitor in addition to KGF.
  • the BMP inhibitor used in Step 2 can be used under the same conditions as described above.
  • the retinoic acid derivative used in Step 2 means an artificially modified retinoic acid that retains the function of natural retinoic acid, such as 4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5, 5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) carbonyl] amino] -Benzoic acid (AM580) (Tamura K, et al., Cell Differ. Dev. 32: 17-26 (1990)), 4-[(1E ) -2- (5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propen-1-yl] -Benzoic acid (TTNPB) (Strickland S, et al Cancer Res.
  • TTNPB 4-[(1E ) -2- (5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propen-1-yl] -Benzoic acid
  • a preferred retinoic acid derivative used in this step is TTNPB.
  • the concentration of the retinoic acid derivative used in this step can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the retinoic acid derivative used.
  • TTNPB is used as the retinoic acid derivative
  • 1 nM to 100 nM preferably 5 nM to 50 nM. More preferably, it is 5 nM to 10 nM.
  • the hedgehog pathway inhibitor used in Step 2 inhibits the signal generated when any of Sonic hedgehog, Indian hedgehog, and Desert hedgehog binds to the membrane receptor Patched, for example, Smoothened activity.
  • hedgehog binds to the receptor and inhibits the signal generated by the receptor, for example, cyclopamine, jervin, 3-keto-N- (aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl) (KAAD ) -Cyclopamine, CUR-61414, SANT-1, SANT-2, SANT-3, SANT-4, IPI-926, IPI-269609, GDC-0449 and NVP-LDE-225.
  • it is KAAD-cyclopamine.
  • the concentration of the hedgehog pathway inhibitor used in Step 2 can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the hedgehog pathway inhibitor used.
  • concentration of the hedgehog pathway inhibitor used in Step 2 0.1 nM To 1 ⁇ M, preferably 1 nM to 500 nM.
  • Step 2 when adherent culture is performed in a medium containing KGF, a BMP inhibitor, a retinoic acid derivative, and a hedgehog pathway inhibitor, it can be isolated by being separated (or dissociated) substantially by any method during the culture.
  • the cells may be brought into a cell state and the culture may be continued again under the same conditions.
  • a ROCK inhibitor may be added to the basal medium for the purpose of suppressing apoptosis when separated into a single cell state.
  • the same ROCK inhibitor as that described above can be used, and Y-27632 is preferable.
  • the addition period is not particularly limited, but is exemplified by 1 day or more, or 2 days or more, and preferably 1 day.
  • the number of days in step 2 is, for example, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, or 8 days or more. There is no upper limit because there is no particular influence on the production efficiency of pancreatic blasts by culturing for a long time, but from the viewpoint of efficiency, it is preferably 10 days or less, or 9 days or less. A more preferable number of days is seven days.
  • the number of days of culture in the medium containing KGF is, for example, 3 days or more, or 4 days. More preferably, it is 4 days.
  • the cell culture medium obtained in the adhesion culture in step 1 is first replaced with a medium containing KGF in step 2 and cultured for 4 days, and then, in addition to KGF, a BMP inhibitor, retinoic acid derivative and hedge The medium is replaced with a medium containing a hog inhibitor and cultured for 2 days. Thereafter, the cells are separated from the wall surface of the culture vessel to form a single cell, and further cultured for one day in a medium containing a ROCK inhibitor.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is preferably about 2 ⁇ 5%.
  • Cells obtained at the end of step 2 are PDX1-positive NKX6.1-negative cells.
  • the cells obtained at the end of step 2 may be provided as a cell population containing cell types other than PDX1-positive NKX6.1-negative cells, or may be a purified population. Preferably, it is a cell population containing 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, or 70% or more of PDX1-positive NKX6.1-negative cells.
  • a pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into all cells existing in a living body and also has proliferative ability.
  • Embryonic stem (ES) cells JA Thomson et.al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; JA Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55: 254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165), clone obtained by nuclear transfer Embryonic embryonic stem (ntES) cells (T.
  • ntES nuclear transfer Embryonic embryonic stem
  • the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • IPS cells are particularly preferably used as a material for transplanted pancreatic cells.
  • iPS cells obtained from somatic cells that are the same as or substantially the same as the HLA genotype of the transplant recipient individual from the viewpoint that rejection does not occur .
  • substantially the same means that the HLA genotype matches the transplanted cells to such an extent that an immune response can be suppressed by an immunosuppressive agent.
  • HLA-A, HLA-B And somatic cells having an HLA type in which 3 loci of HLA-DR or 4 loci plus HLA-C are matched.
  • pancreatic blasts obtained using the above steps can be used as a medicine (especially a medicine for cell medicine).
  • the cells Prior to administration, the cells may be treated with an agent that irradiates radiation or inhibits cell growth such as mitomycin C.
