WO2017010854A1 - 나노입자를 이용한 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법 - Google Patents

나노입자를 이용한 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법 Download PDF

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nanoparticles
acid detection
amplification
primer
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황상현
임지현
강수진
이도훈
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National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid detection kit using a nanoparticle and a nucleic acid detection method, and more particularly, to a nucleic acid detection method comprising amplifying and labeling a nucleic acid and capturing the nanoparticles and centrifuging the same. It relates to a nucleic acid detection kit.
  • nucleic acid testing is ultimately used to reduce overall medical expenses through early detection of disease, and is used for simultaneous analysis, demand, increase, and field test of various nucleic acids for pathogen testing, genotyping and cancer diagnosis.
  • the demand for available products is expected to skyrocket.
  • development of DNA / RNA markers with high specificity and sensitivity for genotyping and cancer diagnosis should be made.
  • nucleic acid tests should satisfy the analytical validity of sensitivity, specificity, precision, accuracy, and clinical validity and clinical utility of clinical sensitivity, specificity, and negative predictive value. do.
  • nucleic acid tests There are two main types of nucleic acid tests: nucleic acids derived from microorganisms infected by the human body and nucleic acids directly derived from the human body. The former accounts for more than 80% of the nucleic acid test market as a diagnostic test. The latter is a genetic test that analyzes nucleic acids involved in disease induction and treatment, with a market share of less than 20%, but the potential value and market potential are very high.
  • Nucleic acid detection using nanoparticles among several nucleic acid detection methods is a next-generation technology that can drastically improve low-speed and high-cost methods, which are disadvantages of conventional negative charged polyanion and silica membrane technologies.
  • a system for producing a nanoparticle and performing a coating process for capturing nucleic acid to selectively bind to a nucleic acid molecule of interest and detect the nucleic acid has been competitively developed.
  • US Patent US20140100131 uses magnetic particles as a method for detecting a target gene
  • US Patent US20100009383 relates to a method for detecting a desired biomolecule. After recovering a target material with magnetic particles, centrifugation is performed. May be performed to detect aggregated target material.
  • the conventional method is inconvenient to add an additional DNA probe or antibody, and additional separation and washing process is required, the invention for a faster nucleic acid detection method was required.
  • the present inventors prepared a gel-card using the amplified target nucleic acid and nanoparticles, and demonstrated that it can be confirmed by naked eye / fluorescence after centrifugation, and this nucleic acid detection method detects a specific nucleic acid for a specific disease. It was confirmed that there is a significant effect. Accordingly, the present invention has invented a nucleic acid detection method and a nucleic acid detection kit capable of determining a negative, positive determination of a specific disease more quickly, simply, sensitively and reliably through a nucleic acid detection method that does not include a separation step. .
  • the present invention provides a kit for detecting nucleic acids quickly and accurately.
  • Another object of the present invention is to provide a nanoparticle complex for detecting a nucleic acid.
  • Still another object of the present invention is to provide a gel card for detecting a nanoparticle complex.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting nucleic acids quickly and accurately.
  • the present invention provides a primer set that specifically binds to a nucleic acid to be detected; Capture nanoparticles; It provides a nucleic acid detection kit comprising a; and a gel card in which the components and the gel components that cause the difference in density are sequentially stacked.
  • the present invention also provides a detectable nanoparticle complex comprising nanoparticles to which a target nucleic acid has been trapped or bound for use in an assay for detecting a target nucleic acid.
  • the present invention also provides a gel card in which a glass bead component and a gel component are sequentially stacked to detect a nanoparticle composite.
  • the invention also relates to the use of a detectable nanoparticle complex comprising nanoparticles to which a target nucleic acid has been trapped or bound for use in an assay for detecting a target nucleic acid.
  • the present invention also relates to the use of a gel card in which a glass bead component and a gel component are sequentially stacked to detect the nanoparticle composite.
  • the present invention also includes the steps of: (a) amplifying a target nucleic acid with a primer set that specifically binds to the target nucleic acid; (B) capturing or binding the nucleic acid to the nanoparticles by adding nanoparticles to the nucleic acid amplified in step (a); (C) placing the complex in which the nucleic acid is captured or bound to the nanoparticles in the gel card container in step (b); (D) centrifuging the mixture prepared in step (c); And ( ⁇ ) provides a nucleic acid detection method using a nanoparticle comprising the step of comparing the position of the precipitate in the gel card container with the control.
  • the primer set of step (a) may be a biotin-labeled forward primer and a fluorescence-labeled reverse primer.
  • the step (a) may be to amplify the nucleic acid by polymerase chain reaction (PCR) or isothermal amplification reaction.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the isothermal amplification reaction may include Helical-Dependent Amplification (HDA), Recombinase Polymerase Amplification (RPA), Rolling Circle Amplification (RPA), Loop mediated isothermal amplification (LAMP), Nucleic Acid-Sequence-Based Amplification (NABA), Transcription Mediated (TMA) Amplification, Signal Mediated Amplification of RNA Technology (SMART), Strand Displacement Amplification (SDA), Isothermal Multiple Displacement Amplification (IMDA), Single Primer Isothermal Amplification (SPIA), and Circular Helicase-Dependent Amplification (cHDA) It may be carried out by any one method, preferably may be performed by the method of Helcase-Dependent Amplification (HDA), Recombinase Polymerase Amplification (RPA), Rolling Circle Amplification (RCA), Loop mediated isothermal amplification (LAMP) And more preferably by the method of Helcase-Dependent Amplification (HDA) or Recombinas
  • the nanoparticles of the present invention are magnetic particles (magnetic bead), gold (Au) nanoparticles, silver (Ag) nanoparticles, platinum (Pt) nanoparticles, quantum dots (Quantum dot) ), Upconversion nanoparticles (UCNP), graphene-nanoparticle complexes, color dyed particles and latex (latex) nanoparticles may be any one selected from the group consisting of. have.
  • the nanoparticles of the present invention are antibodies that can be bound through antigen-antibody reactions to avidin, amine, streptavidin, and primers that are capable of capturing nucleic acids on surfaces.
  • equivalents such as digoxigenin / anti-digoxigenin antibody, Cy3 / anti-Cy3 antibody, etc.
  • aptamers and oligonucleotides characterized in that the coating is any one selected from the group consisting of nucleotides.
  • the gel component may be any one selected from the group consisting of IgG-agarose, agarose, agarose, agar, cellulose acetate, and polyacrylamide gel. have.
  • the nucleic acid detection method of the present invention may additionally include the step of processing an enhancer, and the separation and washing processes included in the existing method are unnecessary.
  • the present invention relates to a nucleic acid detection method and kit nucleic acid detection method using nanoparticles, and more particularly, a nucleic acid detection method comprising amplifying and labeling a nucleic acid and capturing the nanoparticles and centrifuging the same. It relates to a nucleic acid detection kit.
  • the present invention is effective because it is possible to determine a negative, positive judgment for a particular disease more quickly, simple, sensitive and reliable through nucleic acid detection method that does not include a separation step.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a nucleic acid detection method of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the specific nucleic acid detection method of the present invention and a photograph showing a positive / negative result according to the nucleic acid detection method using a reverse primer labeled with the NHS modification method.
  • Figure 3 is a photograph showing the positive / negative results according to the nucleic acid detection method using a reverse primer labeled with phosphoramide method.
  • Figure 4 is a photograph showing the results of nucleic acid detection according to the centrifugation time.
  • 5 is a photograph showing a nucleic acid detection result with or without an enhancer.
  • Figure 6 is a photograph showing that it can be identified by the naked eye or fluorescence for the results of the detection of HPV DNA nucleic acid.
  • Figure 8 is a photograph of the nucleic acid detection method of the present invention with HPV clinical samples (tubes 1-3, HPV DNA negative samples, tubes 4-6: HPV DNA positive samples).
  • the present inventors have devised a method for rapidly and purifying specific nucleic acids related to diseases through a simple method of amplifying a target nucleic acid, injecting the same into a gel-card together with nanoparticles and gel components, and then centrifuging.
  • nucleic acid means a polymer of nucleotides of any length and includes DNA and RNA.
  • capture or “capture” in the present invention is meant to capture, adsorb, electrostatic bond, ionic bond, at least a portion of one or more agents (or linker portion associated with the agent) to the nanoparticles or surfaces thereof, Covalent bonds, complementary oligonucleotide bonds, binding through an antigen-antibody reaction, or immobilization.
  • primer refers to an oligonucleotide, and refers to conditions under which the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template) is induced, i.e., the presence of a polymerizer such as nucleotide and DNA polymerase, and a suitable temperature. It can serve as a starting point for synthesis under conditions of pH.
  • the primer is deoxyribonucleotide and single chain.
  • Primers used in the present invention can include naturally occurring dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the primer may also include ribonucleotides.
  • the primer should be long enough to prime the synthesis of the extension product in the presence of the polymerizer. Suitable lengths of the primers depend on a number of factors, such as temperature, application and source of the primer, but are typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form hybrid complexes that are sufficiently stable with the template.
  • annealing or “priming” refers to the placement of oligodioxynucleotides or nucleic acids into a template nucleic acid, wherein the polymerase polymerizes the nucleotides to form a nucleic acid molecule that is complementary to the template nucleic acid or portion thereof. Let's do it.
  • inhancer refers to a substance that helps determine the positive and negative of a sample more accurately and clearly.
  • it may be a substance that binds to or fluoresces or develops nucleic acids or primers.
  • gel card can be defined with reference to the gel column described in the WO1999 / 050673 patent.
  • the gel-card is a gel card in which a component that causes a difference in density and a gel component are sequentially stacked, and more preferably, glass beads and agarose gels are sequentially contained in a container.
  • the present invention provides a primer set that specifically binds to a nucleic acid to be detected; Capture nanoparticles; It provides a nucleic acid detection kit comprising a; and a gel card in which the components and the gel components that cause the difference in density are sequentially stacked.
  • the primer set may be a biotin-labeled forward primer and a fluorescence-labeled reverse primer.
  • Primers included in the nucleic acid detection kit of the present invention may be labeled with biotin, primers labeled with biotin can be more easily captured or bound to the nanoparticles to facilitate nucleic acid detection.
  • the primers included in the kit of the present invention may be labeled with fluorescence, and the primers labeled with fluorescence may be identified by fluorescence to determine the presence or absence of nucleic acid through the position of the band.
  • the present invention can be distinguished by the naked eye according to the labeling method of the primer, or can be distinguished by fluorescence negative or positive (see Fig. 6).
