WO2017007067A1 - 고추 캡산틴 캡소루빈 합성효소 유전자 유래의 식물체 전신 발현 프로모터 - Google Patents

고추 캡산틴 캡소루빈 합성효소 유전자 유래의 식물체 전신 발현 프로모터 Download PDF

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하선화
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Kyung Hee University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)

Definitions

  • the present invention is a plant systemic expression promoter (constitutive promoter), more specifically, a plant systemic expression promoter derived from pepper capsanthine-capsorubin synthase gene, an expression vector comprising the promoter and a transformed plant transformed with the expression vector It is about. Since the systemic expression promoter according to the present invention can express the gene of interest in all tissues of the plant, selection of transformants using antibiotics or herbicide resistance genes in the preparation of transformants, and development of transformed plants for the production of useful materials for medical and industrial use It can be usefully used.
  • Crop molecular breeding is the key to lead the next generation of agriculture in that it is possible to use all kinds of genes as a material and to fine-tune the effects of infinite breeding by pulling down the breeding technology that was possible only in the existing genome.
  • Technology. The cultivation area and cultivation volume of GM crops using these crop molecular breeding techniques are continuously increasing worldwide.
  • the global market size of commercialized genetically modified genetic seeds is $ 4 billion in 2002 to $ 10 billion in 2010 (including seeds and technology fees), which is 15% of the total global seed market size of $ 30 billion, and includes soybean, corn, cotton, Rapeseeds form the main market.
  • GMO genetically modified
  • the CaMV 35S (patent no .: JP1993192172-A1) promoter has since become the most commonly used universal promoter in plants.
  • the potential risks to the environment of GMOs by viral-derived promoters ie the possibility of transduction of transgenes to target and non-target organisms, safety applications against weeds, ecosystem disturbances, etc. are constantly emerging.
  • the use of plant-derived promoters there has been a continuing social demand for the use of plant-derived promoters.
  • Plant-derived promoters include the ubiquitin promoter of Arabidopsis plants (Callis et al., 1990, Journal of Biological Chemistry, 265: 12486-12493), and the NeIF-4A promoter of tobacco plants (Mandel et al., 1995, Plant Molecular Biology, 29: 995-1004), actin promoter of Arabidopsis plants (An et al., 1996, Plant Journal, 10: 107-121), tCUP promoter of tobacco plants (Foster et al., 1999 , Plant Molecular Biology, 41: 45-55; Wu et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265: 763-770; Malik et al., 2002, Theor Appl Genet, 105: 505-514).
  • CaMV35S promoter had a problem showing much less activity.
  • the capsanthin-capsorubin synthase gene ( CaCcs ) is a gene that is specifically expressed during chromoplast maturation of the fruit. CaCcs is strongly expressed at the same time as the fruit ripens, but leaves, It is not expressed in other organs and stem fruits, including stems and roots. In addition, the transfer of CaCcs is not due to the fault of peppers as red pigment biosynthetic pathway of the baked component, and xanthine cap kaepso Rubin sukgwa the color observed in the pepper varieties representing yellow. CaCcs like this Due to the nature of expression it is considered a good candidate gene for chromosome-specific promoters.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a plant-derived systemic expression promoter.
  • the capsanthin-capsorubin synthase gene ( Cacs ) promoter shows color-specificity.
  • the present invention was completed by confirming that systemic expression is possible when using only the cleavage (-367 to +30) of the CaCcs promoter.
  • the present invention provides a plant systemic expression promoter derived from pepper capsanthine-capsorubicin synthase gene comprising the nucleotide sequence of the 1913 to 2309 (-367 to +30) region of SEQ ID NO: 1.
  • the pepper capsanthine-capsorubin synthase gene-derived plant whole-body expression promoter may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a plant capsular expression promoter derived from pepper capsanthin-capsorubin synthase gene comprising the nucleotide sequence of the 1913 to 2309 (-367 to +30) region of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a transformation transformed with an expression vector comprising a plant systemic expression promoter derived from pepper capsanthine-capsorubicin synthase gene comprising the nucleotide sequence of the 1913 to 2309 (-367 to +30) region of SEQ ID NO: 1.
  • an expression vector comprising a plant systemic expression promoter derived from pepper capsanthine-capsorubicin synthase gene comprising the nucleotide sequence of the 1913 to 2309 (-367 to +30) region of SEQ ID NO: 1.
  • a plant may include the transgenic plant monocotyledonous plant or dicotyledonous plant.
  • the present invention also expresses a plant systemic expression promoter derived from pepper capsanthine-capsorubicin synthase gene comprising the nucleotide sequence of the 1913 to 2309 (-367 to +30) region of SEQ ID NO: 1 and a gene encoding a target protein.
  • the present invention provides a method for producing a transgenic plant comprising the step of transforming a plant with a vector, wherein the protein of interest is expressed in whole plant tissues.
  • the present invention also expresses a plant systemic expression promoter derived from pepper capsanthine-capsorubicin synthase gene comprising the nucleotide sequence of the 1913 to 2309 (-367 to +30) region of SEQ ID NO: 1 and a gene encoding a target protein. Transforming the plant with the vector; And
  • It is to provide a method of producing a target protein comprising the step of producing a target protein by expressing a gene encoding the target protein in the entire tissue of the transformed plant.
  • CaCcs comprising the nucleotide sequence of the region 1913 to 2309 (-367 to +30) of the SEQ ID NO: 1, produced in accordance with the present invention
  • the promoter can induce gene expression not only in the anther and pistils of the colored tissue, but also in the leaf and calyx of the non-chromosomal tissue (see Example 1).
  • CaCcs according to the present invention The promoter may have a 3- to 31-fold expression of activity compared to the conventional 35S promoter (see Example 2).
  • CaCcs according to the present invention The promoter can induce gene expression in all organs with stronger activity than conventional 35S promoters (see Example 3).
  • the promoter is a stronger systemic expression promoter than the conventional 35S promoter, and may be usefully used for the selection of transformants using antibiotics or herbicide resistance genes and the development of medical and industrial useful substance-producing transgenic plants. It is expected.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a vector for comparing the activity of full-length CaCcs promoter ( CaCcs- 6) and its cleavage promoters ( CaCcs- P5, P4, P3, P2 and P1) in transgenic Arabidopsis plants.
  • Figure 2 shows the histochemical GUS staining results for leaves (left) and flowers (right) of Arabidopsis plants transformed with CaCcs -P6, P5, P4, P2 and P1.
  • Figure 3 shows the histochemical GUS staining results for d35S -P: Gus and CaCcs -P1 : Gus transformed Arabidopsis at 3 week seedling stages.
