WO2020027479A1 - 종이기반 핵산검출용 키트 및 pcr 증폭산물을 분석하기 위한 방법 - Google Patents

종이기반 핵산검출용 키트 및 pcr 증폭산물을 분석하기 위한 방법 Download PDF

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Definitions

  • nucleic acid refers to a polymer of nucleotides of any length and includes DNA or RNA.
  • a complex formed by the interaction of biotin and streptavidin was mixed by mixing the target nucleic acid labeled with biotin and magnetic beads (coated with streptavidin). If formed, it spreads widely through the separation layer.
  • the target nucleic acid is not present in the sample, since the target nucleic acid is not amplified by the primer labeled with biotin during PCR, the biotin-labeled nucleic acid is not present in the amplification product, and thus the nanoparticles coated with streptavidin Each of them does not form a composite, so that they do not pass through the separation layer and remain in a narrow circle.
  • the separation layer 120 is generated by the adsorption process due to charge and porosity when the coalescence is formed or not when the coalescence is formed due to the difference in density between the sepharose and the glass beads. If the complex is not formed, it will not pass through the separation layer and will remain and remain in the separation layer. In contrast, if the complex is formed, it will be less affected by the adsorption due to charges and pores.
  • Another aspect of the invention (a) any one selected from the group consisting of avidin (avidin), biotin (avitin), avidin-biotin, antigens, target molecules, oligonucleotides and the first solution of the paper-based nucleic acid detection kit Mixing the labeled PCR amplification products with one to obtain a reaction; And
  • the paper-based on-site diagnostic kit of the present invention is a nanoparticle (preferably magnetic bead) transfer pattern when loading a PCR amplification product containing a target nucleic acid and a nanoparticle when loading a PCR amplification product without a target nucleic acid (
  • the magnetic bead) movement pattern is completely different, even if the result is influenced by the concentration of sepharose, the degree is insignificant, and the result is not inverted or leads to a problem of deterioration of accuracy or reproducibility.
  • the paper-based on-site diagnostic kit of the present invention has the advantage that it is not affected by the size of the target nucleic acid or the size of the PCR amplification product.

Abstract

본 발명은 PCR 증폭산물로부터 표적 핵산의 존재를 쉽고 간단하게 검출할 수 있는 종이기반 핵산검출용 센서를 제공한다. 또한, 본 발명은 PCR 증폭산물로부터 표적 핵산의 존재를 쉽고 간단하게 검출할 수 있는 종이기반 핵산검출용 키트 및 이를 이용해 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 표적 핵산과 나노입자가 결합하여 복합체를 형성되고, 이를 센서 내에 적하하면 센서의 구조를 따라 복합체가 분리 및 이동하게 되며, 최종적으로 센서 외부로 시각화되는 기능을 이용하여 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재하는지 유무를 쉽고 간단하게 검출할 수 있다.

Description

종이기반 핵산검출용 키트 및 PCR 증폭산물을 분석하기 위한 방법
본 발명은 핵산을 검출하기 위한 종이기반 핵산검출용 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명의 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재하는지 유무를 쉽고 간단하게 시각화할 수 있다.
본 출원은 2018년 7월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2018-0089182호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
최근 특정 염기서열의 DNA 단편을 신속하고 간단하게 증폭할 수 있는 중합효소연쇄반응(PCR) 및 실시간 PCR 기법이 보편화되어, 감염 여부를 검출/진단이 용이해졌다. PCR 기법은 목적 병원체의 핵산 염기 서열에 특이적으로 결합하는 핵산 단편 서열(프라이머)를 가하여 온도에 따른 변성(denaturation), 재결합(annealing) 및 중합(polymerization) 과정을 반복하여 미량의 병원체 핵산을 증폭시켜 그 존부를 검출할 수 있는 기술로, 진단하는데 사용되는 대표적인 기술이다.
상기 PCR 기법은 임상 진단의 실용적 측면에서 세포진 검사(Pap smear)의 세포학적 검사와 달리 객관적인 대규모 검사가 가능하며, 측정원리상 세포검사나 액상 hybrid capture에 비해 검사비용, 실험 절차, 검출 감도 (sensitivity) 및 특이도(specificity) 등에서 상대적 우위를 가지고 있는 것으로 확인되어 있다. 그러나, PCR 기법을 설계하고, 결과를 해석함에 주의가 요망되므로, 높은 기술력을 가진 운영자가 요구되며, PCR의 증폭물(amplicon)을 검출하기 위해서는 번거로운 과정을 거쳐야만 하며, PCR 장치의 가격이 매우 높아 제한된 장소에서만 사용이 가능하다는 단점이 있다. 현실적으로 전염성 질병이 창궐하면, 질병의 통제가 신속하게 이루어져야 하기 때문에, 질병 진단은 장소에 구애받지 않고 빠르고 간단하며 저렴하면서, 현장검사(POCT) 환경에 적합한 방법이여야만 한다.
상술한 요구를 만족시키기 위해, 마이크로 유체공학, 마이크로 전자공학, 광학 시스템 및 칩 기반 검출 기술 개발이 이루어져 왔으나, 이들 중 대부분은 여전히 복잡한 제조공정이 필수적으로 필요하며, 분석장치 등의 조건들을 만족하는 제한된 장소에서만 사용이 가능하다는 단점을 가지고 있다.
일예로 인간 유두종 바이러스(HPV) DNA를 검출하기 위한 방법으로, 원심분리 기반의 분리형 시각 검출시스템(SPIN-DNA)이 개발된 바 있으나, 상기 SPIN-DNA는 비드로부터 DNA가 결합된 비드를 분리하기위해 원심분리 장치가 필수적으로 구비되어야 한다는 문제점이 존재한다.
따라서 분자 현장검사(molecular point of care testing, molecular POCT)의 개발에 대한 필요성이 대두되었다. 분자 현장검사(molecular point of care testing, molecular POCT)에 적용할 수 있는 진단 기술을 개발하기 위해서는, 우선 질병에 대한 즉각 대응이 가능하도록, 현장에서 즉각 병원체의 DNA, RNA를 검출하거나 세포의 DNA, RNA를 분석하여, 빨리 결과를 취득하도록 하여야 하므로, 별도의 측정장비나 지식없이 시각적 혹은 육안으로 검출되어야 하고, 30분 미만의 짧은 시간 내에 결과를 얻을 수 있어야 하며, 세척 단계와 같은 부가적인 공정단계를 배제하여야 하며, 측정장치 혹은 계측기없이 저렴하면서도 정확하고, 우수한 재현성이 요구됨에 따라 기존에 사용해오던 DNA 진단방법 발굴전략으로는 한계가 있다.