  • the fluorescent label of the primer is not limited thereto, but Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, It may be any one or more selected from the group consisting of Iowa Black RQ and IRDye.
  • the fluorescent label of the primer can be largely composed of two methods, the NHS modification (N-hydroxysuccinimide modification) or phosphoramide method (phosphoramidite synthesis).
  • the method of labeling Cy dyes can be carried out using the method described in the catalog "marketing of oligonucleotides with CyDye fluors for fluorescent applications using the LEAD seeker homogeneous imaging system, amersham biosiecnces, Vol. L6, 2000” by amersham biosicences.
  • the positive sample when the nucleic acid is detected using a primer labeled by NHS modification, the positive sample is characterized by forming a band below the negative sample;
  • the positive sample forms a band above the negative sample. This difference is judged to be different depending on the position of the fluorescent label of the primer.
  • a positive sample forms a band below (see FIG. 2), and the fluorescently labeled primer by phosphoramide method is used.
  • the fluorescently labeled primer by phosphoramide method is used.
  • the nanoparticles of the present invention are magnetic particles (magnetic bead), gold (Au) nanoparticles, silver (Ag) nanoparticles, platinum (Pt) nanoparticles, quantum dots (Quaantum dot), upconversion nanoparticles (UCNP) )
  • Graphene-nanoparticle complex Graphene-nanoparticle complex, color dyed nanoparticles (color dyed particles) and latex (latex) is characterized in that any one selected from the group consisting of nanoparticles.
  • Dynabead MyOne Streptavidin C1
  • the particles may be magnetic particles or metal particles.
  • the nanoparticles of the present invention are antibodies that can be bound through antigen-antibody reactions against antigens bound to avidin, amine, streptavidin, and primer that can capture nucleic acids on the surface.
  • antibodies that can be bound through antigen-antibody reactions against antigens bound to avidin, amine, streptavidin, and primer that can capture nucleic acids on the surface.
  • primer that can capture nucleic acids on the surface.
  • aptamers and oligonucleotides are characterized in that the coating is any one selected from the group consisting of.
  • a primer containing an antigen When amplifying a target nucleic acid, a primer containing an antigen is used, and the antibody to the antigen is bound to the surface of the nanoparticle, thereby allowing the nanoparticle to capture the target nucleic acid through an antigen-antibody reaction.
  • the component that causes the difference in density serves to support the gel component from below, and sinks when the density of the nucleic acid-nanoparticle complex is greater than the component that causes the density difference, and the nucleic acid-nano than the component that causes the density difference.
  • the density of the particle complex When the density of the particle complex is low, it plays a role of separating negative and positive using density differences so as not to sink. This eliminates the need for a separate washing or separating process.
  • the component for generating the difference in density of the present invention is not limited as long as it is a material capable of generating a density difference, preferably glass beads, quartz based matrix, percoll, colloidal silica media ), It is any one selected from the group consisting of ficoll (ficoll), and more preferably may be a glass bead (glass bead).
  • the gel component of the present invention is any one selected from the group consisting of IgG-agarose (agarose), agarose (agarose), agar ( ⁇ ⁇ ), cellulose acetate (cellulose acetate) and polyacrylamide gel (polyacrylamide gel) Characterized in that, preferably the component may be IgG-agarose (agarose) or agarose (agarose).
  • IgG-agarose was used, and at least 10 to 30 ⁇ l of IgG-agarose showed minimum time and high discrimination power, and preferably 15 to 25 ⁇ l. The amount may be more preferably 20 ⁇ l.
  • the kit for detecting a nucleic acid of the present invention may further include an enhancer which is an interchelating agent.
  • an enhancer which is an interchelating agent.
  • interchelating agents include SYBR green, ethidium bromide, biotium gelred, and biotium gelgreen.
  • JOJO family POPO family
  • SYTO family BOBO family
  • TOTO family Actinomycin, Adriamycin, Anthracene, Benzopyrene, Propidium diiodide-intertwining, Distamycin, Netroxin and ah Credin, psoralen, berberine, proflavine, daunomycin, doxorubicin, thalidomine, cyanine dye or LDS 751. More preferably, it may be any one selected from the group consisting of SYBR green, ethidium bromide, biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO, POPO, SYTO, BOBO, and TOTO.
  • the nucleic acid detection kit of the present invention preferably comprises a primer set composed of a biotin-labeled forward primer and a fluorescently labeled reverse primer, specifically binding to a nucleic acid to be detected; Capture nanoparticles; Interchelating agents; And a gel card in which components and gel components which generate density differences are sequentially stacked.
  • In situ (in situ) nucleic acid detection kit comprising a.
  • the present invention provides a detectable nanoparticle complex comprising nanoparticles in which a target nucleic acid is trapped or bound for use in an assay for detecting a target nucleic acid.
  • the present invention provides a gel card in which a glass bead component and a gel component are sequentially stacked to detect a nanoparticle composite.
  • the gel card in which the glass bead component and the gel component are laminated is contained in a test container, and the test container may be used as any solid container and may be processed into various other types.
  • the test container may be used as any solid container and may be processed into various other types.
  • any container such as a test tube and a microplate well, can be used.
  • the primer set may be a biotin-labeled forward primer and a fluorescence-labeled reverse primer.
  • Primers included in the nucleic acid detection kit of the present invention may be labeled with biotin, primers labeled with biotin can be more easily captured or bound to the nanoparticles to facilitate nucleic acid detection.
  • the primer set may be a biotin-labeled forward primer and a Cy3-labeled reverse primer.
  • Biotin binds to nanoparticles coated with a substance capable of specifically binding to biotin (for example, avidin) through a labeled forward primer, and the position of the precipitate in the naked eye or in fluorescence by a reverse primer labeled with Cy3. You can check it. Cy3 also acts as an enhancer to more clearly distinguish amplification products.
  • HPV nucleic acid was detected by a primer set represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 or a primer set represented by SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • the nucleic acid of the present invention includes DNA and RNA, and DNA amplification can be used for any known amplification method. Preferably it may be PCR or isothermal amplification. In addition, any amplification method known in the art may also be used for amplifying RNA, preferably, a method of synthesizing and then cDNA synthesis, and more preferably a rt-PCR (reverse transcription PCR) method. .
  • Step (a) of the present invention is characterized by amplifying a nucleic acid by a polymerase chain reaction (PCR) or an isothermal amplification reaction.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the nucleic acid of the present invention includes DNA and RNA, and DNA amplification can be used for any known amplification method. Preferably it may be PCR or isothermal amplification.
  • the isothermal amplification reaction of the present invention is HDA (Helicase-Dependent Amplification), Recombinase Polymerase Amplification (RPA), Rolling Circle Amplification (RCA), Loop mediated isothermal amplification (LAMP), Nucleic Acid-Sequence-Based Amplification (NABA) (Transcription Mediated Amplification), Signal Mediated Amplification of RNA Technology (SMART), Strand Displacement Amplification (SDA), Isothermal Multiple Displacement Amplification (IMDA), Single Primer Isothermal Amplification (SPIA), and Circular Helicase-Dependent Amplification (cHDA) It is characterized in that it is performed by any one method selected from.
  • HDA Helicase-Dependent Amplification
  • RPA Recombinase Polymerase Amplification
  • RCA Rolling Circle Amplification
  • LAMP Loop mediated isothermal amplification
  • NABA Nucleic Acid-Sequence-Based Amplification
  • NABA Nucleic Acid-Se
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Isothermal amplification is a technology that allows DNA / RNA amplification at isothermal without temperature changes. Since isothermal amplification technology does not need time to change the temperature, it is possible to amplify a large amount of DNA in a short time, and thus is widely used as a rapid detection technology of nucleic acids.
  • a typical example is loop-mediated isothermal amplification (LAMP) .LAMP is a technique for amplifying a specific target sequence using 4-6 primers. If magnesium pyrophosphate or SYBR green is added, nucleic acid amplification can be determined by eye after amplification. It is highly applicable to the field quick detection technology in the future.
  • RNA template is used to amplify the reaction by synthesizing RNA again by self-sustained after cDNA synthesis.
  • SMART it is a method that can be detected by amplifying the target DNA or RNA without changing the temperature.
  • SDA 4 primers are needed and Hinc's recognition sequence (GTTGAC) is applied using restriction enzyme.
  • RCA is a method in which ⁇ 29 DNA polymerase cyclically extends a primer to amplify a polymer's circular nucleic acid into long strands. RCA binds tightly and is used as an important foundation for DNA diagnosis among other isothermal amplification techniques.
  • IMDA is a method in which a primer is attached to both sides of a double-stranded nucleic acid and stretched as it is.
  • HDA is a method that separates single strands using a helicase so that all reactions can be carried out at one temperature without the need for separate denaturation times.
  • SPIA synthesizes cDNA from RNA, removes RNA by RNaseH, attaches primer for SPIA, and amplifies by DNA polymerase. Through continuous amplification of SPIA primer and polymerase, multiple strands are produced from one strand of cDNA.
  • cHDA is a technology that uses DNA polymerase and helicase together to make all reactions at one temperature.
  • the nucleic acid was detected by amplification by the HDA and RPA reactions, and the LAMP and RCA reactions are also one of the amplification reactions suitable for in situ molecular diagnosis.
  • the isothermal amplification reaction of the present invention is HDA (Helicase-Dependent Amplification). , RPA (Recombinase Polymerase Amplification), RCA (Rolling Circle Amplification) and LAMP (Loop mediated isothermal amplification), more preferably HDA (Helicase-Dependent Amplification), RPA (Recombinase Polymerase Amplification).
  • any amplification method known in the art can also be used for amplifying RNA, and preferably, it may be a rt-PCR reaction using a NASBA reaction using RNA as a template or synthesizing cDNA.
  • the nanoparticles are not limited so long as they are nanoparticles capable of capturing or binding nucleic acids. Any nanoparticle that can coat or bind a substance capable of capturing nucleic acids can be applied. However, since the present invention is to determine the positive or negative of a specific nucleic acid using the density difference, there should be a difference from the density of the medium. In one embodiment of the present invention uses a glass bead (glass bead) as a medium, since the density of the medium is 1.04 g / ⁇ l can be any particle having a higher density than that. However, it may be applied by using a medium of different density or by using particles smaller than the density of the medium.
  • the nanoparticles of the present invention are magnetic particles (magnetic beads), gold (Au) nanoparticles, silver (Ag) nanoparticles, platinum (Pt) nanoparticles, quantum dots (Quantum dot), upconversion nanoparticles (upconversion nanoparticles) UCNP), graphene-nanoparticle complexes, color dyed particles, or latex nanoparticles.