  • Figure 6 is a semi-GUS transcripts from each organ of the Arabidopsis plants transformed switch is CaCcs -P1 - shows the quantitative RT-PCT as a result.
  • Figure 8 shows the results of comparing the promoter activity of d35S -P and CaCcs -P1 in transgenic tobacco plants.
  • the present invention is to provide a plant systemic expression promoter derived from pepper capsanthine-capsorubine synthase gene, an expression vector comprising the promoter and a transformed plant transformed with the expression vector.
  • a plant whole-body expression promoter derived from a capsanthin-capsorubin synthase gene ( CaCcs ) comprising a nucleotide sequence of 1913 to 2309 sites of SEQ ID NO: 1.
  • the CaCcs- derived plant whole-body expression promoter may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • promoter as used herein is located upstream 5 'with respect to the transcription direction of the transcription initiation site of the gene (represents the transcription initiation point as position +1 of the sequence and upstream therewith) Any nucleotides present are represented using negative numbers), binding sites for DNA-dependent RNA polymerase, transcription initiation sites, transcription factor binding sites, inhibitory and activator protein binding sites, and the amount of transcription from the promoter directly or indirectly. Transcription of one or more genes, structurally identified by the presence of any other DNA domain (cis-acting sequence), including, but not limited to, any other nucleotide sequence known to those skilled in the art to act as a regulator. Nucleic acid fragments with the function of controlling are shown. Examples of cis-acting sequences of eukaryotes upstream of the transcription start point (+1) include TATA boxes, CAAT boxes, 5 'enhancers or silent factor elements, and the like.
  • the term “constitutive” or “constitutive” promoter refers to a promoter that is active in most tissues (or organs) under most physiological and developmental conditions. More preferably, systemic promoters are active under essentially all physiological and developmental conditions in all major organs such as leaves, stems, roots, seeds, fruits and flowers. Most preferably, systemic promoters are active in most organs, mostly under physiological and developmental conditions.
  • “inducible” promoter means a promoter that is physiologically controlled (eg, external action of a particular compound) or developmentally.
  • tissue specificity means a promoter that is active only in a tissue or cell of a characteristic type.
  • a “systemic promoter” or “promoter with systemic activity” refers to a nucleic acid sequence capable of transcription in a plant under most physiological and developmental conditions or in plant cells in most tissues (or organs). Indicates.
  • the derived plant systemic expression promoter exhibits at least 70% homology with the nucleotide sequence of the sites 1913 to 2309 of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and is complementary to a nucleotide sequence having a promoter activity equivalent to that of the promoter May comprise a sequence
  • the term “homology” is intended to indicate a degree of similarity with a wild type nucleic acid sequence, and the comparison of the homology can be performed by using a comparison program that is easy to see with the naked eye or purchase.
  • Commercially available computer programs can calculate the percent homology between two or more sequences, and the percent homology can be calculated for adjacent sequences.
  • CaCcs- derived plant whole-body expression promoter may have improved expression activity compared to Cauliflower Mosaic Virus 35S ( CaMV35S ).
  • enhanced expression means that the level of the nucleic acid molecule in the plant after the introduction of the promoter according to the invention is higher than that of the reference plant or the level of expression in the plant before the introduction of the promoter according to the invention. .
  • the term “enhanced” or “increased” as used herein is synonymous and means higher, preferably significantly higher expression of the nucleic acid molecule expressed.
  • expression means the biosynthesis of a gene product in a cell, preferably the electron and / or translation of a nucleotide sequence, such as an endogenous gene or a heterologous gene.
  • the term "enhanced systemic expression promoter” refers to a promoter that induces systemic expression in a plant, wherein the accumulation or synthesis rate of RNA or stability of RNA derived from nucleic acid molecules under the control of each promoter is determined by CaMV35S It is increased by at least 50%, for example at least 100%, preferably at least 200%, more preferably at least 300% and most preferably at least 400% relative to the promoter.
  • an expression vector for systemic expression inducing a systemic expression promoter derived from CaCcs according to the first embodiment is provided.
  • expression vector refers to a plasmid, virus or other known in the art in which a promoter according to the present invention and a gene sequence encoding a protein of interest operably linked with said promoter can be inserted or introduced.
  • a gene sequence encoding a systemic expression promoter of a plant according to the present invention and a target protein operably linked to the promoter may be operably linked to an expression control sequence, and the operably linked gene sequence and expression control sequence may be It can be included in one expression vector that contains the selection marker and replication origin together.
  • operably linked means that the appropriate molecule is linked in such a way as to enable gene expression when binding to expression control sequences.
  • expression control sequence also refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell.
  • regulatory sequences include promoters for carrying out transcription, any operator sequence for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation.
  • the expression vector according to the present invention may be prepared by inserting a recombinant promoter of the present invention using a conventional vector used for protein expression as a backbone and inserting a nucleotide sequence encoding a target protein downstream of the promoter.
  • a conventional vector used for protein expression as a backbone
  • Bacillus subtilis-derived plasmids pUB110 and pTP5
  • yeast-derived plasmids YEp13, YEp24 and YCp50 having various cloning sites as vectors that can be used in the present invention.
  • plasmids such as Ti plasmids, plant viral vectors, and binary vectors such as pCHF3, pPZP, pGA, and pCAMBIA families can be used.
  • binary vectors such as pCHF3, pPZP, pGA, and pCAMBIA families
  • those skilled in the art can use any vector as long as it is a vector capable of introducing the promoter of the present invention and the base sequence encoding the target protein operably linked to the promoter into the host cell.
  • target protein refers to any target protein of external origin that is highly expressed in whole tissues of the plant by the promoter of the present invention, and may preferably be an exogenous protein or an endogenous protein and a reporter protein.
  • the exogenous protein refers to a protein that does not naturally exist in a specific tissue or cell
  • the endogenous protein refers to a protein expressed by a gene that exists naturally in a specific tissue or cell.
  • the reporter protein is a protein expressed by the reporter gene and refers to a labeling protein that indicates its activity in the cell by its presence.
  • the target protein gene expressed by the plant whole-body expression promoter of the present invention may include a gene related to fatty acid biosynthesis and regulation when the plant to be transformed is a maintenance crop such as rapeseed, perilla and sesame.
  • soybean plants such as soybeans and alfalfa, which have a relatively high accumulation compared to other plants, may include antibody genes having high economic value.
  • corn is a typical oral vaccine such as swine diarrheal disease and foot-and-mouth disease virus (edible). vaccine) genes, and most crops that are stored and distributed for a long period of time as roots include genes related to various disease resistance to increase shelf life after harvesting, as well as specific nutritional components such as tocopherol and beta carotene.