  • pancreatic blasts are suspended in physiological saline or the like, and the cell suspension is used as a medicine, which is directly administered to the patient's pancreas, mesentery, spleen, liver and kidney (especially kidney capsule) or polyvinyl alcohol.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the cells may be administered with a scaffold such as polyethylene glycol, gelatin, or collagen.
  • the number of cells to be administered may be appropriately increased or decreased according to the size of the body. For example, 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 cells / individual, preferably 5 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 cells. / Individual, more preferably 1 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 10 cells / individual.
  • the medicament containing the pancreatic blast may be used for the treatment of pancreatic diseases, and examples of the pancreatic diseases include acute pancreatitis, chronic pancreatitis, diabetes, pancreatic cancer, and Langerhans islet tumor.
  • the pancreatic blast cells of the present invention are effective against diabetes because they are induced in the body into insulin-producing cells that secrete insulin corresponding to the glucose concentration. In particular, it is effective for type 1 diabetes, in which insulin-producing cells die.
  • cells are human and non-human animals (eg, mice, rats, cows, horses, pigs, sheep, monkeys, dogs, cats, birds, etc.), with particular limitations although not, human-derived cells are particularly preferred.
  • the peripheral blood mononuclear cell-derived iPS cell line (585A1) (Okita K, et al, Stem Cells. 2013 31: 458-466) is available from the Institute for iPS Cell Research, Kyoto University. Using the 585A1 strain obtained from Kyoto University, differentiation was induced into pancreatic blast cells by the following steps.
  • the cell culture medium obtained in the step 2-1 is 50 ng / ml KGF, 0.2 ⁇ M LDN193189 (Axon Medchem), 10 nM TTNPB (Santa Cruz Biotechnology), 0.5 ⁇ M 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine (KAAD-cyclopamine or K-CYC) (Toronto Research Chemicals) and Implanted MEM Zinc Option medium containing 1% B-27 were replaced and cultured for 2 days.
  • the cell culture medium obtained in step 2-3 is 100 ng / ml KGF, 0.2 ⁇ M LDN193189, 50 ng / ml EGF (R & D systems), each concentration (0.01 ⁇ M to 50 ⁇ M) AT7867 (Selleck Chemicals) (as a negative control) DMSO) and Improved MEM Zinc Option medium (15 ⁇ 10 4 / ml) containing 1% B-27 was added, followed by further cultivation for 4 days.
  • NKX6.1 antibody DSHB
  • FIG. 4A When the cells obtained in Stage 3 were immunostained with NKX6.1 antibody (DSHB) (Fig. 4A), it was confirmed that the content of at least NKX6.1-positive cells increased depending on the addition concentration of AT7867. (FIG. 4B).
  • double staining with PDX1 antibody and NKX6.1 antibody confirmed that PDX1-positive NKX6.1-positive cells increased with the addition of AT7867 (FIGS. 5A and B).
  • RNA extraction from cells was performed using RNeasy kit (Qiagen), and reverse transcription reaction was performed using ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo) and oligo (dT) 20 primer.
  • Quantitative PCR was performed using SYBR Premix Ex Taq II (Takara) and StepOnePlus TM Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Gene expression was standardized by GAPDH expression, and the relative ratio of gene expression levels was calculated based on the relative standard curve (FIG. 6). It was confirmed that the expression levels of PDX1 and transcription factors PTF1A and NKX6.1, which are indicators of differentiation into pancreatic blasts, increased with the addition of AT7867 over time.
  • AT7867 can induce differentiation into NKX6.1 + cells by specifically increasing PDX1-positive cells.

