ES2875758T3 - Conjunto de cebadores y método para la detección e identificación de especies de mejillón del genero mytilus - Google Patents

Abstract

La presente invención consiste en un conjunto de partidores específicos de SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2, y en la utilización de estos en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) junto con la técnica de "High Resolution Melting" (HRM) para identificar especies de mejillón dentro del género Mytilus de forma rápida y con menor costo.

Description

DESCRIPCIÓN

Conjunto de cebadores y método para la detección e identificación de especies de mejillón del genero mytilus

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores específicos y en la utilización de estos en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) junto con la técnica de “Fusión de Alta Resolución” (HRM) para identificar especies de mejillón dentro del género Mytilus de forma rápida y con menor coste. El método divulgado puede ser usado por empresas o laboratorios que prestan servicios a la industria mitilicultora y a las autoridades para responder a las demandas de trazabilidad, concretamente, para certificar-autentificar la especie de la materia prima utilizada.

Estado de la técnica

Los mejillones de agua salada (Mytilidae) son moluscos bivalvos que corresponden a una familia de gran interés económico y gastronómico, que incluye especies de importancia comercial pertenecientes al género Mytilus. Como otros bivalvos, son animales filtradores que viven fijados al sustrato. Son exclusivamente marinos y viven tanto en zonas intermareales como zonas sumergidas de las costas de todo el mundo. Actualmente para distinguir entre las especies dentro del género Mytilus, se usa el ensayo PCR-RFLP AciI de la proteína adhesiva polifenólica. Este ensayo detecta polimorfismos asociados a cada especie, que permiten la identificación de cada una. Por polimorfismo se entiende cualquier diferencia en la secuencia de nucleótidos en el genoma, estas diferencias pueden ser: cambios en el tipo de base, deleciones (perdida de una o más bases), inserciones (adición de una o más bases) o duplicaciones.

El ensayo PCR-RFLP (RFLP- Restriction fragment length polymorphisms) consiste en amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR- Polymerase chain reaction), un segmento específico del genoma del individuo para obtener múltiples copias o amplicones del segmento inicial. Para detectar polimorfismos (diferencias) en este amplicón se digiere con enzimas de restricción adecuadas y se determina el tamaño de los fragmentos obtenidos mediante electroforesis.

El gen de la proteína adhesiva que codifica para la proteína permite la adhesión del mitílido al sustrato y consta de una región repetitiva y no repetitiva. Mediante el PCR-RFLP AciI de la proteína adhesiva polifenólica, que amplifica un segmento de la región no repetitiva de este gen, se pueden detectar los polimorfismos asociados a cada especie para diferenciar la especie M. edulis (amplicón de 180 pb) de M. chilensis y M. galloprovincialis (amplicón de 126 pb). Para distinguir entre estas dos últimas, se digieren los amplicones con la enzima de restricción AciI, que corta únicamente el fragmento de M. galloprovincialis en segmentos de 75 y 51 pb. El tamaño de los distintos fragmentos se visualiza en geles de agarosa o poliacrilamida. El método PCR-RFLP, si bien es el más usado, es muy trabajoso, lento y costoso, ya que incluye digestión enzimática y dos etapas de visualización de los amplicones en geles (agarosa y poliacrilamida).

La solicitud AU2013260747 de la técnica anterior divulga un equipo portable de identificación genética que incluye la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la técnica de Fusión de Alta Resolución (HRM), que es configurado para determinar y comunicar análisis y resultados de identificación. Es decir, hace referencia a un equipo portátil y no a un método para la identificación de especies del género Mytilus. Así mismo, no describe Cebador alguno, como se describe en la presente invención.