  • Biosynthesis of the relevant metabolic pathways But are the electronic or the like, without being limited thereto, may be included around the tissue and a gene encoding a variety of desired protein that can be adjusted using the expression promoter of the present invention. Therefore, if the promoter of the present invention is used in crops that consume the whole tissue of the plant, it is possible to develop a crop that can ingest the target protein together with the plant by expressing the useful target protein in the whole tissue of the plant. Alternatively, the target protein produced in the plant may be extracted and used according to a suitable method known in the art.
  • a transformed plant transformed with an expression vector for inducing systemic expression according to the second embodiment is provided.
  • the term “plant” may be a dicotyledonous or monocotyledonous plant.
  • the dicotyledonous plants may include Arabidopsis, soybean, tobacco, eggplant, pepper, potato, tomato, Chinese cabbage, radish, cabbage, lettuce, peach, pear, strawberry, watermelon, melon, cucumber, carrot, celery and rapeseed, It is not limited to this.
  • the monocotyledonous plants may include, but are not limited to, rice, barley, wheat, rye, corn, sugar cane, oats and onions.
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • the transformation method includes calcium chloride (CaCl 2 ) and heat shock method (particle gun bombardment), silicon carbide whiskers (sonication), electroporation (electroporation) It may include, but is not limited to, precipitation by Polyethylenglycol (PEG) and Agrobacterium mediated ( Agrobacterium- mediated).
  • a method for producing a transgenic plant wherein the plant is expressed in a whole plant tissue, wherein the plant is expressed in a plant-wide expression promoter and an expression vector comprising a gene encoding the protein of interest. do.
  • a method of producing a target protein comprising producing a target protein by expressing a gene encoding the target protein in all tissues of the transformed plant.
  • Capsicum annuum from Korea to isolate the promoter region of Capsicum- Capsorbin synthase gene ( Capsicum Ccs ) cv. NocKwang) genome library was used.
  • 32-P labeled CaCcs About 10 5 plaques were screened using full length cDNA as a probe.
  • Estimated CaCcs Genomic clones were cut using EcoR I restriction enzymes, followed by CaCcs Southern blotting was performed with 32 P-200bp fragments of the N-terminal region of cDNA, and the 2.5 kb DNA band identified was subcloned into pBluescript SK (+) (Stratagene).
  • the 2.3kb PCR product (-2,279-+30) generated by removing the 246bp region of the N-terminal coding region of CaCcs was cloned into the EcoR I and Xba I sites of pBluescript KS (+) (Stratagene).
  • the 5'-upstream 2,309 kb region from the ATG start codon of CaCcs was shown as SEQ ID NO: 1 as the full-length CaCcs promoter, which was named " CaCcs -P6".
  • CaCcs from 2.3kb promoter using restriction enzymes shown in Table 1 below so as to have a promoter region of 2.0kb, 1.4kb, 1.0kb, 0.7kb and 0.4kb were prepared CaCcs promoter section groups:
  • Gus Tnos of pBI221 was then inserted into the vector with the six promoters using the same XbaI and SacI sites.
  • a vector expressing Gus, under the control of six CaCcs -P was named "pKS- CaCcs- P1-6: Tnos: Gus ".
  • CaCcs -P in plants To manifest, Each cassette containing CaCcs- P1-6: Gus: Tnos was digested with Sal I and EcoR I and ligated to pCAMBIA 2300 (Cambia, Australia). A 2 kb fragment of the Bar expression cassette was further introduced into each plasmid to produce a binary vector with six CaCcs P1-6. The produced vector was introduced into Agrobacterium strain EHA105 by freeze-thaw method, and then Arabidopsis ecological Columbia (Col-0) using a floral dip method. Introduced. CaCcs-P1 construct is Agrobacterium strain GC3101) was further transformed and transformed tobacco plants were produced using the leaf disc method.
  • a transgenic Arabidopsis ( s35S- P-transgenic Arabidopsis) comprising a 35S promoter, d35S- P-transgenic Arabidopsis and d35S- P-transformed tobacco were used. . Screening the transformed plant by spraying 0.3% Basta ® spray and incubated in an incubator (22 °C day, 18 °C night) for 16 hours photoperiod.
  • GUS was weakly expressed in the anther of the stamen, but was highly expressed in the sepal. If using CaCcs -P5 to CaCcs -P2, GUS has been very strongly expressed in the anther of surgery was found to be almost no expression in the calyx. On the other hand, when CaCcs-P1 was used, GUS was strongly expressed not only in the calyx but also in the anther and the filaments and the styles of the stamens. In addition, when CaCcs-P1 was used, dark blue color was observed in the leaves, and it was confirmed that GUS was strongly expressed in the transgenic Arabidopsis leaf compared to other promoters.
  • CaCcs-P1 is a systemic high expression promoter that induces the expression of GUS not only in non- chromatic tissues , leaf and calyx, but also in anther and anther of chromosomal surgery (Fig. 2).
  • CaCcs -P1 Gus transgenic each organ leaf (RL of Arabidopsis plants: rosette Compared from leave, C: cauline leave, St: stem, root, R: F, flower, young sillique, and Se: mature seed It was.
  • GUS transcript levels by CaCcs -P1 in rosette leaves were compared with d35S -P-10 lines and d35S -P-5 lines.
  • ectopic GUS expression was performed on stably transformed tobacco plants to determine whether CaCcs-P1 acts as a strong promoter.
  • leaf discs of 12 and 17 transgenic plants each with d35S- P and CaCcs-P1 , four and eight lines showing normal expression through histochemical GUS staining were selected and their GUS enzymes. Activity was measured and compared by MUG test.
  • GUS expression by CaCcs-P1 was found to average 1.4 times higher than the d35S -P, whereby a stronger body than a promoter d35S -P in a variety of dicotyledonous plants, such as Arabidopsis and tobacco plants are CaCcs -P1 It was proved to have potential (FIG. 8).
