ES2432530B1 - Método de determinación del origen genético de cérvidos - Google Patents

Abstract

Método de determinación del origen genético de cérvidos.#La presente invención pertenece al campo de la identificación genética de distintos cérvidos, en particular se refiere a un método genético para determinar el origen genético de ciervos y gamos. Asimismo, se refiere a una serie de oligonucleótidos que permiten llevar a cabo dicho método genético y al kit que los comprende.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de determinación del origen genético de cérvidos

Campo de la invención 5

La presente invención pertenece al campo de la identificación genética de distintos cérvidos, en particular se refiere a un método genético para determinar el origen genético de dos especies de cérvidos: ciervos y gamos. Asimismo, se refiere a los oligonucleótidos necesarios para llevar a cabo dicho método genético y a un kit que comprende dichos oligonucleótidos. 10

Antecedentes de la invención

El concepto de trazabilidad genética surge, entre otros motivos, por la necesidad de conseguir una detección sensible y rápida del origen específico de la carne que se utiliza en la elaboración de alimentos humanos y animales, sobre todo 15 cuando proceden de artiodáctilos. La trazabilidad genética es un tema de primordial importancia en el control de riesgo de contraer enfermedades de tipo neurodegenerativo tanto en el hombre como en especies animales, muestra de ello es que en los países desarrollados desde 1997 se prohíbe el uso de proteínas derivadas de rumiantes en la manufactura de alimentos para rumiantes. Además, la determinación del origen de la especie de carne es una parte integral del reglamento de control de los alimentos con respecto a la falsedad del valor económico de la misma. Por 20 ejemplo, la carne de caza es a menudo objeto de etiquetado fraudulento, debido a los diferentes precios entre dicha carne de caza y otras especies de carne. Aparte de la posible pérdida económica, la correcta identificación de las especies cárnicas es importante para el consumidor por otras razones, tales como los requisitos médicos de las personas que pueden tener alergias alimentarias específicas o restricciones dietéticas religiosas. Para detectar estos fraudes y proteger a los consumidores, se han desarrollado herramientas fiables y sencillas que facilitan el control 25 rutinario de toda la cadena alimentaria.

Los métodos convencionales utilizados en la identificación de especies, por ejemplo en productos cárnicos, han estado predominantemente basados en el análisis de proteínas mediante ensayos cromatográficos, electroforéticos o inmunoquímicos. Sin embargo, la mayoría de las proteínas sufren desnaturalización en productos calentados, 30 resultando en cambios en la antigenicidad y movilidad electroforética de las moléculas, lo que puede afectar a los resultados de los análisis. Existen también métodos para la identificación de la carne basados en el análisis del ADN. En comparación con las técnicas basadas en proteínas, se ha demostrado que los métodos basados en el ADN son más fiables porque el ADN es más estable bajo las condiciones asociadas con altas temperaturas, presiones, y tratamientos químicos utilizados en la preparación de algunos productos alimenticios. En particular, la introducción de la Reacción en 35 Cadena de la Polimerasa (PCR) en el análisis de alimentos ha proporcionado una amplia gama de técnicas para la detección e identificación rápida de organismos. Entre dichas técnicas, las más frecuentemente utilizadas son: (i) amplificación por PCR con cebadores específicos de especie, que puede selectivamente detectar secuencias de ADN a partir de una mezcla de alimentos; y (ii) amplificación por PCR de un fragmento de uno o varios genes marcadores con cebadores universales, junto con técnicas como la secuenciación de nucleótidos o el polimorfismo de longitud de 40 fragmentos de restricción (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism). Una reciente variante de esta última técnica (ii) es aquella en la que se amplifica por PCR un fragmento de ADN satélite (stADN), que posteriormente se digiere con endonucleasas de restricción y los fragmentos obtenidos se resuelven mediante electroforesis. En el contexto de la presente invención, esta técnica se refiere como SFLP, por Satellite (Restriction) Fragment Length Polymorphism. 45