본 발명은 상술한 문제점들을 해결하고, 분자 현장진단(POCT)용 진단 방법을 개발하려고 노력한 바, 원심력이나, 추가적인 프로브, 배양 또는 희석 단계가 필요하지 않은 새로운 DNA 검출 시스템을 개발하기에 이르렀다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안될 것이다.
본 발명자들은 특정 유전자에 대한 PCR를 수행하고, 이의 증폭산물을 쉽고 간단하면서, 별도의 장치 없이 육안으로 검출할 수 있는 장치 및 방법을 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅 처리된 포획 나노입자(capture nanoparticle)와 음전하를 띠는 다공성의 복층의 기판으로 구성된 센서 구조를 고안하였고, 이를 이용하여 특정 서열의 프라이머를 이용해 PCR 수행한, 시료의 증폭산물을 본 발명의 센서 및 키트에 실제 적용한 결과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 음전하를 띠는 다공성의 제1 종이기판; 상기 제1 종이기판의 일 단면에 적층되고, 세파로스, 유리비드 및 이들의 혼합물 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 분리층; 및 상기 분리층의 일 단면에 적층되고, 음전하를 띠는 다공성 제2 종이기판;으로 구성된 종이기반 핵산검출용 센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 a) 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅 처리된 포획 나노입자(capture nanoparticle)가 분산된 제1 용액; 및
b) 상기 종이 기반 핵산 검출용 센서;를 포함하는 종이기반 핵산검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 종이기반 핵산검출용 키트의 제1 용액과 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 PCR 증폭산물을 혼합하여 반응물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 종이기반 핵산검출용 키트의 센서에 상기 반응물을 적하하는 단계;를 포함하는 PCR 증폭산물을 분석하기 위한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 다만, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 유사한 기능 및 작용을 하는 부분에 대해서는 도면 전체에 걸쳐 동일한 부호를 사용한다.
덧붙여, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 '연결' 되어있다고 할 때, 이는 '직접적으로 연결' 되어있는 경우 뿐만 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 '간접적으로 연결' 되어있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 구성요소를 '포함' 한다는 것은, 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은 음전하를 띠는 다공성의 제1 종이기판; 상기 제1 종이기판의 일 단면에 적층되고, 세파로스, 유리비드 및 이들의 혼합물 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 분리층; 및 상기 분리층의 일 단면에 적층되고, 음전하를 띠는 다공성 제2 종이기판;으로 구성된 종이기반 핵산검출용 센서에 관한 것이다. 상기 종이기반 핵산검출용 센서의 구조는 도 1에 나타내었다.
본 발명에서, 핵산(nucleic acid)란 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, DNA 또는 RNA를 포함한다.
도 1을 참조하면 종이기반 핵산검출용 센서(100)는 제1 종이기판(110), 분리층(120) 및 제2 종이기판(130)으로 구성되고, 제1 종이기판(110)이 제일 하단에 위치하며, 제1 종이기판(110)의 일 단면에 분리층(120)이 형성되고, 상기 분리층(120)의 전면에 제2 종이기판(130)이 적층되어 있다.
상기 제1 종이기판(110) 및 제2 종이기판(130)은 다공성의 음전하를 띠는 것으로써, 기공의 크기는 서로 동일하거나, 상이할 수 있으나, 상기 제1 종이기판(110) 및 제2 종이기판(130)에서 PCR 증폭산물과 자성비드 혼합물의 이동성을 고려한다면 상기 제1 종이기판과 제2 종이기판에서의 기공 크기는 동일한 것이 바람직하다.
상기 제1 종이기판(110)과 제2 종이기판(130)의 기공 크기는 1 내지 5 ㎛ 크기 내에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 제1 종이기판(110)과 제2 종이기판(130)은 서로 동일하거나 상이한 재질일 수 있고, 각각 독립적으로 종이를 기반으로 하는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, nitrocelluose, glass fiber Millipore G041, Millipore GFDX, cellulosic Millipore C083, Millipore C048, Millipore C068, Millipore C083, Millipore C248, Healthcare CF1, CF3, CF4 cotton linter, Whatman Fusion 5, Std 14 및 Std 15로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 제1 종이기판의 전체 면적보다 제2 종이기판의 전체 면적이 2 배 내지 5 배 더 작은 것이 바람직한데, 제2 종이기판 상에 PCR 증폭산물과 자성비드의 반응물이 적하되고, 상기 적하된 반응물이 제2 종이기판->분리층->제1 종이기판을 통해 이동하여, 제1 종이기판 상에 퍼짐(spread)으로써 육안으로 식별가능하게 되기 때문에, 제2 종이기판의 전체 면적이 제1 종이기판의 전체 면적보다 2 배 내지 10 배 작은 것이 바람직하다. 만약 제2 종이기판의 전체 면적이 제1 종이기판의 전체 면적과 동일하거나 10 배를 초과하여 더 작아지게 되면, PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재하는지 여부를 효과적으로 검출할 수 없게 되는 문제가 있다.
상기 분리층(120)의 두께는 특별히 제한되지 않으나, 검출 정확성을 고려한다면 10 내지 100 ㎛인 것이 바람직하다.
상기 분리층(120)은 적하된 PCR 증폭산물과 나노입자(아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅 처리된 포획 나노입자(capture nanoparticle)) 용액이 복합체 형성유무에 따라 각각의 속도로 이동하게 되면서, 서로 분리되게 되는 층이다.
구체적으로 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재하는 경우, 표적 핵산은 PCR 과정을 통해 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드 중에서 어느 하나로 표지된 상태로 존재하게 된다(PCR에 사용되는 프라이머 세트에 따라 달라진다). 예를 들어 비오틴으로 표지된 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물일 경우, 비오틴으로 표지된 프라이머를 사용하였으므로, 형성된 표적 핵산은 비오틴으로 표지된 상태가 된다. 따라서, 이때 나노입자는 비오틴과 반응하여 복합체를 형성할 수 있는 스트렙타비딘이 코팅된 나노입자를 사용하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이 형성된 복합체를 상기 센서에 로딩할 경우, 상기 센서의 분리층에 체류되지 않고 통과하는데 반해, 복합체를 형성하지 않고 나노입자와 표적이 아닌 핵산이 각각 존재하는 경우 상기 분리층(120)을 통과하지 못하고 체류되어 제1 종이기판으로 퍼지지 못하게 된다.