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Abstract

PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法を提供する。当該培養工程は、接着培養によって行われても良い。PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は多能性幹細胞からインビトロで誘導することができ、本願方法によって多能性幹細胞から膵芽細胞の製造が可能となる。

Description

膵芽細胞の製造方法
　本発明は、膵芽細胞の製造方法および同方法によって製造された膵芽細胞を含む膵疾患治療剤に関する。本願はさらに、当該膵芽細胞を用いる膵疾患の治療法に関する。
　膵臓は、膵リパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、膵アミラーゼなどの消化酵素を分泌する外分泌腺および、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド（PP）等の膵ホルモンを分泌する内分泌腺として機能している。近年、胃分泌ホルモンであるグレリンが膵臓の内分泌細胞からも分泌されることが報告されている。この膵ホルモンは、膵臓の中のα細胞、β細胞、δ細胞およびPP細胞の4種の細胞からなる膵島と呼ばれる細胞塊により産生されている。
　ここで、インスリンは、ブドウ糖の利用、蛋白の合成、中性脂肪の形成および貯蔵を促進し、血糖値を低下させ、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。グルカゴンは、肝糖原分解、糖新生作用などを介する血糖上昇ホルモンとしてインスリンと並び糖代謝調節機構において重要な役割を担っている。ソマトスタチンは、ソマトスタチンレセプターへの結合を介して作用を発現し、膵臓でのグルカゴン、インスリン等の種々のホルモン分泌を抑制する。ＰＰは、食物摂取に対応してランゲルハンス島の細胞から分泌されるホルモンであり、飽食因子として知られ、食物摂取を抑制し、体重増加を低減させる働きがある。グレリンは食物摂取を刺激し、脂肪酸化を低下させることによって体重を増加させることが知られている。
　糖尿病は、インスリンが不足したりその働きが失われたりすることによって発症する疾患であり、一度発症すると根治させることが難しい疾患である。糖尿病は、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）と２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の大きく２つのタイプに分類することができる。
　２型糖尿病は、インスリンに対する抵抗性を獲得することで発症する慢性疾患であり、食べ過ぎや運動不足によっておこる肥満やストレス等、生活習慣が発症メカニズムと考えられている糖尿病である。２型糖尿病は中高年で発病することが多く、糖尿病患者の多くは２型糖尿病に罹患している。
　一方、１型糖尿病は、自己免疫疾患やウイルス感染等によってβ細胞（インスリン産生細胞）が破壊され、インスリンが体内に分泌されないことによっておこる疾患である。インスリンの投与による対症療法が主に行われているが、体内で常に変化する血糖値を自動的にコントロールして、患者の負担を軽くできる治療法として、膵臓移植又は膵島移植も行われている。この治療法によって正常な血糖値を達成することは可能であるが、移植可能な膵臓又は膵島が不足しているのが現状である。また、移植片に対する免疫拒絶反応を回避するために、患者は免疫抑制剤を一生服用し続ける必要があり、感染症の危険性や免疫抑制剤による副作用等の問題が残る。
　１型糖尿病の治療法として、体外で患者由来の細胞からインスリン産生細胞自体を誘導し、誘導したインスリン産生細胞を患者の生体内に移植することが検討されている。インスリン産生細胞は例えば、患者の膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる等により得ることができる。
　インスリン産生細胞を得る他の方法としては、胚性幹（ES）細胞や人工多能性幹（iPS）細胞などの多能性幹細胞をアクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）やレチノイン酸（ＲＡ）を用いて分化誘導する方法が例示される（特許文献１、非特許文献１から５）。さらに、多能性幹細胞へＰＤＸ１を導入して培養する方法（特許文献２および特許文献３）、低分子化合物を適宜組み合わせて多能性幹細胞に作用させてインスリン産生細胞を製造する方法（特許文献４および非特許文献６）が知られている。しかしながらこのようにin vitroで得られたインスリン産生細胞を生体内に投与して、グルコース応答能を獲得したという報告は無い。一方、膵前駆細胞を製造し、生体内に投与した場合において、投与した細胞からグルコース濃度に応じてインスリンが分泌されたとの報告がある（非特許文献７および非特許文献８）。
特開２００９－２２５６６１号公報 米国特許７５３４６０８号公報 特開２００６－０７５０２２号公報 ＷＯ２０１１／０８１２２２
E.Kroon et al.,Nature Biotechnology(2008)Vol.26,No.4:443-452 K.A.D’Amour et al.,Nature Biotechnology(2006)Vol.24,No.11:1392-1401 W.Jiang,Cell Research(2007)17:333-344 J.H.Shim et al.,Diabetologia(2007)50:1228-1238 R.Maehr et al.,PNAS(2009),vol.106,No.37:15768-15773 Kunisada Y et al.,Stem Cell Res.(2012) vol.8,No.2:274-284 Kroon E et al.,Nat Biotechnol.(2008) vol.26,No.4:443-452 Rezania A et al., Diabetes.(2012) vol.61,No.8:2016-2029.
