WO2016207857A1 - Conjunto de partidores y método para la detección e identificación de especies de mejillón del genero mytilus, mediante la técnica de high resolution melting y pcr - Google Patents
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- WO2016207857A1 WO2016207857A1 PCT/IB2016/053789 IB2016053789W WO2016207857A1 WO 2016207857 A1 WO2016207857 A1 WO 2016207857A1 IB 2016053789 W IB2016053789 W IB 2016053789W WO 2016207857 A1 WO2016207857 A1 WO 2016207857A1
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Definitions
- the present invention consists of a set of specific splitters and the use of these in the polymerase chain reaction (PCR) together with the technique of "High Resolution Melting” (HRM) to identify mussel species within the Mytilus genus of Quickly and with less cost.
- PCR polymerase chain reaction
- HRM High Resolution Melting
- the proposed method can be used by companies or laboratories that provide services to the mitigation industry and the authorities to respond to traceability demands, specifically, to certify-authenticate the species of the raw material used.
- the mitilides are bivalve molluscs that correspond to a family of great economic and gastronomic interest, which includes commercially important species belonging to the Mytilus genus. Like other bivalves, they are filtering animals that live attached to the substrate. They are exclusively marine and live both in intertidal zones and submerged areas of the coast around the world.
- the PCR-RFLP Aci ⁇ assay of the polyphenolic adhesive protein is used. This test detects polymorphisms associated with each species, which allow the identification of each one. Polymorphism means any difference in the sequence of nucleotides in the genome, these differences can be: changes in the type of base, deletions (loss of one or more bases), insertions (addition of one or more bases) or duplications.
- the PCR-RFLP (RFLP-Restriction fragment length polymorphisms) assay consists in amplifying by means of the polymerase chain reaction (PCR), a specific segment of the individual's genome to obtain multiple copies or amplicons of the initial segment. To detect polymorphisms (differences) in this amplicon, it is digested with suitable restriction enzymes and the size of the fragments obtained by electrophoresis is determined.
- PCR-RFLP RFLP-Restriction fragment length polymorphisms
- the adhesive protein gene encoding the protein allows the adhesion of the mitilid to the substrate and consists of a repetitive and non-repetitive region.
- the polymorphisms associated with each species can be detected to differentiate the species M. edulis (180 bp amplicon) from M Chilensis and M. galloprovincialis (126 bp amplicon).
- the amplicons are digested with the restriction enzyme Aci, which cuts only the M. galloprovincialis fragment into segments of 75 and 51 bp.
- the size of the different fragments is visualized on agarose or polyacrylamide gels.
- the PCR-RFLP method although it is the most used, is very laborious, slow and expensive, since it includes enzymatic digestion and two stages of visualization of the amplicons in gels (agarose and polyacrylamide).
- AU2013260747 discloses a portable genetic identification equipment that includes the Polymerase Chain Reaction (PCR) and the High Resolution Melting (HRM) technique, which is configured to determine and communicate analysis and results of ID. That is, it refers to a portable computer and not a method for the identification of species of the Mytilus genus. Likewise, it does not describe any splitter, as described in the present invention. Specifically, the present invention relates to specific splitters, and methods using said splitters, which together with the PCR and HRM techniques allow the identification of different species of economic importance within the Mytilus genus. No other prior art document describes the splitters specified herein, nor are the steps of the method used in the present invention disclosed.
- PCR Polymerase Chain Reaction
- HRM High Resolution Melting
- PCR-RFLP Aci ⁇ of the polyphenolic adhesive protein which takes at least two days and has a cost four times higher than the method proposed in the present invention: HRM cost per sample: $ 821 (equivalent to USD 1, 3); PCR-RFLP cost per sample: $ 3391 (equivalent to USD 5.5).
- HRM cost per sample $ 821 (equivalent to USD 1, 3); PCR-RFLP cost per sample: $ 3391 (equivalent to USD 5.5).
- PCR-RFLP Aci ⁇ of the polyphenolic adhesive protein a method of identifying species of the Mytilus genus faster and cheaper is proposed.
- Specific splitters have been designed and a method that uses such splitters in the polymerase chain reaction (PCR).
- PCR polymerase chain reaction
- the present invention proposes a technology based on the High Resolution Melting (HRM) technique, this technique has been developed to detect SNP -Single Nucleotide Polymorphism by its acronym in English or single nucleotide polymorphism- in small amplicons, its main advantage is its low cost and ease of carrying out in any laboratory that has a real-time thermal cycler, real time PCR.