본 발명의 실험예에서는 상기 비오틴으로 표지된 표적 핵산과 자성비드(스트렙타비딘이 코팅됨)를 혼합하여 비오틴과 스트렙타비딘의 상호작용에 의해 형성된 복합체를 사용하였고, 표적 핵산이 존재하여 복합체가 형성된 경우에는 상기 분리층을 통과하여 넓게 퍼졌다. 이에 반해 시료에 표적 핵산이 존재하지 않는 경우에는 PCR 과정에서 비오틴으로 표지된 프라이머로 표적 핵산이 증폭되지 않으므로, 증폭산물에 비오틴을 표지된 핵산이 존재하지 않으므로, 스트렙타비딘으로 코팅된 나노입자와 복합체를 형성하지 않고 각각 존재하게 되어, 상기 분리층을 통과하지 못하고 체류하게 되어, 좁은 원형으로 존재하게 된다.
상기 분리층(120)은 세파로스와 유리비드에 의한 밀도차에 의한 것이 아닌 합체를 형성한 경우와 형성하지 못한 경우의 전하와 다공성에 의한 흡착과정으로 발생한다. 복합체를 형성하지 못한 경우 분리층을 통과하지 못하고 분리층에 잔류 및 체류하게 되는데 반해, 복합체를 형성한 경우, 전하와 기공으로 인한 흡착에 영향을 덜 받아 통과하게 되는 것이다.
상기 분리층(120)은 세파로스, 유리비드 및 이들의 혼합물 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 세파로스와 유리비드가 동시에 사용될 경우, 혼합한 혼합물을 도포하여 단층으로 제조될 수 있고, 세파로스와 유리비드가 서로 분리되어 형성된 복층의 형태로 제조될 수도 있다.
본 발명의 다른 측면은 a) 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅 처리된 포획 나노입자(capture nanoparticle)가 분산된 제1 용액; 및 b) 상기 종이 기반 핵산 검출용 센서를 포함하는 종이기반 핵산검출용 키트에 관한 것이다.
상기 종이기반 핵산검출용 키트는 음전하를 띠는 다공성의 제1 종이기판, 상기 제1 종이기판의 일 단면에 적층되고, 세파로스, 유리비드 및 이들의 혼합물 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 분리층 및 상기 분리층의 일 단면에 적층되고, 음전하를 띠는 다공성 제2 종이기판;으로 구성된 것일 수 있다.
상기 키트에는 a-1) 검출하고자 하는 표적 핵산에 특이적으로 결합하는, 프라이머 세트(primer set)를 더 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 정방향 프라이머(forward primer), 및 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 프라이머란 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장산물의 합성이 유도되는 조건, 즉 뉴클레오티드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 상기 프라이머는 디옥시리보뉴클레오티드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 사용한 프라이머들은 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dANP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오티드 또는 비자연 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 나아가 상기 프라이머는 리보뉴클레오티드도 포함할 수 있다. 프라이머는 중합체의 존재하에서, 연장산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분한 길이를 가지고 있어야 한다. 상기 프라이머의 길이는 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스에 따라 결정되지만 일반적으로는 10~150 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위해 낮은 온도가 요구된다.
본 발명에서 어닐링 또는 프라이밍은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오티드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오티드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트에서는 시료로 검체로부터 분리할 수 있는 생물학적 시료라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 세포, 조직(생검 샘플 등), 전체 혈액, 혈청, 뇌척수액, 정액, 침, 가래, 소변, 대변, 모발 및 세포 배양액과 같은 표적 핵산을 포함할 수 있는 어느 샘플을 제한하지 않고 사용할 수 있다. 구체적인 이해를 돕기 위해, 일 실시예로서 HPV 16 DNA를 대상 샘플로 실험하였다. 즉, 합성용 주형으로하여, 상기 프라이머 세트를 첨가하여 PCR을 실시하여 PCR 증폭산물을 얻었다. 상기 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산은 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지되었고, 상기 반복 수는 1부터 10까지 범위로 하였다. 상기 표지된 핵산 분자는 추후 본 발명의 핵산검출용 키트에 의해 육안으로 음성 또는 양성을 구분할 수 있도록 시각화된다.
상기 프라이머 세트는, 검체로부터 분리된 시료 중의 표적 핵산과 접촉시, 혼성화되고, 혼성화 산물을 연장시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 거치게 한다.
이때, 상기 프라이머 세트 중에서 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 정방향 프라이머(forward primer)로 인해, 표적 핵산이 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지되어 형성된다. 바람직하게 상기 정방향 프라이머는 아비딘(avidin), 비오틴(biotin) 또는 아비딘-비오틴으로 표지된 것이 바람직하고, 이를 통해 표적 핵산이 아비딘(avidin), 비오틴(biotin) 또는 아비딘-비오틴으로 표지되어 형성되는 것이 바람직하다.
상기 프라이머 세트에는 다른 적절한 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드, Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 또는 멸균수 등이 필요에 따라 더 포함될 수 있다.
상기 증폭은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)로, 본 발명에서 PCR이란 중합효소를 이용해 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로서, 혼성화와 변성을 위한 열순환(thermal cycle)을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 PCR 방법에는 한번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함되며, 다중 PCR 에서는 복수의 프라이머 세트가 사용될 수 있다.
즉, 상기 프라이머 세트는 단일 또는 복수의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
상기 역방향 프라이머는 형광으로 표지된 것일 수도 있다. 상기 형광은 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 형광으로 표지된 경우, 종이기반 핵산검출용 키트 상에 PCR 증폭산물을 로딩하였을 때, 이동한 위치를 형광으로 확인하여, PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재했는지 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 상기 나노입자는 자성입자(magnetic bead), 금(Au) 나노입자, 은(Ag) 나노입자, 백금(Pt) 나노입자, 양자점(Quantum dot), 상방전환 나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP) 그래핀(graphene)-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자(color dyed particles) 및 라텍스(latex) 나노입자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 나노입자는 증폭산물 중에서 프라이머로 증폭된 표적 핵산을 포획 및 캡쳐(capture)하여, 복합체를 형성할 수 있는 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 상기 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 상기 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 상기 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅 처리된 것일 수 있다.