　一の態様において、本願はPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。より具体的には、多能性幹細胞から誘導したPDX1陽性NKX6.1陰性細胞をさらに分化する工程を含み、膵芽細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。
　他の態様において、膵臓疾患治療剤、並びに膵臓疾患治療方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地中で培養することで膵芽細胞を効率よく分化誘導できることを初めて見出した。さらに、Akt阻害剤は、PDX1陽性細胞を特異的に増殖する機能を有することを初めて見出した。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。
　すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法。
［２］　前記培養が、接着培養条件下で行われる、［１］に記載の方法。
［３］　前記Akt阻害剤が、AT7867である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］　前記PDX1陽性NKX6.1陰性細胞が、次の２つの工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞である、［１］から［３］のいずれか１項に記載の方法：
（１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
（２）工程（１）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
［５］　前記工程（１）が、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程である、［４］に記載の方法。
［６］　前記工程（２）が、さらに、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、［４］または［５］に記載の方法。
［７］　前記工程（２）が、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養した後、細胞を解離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する工程を含む、［６］に記載の方法。
［８］　前記BMP阻害剤が、LDN193189である、［１］から［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］　前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、［５］から［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］　前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、［６］から［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］　前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、［６］から［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］　前記膵芽細胞がPDX1陽性およびNKX6.1陽性である［１］から［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］　前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、［１］から［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］　以下の工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法：
（ｉ）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程。
［１５］　前記培養が、接着培養条件下で行われる、［１４］に記載の方法。
［１６］　前記工程（ｉ）が、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程である、［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］　前記工程（ｉｉ）が、さらに、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、［１４］または［１６］のいずれか１項に記載の方法。
［１８］　前記工程（ｉｉ）が、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養した後、細胞を解離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する工程を含む、［１７］に記載の方法。
［１９］　前記Akt阻害剤が、AT7867である、［１４］から［１８］のいずれか１項に記載の方法。
［２０］　前記BMP阻害剤が、LDN193189である、［１４］から［１９］のいずれか１項に記載の方法。
［２１］　前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、［１６］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２２］　前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、［１７］から［２１］のいずれか１項に記載の方法。
［２３］　前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、［１７］から［２２］のいずれか１項に記載の方法。
［２４］　前記膵芽細胞が、PDX1陽性およびNKX6.1陽性である［１４］から［２３］のいずれか１項に記載の方法。
［２５］　前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、［１４］から［２４］のいずれか１項に記載の方法。
［２６］　PDX1陽性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、PDX1陽性細胞の増殖方法。
［２７］　前記培養が、接着培養条件下で行われる、［２６］に記載の方法。
［２８］　前記Akt阻害剤が、AT7867である、［２６］または［２７］に記載の方法。
［２９］　前記BMP阻害剤が、LDN193189である、［２６］から［２８］のいずれか１項に記載の方法。
　本発明によってPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から効率良く膵芽細胞へ誘導することが可能となる。
図１は、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造するプロトコールの概略図を示す。 図２は、各濃度のAT7867を第３工程（stage 3）にて添加した場合に得られた細胞数を計測した結果を示す。 図３は、第3工程（stage 3）の各日数におけるPDX1陽性細胞（左図）、PDX1陽性Ki67陽性細胞（中央図）およびPDX1陰性Ki67陽性細胞（中央図）の含有率を示す。 図４Aは、第3工程（stage 3）後のNKX6.1抗体の免疫染色像（上図）および核染色像（下図）を示す。白色が染色部分を示す。 図４Bは、各濃度のAT7867を用いた場合のNKX6.1陽性細胞の含有率を示す。 図５Aは、第3工程（stage 3）後のPDX1抗体およびNKX6.1抗体を用いて染色した細胞群のフローサイトメトリーの結果を示す。図５Bは、当該フローサイトメトリーの結果から得られたPDX1陽性NKX6.1陰性細胞およびPDX1陽性NKX6.1陽性細胞の含有率を示す。 図６は、第3工程（stage 3）開始から終了までの期間（0-4日目）において、毎日定量ＰＣＲを行い、PDX1、PTF1AおよびNKX6.1の発現量を測定した結果を示す。実線はAT7867、点線は対照群であるDMSOを添加した場合の遺伝子発現量の推移を表す。
　本願の一つの態様として、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞をKGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞を製造する方法を提供する。
　膵芽細胞とは、内分泌細胞、膵管細胞および外分泌細胞などの膵臓を形成する細胞へと分化誘導できる細胞であり、少なくともPDX1およびNKX6.1が発現している細胞が例示される。このほかにも、SOX9、またはGATA4などの遺伝子マーカーが発現している細胞であっても良い。
　本態様によって製造される膵芽細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上の膵芽細胞が含まれる細胞集団である。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞を製造するにあたり、当該PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で接着培養しても良い。