- the identification of SNPs is achieved using specially designed splitters to amplify the region of interest of the genome and intercalating fluorochromes that can bind to DNA saturation without inhibiting the PCR reaction, followed by an analysis of the dissociation curve ("melting") of the amplicons.
- Dissociation curves also detect size polymorphisms between amplicons ( Figure 5).
- Figure 1 Alignment sequences of the polyphenolic adhesive protein gene of M. galloprovincialis and M. chilensis. Enclosed in a rectangle: SNP found between M. galloprovincialis and M. chilensis.
- Figure 3 Point of attachment of the PAPM and Me-15 splitters to the polyphenolic adhesive protein sequence of M. galloprovincialis.
- Figure 4. Alignment for M. edulis with M. chilensis, M. galloprovincialis and PAPM splitters.
- FIG. 5 Normalized HRM curve using PAPM splitters.
- the present invention describes a set of splitters designed for the detection and identification of species of the Mytilus genus, such as Mytilus galloprovincialis, Mytilus chilensis, and Mytilus edulis.
- This set of splitters comprises a splitter of SEQ ID No. 1, called PAPM-SNP F and a splitter of SEQ ID No. 2, called PAPM-SNP R, called PAPM by the Mytilus Polyphenolic Adhesive Protein of the genus Mytilus:
- PAPM-SNP F 5'-GGAACAAAGCATGGACCA-3 ';
- PAPM-SNP R 5'-GACAGCTTCTTTGCAAGTGG-3 '.
- splitters recognize a section of the polyphenolic adhesive protein gene of these species, which is conserved within them, but which allows them to be identified from each other through the use of PCR techniques, and the analysis of dissociation curves (HRM) .
- the present invention also describes a method for the detection and identification of mussel species within the Mytilus genus quickly and at a lower cost, comprising the steps of: a) mix between 1 -50 ng / ⁇ of a DNA sample of the species to be identified with the following reagents necessary for the PCR and HRM reaction: between 2-20 ⁇ , for a final concentration of 0.01 X-4X , of an appropriate fluorescence kit for performing HRM analysis; between 0.05-0.5 ⁇ of SEQ ID No. 1 splitters and between 0.05-0.5 ⁇ of SEQ ID No.
- EXAMPLE 1 Sequence analysis and splitter design.
- PAPM-SNP F and PAPM-SNP R SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 respectively
- PAPM-SNP F 5'-GGAACAAAGCATGGACCA-3 '
- PAPM-SNP R 5'-GACAGCTTCTTTGCAAGTGG-3 '.
- PAPM splitters have a higher melting or dissociation temperature ("tm") and better quality: they do not generate dimers and the amplified one is smaller, 1,16 bp vs 126 bp, which increases the resolution of the HRM technique (Table 1).
- Figure 3 shows the point of attachment of the PAPM and Me15-16 splitters in the sequence of M. galloprovincialis. It is important to note that the binding site that each pair of splitters has is different and therefore, the amplification obtained using each of these is different.
- the in-silico amplification of a segment of the polyphenolic adhesive protein gene using the PAPM splitters designed by the present application correspond to: SEQ ID No. 3 for M. galloprovincialis, SEQ ID No. 4 for M. chilensis and SEQ ID No. 5 for M. edulis.
- polyphenolic adhesive 176 176 87% 6.00E-41 98% DQ640601.1
- the sequence of M. edulis was analyzed in depth in order to determine if in this species it is possible that there is amplification with the PAPM splitters and if so, what would be the expected size of the amplification produced in the PCR reaction.
- the sequence of M. edulis was aligned with the amplification of the PAPM splitters in M. chilensis and M. galloprovincialis, together with the sequence of the PAPM splitters ( Figure 4). Almost perfect alignment of the splitters to the sequence of M. edulis was observed (except for a base at position 1 1 of the PAPM F splitter).
- the expected amplifier has a size of 170 bp, which is consistent with the size observed when displaying the result of the PCR reaction for this species in gels using the PAPM splitters.
- a large insertion of 54 bp was observed prior to SNP 51 G> T (a size polymorphism), detected both using the HRM technique (PAPM Splitters) and using the PCR-RFLP method splitters. The presence of this insertion is the reason why a larger amplicon is generated, which allows to identify individuals of M. edulis.
- EXAMPLE 2 Implementation of the HRM technique for species identification in the Mytilus genus.