  • Dynabead MyOne Streptavidin C1
  • magnetic particles metal particles, quantum dots, up-converting nanoparticles, and graphene, which are capable of capturing nucleic acids on the surface of the nanoparticles, Nanoparticle composites, color dyed nanoparticles or latex nanoparticles can be used. Even more preferred may be magnetic particles, metal particles.
  • the nanoparticles of the present invention are antibodies that can be bound through antigen-antibody reactions against antigens bound to avidin, amine, streptavidin, and primer that can capture nucleic acids on the surface.
  • antibodies that can be bound through antigen-antibody reactions against antigens bound to avidin, amine, streptavidin, and primer that can capture nucleic acids on the surface.
  • primer that can capture nucleic acids on the surface.
  • aptamers and oligonucleotides may be coated with any one selected from the group consisting of.
  • a primer containing an antigen When amplifying a target nucleic acid, a primer containing an antigen is used, and the antibody to the antigen is bound to the surface of the nanoparticle, thereby allowing the nanoparticle to capture the target nucleic acid through an antigen-antibody reaction.
  • the gel component of the present invention may be any one selected from the group consisting of IgG-agarose (agarose), agarose (agarose), agar ( ⁇ ⁇ ), cellulose acetate (cellulose acetate) and polyacrylamide gel (polyacrylamide gel) have.
  • IgG-agarose (agarose), showed a minimum time and high discrimination power to distinguish between positive and negative in 10 to 30 ⁇ l of IgG-agarose, preferably 15 to It may be in an amount of 25 ⁇ l, more preferably in an amount of 20 ⁇ l.
  • step (c) of the present invention an enhancer of an intercalating agent may be further processed.
  • the present invention may further process an enhancer, the enhancer may be an interchelating agent, and the interchelating agent may be SYBR green, ethidium bromide, or biotium gelred.
  • the enhancer may be an interchelating agent
  • the interchelating agent may be SYBR green, ethidium bromide, or biotium gelred.
  • biotium gelgreen, JOJO, POPO, SYTO, BOBO, TOTO Actinomycin, Adriamycin, Anthracene, Benzopyrene, Propidium diiodide-intertwining, Disamicin, Net
  • It may be any one selected from the group consisting of robsin and acridine, psoralen, berberine, proflavine, daunomycin, doxorubicin, thalidomine, cyanine dye, and LDS 751, and more preferably.
  • it is composed of SYBR green, ethidium bromide, biotium gelred,
  • GelRed 10,000X, Biotium
  • nanoparticles were mixed with an amplified nucleic acid as an enhancer and treated on a gel-card.
  • Figure 5 when the enhancer was processed, it was confirmed that the distinction between the positive and negative more distinct.
  • fluorescent dyes can bind to primers, and examples of fluorescent dyes include Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ, IRDye series and equivalents.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the present invention, if the target nucleic acid is contained in the sample, the nucleic acid is located below through centrifugation using a density difference after the target nucleic acid is captured in the nanoparticles. On the other hand, if the target nucleic acid is not included, because it does not bind to the nanoparticles and relatively low density, the precipitate is located in the center of the tube.
  • the present invention is characterized in that it does not include a separation process and a washing process separately before the step (d).
  • the present invention is characterized in that in the step (a), by treating two or more primers, each labeled with different colors of fluorescence, to determine the presence or absence of nucleic acids in multiple.
  • two or more primers each labeled with different colors of fluorescence, may be treated to confirm the presence or absence of the nucleic acid in multiple. Therefore, it is possible to determine the presence or absence of multiple nucleic acids through a single experiment, which is an effective nucleic acid detection method because it can save time and cost.
  • nucleic acid extraction kit QIAamp DNA Micro kit, QIAGEN, Valencia, CA, USA or ChargeSwitch gDNA 1 ⁇ l Serum Kit, Life Technologies, NY, USA
  • HPV Human Papillomavirus
  • Primer Information Sequence of primers (5 '3') Size of fragment (bp) Sequence number number Forward 5'-biotin-TTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACTGTT 136 One Reverse 5'-Cy3-CCTCCCCATGTCTGAGGTACTCCTTAAAG 2 Forward 5'-biotin-TGTCAGAACCATATGGCGACAGCTT 95 3 Reverse 5'-Cy3-TTCACCAACAGCACCAGCCCTATTA 4
  • the amplification products of each sample were obtained using the PCR primer set of Table 1 above.
  • the primer set of the present invention was prepared to enable isothermal amplification (preferably helicase dependent amplification (HDA), recombinase polymerase amplification (RPA)) as well as PCR amplification, and was modified by referring to previously known literature (Virol J. 2010). Aug 19; 7: 194).
  • HDA helicase dependent amplification
  • RPA recombinase polymerase amplification
  • PCR reaction composition Components of PCR Volume Forward / reverse primer (10 pmole / ⁇ l) 1 ⁇ l HotStarTaq plus Master Mix 10 ⁇ l Template DNA (1 ng / ⁇ l) 5 ⁇ l Deionized water 4 ⁇ l Total 20 ⁇ l
  • RPA reaction composition Components of PCR Volume Forward / reverse primer (10 pmole / ⁇ l) 3 ⁇ l rehydration buffer 29.5 ⁇ l Template DNA (1 ng / ⁇ l) 5 ⁇ l Deionized water 11.5 ⁇ l Mg2 + 1 ⁇ l Total 50 ⁇ l
  • RPA reaction composition Components of PCR Volume Forward / reverse primer (10 pmole / ⁇ l) 3 ⁇ l 10X reaction buffer (tris-HCl; pH 9.0, (NH 4 ) 2 SO 4 2.5 ⁇ l IsoAmp III tHDA master mix 25 ⁇ l IsoAmp enzyme mix 2 ⁇ l Template DNA (1 ng / ⁇ l) 5 ⁇ l Deionized water 16.5 ⁇ l MgSO 4 1 ⁇ l NaCl 2 ⁇ l Total 50 ⁇ l
  • PCR reaction composition is shown in Table 2, the amplification conditions were repeated amplified 40 times in a cycle of 95 to 10 minutes, [95 to 30 seconds, 55 to 30 seconds, 72 to 30 seconds] in one cycle.
  • the RPA reaction composition is shown in Table 3 above, and isothermally amplified at 37 to 40 minutes using the primer set and twist amp basic kit (TwistDx, Cambridge, UK) described in Table 1 above.
  • the HDA reaction composition is shown in Table 4, and isothermally amplified for 65 to 60 minutes using the primer set and isoamp III universal tHDA kit (Biohelix) described in Table 1 above.
  • PCR products were analyzed using a Mupid-a (Advance, Japan) electrophoresis device using a 1.5% (w / v) agarose gel.
  • 1.5 g of agarose was added to a Erlenmeyer flask (250 ⁇ l), filled with 100 ⁇ l of 0.5 X TBE (tris boric acid EDTA) buffer, dissolved in a microwave for 2 to 3 minutes, and then the solution was poured into a gel container and hardened for about 30 minutes. . The gel was confirmed to be completely solid and the gel was collected. The collected gels are placed in an electrophoretic device and filled with 0.5 X TBE buffer.
  • 0.5 X TBE tris boric acid EDTA
  • Nanoparticles are capable of capturing nucleic acids and can theoretically be used as long as they are larger than the density of the medium.
  • Dynabead MyOne Streptavidin C1
  • the surface of the Dynabead is treated with streptavidin to bind biotin-labeled primers.
  • the gel-card was purchased from a product of the polyspecific Ortho BioVue System (Ortho Clinical Diagnostics, NJ, USA).
  • HPV nucleic acid was amplified from HPV specimens by isothermal amplification using primer sets consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2 described in Table 1 above.
  • the primer represented by SEQ ID NO: 2 was labeled with a fluorescent substance of Cy3 at the 5 ′ end, and the labeling method was labeled with NHS (N-hydroxysuccinimide) modification.
  • Primers labeled by NHS modification can be represented by the following formula (1).
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the above process.
  • the PCR product banded downward, and the nucleic acid was not detected.
  • a band was formed on the upper side.
  • HPV nucleic acid was amplified from HPV specimens by isothermal amplification using primer sets consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4 described in Table 1 above.
  • the primer represented by SEQ ID NO: 4 was labeled with a fluorescent substance of Cy3 at the 5 'end, and the labeling method was carried out by phosphoramide method.
  • the primer labeled by the phosphoramide method may be represented by the following formula (2).
  • the nucleic acid detection method using the nanoparticles of the present invention can detect nucleic acids quickly and sensitively even with clinical specimens, and can easily change the negative and positive judgment methods according to the fluorescent labeling method.
  • the nucleic acid and nanoparticles were treated on the gel-card according to the method of Example 3-2 above. Thereafter, centrifugation was performed at 100 rpm, 200 rpm, 400 rpm, 600 rpm, 800 rpm, 1200 rpm and 1600 rpm for 2 minutes, respectively.
  • the centrifugation speed can be adjusted by optimizing the length of the nucleic acid to be detected or the size / density of the nanoparticles used.
  • the nucleic acid and nanoparticles were treated on the gel-card according to the method of Example 3-2 above.
  • the centrifugation speed was set at 800 rpm (about 55 g), and observed for 8 minutes each at 1 minute intervals.
  • the centrifugation time of the present invention can be adjusted by the size, density, reaction amount, medium concentration, centrifugal force, etc. of the nanoparticles used.
  • the amount of nucleic acid treated on the gel-card can control the amount of amplified product according to the type and amount of nanoparticles to be reacted, and the entire master mix can also be used.
  • agarose anti-mouse IgG agarose
  • agarose As a result, 10-30 ⁇ l of agarose showed minimal time and high discrimination power for discriminating positive and negative. More preferably, it may be a gel-card containing 20 ⁇ l of agarose (result not shown).
  • nucleic acid detection was performed using a sample that was submitted for HPV DNA test for uterine cancer screening and the remaining samples. Three HPV DNA positive and negative samples were selected from the Rosch Cobas 4800 HPV test.
  • a total of six specimens were amplified from HPV nucleic acid from HPV specimens by isothermal amplification using a primer set consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2 described in Table 1, as described in the above Example.
  • the primer represented by SEQ ID NO: 2 was labeled with a fluorescent substance of Cy3 at the 5 'end, and the labeling method was labeled with NHS (N-hydroxysuccinimide) modification.