本願明細書及び請求の範囲において接着培養とは、コーティング処理された培養皿にて培養することである。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、ゼラチン、細胞外タンパク質（例えば、コラーゲン、ラミニン（例えば、ラミニン１１１、４１１または５１１）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン等）、または当該細胞外タンパク質の断片、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞を製造するにあたり、取扱いの簡便さから接着培養にて行うことが好ましいが、細胞凝集塊を形成した浮遊培養を行ってもよい。
　浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することである。特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）または２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（Lipidure）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へKGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むIMEM Zinc Option培地である。
Akt阻害剤は、Ａｋｔの活性を抑制する薬物であればよく、例えば、Merck Millipore社の Akt Inhibitor（Akt Inhibitor、Akt Inhibitor II～XIII）、MK-2206、Perifosine (KRX-0401)、 GSK690693、AT7867、Ipatasertib (GDC-0068)、AZD5363、SC79、Afuresertib (GSK2110183)、AT13148、TIC10、Triciribine、CCT128930、PHT-427、Palomid 529、PF-04691502、Honokiol、Miltefosine、Deguelin、A-674563、sc-221226、抗Ａｋｔ抗体、Ａｋｔのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。
　Akt阻害剤としてAT7867を用いる場合、その濃度は、０．０１μMから４μM、好ましくは、０．１μMから１μM、より好ましくは、０．５μMである。
　KGFは、Keratinocyte Growth Factorと呼ばれるタンパク質であり、FGF-7と呼ばれることもある。KGFは、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。KGFの濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから200 ng/mlである。
　EGFは、上皮成長因子またはEpidermal Growth Factorと呼ばれるタンパク質である。EGFは、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。EGFの濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
　BMP阻害剤は、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN-193189（すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が例示される。好ましくは、Nogginである。Nogginは、Peprotech社等の市販されているものを使用することができる。
　BMP阻害剤としてLDN-193189を用いる場合、その濃度は、０．０１ μMから５μM、好ましくは、０．１μMから１μM、より好ましくは、０．２μMである。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程に使用される培地は、さらにROCK阻害剤、非筋ミオシンII阻害剤およびTGFβ阻害剤から成る群より選択される少なくとも一つの化合物を含んでいてもよい。
ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、SR3677（例、Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645(2008)参照）、GSK269962（例、Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007)またはWO2005/037197参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil/HA1077、SR3677、GSK269962およびH-1152が挙げられる。
　ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合の培地中の濃度は、0.1μMから100μM、好ましくは、1μMから500μM、さらに好ましくは、10μＭから200μMである。
　ROCK阻害剤としてFasudil/HA1077を用いる場合の培地中の濃度は、1μMから100μM、好ましくは、10μMから100μMである。
　ROCK阻害剤としてSR3677を用いる場合の培地中の濃度は、0.1μMから50μM、好ましくは、0.5μMから50μMである。
　ROCK阻害剤としてGSK269962を用いる場合の培地中の濃度は、0.001μMから100μM、好ましくは、0.005μMから50μM、さらに好ましくは、0.05μMから10μMである。
　ROCK阻害剤としてH-1152を用いる場合の培地中の濃度は、5μMから100μM、好ましくは、10μMから50μMである。
非筋ミオシンII阻害剤は、非筋ミオシンIIの重鎖アイソフォームの一つである非筋ミオシンIIAまたは非筋ミオシンIIBの重鎖サブユニットのATPase活性の阻害剤、ミオシン軽鎖キナーゼの阻害剤が例示される。このような薬剤として、例えば、ブレビスタチン（Blebbistatin）A3、Calphostin C、Goe6976、Goe7874、Fasudil/HA1077、Hypericin、K-252a、KT5823、ML-7、ML-9、Piceatannol、Staurosporine、W-5、W-7、W-12、W-13、Wortmannin等が挙げられるがこれらに限定されない。本工程で用いる好ましい非筋ミオシンII阻害剤としては、ブレビスタチンおよびFasudil/HA1077が挙げられる。
　本発明において、非筋ミオシンII阻害剤としてブレビスタチンを用いる場合の培地中の濃度は、1μMから200μM、好ましくは、10μMから100μMである。
　TGFβ阻害剤は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009146408) ALK5阻害剤II（２－［３－［６－メチルピリジン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］－１，５－ナフチリジン）、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII（６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－［６－メチル－ピリジン－２－イル］－１Ｈ－イミダゾル－４－イル］－キノキサリン）およびこれらの誘導体などが例示される。好ましくは、ALK5阻害剤IIであり得る。
　TGFβ阻害剤としてALK5阻害剤IIを用いる場合の培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１から５０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから２０μＭである。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程の日数は、長期間培養することで膵芽細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上または１４日以上が挙げられる。好ましくは、３日以上２０日以下であり、より好ましくは、４日以上20日以下、例えば４日である。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞とは、PDX1を発現しているが、NKX6.1を発現していない細胞であれば、特に限定されない。PDX1を発現しているとは、公知の方法にて、PDX1遺伝子または遺伝子産物を検出できることを意味し、NKX6.1を発現していないとは、NKX6.1遺伝子または遺伝子産物を検出できないことを意味し、当該検出方法として、例えば、免疫染色法などが例示される。