  • SEQ ID NO 1 CaCcs-P6 nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 2 shows a nucleotide sequence of 1913 to 2309 (-367 to +30) region of SEQ ID NO: 1

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Abstract

식물체 전신 발현 프로모터(constitutive promoter), 보다 상세하게는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성효소 유전자 유래의 식물 전신 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 전신 발현 유도용 재조합 벡터 및 상기 전신 발현 유도용 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체가 개시된다. 본 발명에 따른 전신 발현 프로모터는 식물체의 전 조직에서 목적 유전자를 발현할 수 있으므로, 형질전환체 제작 시 항생제 또는 제초제 저항성 유전자를 이용한 형질전환체 선발 및 의료, 산업용 유용 물질 생산 형질전환 식물체 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

고추 캡산틴 캡소루빈 합성효소 유전자 유래의 식물체 전신 발현 프로모터
본 발명은 식물체 전신 발현 프로모터(constitutive promoter), 보다 상세하게는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성효소 유전자 유래의 식물 전신 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 전신 발현 프로모터는 식물체의 전 조직에서 목적 유전자를 발현할 수 있으므로, 형질전환체 제작 시 항생제 또는 제초제 저항성 유전자를 이용한 형질전환체 선발 및 의료, 산업용 유용 물질 생산 형질전환 식물체 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다. 이러한 작물분자육종 기술을 이용한 유전자변형 작물의 재배면적과 재배량이 전 세계적으로 지속적으로 증가하고 있다. 상업화된 유전자변형 신종자의 세계 시장 규모는 2002년 40억 달러에서 2010년 100억 달러(종자와 기술료 포함)로 전체 세계 종자 시장규모 300억 달러 대비 15% 수준이며 종류로는 대두, 옥수수, 면화, 유채가 주 시장을 형성하고 있다. 유전자변형 작물의 향후 시장 규모에 대한 전망은 장기적으로 유전자변형 작물 시장이 바이오산업에서 가장 큰 영역을 차지할 것이라고 예측하면서 2020년 시장규모를 Astra-Zeneca 등 생명과학 기업들은 750억 달러, 일본의 미쓰비시 연구소는 1,375억 달러에 달할 것으로 전망하였다. 이와 함께 유전자 변형 가공식품도 2010년 1,360억 달러, 2020년에는 1,590억 달러의 거대 시장을 형성하여 21세기 최대의 바이오산업으로 부상할 것으로 예측하였다.
유전자변형 작물(Genetically Modified Organism, GMO)의 효과를 극대화하기 위해서는 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 가장 효과적으로 조절할 수 있어야 하며 이를 위해 다양한 프로모터의 개발이 이루어져야 한다. 이에 1980년대 초반부터 식물 유전자의 발현을 조절하는 프로모터에 대한 연구가 진행되어 왔다. 꽃양배추 모자이크 바이러스(Cauliflower mosaic virus) 유래 프로모터가 식물 전 조직에서 강한 발현을 유도할 것이라는 가능성이 제시되고(Hohn et al., 1982, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 193-236), 상기 프로모터의 염기서열이 밝혀지고(Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), 식물체 내에서 강한 발현이 증명되었다(Sanders et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 1543-58). 그 후 CaMV 35S(특허번호: JP1993192172-A1) 프로모터는 식물에서 가장 많이 쓰이는 항상성 (universal) 프로모터가 되었다. 그러나, 바이러스 유래 프로모터에 의한 GMO가 환경에 미치는 잠재적 위험성, 즉, 도입 유전자가 표적 및 비표적 생물체로 전이될 가능성, 잡초화, 생태계 교란 등에 대한 안전성 시비가 끊임없이 대두되고 있는 실정이다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로서, 식물 유래의 프로모터 사용에 대한 사회적인 요구가 지속적으로 있어 왔다.
식물 유래의 프로모터로는 애기장대 식물체의 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터(Callis et al., 1990, Journal of Biological Chemistry, 265: 12486-12493), 담배 식물체의 NeIF-4A 프로모터(Mandel et al., 1995, Plant Molecular Biology, 29: 995-1004), 애기장대 식물체의 액틴(actin) 프로모터(An et al., 1996, Plant Journal, 10: 107-121), 담배 식물체의 tCUP 프로모터(Foster et al., 1999, Plant Molecular Biology, 41: 45-55; Wu et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265: 763-770; Malik et al., 2002, Theor Appl Genet, 105: 505-514) 등이 개발되어 왔으나, CaMV35S 프로모터에 훨씬 못 미치는 활성을 보이는 문제점이 있었다.
한편, 고추 캡산틴-캡소루빈 합성효소 유전자(capsanthin-capsorubin synthase gene, CaCcs)는 열매의 유색체(chromoplast) 성숙 동안 특이적으로 발현되는 유전자로서, CaCcs는 과일이 익으면서 동시에 강하게 발현되지만, 잎, 줄기 및 뿌리를 포함하는 다른 기관 및 생 과일에서는 발현되지 않는다. 또한, CaCcs의 전사는 고추를 빨갛게 익게 하는 색소 성분인, 캡산틴 및 캡소루빈의 생합성 경로의 장애로 인해 숙과색이 노란색을 나타내는 고추 품종에서는 관찰되지 않는다. 이와 같은 CaCcs 발현의 특성으로 인해 유색체-특이적 프로모터의 우수한 후보 유전자로 여겨지고 있다.
이에 본 발명자는 식물 유래 전신 발현 프로모터를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 고추 캡산틴-캡소루빈 합성효소 유전자(capsanthin-capsorubin synthase gene, CaCcs) 프로모터(-2,279 ~ +30)가 유색체-특이성을 나타내는 것으로 알려져 있지만, 상기 CaCcs 프로모터의 절단체(-367 ~ +30)만을 이용하는 경우 전신 발현이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1의 1913 내지 2309(-367 내지 +30) 부위의 염기서열을 포함하는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성 효소 유전자 유래 식물 전신 발현 프로모터를 제공하고자 한다. 예를 들면, 상기 고추 캡산틴-캡소루빈 합성 효소 유전자 유래 식물 전신 발현 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 1913 내지 2309(-367 내지 +30) 부위의 염기서열을 포함하는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성 효소 유전자 유래 식물 전신 발현 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 1913 내지 2309(-367 내지 +30) 부위의 염기서열을 포함하는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성 효소 유전자 유래 식물 전신 발현 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하고자 한다. 상기 형질전환 식물체 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물을 포함할 수 있다. 예를 들면 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리, 유채, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 또는 양파를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 1913 내지 2309(-367 내지 +30) 부위의 염기서열을 포함하는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성 효소 유전자 유래 식물 전신 발현 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 식물체 전 조직에서 고발현시키는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 1913 내지 2309(-367 내지 +30) 부위의 염기서열을 포함하는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성 효소 유전자 유래 식물 전신 발현 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물체의 전 조직 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에 따라 제조된 서열번호 1의 1913 내지 2309 (-367 내지 +30) 부위의 염기서열을 포함하는 CaCcs 프로모터는 유색체 조직인 수술의 꽃밥과 암술대뿐만 아니라 비-유색체 조직인 잎과 꽃받침에서도 유전자 발현을 유도할 수 있다(실시예 1 참고). 본 발명에 따른 CaCcs 프로모터는 종래 35S 프로모터에 비해 3배 내지 31배의 발현 활성을 가질 수 있다(실시예 2 참고). 본 발명에 따른 CaCcs 프로모터는 종래 35S 프로모터 보다 강한 활성으로 모든 기관에서 유전자 발현을 유도할 수 있다(실시예 3 참고). 따라서, 본 발명에 따른 CaCcs 프로모터는 종래 35S 프로모터 보다 더 강한 전신 발현 프로모터로서, 형질전환체 제작 시 항생제 또는 제초제 저항성 유전자를 이용한 형질전환체 선발 및 의료, 산업용 유용 물질 생산 형질전환 식물체 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 형질전환 애기장대 식물체에서 전장 CaCcs 프로모터(CaCcs-6) 및 그의 절단체 프로모터(CaCcs-P5, P4, P3, P2 및 P1)의 활성을 비교하기 위한 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 CaCcs-P6, P5, P4, P2 및 P1로 형질전환된 애기장대 식물체의 잎(왼쪽) 및 꽃(오른쪽)에 대한 조직화학적 GUS 염색 결과를 나타낸다.