  • a nucleic acid detection method that does not include a separation step can be used to determine whether a negative or positive judgment for a particular disease is quicker, simpler, more sensitive, and more reliable, and thus has high industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 나노입자를 이용한 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산을 증폭 및 표지시킨 후 나노입자로 포획하여 원심분리하는 단계를 포함하는 핵산 검출 방법 및 이의 방법을 이용한 핵산 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 분리 단계를 포함하지 않는 핵산 검출법을 통해 특정 질병에 대한 음성, 양성의 판단을 보다 신속하고 간단하며, 민감하고 신뢰도 높게 판별할 수 있어 효과적이다.

Description

나노입자를 이용한 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법
본 출원은 2015년 07월 13일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2015-0099378호 및 2015년 08월 27일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2015-0121109호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 나노입자를 이용한 핵산 검출용 키트 및 핵산 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산을 증폭 및 표지시킨 후 나노입자로 포획하여 원심분리하는 단계를 포함하는 핵산 검출 방법 및 이의 방법을 이용한 핵산 검출용 키트에 관한 것이다.
초고속 핵산 검사의 필요성은 많은 분야에서 점점 증가하고 있다. 핵산 검사는 궁극적으로 병의 조기 발견을 통해 전체 의료비용을 낮추는 목적으로 사용되고 있으며, 향후 병원균 검사, 제노타이핑, 암 진단 등을 위한 여러 종류의 핵산에 대한 동시 분석·수요·증가와 현장 검사용으로 사용할 수 있는 제품에 대한 수요가 급증할 것으로 기대된다. 이를 해결하기 위해서는 제노타이핑 및 암 진단에 대한 특이성과 민감도가 높은 DNA/RNA 표지의 개발이 많이 이루어져야 할 것이다. 핵산 검사가 널리 이용되기 위해서 해결해야 할 문제들이 많이 남아있지만, 시기만 문제일 뿐 핵산 검사가 진단 시장을 지배하는 시대가 곧 올 것으로 기대되며, 그 시기를 앞당기기 위해 저비용의 핵산 검사를 위한 장치와 효율적인 DNA 표지를 개발하는 것이 연구의 중심으로 자리매김하고 있다.
핵산검사는 민감도, 특이성, 정밀성, 정확성 등의 분석적 타당성 (analytical validity)과 임상적 민감도와 특이성, 음성예측률(negative predictive value) 등의 임상적 타당성(clinical validity) 및 유용성(clinical utility)를 만족하여야 한다. 핵산 검사의 대상을 크게 두 가지로 나누면 인체에 감염된 미생물에서 유래된 핵산과 인체에서 직접 유래된 핵산이다. 전자는 감염 여부를 진단하는 검사로 핵산검사 시장의 80% 이상을 차지하고 있다. 후자는 질환 유발과 치료에 관련된 핵산을 분석하는 유전자검사(genetic test)이며 시장점유율은 20% 미만이지만 잠재적 가치와 시장성은 매우 높을 것으로 전망하고 있다.
여러 핵산 검출 방법 중 나노입자를 이용한 핵산 검출은 기존의 음전하 형태의 수지(negative charged polyanion) 및 실리카 막(silica membrane) 기술을 이용한 방법의 단점인 저속, 고비용 방법을 획기적으로 개선할 수 있는 차세대 기술로, 나노입자를 제조하고, 핵산을 포획할 수 있는 코팅처리를 실시하여 대상 핵산 분자와 선택적으로 결합하여 핵산을 검출하는 시스템이 경쟁적으로 개발되고 있다. 선행문헌으로 미국특허 US20140100131에서는 목적 유전자를 검출하는 방법으로 자성입자를 사용하며, 미국특허 US20100009383는 목적하는 생체분자를 검출하기 위한 방법에 관한 것으로, 자성입자로 타겟물질을 회수한 후, 원심분리를 수행하여 응집된 타겟물질을 검출할 수 있다. 하지만, 기존의 방법은 추가적인 DNA 프로브나 항체를 첨가해주어야 하는 불편함이 있고, 분리 및 세척 과정이 추가적으로 필요하여, 보다 신속한 핵산 검출 방법에 대한 발명이 필요하였다.
이에, 본 발명자들은 증폭된 목적 핵산과 나노입자를 사용하여 겔-카드를 제조하였고, 이를 원심분리 후 육안/형광으로 확일 할 수 있음을 입증하였으며, 이러한 핵산 검출법이 특정 질병에 대한 특정 핵산을 검출하는데 현저한 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 분리 단계를 포함하지 않는 핵산 검출법을 통해 특정 질병에 대한 음성, 양성의 판단을 보다 신속하고 간단하며, 민감하고 신뢰도 높게 판별할 수 있는 핵산 검출 방법 및 핵산 검출용 키트를 발명하였다.
본 발명은 빠르고 정확하게 핵산을 검출하는 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산을 검출하기 위한, 나노입자 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 나노입자 복합체를 검출하기 위한 겔카드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산을 빠르고 정확하게 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 검출하고자 하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트; 포획 나노입자; 및 밀도 차이를 발생시키는 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드;를 포함하는 핵산 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 목적 핵산 검출용 어세이(assay)에 사용하기 위한, 목적 핵산이 포획되거나 또는 결합된 나노입자를 포함하는 검출 가능한 나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 나노입자 복합체를 검출하기 위한, 유리 구슬(glass bead) 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드를 제공한다.
본 발명은 또한, 목적 핵산 검출용 어세이(assay)에 사용하기 위한, 목적 핵산이 포획되거나 또는 결합된 나노입자를 포함하는 검출 가능한 나노입자 복합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 나노입자 복합체를 검출하기 위한, 유리 구슬(glass bead) 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, (ㄱ) 목적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로 목적 핵산을 증폭시키는 단계; (ㄴ) 상기 (ㄱ)단계에서 증폭된 핵산에 나노입자를 첨가하여 핵산을 나노입자에 포획 또는 결합시키는 단계; (ㄷ) 상기 (ㄴ)단계에서 나노입자에 핵산이 포획 또는 결합된 복합체를 겔카드 용기에 넣는 단계; (ㄹ) 상기 (ㄷ)단계에서 제조된 혼합물을 원심분리하는 단계; 및 (ㅁ) 겔카드 용기내 침전물의 위치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 나노입자를 이용한 핵산 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 상기 (ㄱ) 단계의 프라이머 세트는 바이오틴-표지 정방향 프라이머(biotin-labeled forward primer)와 형광 표지 역방향 프라이머(fluorescence-labeled reverse primer)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (ㄱ) 단계는 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 등온증폭반응으로 핵산을 증폭하는 것 일 수 있다.
상기 등온증폭반응은 HDA (Helicase-Dependent Amplification), RPA(Recombinase Polymerase Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification), LAMP(Loop mediated isothermal amplification), NASBA(Nucleic Acid-Sequence-Based Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification), SMART(Signal Mediated Amplification of RNA Technology), SDA(Strand Displacement Amplification), IMDA(Isothermal Multiple Displacement Amplification), SPIA(Single Primer Isothermal Amplification) 및 cHDA(circular Helicase-Dependent Amplification)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 HDA (Helicase-Dependent Amplification), RPA(Recombinase Polymerase Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification), LAMP(Loop mediated isothermal amplification)의 방법으로 수행되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 HDA (Helicase-Dependent Amplification) 또는 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)의 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 자성입자(magnetic bead), 금(Au) 나노입자, 은(Ag) 나노입자, 백금(Pt) 나노입자, 양자점(Quantum dot), 상방전환 나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP), 그래핀(graphene)-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자(color dyed particles) 및 라텍스(latex) 나노입자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 나노입자는 표면에 핵산을 포획할 수 있는 아비딘(avidin), 아민(amine), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체 (예를 들어, digoxigenin/anti-digoxigenin antibody, Cy3/anti-Cy3 antibody 등과 같은 등가물), 앱타머(aptamer) 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅처리가 된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 겔 성분은 IgG-아가로스(agarose), 아가로스(agarose), 한천(寒天), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide gel)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 핵산 검출 방법은 인핸서를 처리하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 기존의 방법에는 포함되었던 분리과정 및 세척과정이 불필요하다.
본 발명은 나노입자를 이용한 핵산 검출용 및 키트핵산 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산을 증폭 및 표지시킨 후 나노입자로 포획하여 원심분리하는 단계를 포함하는 핵산 검출 방법 및 이의 방법을 이용한 핵산 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명은 분리 단계를 포함하지 않는 핵산 검출법을 통해 특정 질병에 대한 음성, 양성의 판단을 보다 신속하고 간단하며, 민감하고 신뢰도 높게 판별할 수 있어 효과적이다.
도 1은 본 발명의 핵산 검출 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 핵산 검출 방법을 구체적으로 나타낸 모식도와 NHS 변형법으로 표지된 역방향 프라이머를 사용한 핵산 검출 방법에 따른 양성/음성 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 포스포라미티드법으로 표지된 역방향 프라이머를 사용한 핵산 검출 방법에 따른 양성/음성 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 원심분리 시간에 따른 핵산 검출 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 인핸서 사용 유무에 따른 핵산 검출 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 HPV DNA 핵산 검출을 실시한 결과에 대해서 육안 또는 형광으로 식별이 가능함을 보여주는 사진이다.
도 7은 DNA 농도에 따른 검출 민감도를 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 HPV 임상 검체로 본 발명의 핵산 검출법을 실시한 사진이다(1-3번 튜브 : HPV DNA 음성 샘플, 4-6번 튜브 : HPV DNA 양성 샘플).
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 기존의 질병관련 특정 핵산의 음성 및 양성 진단의 경우, 통상적으로 4 내지 6 시간이라는 오랜 시간이 걸리고, 정확도가 떨어지는 문제점이 초래되어 왔다. 따라서, 양성인 환자에게 빠른 처방이 어려웠다.
또한, 미국공개특허 2014-0100131의 경우, 목적 유전자를 검출하는 방법에 관해서는 항체를 사용하며, 나노입자로 반드시 자성입자만을 사용하여야 하며, 분리 단계가 추가적으로 포함되어 빠른 검출이 어려웠다.
이에 본 발명자들은 목적 핵산을 증폭하고 이를 나노입자 및 겔 성분과 함께 겔-카드에 주입한 후, 원심분리하는 간단한 방법을 통해 질병 관련 특정 핵산을 신속하고 정화하게 검출하는 방법을 고안하였다.
본 발명에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의된다.