- the temperature profile programmed for the development of the PCR reaction with HRM was as follows: Activation of Cheetah TM Taq DNA polymerase for 2 minutes at 96 ° C, 45 cycles of amplification with 15 seconds of denaturation at 96 ° C and binding of splitters for one minute at 60 ° C, ending with an extra cycle for the construction of the dissociation curve (denaturation at 95 ° C for 15 seconds, hybridization for 15 seconds at 55 ° C and denaturation at 95 ° C for 15 seconds) .
- a previous test in conventional PCR with the aforementioned protocol was performed in order to rule out the presence of any nonspecific amplification.
- the HRM technique allows detecting polymorphisms associated with size.
- using PAPM splitters in M. edulis generates amplicons with a size of 170 bp. This amplicon having a size much larger than that of M. galloprovincialis and M. chilensis (1,16 bp) has a dissociation curve displaced to a higher temperature zone, this allows to identify individuals of M. edulis using the PAPM splitters ( Figure 5).
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Abstract
La presente invención consiste en un conjunto de partidores específicos de SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2, y en la utilización de estos en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) junto con la técnica de "High Resolution Melting" (HRM) para identificar especies de mejillón dentro del género Mytilus de forma rápida y con menor costo.
Description
CONJUNTO DE PARTIDORES Y MÉTODO PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE MEJILLÓN DEL GENERO MYTILUS, MEDIANTE LA TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING Y PCR. CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención consiste en un conjunto de partidores específicos y en la utilización de estos en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) junto con la técnica de "High Resolution Melting" (HRM) para identificar especies de mejillón dentro del género Mytilus de forma rápida y con menor costo. El método propuesto puede ser usado por empresas o laboratorios que prestan servicios a la industria mitilicultora y a las autoridades para responder a las demandas de trazabilidad, concretamente, para certificar-autentificar la especie de la materia prima utilizada.
ESTADO DEL ARTE
Los mitílidos (Mytilidae) son moluscos bivalvos que corresponden a una familia de gran interés económico y gastronómico, que incluye especies de importancia comercial pertenecientes al género Mytilus. Como otros bivalvos, son animales filtradores que viven fijados al sustrato. Son exclusivamente marinos y viven tanto en zonas intermareales como zonas sumergidas de las costas de todo el mundo. Actualmente para distinguir entre las especies dentro del género Mytilus, se usa el ensayo PCR-RFLP Aci\ de la proteína adhesiva polifenolica. Este ensayo detecta polimorfismos asociados a cada especie, que permiten la identificación de cada una. Por polimorfismo se entiende cualquier diferencia en la secuencia de nucleotidos en el genoma, estas diferencias pueden ser: cambios en el tipo de base, deleciones (perdida de una o más bases), inserciones (adición de una o más bases) o duplicaciones.
i
El ensayo PCR-RFLP (RFLP- Restriction fragment length polymorphisms) consiste en amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR- Polymerase chain reaction), un segmento específico del genoma del individuo para obtener múltiples copias o amplicones del segmento inicial. Para detectar polimorfismos (diferencias) en este amplicón se digiere con enzimas de restricción adecuadas y se determina el tamaño de los fragmentos obtenidos mediante electroforesis.
El gen de la proteína adhesiva que codifica para la proteína permite la adhesión del mitílido al sustrato y consta de una región repetitiva y no repetitiva. Mediante el PCR- RFLP Aci\ de la proteína adhesiva polifenólica, que amplifica un segmento de la región no repetitiva de este gen, se pueden detectar los polimorfismos asociados a cada especie para diferenciar la especie M. edulis (amplicón de 180 pb) de M. chilensis y M. galloprovincialis (amplicón de 126 pb). Para distinguir entre estas dos últimas, se digieren los amplicones con la enzima de restricción Aci\, que corta únicamente el fragmento de M. galloprovincialis en segmentos de 75 y 51 pb. El tamaño de los distintos fragmentos se visualiza en geles de agarosa o poliacrilamida. El método PCR-RFLP, si bien es el más usado, es muy trabajoso, lento y costoso, ya que incluye digestión enzimática y dos etapas de visualización de los amplicones en geles (agarosa y poliacrilamida).
En el arte previo existe la solicitud AU2013260747, que divulga un equipo portable de identificación genética que incluye la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la técnica High Resolution Melting (HRM), que es configurado para determinar y comunicar análisis y resultados de identificación. Es decir, hace referencia a un equipo portátil y no a un método para la identificación de especies del género Mytilus. Así mismo, no describe partidor alguno, como se describe en la presente invención.