도 3은 3주 유묘 단계의 d35S-P:Gus 및 CaCcs-P1:Gus 형질전환 애기장대에 대한 조직화학적 GUS 염색 결과를 나타낸다.
도 4는 d35S-P 및 CaCcs-P1가 형질전환된 애기장대 식물체에서 형광 MUG 분석을 이용한 GUS 활성 수준을 정량화한 결과를 나타낸다.
도 5는 2개의 다른 성장 단계(4주 및 5주)에서 d35S-P 및 CaCcs-P1가 형질전환 애기장대 식물체의 전체 기관에서 수행한 조직화학적 GUS 염색 결과를 나타낸다.
도 6은 CaCcs-P1가 형질전환 애기장대 식물체의 각각의 기관에서 GUS 전사체를 반-정량적 RT-PCT한 결과를 나타낸다.
도 7은 2개의 CaCcs-P1가 형질전환 애기장대 식물체에서 GUS 효소 활성을 측정하기 위한 MUG 검사 결과를 나타낸다.
도 8은 형질전환 담배 식물체에서 d35S-P 및 CaCcs-P1의 프로모터 활성을 비교한 결과를 나타낸다.
본 발명은 특정 방법 또는 프로토콜로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현 예를 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하고자 의도되지 않고, 본 발명의 범위는 첨부되는 청구의 범위에 의해서만 제한될 것임을 이해하여야 한다. 본원 명세서 및 첨부되는 청구의 범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 이와 다른 의미로 분명하게 언급되지 않으면 복수형을 포함함을 알아야 한다. 따라서, 예를 들어, "벡터"에 대한 언급은 하나 이상의 벡터에 대한 언급이고, 당업자에게 알려진 그의 균등물을 포함한다. 용어 "약"은 대략, 어림잡아, ~쯤, 또는 그 범위 내를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이 용어는 제시된 수치 범위의 상한 및 하한을 연장함으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치값을 언급된 값의 위 및 아래로 20%, 바람직하게는 10% 증가 또는 감소한 (더 높거나 또는 더 낮은) 변동치 만큼 변경하기 위해 본원에서 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "또는"은 특정 목록의 임의의 하나의 구성원을 의미하고, 상기 목록의 구성원의 임의의 조합도 또한 포함한다. 용어 "이루어지다", "이루어지는", "포함하다" 및 "포함하는"은 본원 명세서 및 하기 청구의 범위에서 사용될 때 하나 이상의 언급된 특징부, 정수, 성분 또는 단계의 존재를 구체화하는 것이 의도되지만, 하나 이상의 다른 특징부, 정수, 성분, 단계 또는 이들의 군의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 발명은 고추 캡산틴-캡소루빈 합성효소 유전자 유래의 식물 전신 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하고자 한다.
1. 프로모터
제1구현 예에 따르면, 서열번호 1의 1913 내지 2309 부위의 염기서열을 포함하는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성효소 유전자(capsanthin-capsorubin synthase gene, CaCcs) 유래 식물 전신 발현 프로모터가 제공된다. 예를 들면, 상기 CaCcs 유래 식물 전신 발현 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로모터(promoter)"는 유전자의 전사 개시 부위의 전사 방향과 관련하여 상류(5')에 위치하고(전사 개시점을 서열의 위치 +1로 나타내고, 그와 관련하여 상류에 있는 임의의 뉴클레오티드는 음수를 사용하여 나타낸다), DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위, 전사 인자 결합 부위, 억제 인자 및 활성 인자 단백질 결합 부위, 및 프로모터로부터 전사량을 직접 또는 간접적으로 조절하는 작용을 하는 것으로 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 다른 DNA 도메인(cis-acting 서열)의 존재에 의해 구조적으로 동정되는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 단편을 나타낸다. 전사 개시점(+1) 상류에 있는 진핵생물의 시스 작용 서열의 일 예로는 TATA 박스, CAAT 박스, 5' 인핸서 또는 침묵 인자 요소 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전신(constitutive)" 또는 "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발생학적 조건 하의 대부분의 조직(또는 기관)에서 활성인 프로모터를 의미한다. 더욱 바람직하게, 전신 프로모터는 모든 주요 기관, 예를 들면, 잎, 줄기, 뿌리, 종자, 열매 및 꽃에서 본질적으로 모든 생리학적 및 발생학적 조건 하에 활성이다. 가장 바람직하게는, 전신 프로모터는 대부분 생리학적 및 발생학적 조건 하의 모든 기관에서 활성이다. 한편, "유도성" 프로모터는 생리학적으로(예를 들면, 특정 화합물의 외적 작용) 또는 발생학적으로 조절되는 프로모터를 의미한다. "조직 특이성" 프로모터는 오직 특징 유형의 조직 또는 세포에서만 활성인 프로모터를 의미한다. 그러므로, 식물체 또는 식물 세포에서 "전신 프로모터" 또는 "전신 활성을 갖는 프로모터"는 대부분의 생리학적 및 발생학적 조건 하에 식물에서 또는 대부분의 조직(또는 기관) 중 식물 세포에서 전사할 수 있는 핵산 서열을 나타낸다.