Inque et al. enseñan un método para detectar e identificar especies de mejillón del género Mytilus que comprende amplificar un segmento del gen que codifica la proteína adhesiva polifenólica Glu-5 mediante p Cr usando los cebadores Me15 y Me16 (KOJI INQUE et al. "Interspecific variations in adhesive protein sequences of Mytilus edulis, M. galloprovincialis and M. trossulus". BIOLOGICAL BULLETIN, LANCASTER PRESS, INC, LANCASTER PA, US, Vol 189, 3, 370-375, 1995). Además, Larrain también enseña un método para detectar e identificar especies de mejillón del género Mytilus, que comprende amplificar un segmento del gen que codifica la proteína adhesiva polifenólica mediante PCR utilizando los cebadores Me15 y Me16 y analizar los fragmentos amplificados por Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción RFLP (MARIA ANGÉLlCA LARRAíN et al. "Genetic composition of Mytilus species in mussel populations from southern Chile". LATIN AMERICAN JOURNAL OF AQUATIC RESEARCH, Vol 40, 1, 1077-1084, 2012). Sin embargo, el par de cebadores utilizado por cualquiera de estos estudios no es muy específico, y en ninguno de ellos se da ninguna sugerencia sobre el análisis del gen Glu-5 mediante PCR-HRM para identificar especies de mejillón.

Específicamente, la presente invención se refiere a cebadores específicos como se define en la reivindicación 1, y métodos como se define en las reivindicaciones 2-6 que utilizan dichos cebadores, que junto con las técnicas PCR y HRM permiten la identificación de distintas especies de importancia económica dentro del género Mytilus. Ningún otro documento de la técnica anterior describe los cebadores acá especificados, así como tampoco se divulgan las etapas del método utilizado en la presente invención.

Como se ha mencionado anteriormente, para identificar las distintas especies de mitílidos de importancia económica (M. edulis, M. chilensis y M. galloprovincialis) en la actualidad, se utiliza el ensayo llamado PCR-RFLP AciI de la proteína adhesiva polifenólica, el que demora al menos dos días y tiene un coste cuatro veces superior al método divulgados en la presente invención: Coste HRM por muestra: $821 (equivalente a USD 1,3); Coste PCR-RFLP por muestra: $3391 (equivalente a USD 5,5). Lo anterior se debe en parte al valor de uno de sus principales reactivos (la enzima de restricción de AciI) y a la necesidad de visualizar los resultados de dos etapas (PCR y RFLP) en geles. El mayor coste y trabajo dificulta su aplicación masiva en la autentificación de especies del género Mytilus y ninguno de los documentos de la técnica anterior proporciona una solución a este problema.

Para resolver este problema de la técnica tradicional empleada para identificación de las especies del género Mytilus (PCR-RFLP AciI de la proteína adhesiva polifenólica), en la presente invención se propone un método como se define en las reivindiaciones anexas de identificación de especies del género Mytilus más rápido y económico.

Se han diseñado cebadores específicos y un método que utiliza dichos cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Lo anterior, junto con la técnica de HRM permite identificar una variación en la secuencia del gen de la proteína adhesiva polifenólica que es diagnóstica para las especies de mejillón Mytilus chilensis, Mytilus galloprovincialis y Mytilus edulis. Todo esto permite la identificación de las especies de manera rápida (en el 20% del tiempo empleado en el ensayo tradicional), sencilla y a un coste cuatro veces menor que la tecnología tradicional, generando distintas curvas de melting o disociación, específicas para cada una de las especies a identificar y de fácil interpretación; y sin la necesidad de visualizar los resultados en geles.

La presente invención utiliza una tecnología basada en la técnica de Fusión de Alta Resolución (HRM), esta técnica ha sido desarrollada para detectar SNP -Single Nucleotide Polymorphism por su sigla en inglés o polimorfismo de un solo nucleótido- en pequeños amplicones, su principal ventaja es su bajo coste y facilidad de realizar en cualquier laboratorio que posea un termociclador para tiempo real, real time PCR. La identificación de los SNP se logra usando cebadores especialmente diseñados para amplificar la región de interés del genoma y fluorocromos intercalantes que pueden unirse a saturación al ADN sin inhibir la reacción de PCR, seguido de un análisis de la curva de disociación ("melting") de los amplicones. La detección e identificación de un SNP se produce, porque las curvas de disociación generadas son distintas para cada alelo del SNP, ya que los pares AT y GC requieren de diferente energía calórica para romper sus enlaces puente de hidrogeno. Las curvas de disociación también detectan polimorfismos de tamaño entre los amplicones (Figura 5).