구체적으로 목적 핵산을 증폭한 증폭산물은 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 프라이머 세트를 사용하여 증폭되므로, 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 표적 핵산을 포함하게 된다.
여기에, 상기 표지된 표적 핵산의 종류에 따라, 상기 표적 핵산과 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하도록, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 상기 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 상기 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 상기 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 중에서 어느 하나를 선택하여 코팅한 나노입자를 선정한 다음, 상기 증폭산물과 제1용액을 반응시키면 '비오틴-스트렙타비딘', '항원-항체', '표적분자-앱타머', 올리고뉴클레오티드-올리고뉴클레오티드(상보적 결합)' 반응을 통해 나노입자가 표적 핵산을 포획할 수 있다(복합체 형성).
상기 나노입자는 스트렙타비딘(streptavidin)이 코팅된 자성비드인 것이 바람직한데, 상기 스트렙타비딘이 코팅된 자성비드는 비오틴으로 표지된 표적 핵산을 포획 및 캡처(capture)하여, 복합체를 형성함으로써, PCR 증폭산물에서 표적 핵산을 선택적으로 분리하기 위한 역할을 효율적으로 수행하기 때문이다. 본 발명에서는 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된 Dynabeads 사의 MyOne Streptavidin C1 자성비드(크기: 1 ㎛, 용량 80 ㎍)을 사용하였다. 본 발명은 복합체의 밀도를 이용해 검출하는 것을 원리로 채택하고 있지 않으므로, 복합체의 크기에 영향을 받지 않으므로 자성비드의 크기는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.1 내지 1 ㎛인 것이 바람직하다.
상기 종이기반 핵산검출용 센서에 대해서는 앞서 자세하게 기술되어 있으므로, 이와 관련하여 반복되는 내용은 생략하기로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 상기 종이기반 핵산검출용 키트의 제1 용액과 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 PCR 증폭산물을 혼합하여 반응물을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 종이기반 핵산검출용 키트의 센서에 상기 반응물을 적하하는 단계;를 포함하는 PCR 증폭산물을 분석하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트의 원리는 도 2에 개략적으로 도시되어 있고, 이를 참고하여 이하에서 구체적으로 설명하기로 한다.
(a) 상기 종이기반 핵산검출용 키트의 제1 용액과 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 PCR 증폭산물을 혼합하여 반응물을 수득한다. 구체적으로 표적 핵산이 존재하는지 확인하고자 하는 PCR 증폭산물에 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅 처리된 포획 나노입자(capture nanoparticle)가 분산된 제1 용액을 첨가한다.
만약 상기 PCR 증폭산물 내에 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 표적 핵산이 존재하는 경우, 상기 표적 핵산의 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나는 제1 용액의 나노입자에 코팅된 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 중에서 어느 하나와 결합을 형성하여 복합체로 제조되게 된다.
일예로, 상기 표적 핵산이 비오틴으로 표지되었을 경우, 상기 제1 용액의 나노입자는 스트렙타비딘으로 코팅된 나노입자(바람직하게 자성입자)을 사용하고, 상기 비오틴으로 표지된 표적 핵산과 상기 스트렙타비딘으로 코팅된 나노입자는 강한 소수 결합을 통해 복합체를 형성하게 된다. 이와 반대로 상기 PCR 증폭산물 내에 비오틴으로 표지된 표적 핵산이 존재하지 않는 경우에는, 제1 용액의 나노입자는 표적 핵산과 복합체를 형성하지 않고 그대로 용액 내에 존재하게 된다.
상기 (a) 단계는 단순 혼합함으로써 충분히 달성될 수 있고, 시간이나 장소에 구애받지 않는다. 또한, 별도로 미반응 자성비드 혹은 핵산을 제거하는 단계를 도입할 필요없으므로, 종래 PCR 증폭산물 검출과정에 비해 매우 단촐하면서 신속하고 간편하여, 어디서나 유용하게 수행할 수 있다.
a) 단계의 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 증폭산물(amplicon DNA)은, a-1) 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; 및 a-2) 목적 핵산에 특이적으로 결합하는, 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(fluorescence-labeled reverse primer)로 구성되고, 프라이머 세트를 처리하여 목적 핵산이 증폭된 PCR 증폭산물을 수득한 것일 수 있다.
상기 검체로부터 분리할 수 있는 생물학적 시료라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 세포, 조직(생검 샘플 등), 전체 혈액, 혈청, 뇌척수액, 정액, 침, 가래, 소변, 대변, 모발 및 세포 배양액과 같은 표적 핵산을 포함할 수 있는 어느 샘플을 제한하지 않고 사용할 수 있다. 구체적인 이해를 돕기 위해, 일 실시예로서 HPV 16 DNA를 대상 샘플로 실험하였다. 즉, 합성용 주형으로하여, 상기 프라이머 세트를 첨가하여 PCR을 실시하여 PCR 증폭산물을 얻었다. 상기 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산은 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지되었고, 상기 반복 수는 1부터 10까지 범위로 하였다. 상기 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 핵산 분자는 추후 본 발명의 핵산검출용 키트에 의해 육안으로 음성 또는 양성을 구분할 수 있도록 시각화된다. 상기 PCR 증폭 산물 내에 표적 핵산은 비오틴으로 표지된 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산은 DNA와 RNA를 포함하며, DNA의 증폭은 기존에 알려진 증폭방법(등온증폭을 포함한)이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 PCR일 수 있다, 또한 RNA의 증폭에 있어서 기존에 알려진 방법이라면 특별히 이에 제한되지 않고 사용할 수 있고, 바람직하게는 합성한 후 증폭하는 방법일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 RT-PCR일 수 있다.
상기 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)은, 본 발명에서 PCR이란 중합효소를 이용해 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로서, 혼성화와 변성을 위한 열순환(thermal cycle)을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 PCR 방법에는 한번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함되며, 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 세트가 사용될 수 있다.
즉, 상기 프라이머 세트는 단일 또는 복수의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍으로 구성되거나, 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍으로 구성된 것일 수 있다.
상기 프라이머 세트에는 다른 적절한 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드, Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 또는 멸균수 등이 필요에 따라 더 포함될 수 있다.