El ADN satélite está organizado en familias de genes (múltiples secuencias de ácido nucléico repetidas y de composición de nucleótidos similares) y está localizado principalmente en muchos de los centrómeros cromosómicos. Concretamente, en muchos artiodáctilos y específicamente en los cérvidos, el ADN satélite de tipo I (stADN I) está distribuido por todos sus autosomas y se caracteriza por estar compuesto de miles de copias de variabilidad genética 50 aún poco conocida pero supuestamente abundante en perfiles genéticos específicos de especie. En la actualidad se considera que las técnicas de secuenciación y/o de clonación son más difíciles y/o tediosas cuando el gen objetivo consiste en familias de genes de copias múltiples muy similares en secuencia de nucleótidos, como es el caso de los genes del ADN satélite de los eucariotas. Sin embargo, la utilización de stADN presenta ventajas respecto a la utilización de genes heredados monoparentalmente, como son los genes mitocondriales, y los genes ligados al 55 cromosoma Y. En los casos en que se producen especímenes híbridos entre especies o subespecies, lo cual no es poco común, se invalida cualquier test basado en genes heredados monoparentalmente. Además, los genes mitocondriales tienen en su contra las fuertes divergencias intra-específicas de sus secuencias.

La creciente tendencia hacia la reducción del contenido de grasa en la dieta ha aumentado el interés en el consumo de 60 carnes de caza. Particularmente, el venado es cada vez más y más popular en los mercados europeos, siendo el ciervo (Cervus elaphus) y gamo (Dama dama), las dos principales especies que exigen los consumidores. Sin embargo, hasta el momento, los métodos utilizados para identificar estas especies se basan en el análisis de fragmentos conservados de los genes mitocondriales 12S rADN con los inconvenientes anteriormente mencionados que ello conlleva. Por lo tanto, sigue existiendo en el estado de la técnica la necesidad de disponer de un método genético para discriminar dos 65 especies de cérvidos estrechamente relacionadas, especialmente si son producto de mezclas inter-específicos. A este

respecto, los autores de la presente invención describen un método genético que permite discriminar categóricamente dos especies de cérvidos estrechamente relacionadas, incluidos los productos de mezclas inter-específicas, de manera fiable, sencilla y económica.

Objeto de la invención 5

La presente invención se refiere en un primer aspecto a un oligonucleótido (también referido como cebador) que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 o la secuencia SEQ ID NO 2.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una pareja de cebadores donde un oligonucleótido 10 comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2.

La presente invención se refiere en un tercer aspecto al uso de una pareja de cebadores donde uno comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2, para determinar el origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama. 15

La presente invención se refiere en un cuarto aspecto a un método para determinar el origen genético de un cérvido que comprende las siguientes etapas:

a) Amplificación por PCR de un segmento de ADN satélite de tipo I a partir de ADN genómico de una muestra de cérvido con una pareja de cebadores donde un oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro 20 comprende la secuencia SEQ ID NO 2,

b) Digestión enzimática del producto obtenido en la etapa a) con un enzima de restricción seleccionado del grupo formado por AluI, XspI y sus isoesquizómeros, y

c) Análisis del tamaño de los fragmentos resultantes de la digestión realizada en la etapa b).

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En un último y quinto aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende una pareja de cebadores donde un oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro la secuencia SEQ ID NO 2, marcados con un fluoróforo (uno de los oligonucleótidos o ambos simultáneamente) o sin marcar, para determinar el origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1. Fotografía de un gel de agarosa obtenido tras la separación de fragmentos AluI por electroforesis submarina en agarosa al 2% y teñido con bromuro de etidio. En los carriles se muestran, de izquierda a derecha: marcador de peso molecular de fragmentos espaciados a 50bp (MW), fragmento del producto de PCR sin digerir (PCR sin digerir), 35 producto de PCR obtenido a partir de ADN genómico de ciervo digerido con AluI (Ciervo/AluI) y producto de PCR obtenido a partir de stADN de gamo digerido con AluI (Gamo/AluI). Las flechas señalan las bandas de aproximadamente 170 y 100 bp de ciervo y las bandas de aproximadamente 200 y 70 bp de gamo.

Figura 2. Espectroferograma que muestra los fragmentos identificados mediante electroforesis capilar de muestras de 40 gamo (panel superior, fragmento discriminante de 202 bp) y ciervo (panel inferior, fragmento discriminante de 170 bp) tras digestión con AluI. La PCR se realizó con los cebadores A2 (SEQ ID NO 1) y 6-FAMTM-C12Lv.2 (SEQ ID NO 2 marcada con 6-FAMTM en el extremo 5´).