Descripción de las figuras

Figura 1. Alineamiento secuencias del gen de la proteína adhesiva polifenólica de M. galloprovincialis y M. chilensis. Encerrado en un rectángulo: SNP encontrado entre M. galloprovincialis y M. chilensis.

Figura 2. Identificación sitio de corte de enzima de restricción AciI.

Figura 3. Punto de unión de los cebadores PAPM y Me-15 a la secuencia de la proteína adhesiva polifenólica de M. galloprovincialis.

Figura 4. Alineamiento para M. edulis con M. chilensis, M. galloprovincialis y los cebadores PAPM.

Figura 5. Curva normalizada de HRM usando los cebadores PAPM. ▼ Corresponde a individuos de M. galloprovincialis (Genotipo G/G, n=1), V corresponde a híbridos M. chilensis XM. galloprovincialis (Heterocigotos G/T, n=2), O corresponde a individuos de M. chilensis (Genotipo T/T, n=3) y • corresponde a individuos de M. edulis (n=3). Todas las muestras en duplicado, excepto los híbridos que están en triplicado.

Descripcion de la invención

La presente invención describe un conjunto de cebadores diseñados para la detección e identificación de especies del género Mytilus, como por ejemplo Mytilus galloprovincialis, Mytilus chilensis, y Mytilus edulis. Este conjunto de cebadores comprende un Cebador de la SEQ ID No. 1, denominado PAPM-SNP F y un Cebador de la SEQ ID No. 2, denominados PAPM-SNP R, denominados PAPM por la Proteína Adhesiva Polifenólica del género Mytilus:

PAPM-SNP F: 5' -GGAACAAAG CATGGACCA-3';

PAPM-SNP R: 5'-GACAGCTT CTTT GCAAGT GG-3'.

Estos cebadores reconocen una sección del gen de la proteína adhesiva polifenólica de dichas especies, que es conservada dentro de las mismas, pero que permite identificarlas unas de otras mediante el uso de las técnicas PCR, y el análisis de las curvas de disociación (HRM).

La presente invención también describe un método para la detección e identificación de especies de mejillón dentro del género Mytilus de forma rápida y con menor coste, que comprende las etapas de:

a) mezclar entre 1-50 ng/pl de una muestra de ADN de la especie que se va a identificar con los siguientes reactivos necesarios para la reacción de PCR y HRM: reactivos de un kit de fluorescencia apropiado para realizar análisis entre 0,05-0,5 pl de cebadores de la SEQ ID No.2 para una concentración final entre 0,1-0,5 pM de cada uno; un fluorocromo de referencia de ser necesario según el equipo y entre 2-40 pL de H2O grado PCR (hasta completar el volumen apropiado según el equipo de PCR utilizado);

b) amplificar un segmento del gen que codifica para la proteína adhesiva polifenólica que se encuentra en el ADN de la mezcla de obtenida en la etapa a), con los cebadores de la SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2 mediante PCR en las siguientes condiciones: Activación de Taq ADN polimerasa a una temperatura entre 70-100°C durante 1 a 10 minutos, 20 a 45 ciclos de amplificación con una etapa de desnaturalización a una temperatura entre 70-100°C durante 10 a 60 segundos, unión de cebadores a una temperatura entre 40-80°C por 10 segundos a un minuto y una etapa de extensión al final de cada ciclo a una temperatura entre 50-80°C por 10 segundos a un minuto y una etapa de extensión final a una temperatura entre 50-80°C durante 1 a 10 minutos;

c) finalizar el PCR con un ciclo extra para la construcción curva de disociación con un aumento de temperatura de 50° a 95°C entre 1 a 15 minutos;

d) generar, durante la etapa c), curvas de disociación de los segmentos amplificados en la etapa b) mediante la técnica HMR; y

e) identificar la especie a la que corresponde la muestra a partir de las curvas de disociación obtenidas con la técnica HRM, contrastando los resultados con individuos control de genotipo conocido.

Ejemplos de aplicación

EJEMPLO 1: Análisis de secuencias y diseño de cebadores.