다음으로, (b) 상기 종이기반 핵산검출용 키트의 센서에 상기 반응물을 적하한다. 상기 종이기반 핵산검출용 키트의 제2 종이기판 상에 상기 반응물을 적하하여야 하고, 이외의 장소에 적하할 경우, PCR 증폭산물이 충분히 분리되지 않아 정확성이 저하되는 문제가 있다.
상기 (b) 단계 후에, (c) 상기 센서의 제1 종이기판 표면 상에 퍼진 반응물의 범위를 통해 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 포함되어 있었는지 여부를 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 종이기반 핵산검출용 키트(100)의 제2 종이기판(130) 상에 PCR 증폭산물과 자성비드의 반응물이 적하하면, 상기 적하된 반응물이 제2 종이기판(130)->분리층(120)->제1 종이기판(110)을 통해 이동하여, 제1 종이기판(110) 상에 퍼짐(spread)으로써 육안으로 식별가능하게 된다. 만약 상기 반응물에 표적 핵산-자성비드 복합체가 존재하는 경우, 세파로스와 유리비드로 이루어진 분리층에 의해 명확하게 구분되어 짐에 따라, 표적 핵산-자성비드 복합체는 기판 전체에 퍼지게 된다. 이 경우 육안으로 갈색이 확인된다. 이에 반해 상기 반응물에 복합체가 존재하지 않고, 나노입자(바람직하게 자성비드)가 그대로 존재하는 경우에는 분리층을 통해 제1 종이기판으로 퍼지지 못하고, 제2 종이기판(130)과 분리층(120)에 체류하게 되는 양상을 나타내게 된다. 이러한 센서에서의 시각적 결과 차이로 인해 PCR 증폭산물에 표적 핵산이 존재하는지 존재하지않는지 여부를 효과적이고, 재현성있게 확인할 수 있다.
앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 개발된 종이기반 핵산검출용 센서, 키트 및 검출 방법은 PCR 증폭산물에 존재하는 표적 핵산의 유무를 시각화한다는 점에서 다양한 장점들을 지닌다. 1) 하나의 혼합단계와 센서에 이를 적하하는 일련의 단계만을 필요하므로, 종래 기술들과는 달리 장시간의 배양시간이나 세척단계가 필요하지 않으므로, 절차를 간소화할 수 있다. 2) 본 발명은 검출과정에서 외력을 사용하지 않으므로, 외부장치가 필요하지 않아 장소에 구애받지 않는다. 이에 반해 종래 기술은 일반적으로 모세관 현상에 대한 추진력이 필요하고, 외부장치가 필수적이며, 흡수패드가 반드시 구비되어야 하는 등의 복잡한 구조적 문제가 존재한다.
일예로, 측방유동면역발색법(lateral flow immunochromatographic assay, LFIA)은 검체를 첨가하는 과정만으로 이후 판독이 가능한 결과를 얻는데 필요한 일련의 반응이 시작되므로 재원이 제한된 상황에서 사용될 수 있는 가장 간단하고 성공적인 도구였다. 구체적으로 LFIA는 고전적인 샌드위치 형식에서 검체가 표지항체를 용해하여 이동하고, 검체와 항체가 반응막을 따라 함께 크로마토그래피되어 포획영역에 결합하면 표지물질이 포획된 경우에만 육안 관찰이 가능한 축적물이 형성된다. 그러나 LFIA는 표지물질의 종류에 따라 검출한계의 차이가 분명하고, 모체 유래 항원 등의 다양한 요소에 의한 간섭현상이 있을 뿐만 아니라, 검체의 포획을 위한 항체와 검출 프로브의 정교한 설계가 필요하여, 제조과정이 어렵다는 단점들이 존재한다. 나아가 상기 LFIA를 통해서는 PCR 증폭산물 중에서 표적 핵산만을 검출하는 것이 매우 어렵다는 한계점이 존재한다.
한편, SPIN-DNA 시스템와 같은 종래 기술의 경우, PCR 증폭산물을 검출하기 위하여 세파로스의 농도, 세파로스의 밀집도와 염료의 도입(intercalating)[GelRed (상품명)], 원심력, PCR 증폭산물의 형광 표지 여부, 온도, 등의 다양한 요인들에 의해 나노입자가 영향을 받았고, 이는 SPIN-DNA 시스템와 같은 종래 기술이 다양한 요소들에 의해 영향을 받는다는 것을 의미하며, 재현성 혹은 정확성이 장소와 때에 따라 달라질 수 있음을 나타내는 것으로써, 장소나 조건에 제한이 있다.
그러나 본 발명의 종이기반 현장진단 키트의 경우, 앞서 설명한 다양한 요인(세파로스의 농도와 염료의 도입(intercalating)[GelRed (상품명)], 원심력, PCR 증폭산물의 형광 표지 여부 등)들에 의해 나노입자(바람직하게 자성비드)의 이동성이 달라지지 않았음을 확인하였다. 심지어 형광 표지물질이 도입된 것과 도입되지 않은 PCR 증폭산물을 본 발명의 종이기반 현장진단 키트에 로딩하였을 때, 그 결과가 동일하였다(미도시). 또한, 본 발명의 종이기반 현장진단 키트는 종래 기술과 달리 원심분리나 GelRed의 첨가가 필요하지 않으므로, 검출 단계를 생략할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 종이기반 현장진단 키트는 표적 핵산이 존재하는 PCR 증폭산물을 로딩하였을 때의 나노입자(바람직하게 자성비드) 이동 패턴과 표적 핵산이 존재하지 않는 PCR 증폭산물을 로딩하였을 때의 나노입자(바람직하게 자성비드) 이동 패턴이 전혀 상이하기 때문에, 세파로스의 농도에 따라 결과가 영향을 받는다 하더라도 그 정도가 미미하며, 결과가 뒤집히거나 정확도나 재현성이 저하되는 문제로 연결되지 않는다. 게다가 본 발명의 종이기반 현장진단 키트는 표적 핵산의 크기 혹은 PCR 증폭산물의 크기에 영향을 받지 않는다는 장점이 있다.