Figura 3. Fotografía de un gel de agarosa obtenido tras la separación de fragmentos XspI por electroforesis submarina 45 en agarosa al 2% y teñido con bromuro de etidio. En los carriles se muestran, de izquierda a derecha: marcador de peso molecular de fragmentos espaciados a 50 bp (MW), fragmento del producto de PCR sin digerir (PCR sin digerir), producto de PCR obtenido a partir de ADN genómico de gamo digerido con XspI (Gamo/XspI) y producto de PCR obtenido a partir de stADN de ciervo digerido con XspI (Ciervo/XspI). La llave en el carril Ciervo/XspI señala las dos bandas muy juntas de unos 130 y 145 bp aproximadamente. 50

Figura 4. Espectroferograma que muestra los fragmentos identificados mediante electroforesis capilar de muestras de gamo (panel superior, ausencia del fragmento discriminante de 277 bp) y ciervo (panel inferior, fragmento discriminante de 277 bp) tras digestión con XspI. La PCR se realizó con los cebadores A2 (SEQ ID NO 1) y 6-FAMTM-C12Lv.2 (SEQ ID NO 2 marcada con 6-FAMTM en el extremo 5´). 55

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere en un primer aspecto a un oligonucleótido (en adelante oligonucleótido de la invención) que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 o la secuencia SEQ ID NO 2. En una realización particular, la secuencia de 60 dicho oligonucleótido es SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2. En una realización particular, el oligonucleótido de la invención comprende la secuencia SEQ ID NO 1 o la secuencia SEQ ID NO 2 y está marcado con un fluoróforo. En otra realización particular, el oligonucleótido de la invención tiene la secuencia SEQ ID NO 1 o la secuencia SEQ ID NO 2 y está marcado con un fluoróforo. Son muchos los fluoróforos (también referidos como fluorocromos) disponibles comercialmente, siendo todos ellos utilizables para el marcaje de los oligonucleótidos que comprenden la SEQ ID NO 1 65 o la SEQ ID NO 2. Entre dichos fluoróforos se encuentran, por ejemplo: 6-FAMTM, VIC®, ROXTM, 5-FAMTM, NEDTM,

PET®, LIZ® y JOETM.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una pareja de cebadores (pareja de cebadores de la invención) donde un oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2. En una realización particular, uno de los cebadores de dicha pareja tiene la secuencia SEQ ID NO 1 y otro la 5 secuencia SEQ ID NO 2. En otra realización particular, en la pareja de cebadores hay uno marcado con un fluoróforo. En otra realización particular, ambos oligonucleótidos están marcados simultáneamente con un fluoróforo, cada uno con un fluoróforo distinto, y en otra realización particular, ninguno de los cebadores está marcado con un fluoróforo.

La presente invención se refiere en un tercer aspecto al uso del oligonucleótido de la invención o una pareja de 10 cebadores donde un oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2, para determinar el origen genéticode las especies Cervus elaphus y Dama dama. En una realización particular, en la pareja de cebadores ninguno está marcado con un fluoróforo. En otra realización particular, uno está marcado con un fluoróforo y en otra realización particular, ambos simultáneamente están marcados con un fluoróforo, cada cebador con un fluoróforo distinto. En otra realización particular, ya sea marcado uno, ambos o ninguno, la secuencia de uno de los 15 oligonucleótidos es la secuencia SEQ ID NO 1 y la secuencia del otro es la secuencia SEQ ID NO 2.

La presente invención se refiere en un cuarto aspecto a un método para determinar el origen genético de un cérvido (en adelante método de la invención) que comprende las siguientes etapas:

a) Amplificación por PCR de un segmento de ADN satélite de tipo I a partir de ADN genómico de una 20 muestra de cérvido con una pareja de cebadores donde un oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2,

b) Digestión enzimática del producto obtenido en la etapa a) con un enzima de restricción seleccionado del grupo formado por AluI, XspI y sus isoesquizómeros, y

c) Análisis del tamaño de los fragmentos resultantes de la digestión realizada en la etapa b). 25

El método de la invención se basa por tanto en la técnica SFLP en la que, como se ha mencionado anteriormente, se amplifica por PCR un fragmento de ADN satélite a partir del ADN genómico del cérvido a analizar, se digiere dicho producto de PCR con un enzima de restricción y posteriormente se analiza el tamaño de los fragmentos obtenidos en dicha digestión enzimática. 30