Para diseñar los cebadores apropiados para la identificación de las especies, primero se ven las diferencias en las secuencias de la proteína adhesiva polifenólica de las tres especies a analizar. Los tamaños de las secuencias para cada especie son: M. edulis 180 pares de base, M. chilensis y M. galloprovincialis 126 pares de base cada una. Por lo tanto, se debe identificar las diferencias entre las secuencias de M. chilensis y M. galloprovincialis, ya que ambas tienen el mismo tamaño. Para esto, se compararon las secuencias de la proteína adhesiva polifenólica de las dos especies del genero Mytilus: Mytilus galloprovincialis (Genbank: D63778, s Eq ID No. 3) y Mytilus chilensis (Genbank: DQ640609.1 SEQ ID No. 4), mediante alineamiento de secuencias (Figura 1).

En dicha Figura 1 se puede apreciar que existe un total consenso en las secuencias comparadas, salvo por la presencia de un de un SNP en posición 66. En M. galloprovincialis, se observa una guanina, en tanto en M. chilensis este nucleótido cambia a una timina (66G>T).

La presencia del SNP 66G>T explica y permite identificar el sitio de corte de la enzima de restricción AciI, que corta el amplicón de M. galloprovincialis en dos fragmentos, no ocurriendo esto en M. chilensis. En específico, la enzima de restricción AciI reconoce sitios de corte de secuencia 5'-CCGC-3', secuencia que se puede observar en M. galloprovincialis y no en la secuencia de M. chilensis (Figura 2) donde el cambio de guanina por timina, secuencia 5'-CCTC-3', elimina el sitio de corte para la enzima de restricción AciI.

A continuación se diseñaron nuevos cebadores, adecuados para la técnica de HRM denominados PAPM-SNP F y PAPM-SNP R (SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2 respectivamente):

PAPM-SNP F: 5'-GGAACAAAGCAT GGACCA-3';

PAPM-SNP R: 5'-GACAGCTT CTTT GCAAGT GG-3'.

Al comparar estos estos cebadores con los del método PCR-RFLP (denominados Me-15 y Me-16), se observa que los cebadores PAPM presentan una mayor temperatura de melting o disociación (“tm”) y mejor calidad: no generan dímeros y el amplificado es de menor tamaño, 116 pb vs 126 pb, lo que aumenta la resolución de la técnica de HRM (Tabla 1).

Tabla 1: Comparación de la calidad de los cebadores del método PCR-RFLP (Me15-16) vs cebadores diseñados en la presente invención (PAPM).

Parámetro

Cebador TM (°C) % GC Auto dímero terminal

Me-15 51,9 40* 0

Me-16 50,1 29** 117**

PAPM F 55 50 0

PAPM R 54,3 50 0

* Parámetro categorizado como malo

** Parámetro categorizado como muy malo

En la Figura 3 se observa el punto de unión de los cebadores PAPM y Me15-16 en la secuencia de M. galloprovincialis. Es importante notar que el sitio de unión que tiene cada par de cebadores es distinto y por ende, es distinto el amplificado que se obtiene usando cada uno de estos.

El amplificado in-silico de un segmento del gen de la proteína adhesiva polifenólica usando los cebadores PAPM diseñados por la presente solicitud corresponden a: SEQ ID No. 3 para M. galloprovincialis, SEQ ID No. 4 para M. chilensis y SEQ ID No. 5 para M. edulis.

Para demostrar la especificidad de los cebadores de la presente invención, también se analizaron en otras especies de mejillón. Para esto, se comenzó buscando en la base de datos de secuencias de GenBank, secuencias de la proteína adhesiva polifenólica (Nombre de acceso: “polyphenolic adhesive protein”). El resultado de esta búsqueda arrojó 53 resultados, de los cuales 44 pertenecen alguna especie de mejillón: M. galloprovincialis (29), M. chilensis (10), M. edulis (3) y M. trossulus (2). Luego se determinó el valor E de los alineamientos, que indica la probabilidad de que las coincidencias entre ambas secuencias alineadas sea debida al azar, y el porcentaje de identidad entre ambas secuencias usando la herramienta BLAST, lo que se muestra en la tabla 2. Este resultado muestra la especificidad de los cebadores PAPM, los cuales solo amplifican en especies del género Mytilus, lo que asegura que no habrá confusión con otras especies.