이에 본 발명은 상술한 종래 기술들이 갖고 있던 문제점을 해결하였을 뿐만아니라, 부가적인 장치들을 생략하여, 구조적으로 더욱 단순화하였으며, PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재하는지 여부를 간단하게 시각화할 수 있어, 장소에 구애받지 않고 PCR 증폭산물을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 종이기반 핵산검출용 키트는 일반적인 PCR 수행을 통해 비오틴화된 PCR 증폭산물을 생성한다면, 핵산의 종류에 상관없이 널리 적용될 수 있다는 장점이 있다. 즉 본 발명의 종이기반 핵산검출용 센서, 키트 및 검출방법은 POCT(현장진단) 환경에 적합하므로, 환자 진단 및 치료에 있어서 POCT 진단 분야에 널리 활용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
i. 본 발명은 PCR 증폭산물로부터 표적 핵산의 존재를 쉽고 간단하게 검출할 수 있는 종이기반 핵산검출용 센서를 제공한다.
ii. 또한, 본 발명은 PCR 증폭산물로부터 표적 핵산의 존재를 쉽고 간단하게 검출할 수 있는 종이기반 핵산검출용 키트 및 이를 이용해 핵산을 검출하는 방법을 제공한다.
iii. 본 발명은 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나로 표시된 표적 핵산과 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅 처리된 포획 나노입자(capture nanoparticle)가 결합하여 복합체를 형성되고, 이를 센서 내에 적하하면 센서의 구조를 따라 복합체가 분리 및 이동하게 되며, 최종적으로 센서 외부로 시각화되는 기능을 이용하여 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재하는지 유무를 쉽고 간단하게 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 종이기반 핵산검출용 센서의 구조를 나타낸 사시도이다.
도 2는 본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트의 원리를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 종이기반 현장진단용 키트를 통해 표적 핵산을 검출한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트의 검출감도와 성능을 평가한 결과를 나타낸다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실시예 1> PCR 증폭산물 준비
1) 시료 준비
일 실시예로써 HPV 대상으로 본 발명의 종이기반 DNA 진단키트를 사용하여 DNA를 검출하여 본 발명의 재현성 및 정확성을 확인하고자 하였다. 본 발명의 종이 기반 DNA 진단키트를 사용하기 위한 시료는 일반적인 PCR 증폭을 통해 수득되는 비오틴으로 표지된 증폭산물이라면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명에는 다음과 같이 준비하였다.
자궁경부검체로부터 genomic DNA를 추출하는 경우, 핵산추출키트(QIAamp DNA Micro kit, QIAGEN, Valencia, CA, USA 또는 ChargeSwitch gDNA 1㎕ Serum Kit, Life Technologies, NY, USA)를 이용하여 제조사의 지시대로 핵산을 추출하였고, 인유두종바이러스(HPV) DNA 표준품은 식품의약품안전처 및 NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control)에 분양신청을 하여 반복실험을 위한 24개의 HPV 16 DNA 양성 시료와 6개의 다른 HPV 유형의 양성 시료를 준비하였다. 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 역방향, 정방향 프라이머(하기 표 1)로 이루어진 프라이머 세트를 이용해 중합효소 연쇄반응을 수행하였고, 각 시료의 증폭산물을 수득하였다. 본 발명의 프라이머 세트는 PCR 증폭뿐만 아니라 등온증폭(바람직하게는 helicase dependent amplification(HDA), recombinase polymerase amplification(RPA))도 가능하도록 제작되었고, 기존에 알려진 문헌을 참고하여 변형하였다(Virol J. 2010 Aug 19;7:194).
Figure PCTKR2019009021-appb-img-000001
상기 역방향 프라이머(reverse primer)는 5 '말단에서 Cy3이 존재하거나 존재하지 않는 것을 사용하였고, 정방향 프라이머(forward primer)는 5' 말단에 비오틴(biotin)으로 표지된 것을 사용하였다. 이는 상기 비오틴이 본 발명에서 b) 스트렙타비딘이 코팅된 자성비드(Dynabead MyOne Streptavidin C1)와 상호작용을 형성하도록 하기 위함이다.
상기 프라이머 세트(10 pmole/㎕) 1 ㎕을 HotStarTaq plus Master Mix 10 ㎕, Template DNA(1 ng/㎕) 5 ㎕ 및 증류수 4 ㎕과 함께 혼합한 후, 증폭조건은 95℃에서 10 분, [95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초]를 한 사이클로 하여 40 회 반복하여 PCR을 수행하였다.
상술한 과정을 통해 HPV16 및 다른 유형의 HPV에 대하여 PCR 분석을 수행하였고, 비오틴화된 증폭산물(amplified DNA) 20 ㎕를 얻었다. 이렇게 제조된 비오틴으로 표지된 증폭산물의 일부를 Roche Cobas 4800 HPV 검사(Roche HPV; Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA, USA)를 통해, 양성 대조군으로 사용하였고, 추후 본 발명의 분석 결과와 비교하였다.
<실시예 2> 종이기반 핵산검출용 키트를 이용한 증폭산물 분석 결과 확인
1) 종이기반 핵산검출용 키트
스트렙타비딘이 코팅된 자성비드가 분산되어 있는 제1 용액(magnetic beads suspension)(10 ㎎/㎖ Dynabead MyOne Streptavidin C1, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)을 준비하였다.
또한, 6 x 6 ㎝ 크기의 Fusion 5 paper(GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용해 제1 종이기판을 준비하였다. 상기 제1 종이기판 상에, 세파로스(sepharose) 용액(2 mg/㎕의 세파로스가 분산된 LISS 완충액(low ionic strength solution)) 24 ㎕과 75 ㎜ 유리비드(1:1 v/v with LISS and 0.1% Triton-X) 8 ㎕를 6 × 6 ㎜의 면적(원형)으로 도포하고 상온에서 건조함으로써, 분리층을 형성하였다. 다음으로, 상기 분리층 상에 원형의 6 x 6 ㎜ 크기의 Fusion 5 paper(GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 적층하여 제2 종이기판을 제조하였다. 제2 종이기판은 분리층 상에 적층되되, 분리층의 표면을 전부 덮도록 적층되는 것이 바람직하다. 상술한 과정을 통해 하기 도 1에서와 같은, 제1기판/제2기판/분리층 구조의 종이기반 핵산검출용 센서를 제조하였다.
상기 제1 및 제2 종이기판에 사용된 Fusion 5 paper은 다공성으로 평균 입자 포집 크기(particle retention size)가 2.3 ㎛이고, 음전하(-)를 띠는 것을 특징으로 한다.