　本願の他の態様として、PDX1陽性細胞をKGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、PDX1陽性細胞を増殖する方法を提供する。PDX1陽性細胞とは、PDX1が陽性である細胞を意味し、他のマーカー遺伝子、特に、NKX6.1の発現については、特に限定されないが、好ましくは、NKX6.1陰性細胞である。PDX1陽性細胞を増殖するとは、少なくともPDX1陽性細胞が細胞分裂によって増えることを意味し、例えば、Ki67抗体で染色される細胞数が増加することを確認することによっても当該増殖を確認することができる。PDX1陽性細胞の増殖の条件は、上述したPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程と同じ条件を用いることによって行い得る。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、生体内から単離されていてもよく、既知の方法にて、多能性幹細胞等の他の細胞種から製造されてもよい。ある態様においてPDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、次の工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞であっても良い：
（工程１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
（工程２）工程１で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
従って、上述のPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞誘導する方法を工程３として適用することで、次の工程を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法も提供する：
（工程１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
（工程２）工程１で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、　　　　
（工程３）工程２で得られた細胞（PDX1陽性NKX6.1陰性細胞）を単一細胞へ分離後、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程。
　これらの態様の多能性幹細胞をアクチビンを含む培地で培養する工程（工程１）で使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へアクチビンを適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むRPMI 1640培地である。
　本態様の工程１において、多能性幹細胞は、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態として培養してもよく、または、細胞同士が接着した細胞凝集塊の状態で培養してもよい。より好ましくは、単一細胞の状態に分離して培養する。分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。多能性幹細胞は、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養することができる。
多能性幹細胞を単一細胞の状態に分離した際のアポトーシスを抑制する目的でROCK阻害剤を基礎培地へ添加しても良い。ROCK阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、好ましくは、Y-27632である。本目的で、ROCK阻害剤を添加する場合、添加期間は特に限定されないが、１日以上、または２日以上が例示され、好ましくは１日である。
　本態様の工程１における接着培養は、前述の条件と同じ方法によって行い得る。
　アクチビンは、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれのアクチビンもよいが、特にアクチビンＡが好適に用いられる。また、アクチビンとしてはヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。本発明に使用するアクチビンとしては、分化に用いる多能性幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
　アクチビンを用いる場合、培地中の濃度は、通常０．１から２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５から１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０から１００ｎｇ／ｍｌである。
　工程１は、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程であっても良い。
ＧＳＫ３阻害剤とは、GSK－3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK－3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK－3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK－3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。他の入手先から入手しても、あるいは自ら作製してもよい。本発明で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
　CHIR99021を用いる場合、培地中の濃度は、通常０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは１μＭから５μＭである。濃度は、適宜変更しても良く、例えば、３μＭの後、１μＭと変更しても良い。
　アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する場合、多能性幹細胞の培養開始時に添加することが望ましい。ＧＳＫ阻害剤の添加期間は特に限定されないが、１日以上、２日以上または３日以上が例示され、好ましくは１日から３日である。その後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する。
　工程１の日数は、例えば、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上が挙げられる。長期間培養することで膵芽細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、効率の観点からは１０日以下、好ましくは８日以下とするのがよい。より好ましい工程１の日数は、４日である。
　例えば多能性細胞をアクチビンＡに加えてＧＳＫ３阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地で１日培養し、次いでアクチビンＡとＧＳＫ３阻害剤を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で２日培養し、次いでアクチビンＡを含むがＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤は含まない培地でさらに１日培養する態様が例示される。
　工程１において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　工程１で得られた細胞をKGFを含む培地で培養する工程（工程２）で使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へKGFを適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むIMEM Zinc Option培地である。
　工程２で用いるKGFは、上述と同様のものを用いることができ、KGFの濃度は、上述より低濃度を用いることが好ましく、例えば、１ ng/mlから500 ng/ml、好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
　工程２は、さらに、KGFに加えて、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含んでもよい。
　工程２で用いるBMP阻害剤は、上述と同様の条件で用いることができる。
　工程２に用いるレチノイン酸誘導体は、天然のレチノイン酸が有する機能を保持する人工的に修飾されたレチノイン酸を意味し、例えば、4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-Benzoic acid（AM580）（Tamura K,et al., Cell Differ. Dev. 32: 17-26 (1990)）、4-[(1E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-Benzoic acid（TTNPB）（Strickland S, et al., Cancer Res. 43: 5268-5272 (1983))、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３－デヒドロレチノイン酸、３－デヒドロレチノール、３－デヒドロレチナール、または、Abe, E., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 78: 4990-4994 (1981)、 Schwartz, E. L.et al., Proc.Am.Assoc.Cancer Res. 24: 18 (1983)、および Tanenaga, K. et al., Cancer Res. 40: 914-919 (1980) に記載されている化合物が挙げられる。本工程で用いる好ましいレチノイン酸誘導体としては、TTNPBが挙げられる。本工程で用いるレチノイン酸誘導体の濃度は、使用するレチノイン酸誘導体に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、レチノイン酸誘導体としてTTNPBを用いる場合、1ｎMから100ｎM、好ましくは、５ｎMから５0ｎM、さらに好ましくは、５ｎＭから１０ｎMである。
