WO2016182402A1 - 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법 - Google Patents

복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법 Download PDF

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문해란
김종수
김은영
신주연
김인애
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Definitions

  • the present invention relates to a method for simultaneous analysis of a plurality of targets using a plurality of metal nanotags, and more particularly, by fusing nanoparticle technology based on an antigenic antibody response, which is a conventional biological immune response,
  • the present invention relates to a method of simultaneously analyzing a plurality of targets using a plurality of metal nanotags having improved diagnostic effect by simultaneously diagnosing a plurality of target materials using a plurality of metal nanotags.
  • HBV Hepatitis B virus
  • HCV Hepatitis C virus
  • HIV Human immunodeficiency virus
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • nucleic acid test Nucleic acid test, NAT
  • Nucleic acid test is a diagnostic method that can detect the presence of the virus with improved sensitivity than the enzyme immunoassay by using oligo primer having a nucleotide sequence specificity for the viral nucleic acid.
  • the nucleic acid test method is expected to be appropriately used for the detection of pathogenic viruses transmitted through blood in the blood business such as blood transfusion or biopharmaceutical business, but due to the cost of introduction and utilization of the test method, It is difficult to use it as a routine test for specimens.
  • Another method of detecting multiple viruses at the same time is multiplex NAT.
  • the multinucleic acid test method has an effect of reducing test time and effort at the time of introduction, if the optimization of the reaction conditions is not guaranteed, the sensitivity may be lowered, there may be false positives or false negatives, It is still difficult to use as an inspection method in terms of inspection cost.
  • a technique currently used mainly in clinical diagnosis for detecting viruses is an ELISA assay based on an antigen-antibody response.
  • the ELISA method is common in that the operation of the measuring machine is simple and the sample can be processed quickly, there are limited types of chromosomes or phosphors available, difficulty in tagging, and In the case of reactivity and fluorescence, various measurement constraints such as photobleaching and quenching are scattered. This is especially true for applications requiring quantitative measurements.
  • a metal nano tag is used in place of a phosphor or other coloring compound, and a method of accurately detecting even a small amount of virus by measuring the mass of the metal is known.
  • the conventional method using the metal nano tag has a problem that it is difficult to detect a plurality of targets at the same time because it includes only one metal.
  • An object of the present invention is to provide a new analysis method capable of simultaneously analyzing a plurality of targets by including a plurality of antibodies in order to solve the above problems of the prior art.
  • the present invention to solve the above problems
  • the target molecule to be analyzed may be a biomolecule.
  • the biomolecule is a substance that is discharged or separated in the living body, and may include not only a material generated in the living body but also a material that is put into the living body and remains for a certain time.
  • biomolecules can include antibiotics, nucleic acids, hormones, enzymes, cells, tumors, cancer cells, bacteria, viruses, and secretions thereof.
  • antibiotics include salinomycin, enlofloxacin, ciprofloxacin, penicillin, cephalosporin, carbapenem, ampicillin, cephalosporin, neomycin, gentamicin, isepamycin, sisomycin, erythromycin, clarithromycin , Vancomycin, tycoplanin, lincomycin, sulfatiazole, tetracycline, oxytetracycline, sulfamerazine, and the like.
  • cell secretion include prostate specific antigens that are proteins synthesized in prostate cells. . However, it is not limited thereto.
  • the analysis platform to which the first antibody is bound is characterized in that it comprises a plurality of kinds of antibodies.
  • the assay platform to which the first antibody is bound is a silica nanoparticle comprising a core comprising a metal and silica coating the core surface, Or it is possible that it is a plate to which the 1st type of 1st antibody was bound.
  • the assay platform to which the first antibody is bound is a silica nanoparticle comprising a core containing a metal and silica coating the surface of the core
  • FIG. 1 shows a case where the analysis platform to which the first antibody is bound is a plate to which a plurality of types of first antibodies are bound.
  • each of the silica nanoparticles comprises one type of metal, the analysis platform to which the antibody is bound silica nanoparticles of different types of metals It characterized in that it comprises two or more kinds.