En el contexto de la presente invención el cérvido se refiere a uno o más cérvidos seleccionados del grupo formado por todos los miembros de la especie Cervus elaphus (también referidos como ciervos), incluyendo todas sus subespecies, como por ejemplo C. e. hispanicus, C. e, elaphus, C.e. hippelaphus, C. e. atlanticus, C.e. canadensis, etc., y todos los miembros de la especie Dama dama (también referidos como gamos), incluyendo todas sus subespecies, como por 35 ejemplo D.dama dama y D. dama mesopotamica. Por lo tanto el método de la invención, permite discriminar, mediante la determinación del origen genético de un cérvido, si la muestra de la que se obtiene el ADN genómico que sirve de molde para llevar a cabo la etapa a) del método de la invención es un ciervo, un gamo o una mezcla de ambos. Así, en una realización particular del método de la invención, se lleva a cabo la discriminación entre un cérvido de la especie C. elaphus y un cérvido de la especie D. dama. 40

El ADN genómico utilizado como molde para la PCR de la etapa a) se obtiene de cualquier tejido de un cérvido cuyo origen genético se quiere determinar, como por ejemplo: músculo esquelético, órganos, piel, sangre, hueso, virutas de astas o pelo. El ADN genómico se obtiene por los procedimientos habituales en biología molecular ampliamente conocidos por el experto en la materia, incluyendo los kit comerciales de aislamiento de ADN, como por ejemplo el 45 UltraCleanTM Tissue & Cells DNA isolation Kit de MoBio Laboratories, Inc.. Así, el método de la presente invención sirve como prueba del origen genético tanto de muestras de carne no mezcladas, como mezcladas e incluso de muestras obtenidas de fósiles, lo que permite una amplia variedad de aplicaciones, desde el control del origen de productos cárnicos hasta estudios paleontológicos. Un claro ejemplo de esta última aplicación del método de la invención, es que al discriminar entre gamo y ciervos contribuye a dirimir de forma definitiva la disputa sobre el extinto ciervo “megalocero” 50 que aunque las pruebas de ADN mitocondrial lo asocian a los gamos aún se discute si podría ser realmente un ciervo gigante (Lister A.M. et al., The phylogenetic position of the ‘giant deer’ Megaloceros giganteus, 2005; Nature 438, 850-853).

En una realización particular del método de la invención, en la pareja de cebadores utilizada en la etapa a) un cebador 55 está marcado con un fluoróforo o ambos cebadores simultáneamente están marcados con fluoróforos distintos. En otra realización particular, ninguno de los cebadores está marcado con un fluoróforo. Esta versatilidad en cuanto a la presencia o no de marcaje fluorescente permite adaptar el método de la invención a laboratorios que dispongan o no de un analizador genético, como por ejemplo un analizador genético del tipo ABI PRISM® 3130 o equivalente.

60

En una realización particular, la PCR de la etapa a) se realiza con un cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 marcado con un fluoróforo y un cebador que comprende la SEQ ID NO 2 sin marcar. En otra realización particular, el cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO 2 está marcado con un fluoróforo y el cebador que comprende la SEQ ID NO 1 sin marcar. En otra realización particular ambos cebadores están marcados, cada uno con un fluoróforo distinto. En otra realización particular, uno de los oligonucleótidos tiene la secuencia SEQ ID NO 1 y otro la secuencia 65 SEQ ID NO 2, ya sean marcados con un fluoróforo, uno o ambos simultáneamente, o sin marcar. Son muchos los

fluoróforos disponibles comercialmente, siendo todos ellos utilizables para el marcaje de los oligonucleótidos que comprenden la SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2. Entre dichos fluoróforos se encuentran, por ejemplo: 6-FAMTM, VIC®, ROXTM, 5-FAMTM, NEDTM, PET®, LIZ® y JOETM. En una realización particular, la PCR de la etapa a) se lleva a cabo utilizando un cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 sin marcar y un cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO 2 marcado con el fluoróforo 6-FAMTM. En otra realización particular, la PCR de la etapa a) se lleva a cabo 5 utilizando un cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 marcado con el fluoróforo 6-FAMTM y un cebador que comprende la secuencia SEQ ID NO 2 sin marcar. En otra realización particular, ambos cebadores, el que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y el que comprende la secuencia SEQ ID NO 2 están marcados, cada uno con un fluoróforo distinto. En una realización particular, la PCR de la etapa a) se lleva a cabo con un cebador cuya secuencia es SEQ ID NO 1 sin marcar y un cebador cuya secuencia es SEQ ID NO 2 marcado con el fluoróforo 6-FAMTM. En otra realización 10 particular, la PCR de la etapa a) se lleva a cabo utilizando un cebador cuya secuencia es SEQ ID NO 1 marcado con el fluoróforo 6-FAMTM y un cebador cuya secuencia es SEQ ID NO 2 sin marcar.