　工程２に用いるヘッジホッグ経路阻害剤は、ソニック・ヘッジホッグ、インディアン・ヘッジホッグ、およびデザート・ヘッジホッグのいずれかが膜受容体であるPatchedに結合して起こるシグナル、例えば、Smoothenedの活性を阻害する化合物を意味し、ヘッジホッグが受容体に結合して起こるシグナルを阻害すれば、特に限定されないが、例えば、シクロパミン、ジェルビン、3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl)（KAAD）-シクロパミン、CUR-61414、SANT-1、SANT-2、SANT-3、SANT-4、IPI-926、IPI-269609、GDC-0449およびNVP-LDE-225が挙げられる。好ましくは、KAAD-シクロパミンである。工程２で用いるヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、使用するヘッジホッグ経路阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ヘッジホッグ経路阻害剤としてKAAD-シクロパミンを用いる場合、0.1 nMから1 μＭ、好ましくは、1 nMから500 nMである。
　工程２において、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する場合、培養の途中で、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態とし、再度、同条件で培養を継続しても良い。このとき、単一細胞の状態に分離した際のアポトーシスを抑制する目的でROCK阻害剤を基礎培地へ添加しても良い。ROCK阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、好ましくは、Y-27632である。本目的で、ROCK阻害剤を添加する場合、添加期間は特に限定されないが、１日以上、または２日以上が例示され、好ましくは１日である。
　工程２の日数は、例えば、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、または８日以上が挙げられる。長期間培養することで膵芽細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、効率の観点からは１０日以下、または９日以下とすることが好ましい。より好ましい日数は、７日である。KGFを含む培地で培養後、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する場合、KGFを含む培地での培養日数は、例えば、３日以上、または４日以上であり、より好ましくは、４日である。
　一例として、工程１における接着培養にて得られた細胞の培地を、工程２においてまずKGFを含有する培地に交換して４日間培養し、次いでKGFに加えてBMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ阻害剤を含有する培地に交換して２日間培養する。その後細胞を培養容器の壁面から分離して単一細胞の状態とし、さらにROCK阻害剤を含む培地にて１日培養する態様が挙げられる。
　工程２において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。工程２終了時に得られる細胞はPDX1陽性NKX6.1陰性細胞となる。工程２終了時に得られる細胞は、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞以外の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上または７０％以上のPDX1陽性NKX6.1陰性細胞が含まれる細胞集団である。
　本願明細書および請求の範囲において多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹(ES)細胞(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)、胚性生殖細胞（「EG細胞」）(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)、人工多能性幹(iPS)細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。より好ましくは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。
　iPS細胞は移植用膵芽細胞の材料として特に好適に用いられる。得られた膵芽細胞を医薬として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型と同一もしくは実質的に同一である体細胞から得たiPS細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
　他の態様においては、上記の工程を用いて得られた膵芽細胞を医薬（特に細胞医療の為の医薬）として利用することができる。当該細胞は、投与前に、放射線を照射する、または、マイトマイシンＣなどの細胞増殖を抑止する薬剤によって処理されても良い。
　得られた膵芽細胞を生理食塩水等に懸濁させ細胞懸濁液を医薬として用い、患者の膵臓、腸間膜、脾臓、肝臓および腎臓（特に、腎被膜化）へ直接投与もしくはポリビニルアルコール（PVA）（Qi Z et al., Cell Transplant.21: 525-534 (2012)）またはアルギン酸（Dufrane D, et al., Transplantation 90: 1054-1062 (2010)）でカプセル化して投与することによって行い得る。投与の際、当該細胞は、ポリエチレングリコール、ゼラチン、またはコラーゲン等の足場材と共に投与しても良い。投与する細胞数は、体躯の大きさに合わせて適宜増減して用いても良く、例えば、１×１０８から１×１０１０細胞／個体、好ましくは、５×１０８から１×１０１０細胞／個体、さらに好ましくは、１×１０９から１×１０１０細胞／個体である。
　当該膵芽細胞を含む医薬は、膵疾患の治療に用いても良く、膵疾患には、急性膵炎、慢性膵炎、糖尿病、膵癌、ランゲルハンス島腫瘍などが例示される。本発明の膵芽細胞は、体内で、グルコース濃度に対応して、インスリンを分泌するインスリン産生細胞へと誘導されることから、糖尿病に対して有効である。特に、インスリン産生細胞が死滅する、１型糖尿病に有効である。
　本明細書中に記載される「細胞」の由来は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）であり、特に限定はされないが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
　iPS細胞株
　末梢血単核球由来のiPS細胞株（585A1）（Okita K, et al, Stem Cells. 2013 31:458-466）は、京都大学iPS細胞研究所より入手可能である。京都大学より入手した585A1株を用いて、次の工程により、膵芽細胞へと分化誘導した。
　分化誘導工程（図１）
（Stage 1）
iPS細胞株（585A1）をMatrigelをコートした24 well plateに2.0×105/wellで播種し、2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地（ナカライテスク）に100 ng/ml アクチビンＡ（R&D systems）、3 μM CHIR99021（Axon Medchem）および10 μM Y-27632（WaKo）を添加して1日間培養した。培地を100 ng/mlアクチビンＡ、1 μM CHIR99021および2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地に交換し、2日間培養した。さらに、培地を100ng/ml アクチビンＡおよび2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地に交換し、1日間培養した。
　（Stage 2-1）
第１工程で得られた細胞の培地を50 ng/ml KGF(R&D systems)および1％のB-27（Life Technologies）を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)に交換して4日間培養した。