Específicamente, la presente invención se refiere a partidores específicos, y métodos que utilizan dichos partidores, que junto con las técnicas PCR y HRM permiten la identificación de distintas especies de importancia económica dentro del género Mytilus. Ningún otro documento del arte previo describe los partidores acá especificados, así como tampoco se divulgan las etapas del método utilizado en la presente invención.
Como se ha mencionado anteriormente, para identificar las distintas especies de mitílidos de importancia económica (M. edulis, M. chilensis y M. galloprovincialis) en la actualidad, se utiliza el ensayo llamado PCR-RFLP Aci\ de la proteína adhesiva polifenólica, el que demora al menos dos días y tiene un costo cuatro veces superior al método propuesto en la presente invención: Costo HRM por muestra: $821 (equivalente a USD 1 ,3); Costo PCR-RFLP por muestra: $3391 (equivalente a USD 5,5). Lo anterior se debe en parte al valor de uno de sus principales reactivos (la enzima de restricción de Aci\) y a la necesidad de visualizar los resultados de dos etapas (PCR y RFLP) en geles. El mayor costo y trabajo dificulta su aplicación masiva en la autentificación de especies del género Mytilus y ninguno de los documentos del arte previo proporciona una solución a este problema.
Para resolver este problema de la técnica tradicional empleada para identificación de las especies del género Mytilus (PCR-RFLP Aci\ de la proteína adhesiva polifenólica), en la presente invención se propone un método de identificación de especies del género Mytilus más rápido y económico. Se han diseñado partidores específicos y un método que utiliza dichos partidores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Lo anterior, junto con la técnica de HRM permite identificar una variación en la secuencia del gen de la proteína adhesiva polifenólica que es diagnóstica para las especies de mejillón Mytilus chilensis, Mytilus galloprovincialis y Mytilus edulis. Todo esto permite la identificación de las especies de manera rápida (en el 20% del tiempo empleado en el ensayo tradicional), sencilla y a un costo cuatro veces menor que la tecnología
tradicional, generando distintas curvas de melting o disociación, específicas para cada una de las especies a identificar y de fácil interpretación; y sin la necesidad de visualizar los resultados en geles.
La presente invención plantea una tecnología basada en la técnica de High Resolution Melting (HRM), esta técnica ha sido desarrollada para detectar SNP -Single Nucleotide Polymorphism por su sigla en inglés o polimorfismo de un solo nucleótido- en pequeños amplicones, su principal ventaja es su bajo costo y facilidad de realizar en cualquier laboratorio que posea un termociclador para tiempo real, real time PCR. La identificación de los SNP se logra usando partidores especialmente diseñados para amplificar la región de interés del genoma y fluorocromos intercalantes que pueden unirse a saturación al ADN sin inhibir la reacción de PCR, seguido de un análisis de la curva de disociación ("melting") de los amplicones. La detección e identificación de un SNP se produce, porque las curvas de disociación generadas son distintas para cada alelo del SNP, ya que los pares AT y GC requieren de diferente energía calórica para romper sus enlaces puente de hidrogeno. Las curvas de disociación también detectan polimorfismos de tamaño entre los amplicones (Figura 5).
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 . Alineamiento secuencias del gen de la proteína adhesiva polifenólica de M. galloprovincialis y M. chilensis. Encerrado en un rectángulo: SNP encontrado entre M. galloprovincialis y M. chilensis.
Figura 2. Identificación sitio de corte de enzima de restricción Aci\.
Figura 3. Punto de unión de los partidores PAPM y Me-15 a la secuencia de la proteína adhesiva polifenólica de M. galloprovincialis.
Figura 4. Alineamiento para M. edulis con M. chilensis, M. galloprovincialis y los partidores PAPM.
Figura 5. Curva normalizada de HRM usando los partidores PAPM.▼ Corresponde a individuos de M. galloprovincialis (Genotipo G/G, n=1 ), corresponde a híbridos M. chilensis X M. galloprovincialis (Heterocigotos G/T, n=2), ^ corresponde a individuos de M. chilensis (Genotipo T/T, n=3) y · corresponde a individuos de M. edulis (n=3). Todas las muestras en duplicado, excepto los híbridos que están en triplicado.
DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe un conjunto de partidores diseñados para la detección e identificación de especies del género Mytilus, como por ejemplo Mytilus galloprovincialis, Mytilus chilensis, y Mytilus edulis. Este conjunto de partidores comprende un partidor de SEQ ID No. 1 , denominado PAPM-SNP F y un partidor de SEQ ID No. 2, denominados PAPM-SNP R, denominados PAPM por la Proteína Adhesiva Polifenolica del género Mytilus:
PAPM-SNP F: 5'-GGAACAAAGCATGGACCA-3';
PAPM-SNP R: 5'-GACAGCTTCTTTGCAAGTGG-3'.