Sorprendentemente, mediante el método de la presente invención todas las muestras de ADN genómico, independientemente del cérvido que provengan, es decir, ya sean de ciervo o de gamo, así como de sus distintas 15 subespecies, producen un amplicón de PCR del mismo tamaño cuando la PCR de la etapa a) se lleva a cabo con la pareja de cebadores de la invención, ya estén marcados con un fluoróforo o sin marcar. El producto de PCR obtenido para cada subespecie de ciervo o gamo tiene una longitud invariable en todas las realizaciones particulares y, también, en ambas especies de cérvido, sin embargo presenta polimorfismos de secuencia fijados para cada especie. A este respecto, destacar que los oligonucleótidos de la invención (SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2) fueron diseñados a partir de 20 dos secuencias distintas de ADN satélite, una proveniente de Cervus elaphus hispanicus y otra proveniente de Cervus elaphus atlanticus y aún así son capaces de amplificar por PCR un fragmento del mismo tamaño independientemente de que el ADN genómico utilizado como molde en dicha PCR provenga de un cérvido C.elaphus o D. dama.

En las etapas b) y c) del método de la invención, se procede a la determinación del origen genético de las muestras 25 mediante mapeo de los polimorfismos específicos de especie contenidos en el stADN de tipo I de los distintos cérvidos. En una realización particular de la etapa b) del método de la invención, la digestión enzimática se realiza con el enzima de restricción XspI (C/TAG). En otra realización particular, el enzima de restricción es AluI (AG/CT). Mediante digestión con AluI o con XspI, se detectan simultáneamente los perfiles genéticos característicos de ciervo y de gamo, y especialmente con AluI cuando el ADN genómico proviene de una muestra en la que hay mezclas de muestras de 30 ambas especies, no necesitándose ensayos confirmatorios adicionales, lo que hace del método de la invención un método de identificación rápido y económico.

En una realización particular del método de la invención, en la etapa b) además de digerir con XspI, AluI o sus isoesquizómeros, se digiere el producto de la PCR de la etapa a), en una digestión aparte, con un enzima de restricción 35 seleccionado del grupo formado por EcoRII (CC/wGG), HaeIII (GG/CC) y cualquiera de sus isoesquizómeros. Los enzimas EcoRII, HaeIII y sus isoesquizómeros no son discriminantes ya que el perfil de bandas tras la digestión siempre resulta no polimórfico en cualquiera de las especies Cervus elaphus y Dama dama, pero sirven como control de que el producto de PCR obtenido con la pareja de cebadores en la que uno comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro comprende la secuencia SEQ ID NO 2 es el deseado y no otro, por ejemplo el obtenido de un origen genético distinto a 40 C. elaphus o D. dama.

El producto de PCR y los fragmentos obtenidos al digerir dicho producto de PCR con enzimas de restricción se pueden resolver mediante electroforesis en gel de agarosa o mediante electroforesis capilar. La electroforesis capilar requiere que la PCR para amplificar el stADN se lleve a cabo con al menos un cebador marcado con un fluoróforo, mientras que 45 la electroforesis en gel de agarosa se puede realizar cuando la PCR se lleva a cabo con oligonucleótidos marcados con un fluoróforo (uno o ambos simultáneamente con fluoróforos distintos) o sin marcar.

En una realización particular del método de la invención, la PCR se lleva a cabo con cebadores sin marcar o con uno o ambos marcados, y el tamaño tanto del producto de PCR como de los fragmentos obtenidos tras la digestión del mismo 50 con enzimas de restricción se estima mediante electroforesis en gel de agarosa. En una realización particular, la electroforesis se lleva a cabo en un gel de agarosa al 1,8%-2% en peso de agarosa, en cuyo caso, el tamaño estimado del producto de PCR es de aproximadamente 420 bp. En otra realización particular, la digestión del producto de PCR se lleva a cabo con el enzima AluI y los fragmentos obtenidos se resuelven mediante electroforesis en gel de agarosa. En otra realización particular, la digestión del producto de PCR se lleva a cabo con el enzima XspI y el análisis de los 55 fragmentos obtenidos mediante electroforesis en gel de agarosa.