본 발명에서 "핵산(nucleic acid)"이란 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
본 발명에서 "포획 또는 결합(capture)"이란 본 발명에서 하나 이상의 제제의 적어도 일부(또는 이 제제와 결합된 링커부)를 나노 입자 또는 그의 표면에 포집, 흡착, 정전기적 결합, 이온적 결합, 공유결합, 상보적인 올리고뉴클레오타이드 결합, 항원-항체반응을 통한 결합 또는 고정시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 "프라이머"란 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에서 "인핸서(inhancer)"란 검체의 양성 및 음성을 판단할 때, 이를 더욱 정확하고 명확하게 판단할 수 있도록 돕는 물질을 의미한다. 예를들어, 핵산 또는 프라이머에 결합하여 형광을 띄거나 또는 발색하는 물질일 수 있다.
본 발명에서 "겔카드(gel card)"란 WO1999/050673 특허에 기재된 gel column을 참고하여 정의될 수 있다. 본 발명에서 겔-카드란, 밀도 차이를 발생시키는 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드이며, 더욱 바람직하게는 유리구슬(glass bead)과 아가로스 겔을 순차적으로 용기에 담은 것을 의미한다.
본 발명은 검출하고자 하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트; 포획 나노입자(capture nanoparticle); 및 밀도 차이를 발생시키는 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드;를 포함하는 핵산 검출용 키트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 바이오틴-표지 정방향 프라이머(biotin-labeled forward primer)와 형광 표지 역방향 프라이머(fluorescence-labeled reverse primer)일 수 있다. 본 발명의 핵산 검출용 키트에 포함되는 프라이머는 바이오틴으로 표지된 것일 수 있으며, 바이오틴으로 표지된 프라이머는 나노입자에 더욱 잘 포획되거나 또는 결합될 수 있어 핵산을 검출하는데 용이하다. 또한, 본 발명의 키트에 포함되는 프라이머는 형광으로 표지될 수 있으며, 형광으로 표지된 프라이머는 형광으로 확인하여 밴드의 위치를 통해 핵산의 유무를 판별할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 프라이머의 표지 방법에 따라 육안으로 음성 또는 양성을 구분할 수 있으며, 형광으로도 음성 또는 양성을 구분할 수 있다(도 6 참조).
상기 프라이머의 형광 표지는 이에 한정하지는 않으나, Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 프라이머의 형광 표지는 크게 두가지 방법, NHS 변형법(N-hydroxysuccinimide modification) 또는 포스포라미티드법(phosphoramidite synthesis)으로 이루어질 수 있다.
Cy 염색약의 표지 방법은 판매 제조사 amersham biosicences의 카달로그 "labelling of oligonucleotides with CyDye fluors for fluorescent applications using the LEAD seeker homogeneous imaging system, amersham biosiecnces, Vol.L6, 2000"에 나온 방법으로 실시될 수 있다.
본원 발명에서 NHS 변형법으로 표지된 프라이머를 사용하여 핵산을 검출하면, 양성 검체가 음성 검체보다 아래에 밴드를 형성하는 것을 특징으로 하며; 포스포라미티드법으로 형광 표지된 프라이머를 사용하여 핵산을 검출하면, 양성 검체가 음성 검체보다 위에 밴드를 형성하는 것을 특징으로 한다. 이러한 차이는 프라이머의 형광 표지 위치에 따라 상이해 지는 것으로 판단된다.
본 발명의 일실시예에서는 NHS 변형법으로 형광 표지된 프라이머를 사용하여 핵산을 검출할 때, 양성 검체가 아래에 밴드를 형성하였으며(도 2 참조), 포스포라미티드법으로 형광 표지된 프라이머를 사용하여 핵산을 검출할 때, 양성 검체가 위에 밴드를 형성하였다(도 3 참조).
본 발명의 상기 나노입자는 자성입자(magnetic bead), 금(Au) 나노입자, 은(Ag) 나노입자, 백금(Pt) 나노입자, 양자점(Quaantum dot), 상방전환 나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP) 그래핀(graphene)-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자(color dyed particles) 및 라텍스(latex) 나노입자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에서는 나노입자로 Dynabead (MyOne Streptavidin C1)를 사용하였으며, 이외에도 나노입자 표면에 핵산을 포획할 수 있는 처리가 가능한 자성입자, 금속입자, 양자점, 상방전환나노입자, 그래핀-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자 또는 라텍스 나노입자가 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는 자성입자, 금속입자일 수 있다.
본 발명의 상기 나노입자는 표면에 핵산을 포획할 수 있는 아비딘(avidin), 아민(amine), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 대하여 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체 (예를들어, digoxigenin/anti-digoxigenin antibody, Cy3/anti-Cy3 antibody 및 이의 등가물), 앱타머(aptamer) 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅처리가 된 것을 특징으로 한다.
목적 핵산을 증폭할 때, 항원을 포함하는 프라이머를 사용하고, 나노입자의 표면에 상기 항원에 대한 항체를 결합시키면, 항원-항체 반응을 통하여 나노입자가 목적 핵산을 포획할 수 있다.
상기 밀도 차이를 발생시키는 성분은 겔 성분을 아래에서 지지해주는 역할을 하며, 밀도 차이를 발생시키는 성분보다 핵산-나노입자 복합체의 밀도가 클 경우 가라앉으며, 밀도차이를 발생시키는 성분보다 핵산-나노입자 복합체의 밀도가 낮으면 가라앉지 않도록 음성 및 양성을 밀도차이를 이용하여 판별할 수 있도록 분리해주는 역할을 한다. 이로 인해, 별도의 세척과정이나 분리과정이 필요하지 않게 된다.
본 발명의 상기 밀도 차이를 발생시키는 성분은 밀도차이를 발생시킬 수 있는 물질이면 한정되지 않으나, 바람직하게는 유리 구슬(glass bead), quartz based matrix, 퍼콜(percoll), 콜로이드 실리카 용액(colloidal silica media), 피콜(ficoll)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 유리 구슬(glass bead)일 수 있다.
본 발명의 상기 겔 성분은 IgG-아가로스(agarose), 아가로스(agarose), 한천(寒天), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 성분은 IgG-아가로스(agarose) 또는 아가로스(agarose)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 IgG-아가로스를 사용하였으며, 10 내지 30 ㎕의 IgG-아가로스 에서 양성 및 음성을 판별하는데 최소의 시간 및 높은 구분력을 나타냈으며, 바람직하게는 15 내지 25 ㎕의 양일 수 있으며, 보다 바람직하게는 20 ㎕의 양일 수 있다.
본 발명의 핵산 검출용 키트는 인터킬레이팅 제제인 인핸서를 추가적으로 포함할 수 있다. 인핸서를 추가적으로 포함하여, 양성과 음성의 구분을 더욱 뚜렷하게 할 수 있는 효과가 있으며, 이에 한정되지는 않으나, 바람직한 인터킬레이팅 제제로는 SYBR 그린, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열, TOTO계열, 악티노마이신, 아드리아마이신, 안트라센, 벤조피렌, 프로피디움 디이오다이드-인터트위닝(propidium diiodide-intertwining), 디스타마이신, 네트롭신과 아크리딘, 프소랄렌, 베르베린(berberine), 프로플라빈(proflavine), 다우노마이신, 독소루비신, 탈리도마이신, 시아닌 염료 또는 LDS 751일 수 있다. 더욱 바람직하게는 인터킬레이팅 염색약인 SYBR 그린, 브롬화 에티듐, biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열 및 TOTO계열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 핵산 검출용 키트는 바람직하게는 바이오틴-표지 정방향 프라이머와 형광 표지 역방향 프라이머로 구성되고, 검출하고자 하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트; 포획 나노입자(capture nanoparticle); 인터킬레이팅 제제; 및 밀도 차이를 발생시키는 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드; 를 포함하는 인시츄(in situ) 핵산 검출용 키트이다.
본 발명은 목적 핵산 검출용 어세이(assay)에 사용하기 위한, 목적 핵산이 포획 또는 결합된 나노입자를 포함하는 검출 가능한 나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명은 나노입자 복합체를 검출하기 위한, 유리 구슬(glass bead) 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드를 제공한다.
상기 유리구슬 성분과 겔 성분이 적층된 겔카드는 테스트 용기 내에 담겨 있는 형태이며, 테스트 용기는 어떠한 고체 용기로도 사용할 수 있으며, 다른 여러 유형으로 가공할 수 있다. 예를 들면 시험관, 마이크로플레이트 웰 등의 어떠한 용기도 사용 가능하다.
본 발명자들은 (ㄱ) 목적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로 목적 핵산을 증폭시키는 단계; (ㄴ) 상기 (ㄱ)단계에서 증폭된 핵산에 나노입자를 첨가하여 핵산을 나노입자에 포획 또는 결합시키는 단계; (ㄷ) 상기 (ㄴ)단계에서 나노입자에 핵산이 포획 또는 결합된 복합체를 겔카드 용기에 넣는 단계; (ㄹ) 상기 (ㄷ)단계에서 제조된 혼합물을 원심분리하는 단계; 및 (ㅁ) 겔카드 용기내 침전물의 위치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 나노입자를 이용한 핵산 검출 방법을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 바이오틴-표지 정방향 프라이머(biotin-labeled forward primer)와 형광 표지 역방향 프라이머(fluorescence-labeled reverse primer)일 수 있다. 본 발명의 핵산 검출용 키트에 포함되는 프라이머는 바이오틴으로 표지된 것일 수 있으며, 바이오틴으로 표지된 프라이머는 나노입자에 더욱 잘 포획되거나 또는 결합될 수 있어 핵산을 검출하는데 용이하다.
더욱 바람직하게 상기 프라이머 세트는 바이오틴-표지 정방향 프라이머(biotin-labeled forward primer)와 Cy3-표지 역방향 프라이머(Cy3-labeled reverse primer)일 수 있다.
바이오틴이 표지된 정방향 프라이머를 통해 바이오틴과 특이적으로 결합할 수 있는 물질(예를들어 avidin 등)로 코팅된 나노입자에 결합하고, Cy3가 표지된 역방향 프라이머에 의하여 육안 또는 형광에서 침전물의 위치를 확인할 수 있다. 또한, Cy3는 증폭물을 더욱 명확하게 구분할 수 있는 인핸서의 역할을 수행하기도 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트로 HPV 핵산을 검출하였다.
본 발명의 핵산은 DNA와 RNA를 포함하며, DNA의 증폭은 기존에 알려진 증폭 방법이면 무엇이든 사용 가능하다. 바람직하게는 PCR 또는 등온증폭법일 수 있다. 또한, RNA의 증폭에 있어서도 기존에 알려진 증폭 방법이면 무엇이든 사용 가능하며, 바람직하게는 cDNA를 합성한 후 증폭하는 방법일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 rt-PCR(reverse transcription PCR) 방법일 수 있다.