  • Simultaneous analysis of a target using a plurality of metal nano tags according to the present invention by attaching and analyzing a first antibody of different types to a plurality of silica nanoparticles of different kinds of metals included according to the type of the first antibody
  • the type of target may be diversified, and by changing the type of metal contained in the silica nanoparticles, two types of metals may be simultaneously analyzed during quantitative analysis using an inductively coupled plasma mass spectrometer.
  • the metal contained in the silica nanoparticles are Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, It is characterized in that it is selected from the group consisting of Tm, Yb, Lu, Sc, Y and Ti.
  • the assay platform to which the first antibody is bound silica nanoparticles containing Au, silica nanoparticles containing Gd, silica containing Y It characterized in that it comprises two or more silica nanoparticles selected from the group consisting of nanoparticles and silica nanoparticles comprising Eu.
  • the analysis platform to which the first antibody is bound can select an appropriate metal according to the target to be analyzed, and specifically, the target to be analyzed is
  • the target to be analyzed is In the case of HBV in the blood, it is preferable to use silica nanoparticles containing Au, silica nanoparticles containing Gd for HIV, and silica nanoparticles containing Eu for HCV. Two or more such silica nanoparticles are used. It is possible to use at the same time.
  • the assay platform to which the first antibody is bound is a plate to which a plurality of types of first antibodies are bound, and that a plurality of types of first antibodies are bound. Except for this, it is possible to use the conventional ELISA method as it is.
  • the second antibody when the plate to which the plurality of first antibodies are bound is used as an analysis platform, the second antibody includes a core containing a metal and / or the core. It is characterized in that bonded to the silica nanoparticles including the silica coating the surface.
  • the core of the silica nanoparticles to which the second antibody is bound is Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, It is characterized in that it comprises at least two metals selected from the group consisting of Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y and Ti.
  • the core of the silica nanoparticles to which the second antibody is bound is characterized in that it contains Au.
  • the first antibody is characterized in that the monoclonal antibody.
  • the said 1st antibody and the 2nd antibody can use the same thing.
  • a said 1st antibody is a monoclonal antibody
  • a 2nd antibody is a polyclonal antibody
  • (iv-2) analyzing the target material to which the collected second antibody is bound with a spectrometer; Characterized in that it comprises a.
  • the target of the second antibody is bound to the magnetic properties of the magnetic nanoparticles included in the silica nanoparticles connected to the second antibody by applying external magnetic force.
  • the target metal is separated and the target metal is analyzed by quantitative analysis of the tagged metal bound to the separated second antibody.
  • Target material analysis method using metal nano tag is a blood management business that handles a large amount of blood samples by fusing nanotechnology to the existing biological immune response, blood preparation and virus verification diagnosis, other biopharmaceutical business Even a small amount of virus can be detected accurately without burden.
  • FIGS. 1 and 2 are schematic diagrams showing a method for simultaneously analyzing targets using a plurality of metal nano tags according to the present invention.
  • 3 and 4 show the results of analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry in blood according to one embodiment of the present invention.
  • the assay platform to which the first antibody is bound may include a plurality of types of antibodies.
  • the assay platform to which the first antibody is bound comprises silica nanoparticles comprising a core comprising a metal and silica coating the core surface.
  • the silica nanoparticles may include one kind of metal, and the assay platform to which the antibody is bound may include two or more kinds of silica nanoparticles having different kinds of metals.
  • the assay platform to which the first antibody is bound is at least two selected from the group consisting of silica nanoparticles including Au, silica nanoparticles including Gd, silica nanoparticles including Y and silica nanoparticles including Eu. It may include a plurality of silica nanoparticles.
  • the second antibody may be bound to silica nanoparticles including a core including a magnetic metal and silica coating the surface of the core.
  • the assay platform to which the first antibody is bound may be a plate to which a plurality of types of first antibodies are bound.
  • the second antibody may be bound to silica nanoparticles including a core including a metal and silica coating the surface of the core.
  • the core of the silica nanoparticles bound to the second antibody is Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Two or more metals selected from the group consisting of Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y and Ti.
  • the core of the silica nanoparticles bound to the second antibody may include Au.
  • the first antibody and the second antibody may be the same.
  • the first antibody may be a monoclonal antibody
  • the second antibody may be a polyclonal antibody
  • (iv-2) analyzing the target material to which the collected second antibody is bound with a spectrometer may include.