Tabla 2: Especificidad de los cebadores PAPM en distintas especies del género Mytilus.

Descripción Mayor Puntaj % Valor E % Acceso Puntaj e Total Cobertura Identida

e d

Mytilus sp. JHX-2002 Precursor 6,00E- AF489933 proteína adhesiva polifenólica 209 209 100% 51 99% .1

Mytilus galloprovincialis mRNA 6,00E-para proteína adhesiva polifenólica 209 209 100% 51 99% D63778.1

Mytilus galloprovincialis Muestra de

Chile (Concepcion) gen proteína 1,00E- HQ25746 adhesiva polifenólica 182 182 87% 42 99% 9.1

Mytilus galloprovincialis Mg11 gen 1,00E- DQ64059 proteína adhesiva polifenólica 182 182 87% 42 99% 0.1

Mytilus galloprovincialis Muestra de

Nueva Zelanda (Akaroa) gen 6,00E- HQ25745 proteína adhesiva polifenólica 176 176 87% 41 98% 9.1

Mytilus chilensis McI1 gen proteína 6,00E- DQ64060 adhesiva polifenólica 176 176 87% 41 98% 1.1

Mytilus galloprovincialis Muestra

de Turquía (Izmir) gen proteína 3,00E- HQ25747 adhesiva polifenólica 171 171 84% 39 98% 0.1

Mytilus galloprovincialis Muestra de

Nueva Zelanda (Kaikoura) gen 3,00E- HQ25746 proteína adhesiva polifenólica 171 171 87% 39 97% 8.1

Mytilus edulis MeII2 gen proteína 3,00E- DQ64058 adhesiva polifenólica 121 121 63% 24 96% 6.1

Mytilus edulis clon 21 proteína 3,00E- AY845258 adhesiva 1 (fp-1) mRNA 121 194 100% 24 96% .1

Mytilus edulis MeIII4 gen proteína 3,00E- DQ64058 adhesiva polifenólica 117 117 63% 23 95% 7.1

Mytilus edulis gen proteína 1,00E-adhesiva polifenólica 115 194 100% 22 95% X54422.1

Mytilus californianus gen proteína 8,00E- AY960602 adhesiva polifenólica mRNA 89,8 89,8 49% 15 95% .1

Mytilus californianus gen proteína 8,00E- AY960601 adhesiva polifenólica mRNA 89,8 89,8 49% 15 95% .1

Mytilus coruscus mRNA gen

proteína adhesiva polifenólica 73,1 73,1 49% 89% 063777.1

Mytilus trossulus gen proteína 3,00E-adhesiva polifenólica 71,3 71,3 35% 09 98% 050553.1

Se analizó la secuencia de M. edulis en profundidad con el fin de determinar si en esta especie es posible que haya amplificación con los cebadores PAPM y de ser así, cuál sería el tamaño esperado del amplificado producido en la reacción de PCR. Para esto, se alineó la secuencia de M. edulis con el amplificado de los cebadores PAPM en M. chilensis y M. galloprovincialis, junto a la secuencia de los cebadores PAPM (Figura 4). Se observó alineamiento casi perfecto de los cebadores a la secuencia de M. edulis (salvo por una base en la posición 11 del Cebador PAPM F). El amplificado esperado tiene un tamaño de 170 pb, lo cual tiene concordancia con el tamaño observado al visualizar en geles el resultado de la reacción de PCR para esta especie usando los cebadores PAPM. Se observó una gran inserción de 54 pb previo al SNP 66 G>T (un polimorfismo de tamaño), detectado tanto usando la técnica de HRM (Cebadores PAPM) como usando los cebadores del método PCR-RFLP. La presencia de está inserción es la razón por lo que se genera un amplicón de mayor tamaño, lo que permite identificar individuos de M. edulis.

EJEMPLO 2: Implementación de la técnica de HRM para identificación de especie en el género Mytilus.

Con la finalidad de obtener resultados comparativos, se utilizaron individuos analizados previamente con el método actualmente en uso RFLP-PCR AciI (Inoue, Waite et al. 1995; Santaclara, Espineira et al. 2006). Se usaron 425 individuos de mitílidos de las especies mencionadas, 308 fueron colectados en el sur de Chile, 46 obtenidos de muestras comerciales procedentes de Galicia, España; 50 colectados en Canadá y 21 en México (Tabla 3).