본 발명의 상기 (ㄱ) 단계는 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 등온증폭반응으로 핵산을 증폭하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 핵산은 DNA와 RNA를 포함하며, DNA의 증폭은 기존에 알려진 증폭 방법이면 무엇이든 사용 가능하다. 바람직하게는 PCR 또는 등온증폭법일 수 있다.
본 발명의 상기 등온증폭반응은 HDA (Helicase-Dependent Amplification), RPA(Recombinase Polymerase Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification), LAMP(Loop mediated isothermal amplification), NASBA(Nucleic Acid-Sequence-Based Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification), SMART(Signal Mediated Amplification of RNA Technology), SDA(Strand Displacement Amplification), IMDA(Isothermal Multiple Displacement Amplification), SPIA(Single Primer Isothermal Amplification) 및 cHDA(circular Helicase-Dependent Amplification)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
PCR(Polymerase Chain Reaction)은 선택성이 우수하고 신속한 분석방법이지만 반응 동안에 주기적으로 온도를 변화 시켜 주어야 한다. 온도 변화 없이도 등온에서 DNA/RNA 증폭이 가능한 기술을 등온증폭기술이라고 한다. 등온증폭 기술은 온도를 변화할 시간이 필요 없기 때문에 단시간 내에 대량의 DNA 증폭이 가능하여 핵산의 신속검출 기술로서 활용도가 높다. 대표적인 것이 loop-mediated isothermal amplification (LAMP)인데, LAMP는 4-6개의 primer를 이용하여 특정한 target sequence를 증폭하는 기술로서 magnesium pyrophosphate이나 SYBR green을 첨가하면 증폭 후 눈으로도 핵산 증폭 판정이 가능하기 때문에 향후 현장용 신속검출기술에 응용가능성이 매우 높다.
NASBA와 TMA의 경우 RNA template을 사용하여 cDNA 합성 후 self-sustained에 의해 다시 RNA를 합성 해내는 반응을 반복하여 증폭하는 방법이다. SMART의 경우 target에 의존하는 방법으로 온도 변화 없이 target DNA나 RNA를 증폭시켜 검출할 수 있는 방법이다. SDA의 경우 4개의 primer를 필요로 하며 제한효소를 사용, Hinc의 인지 염기서열(GTTGAC)을 응용한 방법이다. RCA는 Φ29 DNA polymerase가 순환적으로 primer를 연장하여 고분자의 원형 핵산을 결과적으로 긴 가닥으로 증폭시키는 방법이다. RCA는 단단하게 결합하여 다른 등온 증폭 기술 중 DNA 진단에서 중요한 기반기술로 사용된다. 최근 주목 받고 있는 방법으로 현재 유전검사부터 면역분석법, sequencing, SNP scoring, 유전발현 분석 등에 사용되고 있다. IMDA는 double-stranded nucleic acid에 양쪽으로 primer가 달라붙어 그대로 신장하는 방법이다. HDA는 helicase를 사용하여 단일가닥으로 분리시킴으로써 denaturation time이 따로 필요치 않고 모든 반응을 한 온도에서 시킬 수 있는 방법이다. SPIA는 RNA에서 cDNA가 합성되고 RNaseH에 의해 RNA가 제거되면서 SPIA용primer가붙으며DNA polymerase에 의해 증폭이 일어난다. SPIA primer와 polymerase의 지속적인 증폭 반응을 통해 한 가닥의 cDNA에서 여러 가닥이 생성되는 방법이다. cHDA는 DNA polymerase와 helicase를 함께 사용하는 기술로 한 온도에서 모든 반응을 시키는 방법이다.
본원 발명의 일 실시예에서는 HDA 및 RPA 반응으로 증폭하여 핵산을 검출하였으며, LAMP 및 RCA 반응도 현장분자진단에 적합한 증폭반응 중 하나이므로, 바람직하게 본 발명의 등온증폭반응은 HDA (Helicase-Dependent Amplification), RPA(Recombinase Polymerase Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification) 및 LAMP(Loop mediated isothermal amplification)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 HDA (Helicase-Dependent Amplification), RPA(Recombinase Polymerase Amplification)이다.
또한, RNA의 증폭에 있어서도 기존에 알려진 증폭 방법이면 무엇이든 사용 가능하며, 바람직하게는 RNA를 template로 하는 NASBA 반응을 이용하거나, cDNA를 합성한 후 증폭하는 rt-PCR 반응일 수 있다.
상기 나노입자는 핵산을 포획 또는 결합시킬 수 있는 나노입자라면 제한되지 않는다. 핵산을 포획할 수 있는 물질을 코팅 또는 결합시킬 수 있는 나노입자면 무엇이든 적용할 수 있다. 다만, 본원 발명이 밀도차이를 이용하여 특정 핵산의 양성 또는 음성을 판단하는 것이기 때문에, 매질의 밀도와 차이가 있어야 한다. 본원 발명의 일실시예 에서는 매질로 유리구슬(glass bead)을 사용하며, 이의 매질밀도가 1.04 g/㎕이기 때문에 그보다 큰 밀도를 가진 입자면 모두 가능하다. 하지만, 다른 밀도의 매질을 이용하거나, 매질의 밀도보다 작은 입자를 이용하여 적용할 수 도 있다.
바람직하게 본 발명의 나노입자는 자성입자(magnetic bead), 금(Au) 나노입자, 은(Ag) 나노입자, 백금(Pt) 나노입자, 양자점(Quantum dot), 상방전환 나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP), 그래핀(graphene)-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자(color dyed particles) 또는 라텍스(latex) 나노입자일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 나노입자로 Dynabead (MyOne Streptavidin C1)를 사용하였으며, 이외에도 나노입자 표면에 핵산을 포획할 수 있는 처리가 가능한 자성입자, 금속입자, 양자점, 상방전환나노입자, 그래핀-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자 또는 라텍스 나노입자가 사용될 수 있다. 보다 더욱 바람직하게는 자성입자, 금속입자일 수 있다.
본 발명의 상기 나노입자는 표면에 핵산을 포획할 수 있는 아비딘(avidin), 아민(amine), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 대하여 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체 (예를들어, digoxigenin/anti-digoxigenin antibody, Cy3/anti-Cy3 antibody 및 이의 등가물), 앱타머(aptamer) 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅처리가 된 것일 수 있다.
목적 핵산을 증폭할 때, 항원을 포함하는 프라이머를 사용하고, 나노입자의 표면에 상기 항원에 대한 항체를 결합시키면, 항원-항체 반응을 통하여 나노입자가 목적 핵산을 포획할 수 있다.
본 발명의 상기 겔 성분은 IgG-아가로스(agarose), 아가로스(agarose), 한천(寒天), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide gel)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 IgG-아가로스(agarose)를 사용하였으며, 10 내지 30 ㎕의 IgG-아가로스 에서 양성 및 음성을 판별하는데 최소의 시간 및 높은 구분력을 나타냈으며, 바람직하게는 15 내지 25 ㎕의 양일 수 있으며, 보다 바람직하게는 20 ㎕의 양일 수 있다.
본 발명의 상기 (ㄷ)단계에서 인터킬레이팅 제제(intercalating agent)의 인핸서를 추가적으로 처리할 수 있다.
양성 및 음성의 구분을 명확하게 하기 위하여 본원 발명에서는 인핸서를 추가로 처리할 수 있으며, 인핸서는 인터킬레이팅 제제일 수 있으며, 인터킬레이팅 제제는 SYBR 그린, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열, TOTO계열, 악티노마이신, 아드리아마이신, 안트라센, 벤조피렌, 프로피디움 디이오다이드-인터트위닝(propidium diiodide-intertwining), 디스타마이신, 네트롭신과 아크리딘, 프소랄렌, 베르베린(berberine), 프로플라빈(proflavine), 다우노마이신, 독소루비신, 탈리도마이신, 시아닌 염료 및 LDS 751으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인터킬레이팅 염색약인 SYBR 그린, 브롬화 에티듐, biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열 및 TOTO계열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 증폭된 핵산에 인핸서로 GelRed (10,000X, Biotium)와 나노입자를 섞고 겔-카드에 처리하였다. 그 결과, 도 5에 보이는 바와 같이, 인핸서를 처리했을 경우, 양성과 음성이 구분이 더욱 뚜렷해지는 효과를 확인할 수 있었다.
한편, 인터킬레이팅 제제뿐만 아니라, 프라이머에 형광염료를 결합하여 이를 인핸서로 사용할 수 있다. 형광염료는 프라이머에 결합할 수 있는 것은 모두 가능하며, 형광염료의 예로는 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ, IRDye 계열 및 이와 등가물이 있다.
상기 용기내 침전물의 위치를 대조군과 비교하는 단계는 NHS 변형법으로 형광 표지한 프라이머를 사용하였을 경우, 용기내 침전물이 음성 대조군보다 아래쪽에 위치해 있으면 양성, 음성 대조군과 유사한 위치에 침전물이 위치해 있으면 음성으로 판단할 수 있다. 도 2는 본원 발명을 나타낸 모식도로, 검체 내에 목적 핵산이 포함되어 있으면, 목적 핵산이 나노입자에 포획된 후 밀도차이를 이용한 원심분리를 통하여 핵산이 아래쪽에 위치하게 된다. 반면, 목적 핵산이 포함되어있지 않으면, 나노입자와 결합하지 않아 상대적으로 밀도가 낮으므로 튜브의 중앙부에 침전물이 위치하게 된다.
반면, 포스포라미티드법으로 형광 표지한 프라이머를 사용하였을 경우, 용기내 침전물이 음성 대조군보다 아래쪽에 위치해 있으면 음성, 음성 대조군과 유사한 위치에 침전물이 위치해 있으면 양성으로 판단할 수 있다. 이와 관련된 실험 결과는 도 3에 나타나있다.
본 발명은 상기 (d)단계 전에, 따로 분리과정 및 세척과정을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
선행문헌인 미국공개특허 2014-0100131의 경우, 목적 유전자를 검출하기 위한 방법에 관한 별명으로써, 자성입자와 capture 항체를 사용하며, 분리단계를 거쳐 목적 유전자를 검출한다. 또한, 선행문헌인 미국공개특허 2010-0009383에서도 자성입자와 capture 항체를 사용하고, 분리단계를 거쳐야만 목적 생물분자를 검출할 수 있다. 반면, 본원 발명은 입자의 제한이 없으며, 항체를 사용하지 않을 수 있고, 분리 및 세척단계가 필요하지 않아 더욱 쉽고 간단하며 빠르게 목적 핵산을 검출할 수 있다.