  • (iv-2) analyzing only the substance to which the second antibody bound to the first antibody of the plate is bound with a spectrometer; It may include.
  • (Iv-2) In the analyzing the material bound to the second antibody contained in the collected complex with a spectrometer may be an analysis using an inductively coupled plasma mass spectrometer or graphite furnace atomic absorption spectrometer.
  • silica nanoparticles to which HBsAg was attached as a 2nd antibody and containing Au particle were manufactured and prepared using the Gold nanoparticle conjugation kit.
  • the blood sample was flowed onto the plate to induce a reaction with the first antibody and the target in the blood sample, followed by washing to remove unreacted impurities.
  • the HBsAg was attached thereto and reacted with a second antibody including Au particles.
  • Example 2 First When using silica nanoparticles as an assay platform containing antibodies
  • a gadolinium-doped silica nanoparticle, a yttrium-doped silica nanoparticle, and a flow path-doped silica nanoparticle were synthesized using an analysis platform including a first antibody, respectively.
  • Human anti-p24 monoclonal antibodies were attached to each of the synthesized silica nanoparticles as a first antibody and mixed to prepare a silica nanoparticle analysis platform.
  • Iron nanoparticles were prepared as magnetic nanoparticles, and human anti-p24 monoclonal antibody was attached thereto as a second antibody.
  • the silica nanoparticles mixed with the gadolinium-doped silica nanoparticles, the yttrium-doped silica nanoparticles, and the channel article-doped silica nanoparticles were reacted with a sample including a target material. After removing the unreacted material, the conjugate bound to the second antibody was separated and recovered by reaction with nitric acid and calibrated by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS), and the results are shown in FIG. 4.
  • ICP-MS inductively coupled plasma mass spectrometry
  • FIG. 4 it can be seen that a plurality of targets can be quantitatively analyzed using a method of simultaneously analyzing targets using a plurality of metal nano tags according to the present invention.

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Abstract

본 발명은 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존의 생물학적 면역 반응인 항원항체 반응을 기반으로 나노 입자 기술을 융합하여, 복수개의 항원항체 반응과 복수개의 금속 나노 태그를 이용하여, 복수개의 타겟 물질을 동시 진단함으로써 진단 효과를 향상시킨 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 금속나노태그를 이용한 타겟물질 분석방법은 기존의 생물학적 면역반응에 나노기술을 융합하여 다량의 혈액시료를 취급하는 혈액관리 사업이나 혈액제제 및 바이러스 검증 진단, 기타 생물의약품사업에서 검사비용의 부담 없이 정확하게 미량의 바이러스까지도 검출을 가능하게 한다.

Description

복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
본 발명은 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존의 생물학적 면역 반응인 항원항체 반응을 기반으로 나노 입자 기술을 융합하여, 복수개의 항원항체 반응과 복수개의 금속 나노 태그를 이용하여, 복수개의 타겟 물질을 동시 진단함으로써 진단 효과를 향상시킨 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 관한 것이다.
혈액이나 체액을 통하여 전파되는 주요 병원성 바이러스, 예를 들면 B형 간염바이러스(Hepatitis B virus, HBV), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV) 및 인간면역결핍바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV)는 수혈용 혈액관리에서 매우 중요한 사전진단 항목이다.
현재 이들 병원체의 감염진단은 주로 혈액내에 존재하는 HBV의 표면항원 (HBsAg) 또는 HCV 및 HIV에 대한 항체를 탐지하여 바이러스 감염 여부를 가려낼 수 있는 효소면역검사법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)에 의해 수행되고 있다. 그러나, 상기 효소면역 검사법은 바이러스 감염 후 항체가 형성되기까지의 잠복기, 면역활성이 다른 바이러스의 감염, 또는 감염자의 면역비활성 상태에서는 정확도가 떨어지는 문제가 있다.