En una realización particular del método de la invención, la PCR se lleva a cabo con al menos un cebador marcado con un fluoróforo, y el producto de PCR obtenido en la etapa a) y los fragmentos resultantes de la digestión enzimática de la etapa b), se resuelven mediante electroforesis capilar en equipos de secuenciación, como por ejemplo del tipo ABI 60 PRISM® 3130 o equivalentes. De esta manera, el producto de PCR obtenido en la etapa a) se lee a un tamaño de 414 bp. En otra realización particular el producto de PCR se digiere con el enzima AluI y se resuelven los fragmentos obtenidos mediante electroforesis capilar. En otra realización particular el producto de PCR se digiere con el enzima XspI y se resuelven los fragmentos obtenidos mediante electroforesis capilar. Destacar que con la electroforesis capilar se permite determinar de forma sistemática, automática y precisa la ausencia de posibles pequeñas diferencias (hasta 65 de un único par de bases) en la longitud tanto de los productos de PCR como de los productos de la digestión con

endonucleasas de restricción.

La digestión del producto de PCR con los enzimas de restricción XspI, AluI, EcoRII y HaeIII resulta en los siguientes fragmentos (Tabla 1), subrayados aparecen los fragmentos discriminantes entre ciervos y gamos.

5

Tabla 1: Fragmentos resultantes de la digestión con AluI, XspI, EcoRII y HaeIII.

CIERVO

EcoRII AluI HaeIII XspI

Agarosa (tamaño estimado aproximado)

420, 215, 210 420, 370, 280, 250, 170, 150, 100 410, 340, 305, 290,115,70,45 420, 295, 130/145#

Electroforesis Capilar

414, 213 414, 272, 170 307 414, 277 ,131

GAMO

EcoRII AluI HaeIII XspI

Agarosa (tamaño estimado aproximado)

420, 215, 210 420, 370, 280, 250, 200, 150, 70 410, 340, 305, 290, 115, 70, 45 420, 295, 130

Electroforesis Capilar

414, 213 414, 272, 202 307 414, 131

#: Bandas muy juntas en el gel de agarosa.

La digestión con AluI genera, en el caso de los ciervos, un fragmento discriminante de 170 bp mediante electroforesis 10 capilar (Fig. 2, espectroferograma inferior) y dos fragmentos discriminantes de 170 bp y 100 bp mediante electroforesis en geles de agarosa (Fig. 1). En el caso de los gamos, la digestión con AluI genera un fragmento discriminante de 202 bp mediante electroforesis capilar (Fig. 2, espectroferograma superior) y dos fragmentos discriminantes de 200 bp y 70 bp mediante electroforesis en gel de agarosa (Fig. 1). La digestión con XspI genera, en el caso de los ciervos, un fragmento discriminante de 277 bp mediante electroforesis capilar (Fig. 4, espectroferograma inferior) y dos fragmentos 15 discriminantes de 130 y 145 bp (bandas muy juntas en el gel de agarosa, marcadas con una llave en la Fig. 3) mediante electroforesis en gel de agarosa. En el caso de los gamos, la digestión con XspI no genera el fragmento discriminante de 277 bp, generado para el ciervo, mediante electroforesis capilar (Fig. 4, espectroferograma superior). El análisis por electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos obtenidos mediante digestión con XspI en gamo genera una banda de 130 bp en lugar de dos bandas juntas de 130 bp y 145 bp como ocurre en el ciervo (Fig. 3). Los valores del tamaño 20 estimado de los fragmentos de ADN obtenidos mediante electroforesis en gel de agarosa convencionales son aproximados (Fig. 1 y 3).

Dado que el stADN I contiene múltiples copias independientes con variabilidad molecular parcialmente conocida hacen de la secuenciación y/o la clonación metodologías difíciles y/o tediosas. Sorprendentemente, el método de la presente 25 invención no requiere difíciles clonaciones y secuenciaciones, proporcionando así un método sencillo de discriminación entre ciervos y gamos utilizando ADN satélite. Además, al ser el stADN I multicopia y biparentalmente heredado los resultados obtenidos utilizando stADN son más fiables que los obtenidos al utilizar marcadores genéticos específicos de especie derivados de ADN monoparental, como el ADN mitocondrial y el cromosoma Y.

Por último, la presente invención se refiere en otro aspecto a un kit que comprende una pareja de cebadores donde un 30 oligonucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y otro oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO 2, para determinar el origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama. En una realización particular, en la pareja de cebadores del kit un oligonucleótido está marcado con un fluoróforo o ambos oligonucleótidos simultáneamente están marcados con fluoróforos (un fluoróforo distinto cada uno). En una realización particular, en el kit ninguno de los oligonucleótido está marcado con un fluoróforo. En una realización particular, el kit comprende un 35 oligonucleótido cuya secuencia es SEQ ID NO 1 y otro oligonucleótido cuya secuencia es SEQ ID NO 2, ya sean sin marcar, marcados simultáneamente con fluorocromos distintos o marcado únicamente uno de los cebadores.