본 발명은 상기 (a) 단계에서, 각각 다른 색의 형광으로 표지된 둘 이상의 프라이머를 처리하여, 다중으로 핵산의 존재 유무를 확인하는 것을 특징으로 한다.
핵산을 증폭하는 단계에서, 각각 다른 색을 띄는 형광으로 표지된 둘 이상의 프라이머를 처리하여, 다중으로 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있다. 따라서, 한번의 실험을 통해 다중 핵산의 존재 유무를 판별할 수 있으며, 이를 통해 시간과 비용을 절감할 수 있으므로 효과적인 핵산 검출 방법이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
시료로부터 genomic DNA 추출 및 증폭
자궁경부검체로부터 genomic DNA를 추출하는 경우, 핵산추출키트(QIAamp DNA Micro kit, QIAGEN, Valencia, CA, USA 또는 ChargeSwitch gDNA 1㎕ Serum Kit, Life Technologies, NY, USA)를 이용하여 제조사의 지시대로 핵산을 추출하였고, 인유두종 바이러스(HPV) DNA 표준품은 식품의약품안전처 및 NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control)에 분양신청을 하여 핵산을 준비하였다.
프라이머 정보
Sequence of primers(5' 3') Size of fragment (bp) 서열번 호
Forward 5'-biotin-TTGTTGGGGTAACCAACTATTTGTTACTGTT 136 1
Reverse 5'-Cy3-CCTCCCCATGTCTGAGGTACTCCTTAAAG 2
Forward 5'-biotin-TGTCAGAACCATATGGCGACAGCTT 95 3
Reverse 5'-Cy3-TTCACCAACAGCACCAGCCCTATTA 4
상기 표1의 PCR 프라이머 세트를 이용하여 각 시료의 증폭 산물을 얻었다. 본 발명의 프라이머 세트는 PCR 증폭뿐만 아니라 등온증폭(바람직하게는 helicase dependent amplification(HDA), recombinase polymerase amplification(RPA))도 가능하도록 제작되었고, 기존에 알려진 문헌을 참고하여 변형하였다(Virol J. 2010 Aug 19;7:194).
PCR 반응 조성액
Components of PCR Volume
Forward/reverse primer (10 pmole/㎕) 1 ㎕
HotStarTaq plus Master Mix 10 ㎕
Template DNA (1 ng/㎕) 5 ㎕
Deionized water 4 ㎕
Total 20 ㎕
RPA 반응 조성액
Components of PCR Volume
Forward/reverse primer (10 pmole/㎕) 3 ㎕
rehydration buffer 29.5 ㎕
Template DNA (1 ng/㎕) 5 ㎕
Deionized water 11.5 ㎕
Mg2+ 1 ㎕
Total 50 ㎕
RPA 반응 조성액
Components of PCR Volume
Forward/reverse primer (10 pmole/㎕) 3 ㎕
10X reaction buffer (tris-HCl; pH 9.0, (NH4)2SO4 2.5 ㎕
IsoAmp III tHDA master mix 25 ㎕
IsoAmp enzyme mix 2 ㎕
Template DNA (1 ng/㎕) 5 ㎕
Deionized water 16.5 ㎕
MgSO4 1 ㎕
NaCl 2 ㎕
Total 50 ㎕
1) PCR
PCR 반응 조성액은 상기 표2와 같으며, 증폭조건은 95에서 10 분, [95에서 30초, 55에서 30초, 72에서 30초]를 한 사이클로 하여 40 회 반복하여 증폭하였다.
2) RPA
RPA 반응 조성액은 상기 표3과 같으며, 상기 표1에 기재된 프라이머 세트 및 트위스트엠프 기본 키트(TwistDx, Cambridge, UK)을 이용하여, 37에서 40분간 등온 증폭하였다.
3) HDA
HDA 반응 조성액은 상기 표4와 같으며, 상기 표1에 기재된 프라이머 세트 및 아이소엠프 III 유니버셜 tHDA 키트 (Biohelix)를 이용하여 65에서 60분 간 등온 증폭하였다.
[실시예 2]
전기영동에 의한 증폭산물의 확인
1.5%(w/v) 아가로스 겔을 이용하여 Mupid-a(Advance, Japan) 전기 영동장치로 PCR 산물을 분석하였다. 아가로스 1.5 g을 삼각플라스크(250 ㎕)에 넣고, 0.5 X TBE(tris boric acid EDTA) 완충용액 100 ㎕을 채운 후에 전자렌지에서 2 내지 3 분 동안 녹인 후 용액을 겔 용기에 부어서 30분 정도 굳혔다. 겔이 완전히 굳은 것을 확인하고 겔을 수거하였다. 수거한 겔을 전기영동장치에 넣고 0.5 X TBE 완충용액으로 채운다. 그리고 PCR 산물 4 ㎕와 6X BPB(bromo phenol blue) dye 0.8 ㎕를 섞어서 4 ㎕씩 로딩하고 100 V에서 25분 동안 전기영동 하였다. 그 후에 겔을 떼어내어 EtBr(ethidium bromide)로 10 분간 염색하고 다시 10 분간 증류수로 DNA와 결합하지 못한 EtBr을 씻어내었다. 마지막으로 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator) 위에 아가로스 겔을 올려놓고 PCR 증폭 여부를 확인하였다.
PCR 증폭 산물에 대하여 전기영동을 실시한 결과, 136bp의 밴드가 확인되었으며, 상기 실시예 1에 기재된 방법으로부터 정상적으로 목적 DNA가 증폭됨을 확인할 수 있었다(결과 미도시).
[실시예 3]
3-1. 나노입자 및 겔-카드 준비
나노입자는 핵산을 포획가능 하면서, 매질의 밀도보다 큰 입자이면 이론적으로 모두 사용 가능하다. 본 실시예 3에서는 핵산분자를 포획하기 위해서 나노입자로 Dynabead (MyOne Streptavidin C1)를 사용하였다. 이 Dynabead의 표면은 스트렙타비딘이 처리되어 있어 바이오틴(biotin)이 표지된 프라이머와 결합하게 된다. 또한, 겔-카드는 polyspecific Ortho BioVue System (Ortho Clinical Diagnostics, NJ, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다.
3-2. NHS 변형법으로 표지된 프라이머를 이용한 핵산 검출
상기 표 1에 기재된 서열번호 1 및 2로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭을 통해 HPV 검체로부터 HPV 핵산을 증폭하였다. 서열번호 2로 표시되는 프라이머에는 5'말단에 Cy3의 형광물질이 표지 되었으며, 표지 방법은 NHS(N-hydroxysuccinimide) 변형법으로 표지하였다. NHS 변형법으로 표지된 프라이머는 하기 화학식 1과 같이 나타날 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016008047-appb-I000001
증폭된 핵산 4㎕와 Dynabead 4㎕를 섞은 후 겔카드에 넣고 37에서 5분간 반응시킨 후 2분 내지 4분간 원심분리 하였다. 도 2는 상기 과정을 모식도로 나타낸 것이며, 그 결과, 도 2에 보이는 바와 같이, 핵산이 검출된(양성) 겔-카드에서는 PCR 산물이 아랫쪽에 밴드를 이루는 것을 볼 수 있으며, 핵산이 검출되지 않은(음성) 겔-카드에서는 윗쪽에 밴드를 이루는 것을 확인할 수 있었다.
3-3. 포스포라미티드법으로 표지된 프라이머를 이용한 핵산 검출
상기 표 1에 기재된 서열번호 3 및 4로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭을 통해 HPV 검체로부터 HPV 핵산을 증폭하였다. 서열번호 4로 표시되는 프라이머에는 5' 말단에 Cy3의 형광물질을 표지 되었으며, 표지 방법은 포스포라미티드법으로 실시되었다. 포스포라미티드법으로 표지된 프라이머는 하기 화학식 2와 같이 나타날 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2016008047-appb-I000002
증폭된 산물 4 ㎕와 Dynabead 4 ㎕를 섞은 후 겔카드에 넣고, 37에서 5분 반응시킨 후 원심분리 하였다. 이 때, 2분, 4분 및 6분째 각각 내려가는 정도를 관찰하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 음성에 해당하는 검체인 1 번 튜브에서는 밴드가 내려가고, 양성에 해당하는 검체인 2번 튜브에서는 밴드가 위에 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
이로서, 본원 발명의 나노입자를 이용한 핵산 검출 방법은 임상 검체로도 빠르고 민감하게 핵산을 검출할 수 있으며, 형광 표지 방법에 따라 음성과 양성 판단 방식을 용이하게 변경할 수 있다.
[실시예 4]
핵산 검출 방법의 최적화
1) 원심분리 속도
핵산을 검출하기에 가장 최적의 원심분리 속도를 측정하기 위하여, 상기 실시예 3-2의 방법에 따라 겔-카드에 핵산과 나노입자를 처리하였다. 그 후, 2분동안 각각 100rpm, 200rpm, 400rpm, 600rpm, 800rmp, 1200rpm 및 1600rmp으로 원심분리를 실시하였다.
그 결과, HPV16 DNA 136 bp를 검출하는데 600rpm 내지 1200rpm이 핵산을 검출하기에 최적의 원심분리 속도임을 확인하였으며, 더욱 바람직하게는 800 rpm x 2분 (약 55 g)이 가장 바람직한 것으로 확인되었다(결과 미도시).
원심분리 속도는 검출하고자 하는 핵산의 길이 또는 사용하는 나노 입자의 크기/밀도에 따라 최적화하여 g-force를 조절 가능하다.
2) 원심분리 시간
핵산을 검출하기에 가장 최적의 원심분리 시간을 측정하기 위하여, 상기 실시예 3-2의 방법에 따라 겔-카드에 핵산과 나노입자를 처리하였다. 원심분리 속도는 800 rpm(약 55g)로 설정하고, 1분 간격으로 각각 8분까지 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이(2분, 4분, 6분만 도시함), 최초 2분의 원심분리로도 양성 및 음성의 구분이 가능하였으며, 2분 내지 6분간 원심분리를 하였을 때 구분이 가능하였으며, 6분 이상 원심분리를 실시 할 경우, 양성 및 음성 구분이 명확하지 않은 것으로 확인되었다.
본 발명의 원심분리 시간은 사용 나노입자의 크기, 밀도, 반응 양, 매질의 농도, 원심력 등에 의해 조절 가능하다.
3) 핵산의 양
상기 실시예 1을 통해 핵산을 증폭한 후, 생성된 master mix에서 증폭된 산물 2 내지 6 ㎕ (가장 바람직하게는, 4 ㎕)를 실시예 3에서 준비한 겔-카드에 처리하여 핵산을 검출하였다. 너무 적은 핵산을 처리하면, 나노입자와 결합하는 핵산이 적어 양성 및 음성을 판단하기 위한 밴드가 선명하지 않아 구분이 어렵다.