상기 효소면역 검사법의 한계를 극복하고자 지난 수년 간 개발되어온 방법이 DNA 또는 RNA로 이루어진 바이러스의 유전물질을 직접 감지해내는 핵산 검사법(Nucleic acid test, NAT)이다. 핵산검사법은 바이러스 핵산에 대한 염기서열 특이도를 가지는 올리고 프라이머를 사용함으로써, 효소면역 검사법 보다 향상된 민감도로 바이러스 존재 유무를 분석해 낼 수 있는 진단방법이다. 상기 핵산 검사법은 수혈 등의 혈액사업이나 생물의약품사업 분야에서 혈액을 통하여 전염되는 병원성 바이러스들의 탐색에 적절히 활용될 수 있을 것으로 기대되었지만 해당 검사법의 도입 및 활용을 위해 사용되는 비용의 문제로 인하여 대량의 검체를 대상으로 한 일상적인 검사법으로 활용하기에는 어려움이 있다.
그 밖에 동시에 여러 종류의 바이러스를 탐지하는 방법으로 다중핵산 검사법(multiplex NAT)이 있다. 상기 다중핵산 검사법은 도입시 검사시간과 노력을 다소 줄여주는 효과가 있지만 반응조건의 최적화가 보증되지 않으면 민감도가 저하될 수 있고, 위양성이나 위음성의 소지가 있으며, 대량의 검체를 대상으로 한 일상적인 검사법으로 활용하기에는 여전히 검사 비용 측면에서 어려움이 있다.
상기와 같이 바이러스 진단의 여러 가지 방법들에 대한 장점 및 단점에도 불구하고, 현재 바이러스를 검출하기 위해 임상진단에서 주로 사용되고 있는 기술은 항원-항체 반응을 기본으로 하는 ELISA 검사법이다. ELISA 검사법의 경우 측정 기계의 작동이 간단하고, 신속하게 시료를 처리할 수 있다는 점에서 보편화되어 있기는 하지만, 사용가능한 발색체 또는 형광체의 종류가 제한적이고, 태깅 작업의 어려움, 발색과 관련한 효소의 반응성, 형광의 경우 photo bleaching 및 quenching 등에 의한 여러 가지 측정의 제약요건들이 산재해 있다. 특히 정량적 측정을 요하는 응용분야에 있어서는 더욱 그러하다.
따라서, 다양한 matrix에서 다양한 종류의 단백질 등의 타겟 물질을 정량할 수 있을 뿐만 아니라 정확한 측정 및 정량을 가능하게 하는 새로운 기술에 대한 필요성이 대두되고 있다.
이를 위해 종래 ELISA 검사법에서 형광체나 기타 발색 화합물 대신에 금속 나노태그를 이용하고, 상기 금속의 질량을 측정함으로써 정확하게 미량의 바이러스까지도 검출하는 방법이 알려져 있다.
그러나, 종래 금속 나노 태그를 이용하는 방법의 경우 한가지 금속 만을 포함하기 때문에 복수개의 타겟을 동시에 검출하기는 어렵다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 복수개의 항체를 포함함으로써 복수개의 타겟을 동시 분석하는 것이 가능한 새로운 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여
(i) 타겟과 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼을 제조하는 단계;
(ii) 상기 제 1 항체를 포함하는 분석 플랫폼과 복수개의 타겟을 포함하는 시료와 반응시켜서 타겟 물질이 결합된 분석 플랫폼을 형성하는 단계;
(iii) 타겟과 특이적으로 결합하는 제 2 항체와 상기 제 1 항체와 타겟이 결합된 분석 플랫폼을 반응시키는 단계; 및
(iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계; 를 포함하는 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 분석되는 타겟 분자는 생체 분자일 수 있다. 생체 분자는 생체 내에서 배출되거나 분리되는 물질로서, 생체에서 생성되는 물질뿐만 아니라, 생체에 투입되어 일정 시간 잔류하는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생체 분자는 항생제, 핵산, 호르몬, 효소, 세포, 종양, 암세포, 세균, 바이러스 및 이들의 분비물 등을 포함할 수 있다. 항생제의 예로는 살리노마이신, 엔로플록사신, 시프로플록사신, 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴, 암피실린, 세팔로스포린, 네오마이신, 겐타마이신, 이세파마이신, 시소마이신, 에리트로마이신, 클래리스로마이신, 반코마이신, 타이코플라닌, 린코마이신, 술파티아졸, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 설파메라진 등을 들 수 있으며, 세포 분비물의 예로는 전립선 세포에서 합성되는 단백질인 전립선 특이 항원 등을 들 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 복수개의 종류의 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 금속을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자이거나, 또는 복수 종류의 제 1 항체가 결합된 플레이트 인 것이 가능하다. 