상기 구현 예에 따른 CaCcs 유래 식물 전신 발현 프로모터는 서열번호 1의 1913 내지 2309 부위의 염기서열 또는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상의 상동성(homology)를 나타내고, 상기 프로모터와 동등한 프로모터 활성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다
본 명세서에서 사용된 용어 “상동성”은 야생형(wild type) 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 상기 상동성의 비교는 육안 또는 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.　시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
상기 구현 예에 따른 CaCcs 유래 식물 전신 발현 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S(Cauliflower Mosaic Virus 35S, CaMV35S)에 비해 향상된 발현 활성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "향상된 발현"은 본 발명에 따른 프로모터를 도입 후의 식물에서 핵산 분자의 수준이 본 발명에 따른 프로모터를 도입하기 전의 식물에서의 발현 수준 또는 참조 식물에 비해 더 높다는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용된 용어 "향상된" 또는 "증가된"은 동의어이고, 발현되는 핵산 분자의 보다 높은, 바람직하게는 유의하게 더 높은 발현을 의미한다. 상기 용어 "발현"은 세포 내에서 유전자 생성물의 생합성, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 내인성 유전자 또는 이종성 유전자의 전자 및/또는 번역을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "향상된 전신 발현 프로모터"는 식물에서 전신 발현을 유도하는 프로모터를 의미하고, 여기서 각각의 프로모터의 제어 하의 핵산 분자로부터 유래된 RNA의 축적 또는 합성 속도 또는 RNA의 안정성은 CaMV35S 프로모터에 비해 50% 이상, 예를 들면, 100% 이상, 바람직하게는 200% 이상, 보다 바람직하게는 300% 이상, 가장 바람직하게는 400% 이상 증가한다.
2. 발현 벡터
제2구현 예에 따르면, 상기 제1구현 예에 따른 CaCcs 유래 식물 전신 발현 프로모터를 포함하는 전신 발현 유도용 발현 벡터가 제공된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 본 발명에 따른 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 유전자 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 전신 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결됨(operably linked)"은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합할 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 또한, 용어 "발현 조절 서열(expression control sequence)"은 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 재조합 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream) 쪽으로 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드가 있고, 식물 바이러스 벡터가 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 그러나 당업자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "목적 단백질"은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체의 전 조직에서 고 발현되길 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질을 의미하며, 바람직하게는 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연으로 존재하는 유전자에 의해 발현된 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 일 예로서, 본 발명의 식물 전신 발현 프로모터에 의해 발현되는 목적 단백질 유전자는 형질전환 대상 식물체가 유채, 들깨 및 참깨 등의 유지작물인 경우 지방산 생합성 및 조절 관련 유전자 등을 들 수 있고, 단백질의 생성 및 축적량이 다른 식물에 비해 상대적으로 높은 콩 및 알팔파 등의 두과식물인 경우 경제적으로 부가가치가 높은 항체 유전자 등을 들 수 있고, 사료작물로 대표적인 옥수수의 경우 돼지 설사병, 구제역 바이러스 등의 경구 백신(edible vaccine) 유전자 등을 들 수 있고, 뿌리로 장기간 보관, 유통되는 대부분의 작물의 경우 수확 후 저장성을 높이도록 각종 병 저항성에 관련된 유전자 등을 들 수 있으며, 그 외에도 토코페롤, 베타카로틴 등과 같이 특정 영양 성분을 작물의 뿌리에서 강화하려는 경우에는 관련 물질대사경로의 생합성 유전자 등을 들 수 있으나, 여기에 한정되지 않고, 본 발명의 전 조직 고 발현 프로모터를 사용하여 조절될 수 있는 각종 목적 단백질을 코딩하는 유전자들이 포함될 수 있다. 그러므로 본 발명의 프로모터를 이용한다면 식물체의 전 조직을 섭취하는 작물의 경우, 유용한 목적 단백질을 식물체의 전 조직에서 발현시킴으로써 식물체와 함께 목적 단백질을 함께 섭취할 수 있는 작물을 개발할 수 있다. 또는, 식물체 내에서 생산된 목적 단백질을 당업계에 알려진 적절한 방법에 따라 추출하여 사용할 수도 있다.
3. 형질전환된 식물체
제3구현 예에 따르면, 상기 제2구현 예에 따른 전신 발현 유도용 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체가 제공된다.
본 발명에서 사용된 용어 "식물체"는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있다. 상기 쌍자엽 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리 및 유채를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 상기 형질전환 방법으로는 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공(electroporation), PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 및 아그로박테리움 매개법(Agrobacterium-mediated)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가 구현 예에 따르면,
제1구현 예에 따른 식물 전신 발현 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 식물체 전 조직에서 고발현시키는 형질전환 식물체의 제조 방법이 제공된다.
또 다른 추가 구현 예에 따르면,
제1구현 예에 따른 식물 전신 발현 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물체의 전 조직 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 목적 단백질 생산 방법이 제공된다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시 예를 제시한다. 하기 실시 예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
1. Capsicum Ccs 프로모터의 5'-상류 조절 영역 클로닝
고추 캡산틴-캡소루빈 합성효소 유전자(Capsicum Ccs )의 프로모터 영역을 분리하기 위하여 한국산 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. NocKwang)의 게놈 라이브러리를 이용하였다. 32-P 표지된 CaCcs 전장(full length) cDNA를 프로브로 하여 약 105 플라크를 스크리닝하였다. 추정 CaCcs 게놈 클론을 EcoRI 제한효소를 이용하여 자른 후, CaCcs cDNA의 N-말단 영역의 32P-200bp 단편으로 Southern blotting을 수행하여 확인된 2.5kb의 DNA 밴드를 pBluescript SK (+)(Stratagene)에 서브클로닝하였다. CaCcs의 N-말단 코딩 영역의 246bp 영역을 제거하여 생성된 2.3kb PCR 산물(-2,279 ~ +30)을 pBluescript KS (+)(Stratagene)의 EcoRI 및 XbaI 부위에 클로닝하였다. CaCcs의 ATG 개시 코돈으로부터 5'-상류 2,309kb 영역을 전장 CaCcs 프로모터로서 서열번호 1로 나타내었으며, 이를 "CaCcs-P6"로 명명하였다.
2. Capsicum Ccs 의 5'-상류 조절 영역 절단체의 제작
하기의 표 1의 제한 효소를 이용하여 2.3kb CaCcs 프로모터로부터 2.0kb, 1.4kb, 1.0kb, 0.7kb 및 0.4kb의 프로모터 영역을 갖도록 CaCcs 프로모터 절단체를 제조하였다:
표 1
프로모터 제한효소 크기
CaCcs -P6 -2279 ~ +30 (전장)
CaCcs-P5 EcoRV 및 ScaI -1971 ~ +30
CaCcs-P4 EcoRV 및 klenow 단편-처리된 AvaII -1349 ~ +30
CaCcs-P3 ClaI 및 TaqI -954 ~ +30
CaCcs-P2 EcoRV 및 StuI -531 ~ +30
CaCcs -P1 EcoRV 및 klenow 단편-처리된 AvaII -367 ~ +30
그 다음, pBI221의 Gus:Tnos를 동일한 XbaI 및 SacI 부위를 사용하여 상기 6개의 프로모터를 갖는 벡터에 삽입하였다. 6개의 CaCcs-P의 제어 하에 Gus를 발현하는 벡터를 "pKS-CaCcs-P1-6:Gus:Tnos"로 명명하였다.