Estos partidores reconocen una sección del gen de la proteína adhesiva polifenolica de dichas especies, que es conservada dentro de las mismas, pero que permite identificarlas unas de otras mediante el uso de las técnicas PCR, y el análisis de las curvas de disociación (HRM).
La presente invención también describe un método para la detección e identificación de especies de mejillón dentro del género Mytilus de forma rápida y con menor costo, que comprende las etapas de:
a) mezclar entre 1 -50 ng/μΙ de una muestra de ADN de la especie a identificar con los siguientes reactivos necesarios para la reacción de PCR y HRM: entre 2-20 μΙ, para una concentración final de 0,01 X-4X, de un kit de fluorescencia apropiado para realizar análisis por HRM; entre 0,05-0,5 μΙ de partidores de SEQ ID No. 1 y entre 0,05-0,5 μΙ de partidores de SEQ ID No. 2 para una concentración final entre 0,1 -0,5 μΜ de cada uno; entre 0,01 -0,5 μΙ de un fluorocromo de referencia de ser necesario según el equipo a una concentración final de 0,1 -2X y entre 2-40 μΙ_ de H20 grado PCR (hasta completar el volumen apropiado según el equipo de PCR utilizado); b) amplificar un segmento del gen que codifica para la proteína adhesiva polifenólica que se encuentra en el ADN de la mezcla de obtenida en la etapa a), con los partidores de SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2 mediante PCR en las siguientes condiciones: Activación de Taq ADN polimerasa a una temperatura entre 70-100°C durante 1 a 10 minutos, 20 a 45 ciclos de amplificación con una etapa de denaturación a una temperatura entre 70- 100°C durante 10 a 60 segundos, unión de partidores a una temperatura entre 40-80°C por 10 segundos a un minuto y pudiéndose emplear una etapa de extensión al final de cada ciclo a una temperatura entre 50-80°C por 10 segundos a un minuto y una etapa de extensión final a una temperatura entre 50-80°C durante 1 a 10 minutos; c) finalizar el PCR con un ciclo extra para la construcción curva de disociación con un aumento de temperatura de 50e a 95eC entre 1 a 15 minutos; d) generar, durante la etapa c), curvas de disociación de los segmentos amplificados en la etapa b) mediante la técnica HMR; y
dentificar la especie a la que corresponde la muestra a partir de las curvas de disociación obtenidas con la técnica HRM, contrastando los resultados con individuos control de genotipo conocido. EJEMPLOS DE APLICACIÓN
EJEMPLO 1 : Análisis de secuencias y diseño de partidores.
Para diseñar los partidores apropiados para la identificación de las especies, primero se ven las diferencias en las secuencias de la proteína adhesiva polifenólica de las tres especies a analizar. Los tamaños de las secuencias para cada especie son: M. edulis 180 pares de base, M. chilensis y M. galloprovincialis 126 pares de base cada una. Por lo tanto, se debe identificar las diferencias entre las secuencias de M. chilensis y M. galloprovincialis, ya que ambas tienen el mismo tamaño. Para esto, se compararon las secuencias de la proteína adhesiva polifenólica de las dos especies del genero Mytilus: Mytilus galloprovincialis (Genbank: D63778, SEQ ID No. 3) y Mytilus chilensis (Genbank: DQ640609.1 SEQ ID No. 4), mediante alineamiento de secuencias (Figura 1 ).
En dicha Figura 1 se puede apreciar que existe un total consenso en las secuencias comparadas, salvo por la presencia de un de un SNP en posición 51 . En M. galloprovincialis, se observa una guanina, en tanto en M. chilensis este nucleótido cambia a una timina (51 G>T). La presencia del SNP 51 G>T explica y permite identificar el sitio de corte de la enzima de restricción Aci\, que corta el amplicón de M. galloprovincialis en dos fragmentos, no ocurriendo esto en M. chilensis. En específico, la enzima de restricción Aci\ reconoce sitios de corte de secuencia 5'-CCGC-3', secuencia que se puede observar en M. galloprovincialis y no en la secuencia de M. chilensis (Figura 2) donde el cambio de
guanina por timina, secuencia 5'-CCTC-3', elimina el sitio de corte para la enzima de restricción Aci\.