본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼이 금속을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자인 경우를 도 1에 나타내고, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼이 복수 종류의 제 1 항체가 결합된 플레이트인 경우를 도 2에 나타내었다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 각각의 실리카 나노 입자는 1 종류의 금속을 포함하고, 상기 항체가 결합된 분석 플랫폼은 금속의 종류가 다른 실리카 나노 입자를 2 종류 이상 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법은 포함된 금속의 종류가 다른 복수개의 실리카 나노 입자에 각각 종류를 다르게 하는 제 1 항체를 부착하여 분석함으로써 제 1 항체의 종류에 따른 타겟의 종류를 다양화할 수 있으며, 실리카 나노 입자에 포함된 금속의 종류를 다르게 함으로써 이후 유도결합 플라즈마 질량분석기를 이용한 정량 분석시 2가지 종류의 금속을 동시에 분석하는 것이 가능하게 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 실리카 나노 입자에 포함되는 금속은 Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y 및 Ti로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 Au를 포함하는 실리카 나노 입자, Gd 을 포함하는 실리카 나노 입자, Y 을 포함하는 실리카 나노 입자 및 Eu 를 포함하는 실리카 나노 입자로 이루어진 그룹에서 선택되는 2개 이상의 복수개의 실리카 나노 입자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 분석하고자 하는 타겟에 따라서 적절한 금속을 선택할 수 있으며, 구체적으로는 분석하고자 하는 타겟이 혈액 내의 HBV 인 경우 Au를 포함하는 실리카 나노 입자, HIV 인 경우 Gd 을 포함하는 실리카 나노 입자, HCV 인 경우 Eu 를 포함하는 실리카 나노 입자를 사용하는 것이 바람직하며, 이와 같은 실리카 나노 입자를 2개 이상 동시에 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 다른 실시예에 의할 경우, 도 2에서 보는 바와 같이 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 복수 종류의 제 1 항체가 결합된 플레이트이고, 복수 종류의 제 1 항체가 결합되었다는 점을 제외하고는 종래 ELISA 방법을 그대로 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 복수 종류의 제 1 항체가 결합된 플레이트를 분석 플랫폼으로 하는 경우 상기 제 2 항체는 금속을 포함하는 코어 및/또는 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자에 결합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 2 항체가 결합되는 실리카 나노 입자의 코어는 Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y 및 Ti로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 금속을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 2 항체가 결합되는 실리카 나노 입자의 코어는 Au 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체는 단클론 항체인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체와 제 2 항체는 동일한 것을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체는 단클론 항체이고, 제 2 항체는 다클론 항체인 것이 가능하다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, (iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계는
(iv-1) 외부 자력을 가하여 상기 제 2 항체가 결합된 타겟 물질을 포집하는 단계; 및
(iv-2) 상기 포집된 제 2 항체가 결합된 타겟 물질을 분광분석기로 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼으로서 실리카 나노 입자를 사용하는 경우에는 제 2 항체가 결합된 타겟을, 외부 자력을 가하여 제 2 항체에 연결되는 실리카 나노 입자에 포함되는 자성 나노 입자의 자성에 의하여 분리하고, 분리된 제 2 항체까지 결합된 타겟의 태그된 금속을 정량분석하여 타겟을 분석하게 된다.
본 발명의 다른 실시예에 의하여 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼으로서 플레이트에 결합된 제 1 항체를 사용하는 경우, (iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계는
(iv-1) 플레이트의 제 1 항체와 결합된 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 분리하는 단계; 및
(iv-2) 상기 플레이트의 제 1 항체와 결합된 상기 제 2 항체가 결합된 물질만을 분광분석기로 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 제 2 항체까지 결합되는 타겟이 플레이트에 고정되어 있으므로, 단순히 분리 후에 제 2 항체에 결합된 태그된 금속을 정량분석하여 결과적으로 복수개의 타겟을 정량 분석하는 것이 가능해진다.