　（Stage 2-2）
第２-1工程で得られた細胞の培地を50 ng/ml KGF、0.2μM LDN193189（Axon Medchem）、10nM TTNPB（Santa Cruz Biotechnology）、0.5 μM 3－Keto－N－aminoethyl－N'－aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine（KAAD‐シクロパミンまたはK-CYC）(Toronto Research Chemicals)および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地に交換して2日間培養した。
　（Stage 2-3）
　続いて、得られた細胞をTrypsinを用いて単一細胞へと分離し、Matrigelをコートした24 well　plateに1.2×105/ cm2にて播種した。50 ng/ml KGF、0.2μM LDN193189、10nM TTNPB、0.5 μM KAAD‐シクロパミン、10 μM Y-27632および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地を加え、1日間培養した。
　第２工程終了時に得られた細胞をBD Cytofix/CytopermTM Kitを用いて処理した後、抗PDX1抗体（R&D systems）および抗NKX6.1抗体（University of Iowa）を用いて染色しフローサイトメーターにて調べたところ、得られた細胞の約６０％がPDX1陽性NKX6.1陰性の細胞であることが確認された。
　（Stage 3）
第2-3工程で得られた細胞の培地を100 ng/ml KGF、0.2μM LDN193189、50ng/ml EGF（R&D systems）、各濃度（0.01μM～50μM）のAT7867（Selleck Chemicals）（陰性対照としてDMSO）および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（15×104/ml）を添加してさらに4日間培養した。
　細胞解析
　Stage 3で得られた細胞を計数したところ、陰性対照であるDMSOと比較してAT7867の添加濃度依存的に得られる細胞数が増加することが確認された（図２）。さらに、Stage 3で1 μMのAT7867を添加して１から４日後に得られた細胞をPDX1抗体（R&D Systems）およびKi67抗体（Novocastra）にて免疫染色したところ、増殖する細胞は少なくともPDX１が陽性である細胞であることが確認された（図３）。
　Stage 3で得られた細胞をNKX6.1抗体（DSHB）にて免疫染色したところ（図４A）、AT7867の添加濃度依存的に、少なくともNKX6.1が陽性細胞の含有率が増加することが確認された（図４B）。同様に、PDX1抗体およびNKX6.1抗体で二重染色したところ、AT7867の添加によりPDX1陽性NKX6.1陽性細胞が増加することが確認された（図５AおよびB）。
　Stage 3で1μMのAT7867を添加して培養した。Stage 3の0日目から4日目まで毎日細胞を採取し、定量PCRを行ってPDX1、PTF1A およびNKX6.1それぞれの遺伝子発現量を測定した。細胞からのRNAの抽出はRNeasy kit (Qiagen)を使用し、逆転写反応はReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo)およびoligo (dT)20 primerを使用して行った。定量PCRはSYBR Premix Ex Taq II (Takara)を用い、StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を使用して行った。遺伝子発現はGAPDHの発現により標準化し、遺伝子発現量の相対比を相対標準曲線を元に算出した（図６）。AT7867の添加により、経時的にPDX1および、膵芽細胞への分化の指標となる転写因子であるPTF1A およびNKX6.1の発現量が上昇することが確認された。
　以上のように、AT7867は、PDX１陽性細胞を特異的に増加させることで、NKX6.1+細胞への分化誘導を行うことができることが示唆された。

Claims (29)

  1. 　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法。
  2. 　前記培養が、接着培養条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記Akt阻害剤が、AT7867である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記PDX1陽性NKX6.1陰性細胞が、次の２つの工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法：
    （１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
    （２）工程（１）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
  5. 　前記工程（１）が、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程である、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記工程（２）が、さらに、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記工程（２）が、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養した後、細胞を解離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する工程を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記BMP阻害剤が、LDN193189である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、請求項６から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記膵芽細胞がPDX1陽性およびNKX6.1陽性である請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　以下の工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法：
    （ｉ）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程。
  15. 　前記培養が、接着培養条件下で行われる、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記工程（ｉ）が、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程である、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 　前記工程（ｉｉ）が、さらに、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記工程（ｉｉ）が、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養した後、細胞を解離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記Akt阻害剤が、AT7867である、請求項１４から１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　前記BMP阻害剤が、LDN193189である、請求項１４から１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、請求項１７から２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 　前記膵芽細胞が、PDX1陽性およびNKX6.1陽性である請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 　前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、請求項１４から２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. PDX1陽性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、PDX1陽性細胞の増殖方法。
  27. 　前記培養が、接着培養条件下で行われる、請求項２６に記載の方法。
  28. 　前記Akt阻害剤が、AT7867である、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. 　前記BMP阻害剤が、LDN193189である、請求項２６から２８のいずれか１項に記載の方法。
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