A continuación se diseñaron nuevos partidores, adecuados para la técnica de HRM denominados PAPM-SNP F y PAPM-SNP R (SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2 respectivamente):
PAPM-SNP F: 5'-GGAACAAAGCATGGACCA-3' ; PAPM-SNP R: 5'-GACAGCTTCTTTGCAAGTGG-3'.
Al comparar estos estos partidores con los del método PCR-RFLP (denominados Me- 15 y Me-16), se observa que los partidores PAPM presentan una mayor temperatura de melting o disociación ("tm") y mejor calidad: no generan dimeros y el amplificado es de menor tamaño, 1 16 pb vs 126 pb, lo que aumenta la resolución de la técnica de HRM (Tabla 1 ).
Tabla 1 : Comparación de la calidad de los partidores del método PCR-RFLP (Me15-
16) vs partidores diseñados en la presente invención (PAPM).
Parámetro
Partidor TM (°C) % GC Auto dímero terminal
Me-15 51 ,9 40* 0
Me-16 50,1 29** 1 17**
PAPM F 55 50 0
PAPM R 54,3 50 0
* Parámetro categorizado como malo
** Parámetro categorizado como muy malo
En la Figura 3 se observa el punto de unión de los partidores PAPM y Me15-16 en la secuencia de M. galloprovincialis. Es importante notar que el sitio de unión que tiene cada par de partidores es distinto y por ende, es distinto el amplificado que se obtiene usando cada uno de estos.
El amplificado in-silico de un segmento del gen de la proteína adhesiva polifenólica usando los partidores PAPM diseñados por la presente solicitud corresponden a: SEQ
ID No. 3 para M. galloprovincialis, SEQ ID No. 4 para M. chilensis y SEQ ID No. 5 para M. edulis.
Para demostrar la especificidad de los partidores de la presente invención, también se analizaron en otras especies de mejillón. Para esto, se comenzó buscando en la base de datos de secuencias de GenBank, secuencias de la proteína adhesiva polifenolica (Nombre de acceso: "polyphenolic adhesive protein"). El resultado de esta búsqueda arrojó 53 resultados, de los cuales 44 pertenecen alguna especie de mejillón: M. galloprovincialis (29), M. chilensis (10), M. edulis (3) y M. trossulus (2). Luego se determinó el valor E de los alineamientos, que indica la probabilidad de que las coincidencias entre ambas secuencias alineadas sea debida al azar, y el porcentaje de identidad entre ambas secuencias usando la herramienta BLAST, lo que se muestra en la tabla 2. Este resultado muestra la especificidad de los partidores PAPM, los cuales solo amplifican en especies del género Mytilus, lo que asegura que no habrá confusión con otras especies. Tabla 2: Especificidad de los partidores PAPM en distintas especies del género Mytilus.
Descripción Mayor Puntaje % Cobertura Valor E % Acceso
Puntaje Total Identidad
Mytilus sp. JHX-2002 Precursor proteína
adhesiva polifenolica 209 209 100% 6,00E-51 99% AF489933.1
Mytilus galloprovincialis mRNA para
proteína adhesiva polifenolica 209 209 100% 6,00E-51 99% D63778.1
Mytilus galloprovincialis Muestra de Chile
(Concepción) gen proteína adhesiva
polifenolica 182 182 87% l,00E-42 99% HQ257469.1
Mytilus galloprovincialis Mgll gen proteína
adhesiva polifenolica 182 182 87% l,00E-42 99% DQ640590.1
Mytilus galloprovincialis Muestra de Nueva
Zelanda (Akaroa) gen proteína adhesiva
polifenolica 176 176 87% 6,00E-41 98% HQ257459.1
Mytilus chilensis Mcll gen proteína
adhesiva polifenolica 176 176 87% 6,00E-41 98% DQ640601.1
Mytilus galloprovincialis Muestra de
Turquía (Izmir) gen proteína adhesiva
polifenolica 171 171 84% 3,00E-39 98% HQ257470.1
Mytilus galloprovincialis Muestra de Nueva
Zelanda (Kaikoura) gen proteína adhesiva
polifenolica 171 171 87% 3,00E-39 97% HQ257468.1
Mytilus edulis Mell2 gen proteína adhesiva
polifenolica 121 121 63% 3,00E-24 96% DQ640586.1
Mytilus edulis clon 21 proteína adhesiva 1
(fp-1) mRNA 121 194 100% 3,00E-24 96% AY845258.1
Mytilus edulis Melll4 gen proteína adhesiva
polifenólica 117 117 63% 3,00E-23 95% DQ640587.1
Mytilus edulis gen proteína adhesiva
polifenólica 115 194 100% l,00E-22 95% X54422.1
Mytilus californianus gen proteína adhesiva
polifenólica mRNA 89,8 89,8 49% 8,00E-15 95% AY960602.1
Mytilus californianus gen proteína adhesiva
polifenólica mRNA 89,8 89,8 49% 8,00E-15 95% AY960601.1
Mytilus coruscus mRNA gen proteína
adhesiva polifenólica 73,1 73,1 49% 8,00E-10 89% D63777.1
Mytilus trossulus gen proteína adhesiva