본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 (iv-2) 상기 포집된 복합체에 포함된 제 2 항체가 결합된 물질을 분광분석기로 분석하는 단계에서는 유도결합 플라즈마 질량분석기 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기를 사용하여 분석하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 금속나노태그를 이용한 타겟물질 분석방법은 기존의 생물학적 면역반응에 나노기술을 융합하여 다량의 혈액시료를 취급하는 혈액관리 사업이나 혈액제제 및 바이러스 검증 진단, 기타 생물의약품사업에서 검사비용의 부담 없이 정확하게 미량의 바이러스까지도 검출을 가능하게 한다.
도 1 및 도 2는 본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법을 나타내는 모식도이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 일 실시예에 의하여 혈액 내에서 유도결합 플라즈마 질량분석기로 분석한 결과를 나타낸다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법은
(i) 타겟과 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼을 제조하는 단계;
(ii) 상기 제 1 항체를 포함하는 분석 플랫폼과 복수개의 타겟을 포함하는 시료와 반응시켜 타겟 물질이 결합된 분석 플랫폼을 형성하는 단계;
(iii) 타겟과 특이적으로 결합하는 제 2 항체와 상기 제 1 항체와 타겟이 결합된 분석 플랫폼을 반응시키는 단계;
(iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 복수개의 종류의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 금속을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자일 수 있다. 상기 실리카 나노 입자는 1 종류의 금속을 포함하고, 상기 항체가 결합된 분석 플랫폼은 금속의 종류가 다른 실리카 나노 입자를 2 종류 이상 포함할 수 있다. 상기 실리카 나노 입자에 포함되는 금속은 Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y 및 Ti로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 Au를 포함하는 실리카 나노 입자, Gd 을 포함하는 실리카 나노 입자, Y 을 포함하는 실리카 나노 입자 및 Eu 를 포함하는 실리카 나노 입자로 이루어진 그룹에서 선택되는 2개 이상의 복수개의 실리카 나노 입자를 포함할 수 있다. 상기 제 2 항체는 자성 금속을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자에 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 복수 종류의 제 1 항체가 결합된 플레이트 일 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 2 항체는 금속을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자에 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 2 항체에 결합된 실리카 나노 입자의 코어는 Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y 및 Ti로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 금속을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 2 항체에 결합된 실리카 나노 입자의 코어는 Au 을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체와 제 2 항체는 동일할 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서, 상기 제 1 항체는 단클론 항체이고, 제 2 항체는 다클론 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서,
(iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계는
(iv-1) 외부 자력을 가하여 상기 제 2 항체가 결합된 타겟 물질을 포집하는 단계; 및
(iv-2) 상기 포집된 제 2 항체가 결합된 타겟 물질을 분광분석기로 분석하는 단계; 를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서,
(iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계는
(iv-1) 플레이트의 제 1 항체와 결합된 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 분리하는 단계; 및
(iv-2) 상기 플레이트의 제 1 항체와 결합된 상기 제 2 항체가 결합된 물질만을 분광분석기로 분석하는 단계; 를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법에 있어서,
상기 (iv-2) 상기 포집된 복합체에 포함된 제 2 항체가 결합된 물질을 분광분석기로 분석하는 단계에서는 유도결합 플라즈마 질량분석기 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기를 사용하여 분석하는 것일 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 더욱 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 제 1 항체를 포함하는 분석 플랫폼으로 플레이트를 사용하는 경우
플레이트에 제 1 항체로서 ..., 를 부착시킨 후, 제 2 항체로서 HBsAg 가 부착되고 Au 입자를 포함하는 실리카 나노 입자를 Gold nano particle conjugation kit 를 사용하여 제조 준비하였다.
혈액 샘플을 플레이트에 흘려주어 제 1 항체와 혈액 샘플 내의 타겟과 반응을 유도한 후, 세척으로 반응하지 않은 불순물을 제거하였다. 여기에 상기 HBsAg 가 부착되고 Au 입자를 포함하는 제 2 항체와 반응시켰다.
이후 질산과의 반응으로 제 2 항체까지 결합된 결합체를 분리 회수한 후, 유도결합플라즈마 질량분석법(ICP-MS)으로 검량하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
< 실시예 2> 제 1 항체를 포함하는 분석 플랫폼으로 실리카 나노 입자를 사용하는 경우
제 1 항체를 포함하는 분석 플랫폼으로 가돌리늄이 도핑된 실리카 나노 입자, 이트륨이 도핑된 실리카 나노 입자 및 유로품이 도핑된 실리카 나노 입자를 각각 합성하였다.