3. 식물 형질전환용 운반체의 제작
식물체 내에서 CaCcs-P를 발현시키기 위하여, CaCcs-P1-6:Gus:Tnos를 함유하는 각각의 카세트를 SalI 및 EcoRI로 절단하여 pCAMBIA 2300(Cambia, Australia)에 리게이션하였다. Bar 발현 카세트의 2kb 단편을 각각의 플라스미드에 추가 도입하여 6개의 CaCcs P1-6를 갖는 바이너리 벡터를 제작하였다. 상기 제작된 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium strain EHA105)에 냉-해동(Freeze-thaw) 방법으로 도입한 후, 플로랄 딥(floral dip) 방법을 이용하여 애기장대(Arabidopsis) 생태형 Columbia(Col-0)에 도입하였다. CaCcs-P1 구조체는 아그로박테리움(Agrobacterium strain GC3101)에 추가 형질전환시키고 리프 디스크(leaf disc) 방법을 이용하여 형질전환 담배 식물체를 생성하였다. 상기 프로모터의 활성을 비교하기 위한 대조로서, 35S 프로모터를 포함하는 형질전환 애기장대(s35S-P-형질전환 애기장대), d35S-P-형질전환 애기장대 및 d35S-P-형질전환 담배를 사용하였다. 상기 형질전환 식물체를 0.3% Basta® 스프레이를 살포하여 선별하고 16시간 광주기의 배양기(22℃ 낮, 18℃ 밤)에서 배양시켰다.
4. 조직화학적 염색 분석 및 GUS 발색 분석
GUS 조직화학적 분석을 수행하기 위하여 애기장대 식물체를 1% 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide(X-Gluc) 용액으로 염색한 후 디지털 카메라(Olympus)가 장착된 광학 현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다. GUS 발색 활성을 측정하기 위하여, 애기장대 및 담배 식물체를 이용하여 4-methyl umbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG) 분석을 수행하였다. Qubit 형광계(Invitrogen, CA) 및 FluorAceTM β-glucuronidase Reporter Assay Kit(Bio-Rad, CA)를 이용하여 GUS 단백질의 정량화 및 효소 활성을 측정하였다.
5. RT-PCR 분석
Plant RNA Purification Reagent(Invitrogen)을 사용하여 준비된 애기장대의 다양한 조직으로부터 전체 RNA를 첫번째-가닥 cDNA로 전환시키고 mRNA Selective PCR Kit(Takara, Japan)를 이용하여 반정량적(semi-quantitative) PCR을 시작하였다. 상기 반응은 Gus-특이적 프라이머 세트(5'-ACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGC-3'/5'-CTCCCTGCTGCGGTTTTTCA-3')를 사용하여 25 사이클로 수행하였다. 애기장대 연장 인자-1 유전자(Arabidopsis elongation factor 1 gene)에 특이적인 프라이머 세트(AtEF1α: 5'-GTTCACATTAACATTGTGGTCATT-3'/5'-CAGGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3')를 이용하여 총 RNA로 표준화하였다. 478bp 및 305bp의 크기를 갖는 2개의 PCR 산물이 생성되었다. PCR 밴드 강도는 농도계 및 QuantitiOne 소프트웨어(Bio-Rad, CA)를 이용하여 정량적으로 분석하였다.
6. 수치적 해석
CaCcs1-P의 -367 ~ +30 영역을 포함하는 5'-상류 DNA 서열을 하기의 웹 사이트를 사용하여 cis-acting element를 탐색하기 위하여 분석하였다: PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html), PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/), 및 Softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter).
<실시예>
실시예 1: 형질전환 애기장대 식물을 이용한 CaCcs 프로모터 및 그의 절단체의 발현 양상과 활성 분석
형질전환 토마토 식물체의 열매(fruit)와 종자(anther)에서는 강한 발현을 나타내지만 꽃잎(petal)에서는 약한 발현을 나타내는 5' 상류 2.3kb CaCcs 프로모터의 유색체(chromoplast)-특이성을 바탕으로, 형질전환 애기장대 식물체의 꽃 기관에서 유색체-특이성에 필요한 조절 영역을 확인하기 위하여, GUS 리포터 유전자와 6개의 CaCcs 프로모터, 2,309bp(P6), 2,001bp(P5), 1,379bp(P4), 984bp(P3), 661bp(P2) 및 397bp(P1)를 포함하는 발현 벡터를 제작하였다(도 1). 10개의 형질전환 식물체를 생성하고 전장 CaCcs -P6 및 절단체 CaCcs -P5, CaCcs -P4, CaCcs -P2 및 CaCcs-P1로 유도된 발현양상을 확인하기 위해 조직화학적 GUS 분석을 수행하였다. 한편, CaCcs-P3에 의해 형질전환 식물체는 얻지 못하였다.
조직화학적 GUS 분석은 β-glucuronidase(GUS)가 발현된 조직에 기질인 X-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide)과 반응시키게 되면, 청색(insoluble blue)을 띰으로써 GUS 유전자의 발현으로 프로모터의 발현 양상을 육안으로 쉽게 확인할 수 있다. 먼저 각각의 조직을 채취한 후, GUS 염색액에 조직을 침지시켜 37℃에서 하룻밤 배양한 후, 100% 에탄올로 고정하였다.
그 결과, 토마토 꽃에서 관찰되는 것과 달리, CaCcs-P6를 이용한 경우, GUS는 수술의 꽃밥 부위(anther)에서 약하게 발현되었으나, 꽃받침(sepal)에서는 높게 발현되었다. CaCcs-P5 내지 CaCcs-P2를 이용한 경우, GUS는 수술의 꽃밥에서 매우 강하게 발현되었으나 꽃받침에서는 거의 발현되지 않는 것으로 확인되었다. 한편, CaCcs-P1을 이용한 경우, GUS는 꽃받침뿐만 아니라 수술의 꽃밥(anther)과 수술대(filaments) 및 암술대(styles)에서도 강하게 발현되었다. 게다가, CaCcs-P1를 이용한 경우, 잎에서 진한 청색이 관찰됨으로써, 다른 프로모터에 비해 형질전환 애기장대 잎에서 GUS를 강하게 발현시키는 것으로 확인되었다. 이로써 CaCcs-P1가 비-유색체 조직인 잎과 꽃받침에서뿐만 아니라 유색체 조직인 수술의 꽃밥과 암술대에서도 GUS의 발현을 유도하는 전신 고발현 프로모터임이 입증되었다 (도 2).