polifenólica 71,3 71,3 35% 3,00E-09 98% D50553.1
Se analizó la secuencia de M. edulis en profundidad con el fin de determinar si en esta especie es posible que haya amplificación con los partidores PAPM y de ser así, cuál sería el tamaño esperado del amplificado producido en la reacción de PCR. Para esto, se alineó la secuencia de M. edulis con el amplificado de los partidores PAPM en M. chilensis y M. galloprovincialis, junto a la secuencia de los partidores PAPM (Figura 4). Se observó alineamiento casi perfecto de los partidores a la secuencia de M. edulis (salvo por una base en la posición 1 1 del partidor PAPM F). El amplificado esperado tiene un tamaño de 170 pb, lo cual tiene concordancia con el tamaño observado al visualizar en geles el resultado de la reacción de PCR para esta especie usando los partidores PAPM. Se observó una gran inserción de 54 pb previo al SNP 51 G>T (un polimorfismo de tamaño), detectado tanto usando la técnica de HRM (Partidores PAPM) como usando los partidores del método PCR-RFLP. La presencia de está inserción es la razón por lo que se genera un amplicón de mayor tamaño, lo que permite identificar individuos de M. edulis.
EJEMPLO 2: Implementación de la técnica de HRM para identificación de especie en el género Mytilus.
Con la finalidad de obtener resultados comparativos, se utilizaron individuos analizados previamente con el método actualmente en uso RFLP-PCR Aci\ (Inoue, Waite et al. 1995; Santaclara, Espineira et al. 2006). Se usaron 425 individuos de mitílidos de las especies mencionadas, 308 fueron colectados en el sur de Chile, 46 obtenidos de
muestras comerciales procedentes de Galicia, España; 50 colectados en Canadá y 21 en México (Tabla 3).
Tabla 3. Origen de Muestras
País Localización n Especie de acuerdo a PCR RFLP
muestreo Me15-16 Ac/I
Chile Isla Peel 5 M. chilensis
Chile Metri 54 M. chilensis
Chile Pichicolo 54 M. chilensis
Chile La Arena 53 M. chilensis
Chile Canutillar 55 M. chilensis
Chile Canal Doldita 54 M. chilensis
Chile Dichato 3 M. chilensis x M. galloprovincialis
Chile Metri 1 M. chilensis x M. galloprovincialis
Chile La Arena 1 M. chilensis x M. galloprovincialis
Chile Canal Coldita 1 M. chilensis x M. galloprovincialis
Chile Dichato 27 M. galloprovincialis
España Galicia 46 M. galloprovincialis
México Rincón de las ballenas 21 M. galloprovincialis
Canadá Isla Prince Edward 50 M. edulis
Tanto el protocolo de PCR, disposición de las muestras en la placa, análisis de disociación y el posterior análisis de resultados, fueron diseñados y realizados usando el programa ECO™ Real-Time PCR System 4.0 (lllumina). Se utilizó la mezcla Fast EvaGreen® qPCR Master Mix (Biotium) que contiene EvaGreen®, Cheetah™ Taq ADN polimerasa, dNTPs y buffer necesarios para la reacción PCR, para la lectura y creación de la curva de disociación. Las pruebas fueron realizadas usando el siguiente protocolo (Tabla 4):
Tabla 4: Mezcla PCR
PCR-HRM x1 (μΙ) x48 (μΙ)
2x Fast Evagreen® 4 192
Partidor de SEQ ID No. 1 0,075 3,6
Partidor de SEQ ID No. 2 0,075 3,6
ROX 0,1 4,8
H20 PCR 3,25 156
Total 7,5
ADN 05
Total + ADN 8~
El perfil de temperatura programado para el desarrollo de la reacción de PCR con HRM fue el siguiente: Activación de Cheetah™ Taq ADN polimerasa por 2 minutos a 96°C, 45 ciclos de amplificación con 15 segundos de denaturación a 96°C y unión de partidores por un minuto a 60°C, finalizando con un ciclo extra para la construcción de la curva de disociación (denaturación a 95°C por 15 segundos, hibridación por 15 segundos a 55°C y denaturación a 95°C por 15 segundos). Una prueba previa en PCR convencional con el protocolo mencionado fue realizada con el fin de descartar la presencia de algún amplificado inespecífico. La técnica de HRM además de tener la capacidad de detectar los distintos alelos de un SNP, permite detectar polimorfismos asociados a tamaño. Como ya se mencionó, usando los partidores PAPM en M. edulis se generan amplicones con tamaño de 170 pb. Este amplicón al tener un tamaño mucho mayor que el de M. galloprovincialis y M. chilensis (1 16 pb) tiene un curva de disociación desplazada a una zona de mayor temperatura, esto permite identificar individuos de M. edulis usando los partidores PAPM (Figura 5).