상기 합성된 실리카 나노 입자에 제 1 항체로서 각각 Human anti-p24 monoclonal 항체를 부착하고 혼합하여 실리카 나노 입자 분석 플랫폼을 제작하였다.
자성 나노 입자로서 철 나노 입자를 제조하고, 여기에 제 2 항체로서 Human anti-p24 monoclonal 항체를 부착하여 제조하였다.
상기 가돌리늄이 도핑된 실리카 나노 입자, 이트륨이 도핑된 실리카 나노 입자 및 유로품이 도핑된 실리카 나노 입자가 혼합된 실리카 나노 입자를 타겟 물질을 포함하는 시료와 반응시켰다. 미반응 물질을 제거한 후, 질산과의 반응으로 제 2 항체까지 결합된 결합체를 분리 회수하고 유도결합플라즈마 질량분석법(ICP-MS)으로 검량하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 본 발명에 의한 복수개의 금속 나노 태그를 이용한 타겟의 동시 분석 방법을 사용하는 경우 복수의 타겟을 정량적으로 분석할 수 있다는 것을 알 수 있다.

Claims (16)

  1. (i) 타겟과 특이적으로 결합하는 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼을 제조하는 단계;
    (ii) 상기 제 1 항체를 포함하는 분석 플랫폼과 복수개의 타겟을 포함하는 시료와 반응시켜 타겟 물질이 결합된 분석 플랫폼을 형성하는 단계;
    (iii) 타겟과 특이적으로 결합하는 제 2 항체와 상기 제 1 항체와 타겟이 결합된 분석 플랫폼을 반응시키는 단계;
    (iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계; 를 포함하는
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 복수개의 종류의 항체를 포함하는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 금속을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자인 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 실리카 나노 입자는 1 종류의 금속을 포함하고,
    상기 항체가 결합된 분석 플랫폼은 금속의 종류가 다른 실리카 나노 입자를 2 종류 이상 포함하는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 실리카 나노 입자에 포함되는 금속은 Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y 및 Ti로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 Au를 포함하는 실리카 나노 입자, Gd 을 포함하는 실리카 나노 입자, Y 을 포함하는 실리카 나노 입자 및 Eu 를 포함하는 실리카 나노 입자로 이루어진 그룹에서 선택되는 2개 이상의 복수개의 실리카 나노 입자를 포함하는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 제 2 항체는 자성 금속을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자에 결합되는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 항체가 결합된 분석 플랫폼은 복수 종류의 제 1 항체가 결합된 플레이트 인 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 2 항체는 금속을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면을 코팅하는 실리카를 포함하는 실리카 나노 입자에 결합되는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 제 2 항체에 결합된 실리카 나노 입자의 코어는 Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y 및 Ti로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 금속을 포함하는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 제 2 항체에 결합된 실리카 나노 입자의 코어는 Au 을 포함하는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 항체와 제 2 항체는 동일한 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 항체는 단클론 항체이고, 제 2 항체는 다클론 항체인 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  14. 제 1 항에 있어서,
    (iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계는
    (iv-1) 외부 자력을 가하여 상기 제 2 항체가 결합된 타겟 물질을 포집하는 단계; 및
    (iv-2) 상기 포집된 제 2 항체가 결합된 타겟 물질을 분광분석기로 분석하는 단계; 를 포함하는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  15. 제 1 항에 있어서,
    (iv) 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 정량 분석하는 단계는
    (iv-1) 플레이트의 제 1 항체와 결합된 상기 제 2 항체가 결합된 물질을 분리하는 단계; 및
    (iv-2) 상기 플레이트의 제 1 항체와 결합된 상기 제 2 항체가 결합된 물질만을 분광분석기로 분석하는 단계; 를 포함하는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
  16. 제 14 항 및 제 15항에 있어서,
    상기 (iv-2) 상기 포집된 복합체에 포함된 제 2 항체가 결합된 물질을 분광분석기로 분석하는 단계에서는 유도결합 플라즈마 질량분석기 또는 흑연로 원자흡수 분광분석기를 사용하여 분석하는 것인
    복수개의 금속 나노 태그를 이용한 복수개의 타겟의 동시 분석 방법
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