본 발명의 겔-카드를 이용한 핵산 검출에서 겔-카드에 처리하는 핵산의 양은 반응하는 나노 입자의 종류와 양에 따라 증폭된 산물의 양을 조절 가능하며, master mix 전체 또한 이용 가능하다.
4) 아가로스의 양
핵산을 검출하기에 가장 최적의 겔-카드 내 agarose의 양을 측정하기 위하여 각각 5㎕, 10㎕, 20㎕, 30㎕, 40㎕ 및 50㎕의 agarose (anti-mouse IgG agarose)가 적층되어 있는 겔-카드 내에 상기 실시예 1의 방법으로 수득한 PCR 증폭 산물과 나노 입자를 처리하였다.
그 결과, 10 내지 30 ㎕의 아가로스에서 양성 및 음성을 판별하는데 최소의 시간 및 높은 구분력을 나타냈다. 더욱 바람직하게는 아가로스 20㎕가 포함된 겔-카드일 수 있다(결과 미도시).
5) 인핸서 첨가
양성 및 음성 판정에 있어서, 보다 확연한 구분을 위하여 인핸서를 첨가할 수 있다.
첫번째로, 실시예 1의 방법으로 증폭된 핵산에 인핸서로 GelRed (10,000X, Biotium) 1/100 1 ㎕와 나노입자를 섞고 겔-카드에 처리하였다. 그 결과, 도 4에 보이는 바와 같이, 인핸서를 처리했을 경우, 양성과 음성이 구분이 더욱 뚜렷해지는 효과를 확인할 수 있었다(도 5 참조).
두번째로, 인핸서로 프라이머에 형광인 Cy3를 붙여 핵산을 증폭한 후, 나노입자와 증폭 산물을 혼합하여 겔-카드에 처리하였다. 이 경우에는 육안으로 양성 및 음성을 판단할 수 있을 뿐만 아니라, 형광에서도 관측 가능하였으며, 검출 결과가 더욱 분명하게 나타났다(도 6 참조).
[실시예 5]
핵산 검출 민감도 측정
HPV16 DNA standard (WHO International Standard 1st WHO International Standard for Human Papillomavirus (HPV) Type 16 DNA, 107 copies/㎕)를 희석하여 102, 103, 104 및 105 copies/㎕를 만든 후 PCR로 증폭하였다.
증폭된 산물이 제대로 희석되었는지는, 실시예 2의 방법을 통해 관찰하였으며, 도 7의 A에 결과를 도시하였다. 이들 증폭된 산물 4 ㎕와 Dynabead 4 ㎕를 섞고 anti-mouse IgG agarose 1/50 20 ㎕를 추가한 겔-카드에 넣고, 37에서 5분 반응시킨 후 원심분리 하였다. 이 때, 2분, 4분, 6분째 각각 내려가는 정도를 관찰하였다(도 7 B).
그 결과 도 7에서 보이는 바와 같이, 102 내지 105 copies/㎕에서 모두 핵산의 양성 및 음성 판정이 가능함을 확인하였다. 즉, 102 copies/㎕의 핵산만으로도 핵산 검출이 가능하였다.
[실시예 6]
HPV 임상 검체에서의 핵산 검출
HPV 임상 검체에서도 민감하고 특이적으로 핵산을 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 자궁암 선별검사를 위해 HPV DNA 검사가 의뢰된 검체로 검사를 시행하고 남은 잔여 검체를 이용하여 핵산 검출을 실시하였다. HPV DNA 양성 및 음성 검체는 로슈 Cobas 4800 HPV test를 시행한 검체에서 각각 3개씩 선정하였다.
상기 실시예에 기재한 방법과 같이 총 6개의 검체를 상기 표 1에 기재된 서열번호 1 및 2로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭을 통해 HPV 검체로부터 HPV 핵산을 증폭하였다. 서열번호 2로 표시되는 프라이머에는 5' 말단에 Cy3의 형광물질이 표지 되었으며, 표지 방법은 NHS(N-hydroxysuccinimide) 변형법으로 표지하였다.
그 후 증폭된 산물 4 ㎕와 Dynabead 4 ㎕를 섞고 anti-mouse IgG agarose 1/50 20 ㎕를 추가한 겔-카드에 넣고, 37에서 5분 반응시킨 후 원심분리 하였다. 이 때, 2분, 4분 및 6분째 각각 내려가는 정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 음성에 해당하는 검체인 1 내지 3번 튜브에서는 밴드가 윗쪽에 형성됨을 확인하였으며, 양성에 해당하는 검체인 4 내지 6번 튜브에서는 밴드가 아랫쪽에 형성됨을 확인할 수 있었다. 이로서, 임상 검체로도 빠르고 민감하게 핵산을 검출할 수 있음이 확인되었다.
본 발명은 분리 단계를 포함하지 않는 핵산 검출법을 통해 특정 질병에 대한 음성, 양성의 판단을 보다 신속하고 간단하며, 민감하고 신뢰도 높게 판별할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (23)

  1. 검출하고자 하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트;
    포획 나노입자(capture nanoparticle); 및
    밀도 차이를 발생시키는 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드;
    를 포함하는 핵산 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 바이오틴-표지 정방향 프라이머(biotin-labeled forward primer)와 형광 표지 역방향 프라이머(fluorescence-labeled reverse primer)인 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 형광 표지 프라이머는 NHS 변형법(N-hydroxysuccinimide modification) 또는
    포스포라미티드법(phosphoramidite syntheis)을 통해 형광 표지된 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  4. 제2항에 있어서, 상기 형광 표지는 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  5. 제3항에 있어서, NHS 변형법으로 형광 표지된 프라이머를 사용하여 핵산을 검출하면, 양성 검체가 음성 검체보다 아래에 밴드를 형성하는 것을 특징으로 하며;
    포스포라미티드법으로 형광 표지된 프라이머를 사용하여 핵산을 검출하면, 양성 검체가 음성 검체보다 위에 밴드를 형성하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 자성입자(magnetic bead), 금(Au) 나노입자, 은(Ag) 나노입자, 백금(Pt) 나노입자, 양자점(Quaantum dot), 상방전환 나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP) 그래핀(graphene)-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자(color dyed particles) 및 라텍스(latex) 나노입자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 밀도 차이를 발생시키는 성분은 유리 구슬(glass bead), quartz based matrix, 퍼콜(percoll), 콜로이드 실리카 용액(colloidal silica media), 피콜(ficoll)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  8. 제1항에 있어서, 상기 겔 성분은 IgG-아가로스(agarose), 아가로스(agarose), 한천(寒天), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide gel)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  9. 제1항에 있어서, 인터킬레이팅 제제의 인핸서를 추가적으로 포함하는 핵산 검출용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인터킬레이팅 제제는 SYBR 그린, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열, TOTO계열, 악티노마이신, 아드리아마이신, 안트라센, 벤조피렌, 프로피디움 디이오다이드-인터트위닝(propidium diiodide-intertwining), 디스타마이신, 네트롭신과 아크리딘, 프소랄렌, 베르베린(berberine), 프로플라빈(proflavine), 다우노마이신, 독소루비신, 탈리도마이신, 시아닌 염료 및 LDS 751로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 키트.
  11. 바이오틴-표지 정방향 프라이머와 형광 표지 역방향 프라이머로 구성되고, 검출하고자 하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트;
    포획 나노입자(capture nanoparticle);
    인터킬레이팅 제제; 및
    밀도 차이를 발생시키는 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드;
    를 포함하는 인시츄(in situ) 핵산 검출용 키트.
  12. 핵산 검출용 어세이(assay)에 사용하기 위한, 목적 핵산이 포획되거나 또는 결합된 나노입자를 포함하는 검출 가능한 나노입자 복합체.
  13. 제12항의 나노입자 복합체를 검출하기 위한, 유리 구슬(glass bead) 성분과 겔 성분이 순차적으로 적층된 겔카드.
  14. (ㄱ) 목적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로 목적 핵산을 증폭시키는 단계;
    (ㄴ) 상기 (ㄱ)단계에서 증폭된 핵산에 나노입자를 첨가하여 핵산을 나노입자에 포획 또는 결합시키는 단계;
    (ㄷ) 상기 (ㄴ)단계에서 나노입자에 핵산이 포획 또는 결합된 복합체를 겔카드 용기에 넣는 단계;
    (ㄹ) 상기 (ㄷ)단계에서 제조된 혼합물을 원심분리하는 단계; 및
    (ㅁ) 겔카드 용기내 침전물의 위치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 나노입자를 이용한 핵산 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 (ㄱ) 단계의 프라이머 세트는 바이오틴-표지 정방향 프라이머(biotin-labeled forward primer)와 형광 표지 역방향 프라이머(fluorescence-labeled reverse primer)인 것을 특징으로 하는 나노입자를 이용한 핵산 검출 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 (ㄱ) 단계는 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 등온증폭반응으로 핵산을 증폭하는 것을 특징으로 하는 나노입자를 이용한 핵산 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 등온증폭반응은 HDA (Helicase-Dependent Amplification), RPA(Recombinase Polymerase Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification), LAMP(Loop mediated isothermal amplification), NASBA(Nucleic Acid-Sequence-Based Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification), SMART(Signal Mediated Amplification of RNA Technology), SDA(Strand Displacement Amplification), IMDA(Isothermal Multiple Displacement Amplification), SPIA(Single Primer Isothermal Amplification) 및 cHDA(circular Helicase-Dependent Amplification)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 나노입자는 자성입자(magnetic bead), 금(Au) 나노입자, 은(Ag) 나노입자, 백금(Pt) 나노입자, 양자점(Quantum dot), 상방전환 나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP), 그래핀(graphene)-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자(color dyed particles) 및 라텍스(latex) 나노입자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 나노입자는 표면에 핵산을 포획할 수 있는 아비딘(avidin), 아민(amine), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 앱타머(aptamer) 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅처리가 된 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 겔 성분은 IgG-아가로스(agarose), 아가로스(agarose), 한천(寒天), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide gel)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 (ㄷ)단계에서 인터킬레이팅 제제(intercalating agent)의 인핸서를 추가적으로 처리하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 (ㄹ)단계 전에 별도의 분리과정 또는 세척과정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (ㄱ) 단계에서, 각기 다른 색의 형광으로 표지된 둘 이상의 프라이머 세트를 처리하여, 다중으로 핵산의 존재 유무를 확인하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법.
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