EJEMPLO 3: Secuenciación.
Con el fin de verificar que el SNP de interés estuviera dentro del amplificado obtenido usando los partidores PAPM, éste se mandó a secuenciar. En primer lugar se realizó una reacción de PCR normal con los partidores PAPM, a continuación los amplicones se visualizaron en un gel de agarosa con el fin de descartar la presencia de amplificados inespecíficos. Posteriormente, se purificaron los amplificados usando FavorPrep™ Gel/PCR purification MINI kit. Los fragmentos así obtenidos fueron enviados a
secuenciar a Macrogen Inc. Los resultados de la secuenciacion indicaron que el SNP de interés se encuentra dentro del amplicón generado con los partidores PAPM.
Claims
1 . Conjunto de partidores para la detección e identificación de especies de mejillón del genero Mytilus, CARACTERIZADO porque comprende un partidor de SEQ ID No. 1 y un partidor de SEQ ID No. 2.
2. Método para la detección e identificación de especies de mejillón del género Mytilus, CARACTERIZADO porque comprende las etapas de: a) mezclar entre 1 -50 ng/μΙ de una muestra de ADN de la especie a identificar con reactivos para la reacción de PCR y HRM; b) amplificar un segmento del gen que codifica para la proteína adhesiva polifenólica que se encuentra en el ADN de la mezcla de obtenida en la etapa a), con el conjunto de partidores de la reivindicación 1 ; c) finalizar el PCR con un ciclo extra para la construcción curva de disociación con un aumento de temperatura de 50e a 95eC entre 1 a 15 minutos; d) generar, durante la etapa c), curvas de disociación de la secuencia de los segmentos amplificados en la etapa b) mediante la técnica HMR; e e) identificar la especie a la que corresponde la muestra a partir de las curvas de disociación obtenidas con la técnica HRM, contrastando los resultados con individuos control de genotipo conocido.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque los reactivos que se mezclan en la etapa a) son los siguientes: Kit de fluorescencia apropiado para realizar análisis por HRM; Partidores SEQ ID No. 1 y SEQ ID No.
2; un fluorocromo de referencia de ser necesario según el equipo y completando el volumen añadiendo H20 grado PCR.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque se utiliza entre 2-20 μΙ, a una concentración final de 0,01 X-4X del kit de fluorescencia.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque se utiliza entre 0,05-0,5 μΙ de los partidores de SEQ ID No. 1 y entre 0,05-0,5 μΙ de los partidores de SEQ ID No. 2 a una concentración final entre 0,1 -0,5 μΜ de cada uno.
6. Método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque se utiliza entre 0,01 -0,5 μΙ del fluorocromo hasta una concentración final entre 0,1 -2X.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque se utiliza entre 2-40 μΙ de H20 PCR hasta completar el volumen apropiado según el equipo de PCR utilizado.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque la amplificación de la etapa b) se realiza mediante PCR en las siguientes condiciones: activación de Taq ADN polimerasa a una temperatura entre 70- 100°C durante 1 a 10 minutos, 20 a 45 ciclos de amplificación con una etapa de denaturación a una temperatura entre 70-100°C durante 10 a 60 segundos, unión de partidores a una temperatura entre 40-80°C por 10 segundos a un minuto y pudiéndose emplear una etapa de extensión al final de cada ciclo a una temperatura entre 50-80°C por 10 segundos a un minuto y una etapa de extensión final a una temperatura entre 50-80°C durante 1 a 10 minutos.
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2016
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| CN109825599B (zh) * | 2018-11-28 | 2022-08-09 | 宁波大学 | 一种鉴定厚壳贻贝和地中海贻贝杂交个体遗传背景的方法 |
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