실시예 2. 형질전환 애기장대 식물체에서 CaCcs -P1과 d35S -P의 활성 비교
CaCcs-P1과 d35S-P의 전신 발현 활성을 비교하기 위하여, CaCcs-P1:Gus를 갖는 12개의 애기장대 식물체와 d35S-P를 갖는 15개의 식물체(T1)를 X-Gluc 용액을 이용하여 염색하였다. 모든 형질전환 식물체는 전체 기관 영역에서 GUS가 발현되기 때문에 유사한 정도의 청색을 나타내었다(도 3). 그 중에서 각각의 프로모터에서 가장 강한 청색을 띄는 5개의 라인을 선택하여 추가 성장 시킨 후(T2) GUS 활성 분석을 수행하였다. 그 결과, CaCcs-P1을 이용한 경우, GUS 유전자는 d35S-P에 비해 3 내지 31배 더 높은 발현 활성을 가지는 것으로 확인되었다(도 4).
또한, CaCcs-P1에 의한 강한 전신 발현이 식물의 전체 성장 기간 동안 유지될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 2개의 라인(CaCcs-P1-4 및 CaCcs-P1-12)의 4 및 5주 추가 성장 단계에서 조직화학적 GUS 염색을 수행하고 d35S-P-5 라인 및 s35S-P-1 라인를 이용한 경우와 비교하였다. CaCcs-P1을 이용하여 유도된 GUS 효소 활성 결과와 마찬가지로, 2개의 CaCcs-P1 라인(라인 4 및 12)에서 GUS 염색이 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃을 포함하는 식물체 전체에서 식물 성장 3단계 동안 d35S-P-5에 비해 매우 강하게 관찰되었다(도 5).
실시예 3. 형질전환 애기장대 식물체에서 CaCcs-P1에 의한 전신 발현 분석
기관 특이성을 바탕으로 프로모터 특성을 확인하기 위하여, CaCcs-P1에 의한 GUS 발현 활성을 반정량 RT-PCR 방법을 이용하여 CaCcs-P1:Gus 형질전환 애기장대 식물체의 각각의 기관, 잎(RL: rosette leave, C: cauline leave), 줄기(St: stem), 뿌리(R: root), 꽃(F: flower), 종자 꼬뚜리(Si: young sillique), 및 성숙 종자(Se: mature seed)에서 비교하였다. 추가로, 로세트 잎에서 CaCcs-P1에 의한 GUS 전사체 수준을 d35S-P-10 라인 및 d35S-P-5 라인과 비교하였다.
그 결과, CaCcs-P1-4에 의한 GUS mRNA의 발현 수준은 d35S-P-10에 비해 4배 이상 높은 것으로 확인되었다. CaCcs-P1의 활성은 식물체의 각각의 기관 중에서 줄기에서 가장 높은 것으로 확인되었으며, 그 다음 잎, 꽃, 뿌리, 종자 꼬뚜리 및 성숙 종자 순으로 나타났다(도 6).
한편, CaCcs-P1-4와 CaCcs-P1-12에 대해 동일한 기관으로 GUS 분석을 수행한 결과, 약간의 차이는 있지만 두 프로모터 모두 거의 모든 기관에서 GUS 효소 활성을 증가시키는 것으로 확인되었다(도 7). 이로써, CaCcs-P1는 d35S-P 보다 강한 활성으로 모든 기관에서 외래 유전자 발현을 유도할 수 있으므로, 매우 효과적으로 사용될 수 있는 전신 발현 프로모터임이 입증되었다.
실시예 4. 형질전환 담배 식물체에서의 CaCcs -P1와 d35S -P의 활성 비교
다른 식물체 시스템에서도 CaCcs-P1가 강한 프로모터로서 작용하는지 여부를 확인하기 위하여 안정하게 형질전환된 담배 식물체에서 이소성 GUS 발현을 수행하였다. d35S-P와 CaCcs-P1를 갖는 각각 12개 및 17개의 형질전환 식물체의 잎 절편(leaf disc)에서, 조직화학적 GUS 염색을 통해 보통의 발현을 나타내는 4개 및 8개 라인을 선택하여 그들의 GUS 효소 활성을 MUG 검사로 측정하여 비교하였다.
그 결과, CaCcs-P1에 의한 GUS의 발현이 d35S-P에 비해 평균 1.4배 높은 것으로 확인되었으며, 이로써 CaCcs-P1이 애기장대 및 담배 식물체와 같은 다양한 쌍떡잎 식물에서 d35S-P 보다 더 강한 전신 프로모터로서 잠재성을 가짐이 입증되었다(도 8).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
서열번호 1: CaCcs-P6 염기서열
서열번호 2: 서열번호 1의 1913 내지 2309(-367 내지 +30) 부위의 염기서열

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 1913 내지 2309(-367 내지 +30) 부위의 염기서열을 포함하는 고추 캡산틴-캡소루빈 합성 효소 유전자(capsanthin-capsorubin synthase gene) 유래 식물 전신 발현 프로모터.
  2. 제1항에 따른 식물 전신 발현 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
  3. 제2항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 형질전환 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 샐러리, 유채, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인, 형질전환 식물체.
  5. 제1항에 따른 식물 전신 발현 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 식물체 전 조직에서 고발현시키는 형질전환 식물체의 제조 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030131374A1 (en) * 1997-09-26 2003-07-10 Marcel Kuntz Gene promoter sequences and uses thereof
KR101424123B1 (ko) * 2012-11-05 2014-08-20 대한민국 캡산틴을 생성하는 형질전환 컬러쌀 및 이의 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030131374A1 (en) * 1997-09-26 2003-07-10 Marcel Kuntz Gene promoter sequences and uses thereof
KR101424123B1 (ko) * 2012-11-05 2014-08-20 대한민국 캡산틴을 생성하는 형질전환 컬러쌀 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHRAZEM, OUSSAMA ET AL.: "The Expression of a Chromoplast-specific Lycopene Beta Cyclase Gene is involved in the High Production of Saffron's Apocarotenoid Precursors", JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY, vol. 61, no. 1, 18 September 2009 (2009-09-18), pages 105 - 119, XP055346043 *
BOUVIER, FLORENCE ET AL.: "Induction and Control of Chromoplast-specific Caro-tenoid Genes by Oxidative Stress", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 273, no. 46, 13 November 1998 (1998-11-13), pages 30651 - 30659, XP055346035 *
HA, SUN - HWA ET AL.: "A Comparison of the Carotenoid Accumulation in Capsicum Varieties that Show Different Ripening Colours: Deletion of the Capsanthin-Capsorubin Synthase Gene Is Not a Prerequisite for the Formation of a Yellow Pepper", JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY, vol. 58, no. 12, 28 August 2007 (2007-08-28), pages 3115 - 3144, XP055013124 *

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