2) 종이기반 핵산검출용 키트를 이용한 PCR 증폭산물 분석
상기 실시예 1로부터 수득한 비오틴으로 표지된, HPV의 PCR 증폭산물(positive 시료)에 스트렙타비딘(streptavidin)이 코팅된 자성비드가 분산된 제1용액(magnetic beads suspension)(10 ㎎/㎖ Dynabead MyOne Streptavidin C1, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 8 ㎕을 혼합하였다. 이의 대조군(negative 시료)으로 표적 핵산이 존재하지 않는 PCR 증폭산물을 시료(negative)로 이용하였다.
상기 혼합액을 종이기반 핵산검출용 센서의 제2 종이기판 상에 적하하였다. 상기 혼합액이 종이기반 핵산검출용 센서 상에 적하된 후, 여기에 LISS(low ionic strength solution) 완충액(BLISS, Ortho-Clinical Diagnostics) 60 ㎕를 추가로 적하하였다. 상기 혼합액은 침전물의 이동도에 따라 제2 종이기판을 따라 세파로스(Sepharose)와 75-㎜ 유리비드로 이루어진 분리층을 통해 제1 종이기판 상으로 이동하게 되고, 상기 침전물의 이동정도를 따라 육안으로, 상기 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재하는지(양성), 존재하지 않는지(음성)를 판단할 수 있게 된다. 상술한 과정은 수~수십 초 이내에 이루어지므로, 육안으로 결과를 확인하는데 까지 1~10분 정도 소요되었다.
3) 표적 핵산이 존재하거나 존재하지 않는 PCR 증폭산물을 제1 용액과 혼합하였을 때의 분석 결과 비교
도 3은 본 발명에 따른 종이기반 현장진단용 키트를 통해 표적 핵산을 검출한 결과에 관한 것으로, 우측은 비오틴으로 표지된 HPV의 PCR 증폭산물을 양성 시료(positive)로 이용한 것 이고, 좌측은 비오틴으로 표지되지 않은 HPV의 PCR 증폭산물을 음성 시료(negative)로 이용한 것이다.
도 3에 나타난 바와 같이 표적 핵산이 존재하는 PCR 증폭산물을 로딩한 종이기반 현장진단용 키트(우측)의 경우와 표적 핵산이 존재하지 않는 PCR 증폭산물을 로딩한 종이기반 현장진단용 키트(좌측)이 시각적으로 현저한 차이가 있음을 확인하였다. 즉 표적 핵산이 존재하는 PCR 증폭산물을 로딩하면, 종이기반 현장진단용 키트 전체에 자성비드의 갈색이 넓게 퍼지기 때문에, 육안으로 PCR 증폭산물에 표적 핵산이 존재함을 쉽게 판별할 수 있다.
일반적으로 PCR 증폭산물에 표적 핵산이 존재하는 유무(양성/음성)를 시각적으로 검출하기 위해서는, 전력, 모터 구동 또는 원심력 등의 외력이나 외부 검출장비가 필수적이다. 허나, 본 발명의 종이기반 현장진단용 키트의 경우 도 3에 나타난 바와 같이 외력이나 외부 검출장비 없이 PCR 증폭산물에 표적 핵산이 존재하는 지를 육안으로 판별할 수 있도록 시각적으로 결과가 도출되도록 한다. 이는 다음과 같이 설명될 수 있다.
표적 핵산이 포함된 PCR 증폭산물을 본 발명의 제1용액(자성비드)과 혼합할 경우, 표적 핵산에 결합되어 있는 비오틴과 자성비드에 코팅된 스트렙타비딘이 서로 상호작용하여 표적 핵산-자성비드 복합체(amplicon-attached)를 형성하게 된다. 반면 표적 핵산이 포함되지 PCR 증폭산물을 본 발명의 제1용액(자성비드)과 혼합할 경우, 자성비드는 복합체를 형성하지 못하고, 그래도 존재하게 된다. 따라서 표적 핵산-자성비드 복합체와 자성비드는 이동성에 차이를 갖게 되는데, 상기 이동성의 차이가 세파로스와 유리비드로 이루어진 분리층에 의해 명확하게 구분되어 짐에 따라, 표적 핵산-자성비드 복합체는 기판 전체에 퍼지게 되고, 자성비드는 처음 적하되었던 제2기판 상에 머물게 되는 것이다.
다시 말해 본 발명에 따른 종이기반 핵산검출용 키트는 PCR 증폭산물로부터 표적 핵산을 포획하거나 검출하기 위한 프로브(탐침)가 기판 상에 고정화되어 있지 않더라도(기판 상에 별도의 구성이 포함되어 있지 않음에도), 재현성있고, 정확하면서, 쉽고 간편하게 PCR 증폭산물로부터 표적 핵산의 유무를 육안으로 판별하도록 함을 알 수 있다.
<실시예 3> 종이기반 핵산검출용 키트를 이용한 증폭산물 분석 결과 확인
1) 종이기반 핵산검출용 키트
스트렙타비딘이 코팅된 자성비드가 분산되어 있는 제1 용액(magnetic beads suspension)(10 ㎎/㎖ Dynabead MyOne Streptavidin C1, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)을 준비하였다.
또한, 6 x 6 ㎝ 크기의 Fusion 5 paper(GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용해 제1 종이기판을 준비하였다. 상기 제1 종이기판 상에, 세파로스(sepharose) 용액(2 mg/㎕의 세파로스가 분산된 LISS 완충액(low ionic strength solution)) 24 ㎕과 75 ㎜ 유리비드(1:1 v/v with LISS and 0.1% Triton-X) 8 ㎕를 6 × 6 ㎜의 면적(원형)으로 도포하고 상온에서 건조함으로써, 분리층을 형성하였다. 다음으로, 상기 분리층 상에 원형의 6 x 6 ㎜ 크기의 Fusion 5 paper(GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 적층하여 제2 종이기판을 제조하였다. 제2 종이기판은 분리층 상에 적층되되, 분리층의 표면을 전부 덮도록 적층되는 것이 바람직하다. 상술한 과정을 통해 하기 도 1에서와 같은, 제1기판/제2기판/분리층 구조의 종이기반 핵산검출용 센서를 제조하였다.
상기 제1 및 제2 종이기판에 사용된 Fusion 5 paper은 다공성으로 평균 입자 포집 크기(particle retention size)가 2.3 ㎛이고, 음전하(-)를 띠는 것을 특징으로 한다.