Tabla 3. Origen de Muestras

País Localización de muestreo n Especie de acuerdo con PCR RFLP Me15-16

AciI

Chile Isla Peel 5 M. chilensis

Chile Metri 54 M. chilensis

Chile Pichicolo 54 M. chilensis

Chile La Arena 53 M. chilensis

Chile Canutillar 55 M. chilensis

Chile Canal Doldita 54 M. chilensis

Chile Dichato 3 M. chilensis x M. galloprovincialis

Chile Metri 1 M. chilensis x M. galloprovincialis

Chile La Arena 1 M. chilensis x M. galloprovincialis

Chile Canal Coldita 1 M. chilensis x M. galloprovincialis

Chile Dichato 27 M. galloprovincialis

España Galicia 46 M. galloprovincialis

México Rincón de las ballenas 21 M. galloprovincialis

Canadá Isla Prince Edward 50 M. edulis

Tanto el protocolo de PCR, disposición de las muestras en la placa, análisis de disociación y el posterior análisis de resultados, fueron diseñados y realizados usando el programa ECO™ Real-Time PCR System 4.0 (Illumina). Se utilizó la mezcla Fast EvaGreen® qPCR Master Mix (Biotium) que contiene EvaGreen®, Cheetah™ Taq ADN polimerasa, dNTPs y buffer necesarios para la reacción PCR, para la lectura y creación de la curva de disociación. Las pruebas fueron realizadas usando el siguiente protocolo (Tabla 4):

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Conjunto de cebadores para la detección e identificación de especies de mejillón del genero Mytilus, CARACTERIZADO porque comprende un cebador de la SEQ ID No. 1 y un cebador de la SEQ ID No. 2.

2. Método para la detección e identificación de especies de mejillón del género Mytilus, CARACTERIZADO porque comprende las etapas de:

a) mezclar entre 1-50 ng/pl de una muestra de ADN de la especie que se va a identificar con reactivos para la reacción de PCR y HRM;

b) amplificar un segmento del gen que codifica para la proteína adhesiva polifenólica que se encuentra en el ADN de la mezcla de obtenida en la etapa a), con el conjunto de cebadores de la reivindicación 1;

c) finalizar el PCR con un ciclo extra para la construcción de la curva de disociación con un aumento de temperatura desde 50° hasta 95°C entre 1 hasta 15 minutos;

d) generar, durante la etapa c), curvas de disociación de la secuencia de los segmentos amplificados en la etapa b) mediante la técnica HMR; e

e) identificar la especie a la que corresponde la muestra a partir de las curvas de disociación obtenidas con la técnica HRM, contrastando los resultados con individuos control de genotipo conocido.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque los reactivos que se mezclan en la etapa a) son los siguientes: reactivos de un kit de fluorescencia apropiado para realizar análisis por HRM; cebadores de la SEQ ID No. 1 y la SEQ ID No. 2; un fluorocromo de referencia de ser necesario de acuerdo con el equipo y completando el volumen añadiendo H2O grado PCR.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque se utiliza entre 0,05-0,5 pl de los cebadores de la SEQ ID No. 1 y entre 0,05-0,5 pl de los cebadores de la SEQ ID No. 2 a una concentración final entre 0,1-0,5 pM de cada uno.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque se utiliza entre 2-40 pl de H2O grado PCR hasta completar el volumen apropiado de acuerdo con el equipo de PCR utilizado.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque la amplificación de la etapa b) se realiza bajo las siguientes condiciones: activación de Taq ADN polimerasa a una temperatura entre 70-100°C durante 1 a 10 minutos, 20 a 45 ciclos de amplificación con una etapa de desnaturalización a una temperatura entre 70-100°C durante 10 a 60 segundos, unión de cebadores a una temperatura entre 40-80°C durante 10 segundos hasta un minuto y una etapa de extensión al final de cada ciclo a una temperatura entre 50-80°C durante 10 segundos hasta un minuto y una etapa de extensión final a una temperatura entre 50-80°C durante 1 hasta 10 minutos.