Ejemplos

40

A continuación se detallan unos ejemplos concretos de realización de la invención que sirven para ilustrar la invención.

EJEMPLO 1. Discriminación genética entre ciervo y gamo mediante electroforesis en gel de agarosa

Aislamiento del ADN 45

El ADN genómico se obtuvo de músculo esquelético de C. elaphus atlanticus y de virutas de asta de D. dama dama utilizando el kit comercial UltraCleanTM Tissue & Cells DNA isolation Kit de MoBio Laboratories, Inc.. La calidad del ADN aislado fue medida mediante espectrometría y electroforesis en gel de agarosa (gel al 0,8% en peso de agarosa), aunque el procedimiento es eficiente incluso con ADN degradado hasta el límite de 450 bp. 50

Oligonucleótidos para la PCR

Los oligonucleótidos cebadores utilizados fueron: A2 (SEQ ID NO 1) y C12Lv.2 (SEQ ID NO 2).

Reacción de amplificación del stADN I A2/C12Lv.2 5

Las muestras de ADN genómico purificado se sometieron a PCR utilizando los oligonucleótidos cebadores A2 y C12Lv.2. La reacción se preparó en 25 µL de volumen total que contiene de 10 a 50 ng de ADN genómico y una pre-mezcla (95% en volumen) con 0,25 µM de cebador A2, 0,25 µM de cebador C12Lv.2, 0,25 mM de MgCl2, 0,125 mM dNTPs y 0,125 U hot-start Taq polimerasa (Ecogen ®). Se pueden utilizar otras polimerasas similares, incluidas las no 10 hot-start. El protocolo de Termociclado utilizado fue: predesnaturalización a 95 ºC durante 10 minutos; 30 ciclos [94 ºC, 30 segundos; 55 ºC, 30 segundos; 72 ºC, 30 segundos]; extensión final a 72 ºC durante 7 minutos.

Producto amplificado

15

Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis convencional submarina en gel de agarosa al 1,8%-2% (teñido con 0,5 µg/ml de bromuro de etidio) en cubetas submarinas corriendo en paralelo 2 µl del producto de PCR y el marcador de pesos moleculares Step Ladder 50 pb (SIGMA-ALDRICH®). En el gel se visualizó un único producto de longitud molecular similar en ambas especies, Cervus elaphus y Dama dama, cuya longitud molecular aproximada fue estimada en 420 bp. 20

Tipado de las mutaciones específicas de especie

La digestión del producto de PCR se realizó sin dilución previa. 4-5 µL de producto de PCR se digirieron por un mínimo de tres horas o durante toda la noche a 37 ºC usando 2 UI de cada enzima de restricción en un volumen total de 25 reacción de 10 µL y siempre siguiendo rigurosamente las especificaciones del fabricante. Los enzimas de restricción utilizados fueron: HaeIII, EcoRII, AluI y XspI o sus isoesquizómeros, cada una de ellas en una digestión individual.

Los fragmentos resultantes de la digestión se separaron en geles de agarosa LM (Low Melting) al 1,8%- 2% en peso de agarosa (con 0,5 µg / ml de bromuro de etidio), en un carril paralelo se corrió el marcador de peso molecular Step 30 Ladder, 50 bp (SIGMA-ALDRICH®).

Los perfiles genéticos en geles de agarosa son invariables por encima de 250 bp del marcador de pesos moleculares (MW) y discriminantes por debajo de este valor (ver tabla 1). La digestión con AluI genera los fragmentos o bandas discriminantes de 170 bp y de 100 bp en el perfil genético de los ciervos y las bandas discriminantes de 200 bp y de 70 35 bp en el caso de gamos (Fig. 1). La digestión con XspI genera los fragmentos discriminantes de 130 bp y de 145 bp en el perfil de los ciervos y sólo la banda de 130 bp en el perfil genético de los gamos (Fig. 3).

EJEMPLO 2. Discriminación genética entre ciervo y gamo mediante electroforesis capilar

40

Aislamiento del ADN

El ADN genómico se obtuvo de piel de C. elaphus hispanicus y de virutas de asta de D. dama mesopotamica, tal y como se ha indicado en el ejemplo 1.