2) 종이기반 핵산검출용 키트를 이용한 PCR 증폭산물 분석
인유두종바이러스(HPV) DNA 표준품(NIBSC 코드 : 06/202, HPV16 DNA WHO 표준)를 10, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 배 희석한 것을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 하여 각각에 대한 비오틴으로 표지된 PCR 증폭산물을 수득하였다. 이의 대조군(negative 시료)으로 표적 핵산이 존재하지 않는 시료(10, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 배 희석)를 PCR로 증폭하여 증폭산물을 얻었다.
상기 수득한 비오틴으로 표지된 PCR 증폭산물(positive 시료)에 스트렙타비딘(streptavidin)이 코팅된 자성비드가 분산된 제1용액(magnetic beads suspension)(10 ㎎/㎖ Dynabead MyOne Streptavidin C1, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 8 ㎕을 혼합하였다.
상기 혼합액을 종이기반 핵산검출용 센서의 제2 종이기판 상에 적하하였다. 상기 혼합액이 종이기반 핵산검출용 센서 상에 적하된 후, 여기에 LISS(low ionic strength solution) 완충액(BLISS, Ortho-Clinical Diagnostics) 60 ㎕를 추가로 적하하였다. 상기 혼합액은 침전물의 이동도에 따라 제2 종이기판을 따라 세파로스(Sepharose)와 75-㎜ 유리비드로 이루어진 분리층을 통해 제1 종이기판 상으로 이동하게 되고, 상기 침전물의 이동정도를 따라 육안으로, 상기 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 존재하는지(양성), 존재하지 않는지(음성)를 판단할 수 있게 된다. 상술한 과정은 수~수십 초 이내에 이루어지므로, 육안으로 결과를 확인하는데 까지 1~10분 정도 소요되었다.
3) 검출감도 및 성능평가 분석
도 4는 본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트의 검출감도와 성능을 평가한 결과를 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트는 10 5 배 희석한 생물학적 시료를 이용해 PCR 증폭산물을 제조하였음에도, 우수한 검출 민감도를 나타내고 있음을 알 수 있다. 또한 본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트는 상술한 실험을 통해 검출 민감도가 적어도 10 1 copies/mL의 HPV DNA임을 재현성있게 확인하였다(6 일 동안 12 복제(replicate))(n = 30). 본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트는 Roche Cobas 4800 HPV 검사를 사용하여 얻은 결과와 완벽한 일치함을 확인하였으므로, 본 발명의 종이기반 핵산검출용 키트는 재현성 및 정확성에 있어서 매우 우수함을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 표적 핵산의 존재를 쉽고 간단하게 검출할 수 있는 종이기반 핵산검출용 센서 및 이를 이용하여 핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 기존 방법과 비교하여 표적 핵산의 존재 유무를 쉽고 빠르고 간단하게 검출할 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (13)

  1. 음전하를 띠는 다공성의 제1 종이기판;
    상기 제1 종이기판의 일 단면에 적층되고, 세파로스, 유리비드 및 이들의 혼합물 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 분리층; 및
    상기 분리층의 일 단면에 적층되고, 음전하를 띠는 다공성 제2 종이기판;으로 구성된 종이기반 핵산검출용 센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 종이기판 및 제2 종이기판은 동일하거나 서로 상이한 크기의 기공을 가지는 것을 특징으로 하는 종이기반 핵산검출용 센서.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 기공의 크기는 1 내지 5 ㎛인 것을 특징으로 하는 종이기반 핵산검출용 센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 종이기판 및 제2 종이기판은 서로 동일하거나 상이한 재질이고, 각각 독립적으로 glass fiber Millipore G041, Millipore GFDX, cellulosic Millipore C083, Millipore C048, Millipore C068, Millipore C083, Millipore C248, Healthcare CF1, CF3, CF4 cotton linter, Whatman Fusion 5, Std 14 및 Std 15로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 종이기반 핵산검출용 센서.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 종이기판의 전체 면적보다 제2 종이기판의 전체 면적이 2 배 내지 10 배 더 작은 것을 특징으로 하는 종이기반 핵산검출용 센서.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 분리층의 두께는 10 내지 100 ㎛인 것을 특징으로 하는 종이기반 핵산검출용 센서.
  7. a) 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프라이머에 결합된 항원에 항원-항체 반응을 통해 결합될 수 있는 항체, 프라이머에 결합된 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer) 및 프라이머에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 코팅 처리된 포획 나노입자(capture nanoparticle)가 분산된 제1 용액; 및
    b) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 종이 기반 핵산 검출용 센서;를 포함하는 종이기반 핵산검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 나노입자는 자성입자(magnetic bead), 금(Au) 나노입자, 은(Ag) 나노입자, 백금(Pt) 나노입자, 양자점(Quantum dot), 상방전환 나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP) 그래핀(graphene)-나노입자 복합체, 색 염색 나노입자(color dyed particles) 및 라텍스(latex) 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 종이기반 핵산검출용 키트.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 나노입자는 스트렙타비딘(streptavidin)이 코팅된 자성비드인 것을 특징으로 하는 종이기반 핵산검출용 키트.
  10. 제7항에 있어서,
    a-1) 검출하고자 하는 표적 핵산에 특이적으로 결합하는, 프라이머 세트(primer set)를 더 포함하고,
    상기 프라이머 세트는 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 정방향 프라이머(forward primer), 및 형광 표지된 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 종이기반 핵산검출용 키트.
  11. (a) 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 종이기반 핵산검출용 키트의 제1 용액과 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 PCR 증폭산물을 혼합하여 반응물을 수득하는 단계; 및
    (b) 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 종이기반 핵산검출용 키트의 센서에 상기 반응물을 적하하는 단계;를 포함하는 PCR 증폭산물을 분석하기 위한 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (b) 단계 후에, (c) 상기 센서의 제1 종이기판 표면 상에 퍼진 반응물의 범위를 통해 PCR 증폭산물 내에 표적 핵산이 포함되어 있었는지 여부를 판별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    a) 단계는
    a-1) 검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; 및
    a-2) 목적 핵산에 특이적으로 결합하는, 프라이머 세트(프라이머 세트는 아아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 아비딘-비오틴, 항원, 표적분자, 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 정방향 프라이머(forward primer), 및 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나로 표지된 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함함)를 처리하여 목적 핵산이 증폭된 PCR 증폭산물을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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