45

Oligonucleótidos para la PCR

Los oligonucleótidos cebadores utilizados fueron: A2 (SEQ ID NO 1) y 6-FAMTM-C12Lv.2 (SEQ ID NO 2 marcada con 6-FAMTM en el extremo 5´).

50

Reacción de amplificación del stADN I A2/6-FAMTM-C12Lv.2

Las muestras de ADN genómico purificado se sometieron a PCR utilizando los oligonucleótidos cebadores A2 y 6-FAMTM-C12Lv.2 y las condiciones descritas en el ejemplo 1.

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Producto amplificado

Los productos de PCR obtenidos con oligonucleótidos marcados se cargaron en equipos de análisis genético tipo ABI PRISM® 3130. Para ello se diluyó 1 µl de producto de PCR entre 10 y 20 veces (esto puede variarse en función de la eficiencia final obtenida en la reacción de PCR). Cantidades comprendidas entre 0,5-1 µl del producto diluido se 60 mezclaron con el estándar interno de tamaño GeneScan™ 500 LIZ™ siguiendo las instrucciones del fabricante. La lectura de longitud se realizó con el software GeneMapper® y resultó en 414 bp en todos los casos.

Tipado de las mutaciones específicas de especie

65

La digestión del producto de PCR se realizó tal y como se describe en el ejemplo 1.

Los productos marcados obtenidos de la digestión se cargan en equipos de análisis genético tipo ABI PRISM® 3130 o equivalente para realizar una electroforesis capilar. Para ello se diluyeron 1-2 µl de productos digeridos entre 5 y 10 veces (variable dependiendo del rendimiento final de la PCR). Se mezcló 1 µl del producto diluido con el estándar interno de tamaño GeneScan™ 500 LIZ™ y se cargaron en el analizador genético siguiendo las instrucciones del fabricante del equipo. La lectura de longitud se realiza con el software GeneMapper® siguiendo las instrucciones del 5 fabricante.

En el espectroferograma que resultó de la electroforesis capilar del producto de PCR procedente de muestras de ciervo y digerido con AluI se leyó un pico específico en 170 bp (Fig. 2, espectroferograma inferior). Sin embargo, en el espectroferograma que resultó de la electroforesis capilar del producto de PCR procedente de muestras de gamo y 10 digerido con AluI se leyó un pico específico en 202 bp (Fig. 2, espectroferograma superior). En el espectroferograma que resulta de la electroforesis capilar del producto de PCR de muestras de ciervo digeridos con XspI se identifican dos picos de tamaño 277 y 131 bp (Fig. 4, espectroferograma inferior) pero la primera (277 bp) estuvo ausente en el espectroferograma de la muestra de gamo (Fig. 4, espectroferograma superior).

15

Claims (12)

1. 
   
   

   REIVINDICACIONES

   1. Oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 2.
2. 2. Oligonucleótido según la reivindicación 1 cuya secuencia es la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 2.
3. 3. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, marcado con un fluorocromo. 5
4. 4. Pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido de secuencia SEQ ID NO 1 y otro de secuencia SEQ ID NO 2 de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. Uso del oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de la pareja de cebadores según la reivindicación 4 para determinar del origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama.
6. 6. Método para determinar el origen genético de un cérvido que comprende las siguientes etapas: 10

   a) Amplificación por PCR de un segmento de ADN satélite de tipo I a partir de ADN genómico de una muestra de cérvido con una pareja de cebadores según la reivindicación 4,

   b) Digestión enzimática del producto obtenido en la etapa a) con un enzima de restricción seleccionado del grupo formado por AluI, XspI y sus isoesquizómeros, y

   c) Análisis del tamaño de los fragmentos resultantes de la etapa b). 15
7. 7. Método según la reivindicación 6 donde el cérvido se selecciona del grupo formado por todos los miembro de la especie Cervus elaphus y todos los miembros de la especie Dama dama.
8. 8. Método según la reivindicación 6 ó 7 en el que la etapa b) se lleva a cabo con el enzima de restricción AluI.
9. 9. Método según la reivindicación 6 ó 7 en el que la etapa b) se lleva a cabo con el enzima de restricción 20 XspI.
10. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 en el que la etapa c) se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa.
11. 11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 en el que la etapa c) se lleva a cabo mediante electroforesis capilar. 25
12. 12. Kit que comprende una pareja de cebadores según la reivindicación 4, para determinar el origen genético de las especies Cervus elaphus y Dama dama.